( B ) (11) KUULUTUSJ'ULKÅISU UTLAGGNINGSSKRIFT (51) Kv.lk.5 - Int.c1.5 C 07H 15/04, C 07K 3/08, A 61K 39/385 // C 07H 11/04

Transkriptio

1 ( B ) (11) KUULUTUSJ'ULKÅISU UTLAGGNINGSSKRIFT C /1:3) P3,',y.. - (51) Kv.lk.5 - Int.c1.5 C 7H 15/4, C 7K 3/8, A 61K 39/385 // C 7H 11/4 -- SUOMI-FINLAND (FI) Patentti- ja rekisterihallitus Patent- och registerstyreisen (21) Patenttihakemus - Patentansökning (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag (24) Alkupäivä - Löpdag (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig (44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. - Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet NL P (71) Hakija - Sökande 1. De Staat der Nederlanden, represented by the Deputy Director - General of the RIVI.' of Bilthoven, Antonie van Leeuwenhoeklaan 9, 372 BA Bilthoven, Netherlands, (NL) (72) Keksijä - Uppfinnare 1. Beuvery, Eduard Coen, Kerkstraat 66, 4132 AG Vianen, Netherlands, (NL) 2. Evenberg, Adolf, Vaartserijnstraat 14, 3523 TE Utrecht, Netherlands, (NL) 3. Poolman, Jan Theunis, Leeteinde 8, 1151 AK Broek in Waterland, Netherlands, (NL) 4. van Boom, Jacobus Hubertus, Het Wedde 17, 2253 AD Voorschoten, Netherlands, (NL) 5. Hoogerhout, Peter, Idenburgstraat 13, 285 SZ Gouda, Netherlands, (NL) 6. van Boeckel, Constant Adriaan Anton, Mercuriusstraat 32, 5345 LX Oss, Netherlands, (NL) (74) Asiamies - Ombud: Oy Kolster Ab (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Uudet oligosakkaridit ja niiden käyttö immunogeenien valmistamiseen Nya oligosackarider och deras användning för framställning av immunogener (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer EP A (A 61K 39/385), Chemical Abstracts, vol. 13 (1985), 86144e: J. Clin. Invest., vol. 16 (1985) nro 1, p. 52-9, Chemical Abstracts, vol. 15 (1986), m: J. Immunol., vol. 137 (1986) nro 4, p (57) Tiivistelmä - Sammandrag Keksintö koskee uusia oligosakkarideja, jotka käsittävät rakenteen (D-riboosi- D-ribitoli-fosfaatti) m, (D-ribitolifosfaatti-D-riboosi) m tai (fosfaatti-driboosi-d-ribitoli) m, jolloin m on 2, 3, tai 2, sellaisia oligosakkari - deja sisältäviä immunogeeneja, sellaisia immunogeeneja sisältäviä rokotteita ja menetelmiä sellaisten oligosakkaridien, immunogeenien ja rokotteiden valmistamiseksi. Rokote soveltuu erittäin hyvin niiden infektioiden hoitoon, joita aiheuttaa Haemophilus Influenzae tyyppi b. Uppfinningen avser nya oligosackarider med strukturen (D-ribos-D-ribitolfosfat) m (D-ribitol-fosfat-D-ribos) m eller (fosfat-d-ribos-d-ribitol), vari m m är 2, 3, eller 2, immunogener, vilka innehåller dylika oligosackarider, vaccin, vilka innehåller dylika immunogener, och förfaranden för framstållning av dylika-oligosackarider, immunogener och vaccin. Vaccinet är mycket lämpligt för behandling av infektioner, vilka förorsakats av Haemophilus Influenzae typ b.

2 Uudet oligosakkaridit ja niiden käyttö immunogeenien valmistamiseen 5 Keksintö koskee uusia oligosakkarideja, jotka sisältävät D-riboosi-, D-ribitoli- ja fosfaattiyksikköjä, sekä niiden näyttöä immunogeenien valmistamiseen. Bakteerin Haemophilus influenzae tyyppi b kapselipolysakkaridi koostuu monista D-riboosi-D-ribitolifos- 1 faatti-yksiköistä Haemophilus influenzae tyyppi b on, muun muassa, patogeeninen bakteeri, joka aiheuttaa aivokalvontulehdusta ja muita tarttuvia tauteja. On todettu, että voidaan saada aikaan immuniteetti 15 antamalla Haemophilus influenzae tyyppi b:n (HIB) kapselipolysakkaridia. On myös todettu, että erityisesti alle 2 vuoden ikäisillä lapsilla kestää saavutettu immuniteetti lyhyen aikaa ja alle 18 kuukauden ikäisillä lapsilla sitä ei voida havaita ollenkaan. Asiaa voidaan parantaa anta- 2 maila kapselipolysakkaridi liitettynä niin kutsuttuun kateenkorvasta riippuvaiseen kantajaan (proteiiniin). Tällaisilla polysakkaridi-proteiinikonjugaateilla on se huono puoli, että rakenne ei ole tarkoin määrätty ja että tuotteessa ei polysakkaridiosa ole homogeeninen. Tästä on seu- 25 rauksena, että jokainen vasta valmistettu erä rokotetta, joka sisältää tällaisia konjugaatteja, on testattava koeeläimillä ja/tai ihmisillä rokotteen tehokkuuden suhteen. Lisäksi voi sellaisen tuotteen käyttäminen rokotteessa aiheuttaa epäsuotavia vasta-aineita tai myrkyllisyyttä. 3 Oligosakkaridit, jotka on saatu hajottamalla HIBkapselipolysakkaridia, eivät myöskään ole puhtaita, vaikkakin tarkemmin määrättyjä. Tällöinkin on tehokkuus aina testattava jälleen. Sen vuoksi on olemassa tarve saada HIB-sairautta 35 vastaan rokote, joka sisältää tarkoin kuvatun, puhtaan

3 2 "89172 oligosakkaridifragmentin, s.o. oligosakkaridifragmentin, joka ei sisällä sellaisia oligosakkarideja, joilla on erilainen rakenne tai ketjun pituus. Nyt on todettu, että sellaisia puhtaita oligosakka- 5 rideja voidaan saada synteettisesti ja että voidaan saada aikaan sopivia immunogeeneja liittämällä sellaiset fragmentit yhteen kantajan kanssa. Tällaisia immunogeeneja voidaan käyttää rokotteissa. Siitä, että tällainen oligosakkaridi voidaan valmistaa synteettisesti, aiheutuu myös 1 se etu, että saatavuus ei ole riippuvainen patogeenisen bakteerin HIB saatavissa olosta. Keksintö koskee siten oligosakkarideja, joilla on seuraava kaava: 15 2 X o HO 1/ ori i # k (1) o p Ho m -- l/ ow Oy q os 5k= o, 1=ti1 a, 3 a,jsn=1,jsn= ey ekikkie ym,jk yee udsa ma,soantieäursi iosnknaa asa a ym,jsao yrfbnnktustuuatmsa 3 äsä a ätrhäx-o ovturatoyyslä

4 ryhmällä H 2N- tai HS-, ja Y = vety, reaktiokykyinen ryhmä, joka kykenee muodostamaan, suoraan tai epäsuorasti, sidoksen kantajan kanssa, tai ryhmä, jossa on hydrofobinen ketju sitoutumattomassa 5 päässä, tai pääteryhmä -OY on korvattu reaktiokykyisellä ryhmällä -NH 2 tai -SH, sillä ehdolla, että Y = vety, jos X vety tai että X = vety, jos Y y vety, ja niiden suoloja. Keksintö koskee myös näiden oligosakkaridien käyt- 1 töä immunogeenien valmistamiseen, jotka immunogeenit sisältävät kantajaan liitetyn oligosakkaridin tai usean oligosakkaridin yhdistymän. Immunogeenit soveltuvat käytettäviksi rokotteissa. Kun jätetään huomioimatta X(XO-) ja Y(-OY), voi D- 15 riboosi-d-ribitoli-fosfaatti-runko, joka on esitetty kaavassa 1, päättyä sekä vasemmalla että oikealla riboosi-, ribitoli- tai fosfaattiryhmään. Parhaina pidetään kuitenkin oligosakkarideja, jotka päättyvät, kun X(XO-) ja Y(OY) jätetään huomioon ottamatta, vasemmalla ribitoli- tai ri- 2 boosiryhmään ja oikealla fosfaattiryhmään tai oikealla ribitoli- tai riboosiryhmään ja vasemmalla fosfaattiryhmään. m on edullisesti 2, 3, 4, 5 tai 6, koska sen pituinen oligosakkaridirunko on yleensä jo riittävän kokoinen kysymyksessä olevaa tarkoitusta varten. Vielä edullisemmin m on 25 3, 4, 5 tai 6. ole H. Mieluimmin k, 1, n ja q ovat nolla, X on H ja Y ei Koska keksinnön mukaisissa oligosakkarideissa olevat fosfaattiryhmät esiintyvät liuoksessa ionisoituneina 3 esimerkiksi neutraalissa ph:ssa, valmistetaan tämän keksinnön mukaiset oligosakkaridit edullisesti suolan, esimerkiksi natriumsuolan, muodossa. Koska keksinnön mukaiset oligosakkaridit eivät sellaisenaan ole immunogeenisiä tai riittävän immunogeenisiä, 35 on välttämätöntä liittää mainitut oligosakkaridit kanta-

5 jaan, minkä seurauksena todella aikaansaadaan riittävän asteisena mainittu immunogeenisyys. Tapa, jolla oligosakkaridi liitetään kantajaan, vaihtelee kantajan tyypin mukaan. Oligosakkaridin ja kantajan yhteenliittyminen tapah- 5 tuu suoraan tai epäsuorasti kaavassa 1 olevan X(XO-):n tai Y(-OY):n kautta. Jos X ja Y ovat vety, on oligosakkaridia muunnettava jommasta kummasta noista kohdista, jotta yhteenliittyminen kantajan kanssa tulisi mandolliseksi. Koska kaavas- 1 sa 1 näkyvät -OH ja = -ryhmät, jotka ovat enemmän tai vähemmän aktiivisia, ovat keksinnön mukaisten oligosakkaridien valmistuksen aikana suojattuina pitemmän tai lyhyemmän ajan, on edullista suorittaa kantajan kanssa yhteenlittymistä varten tarvittavat muutokset ennen kuin suojaa- 15 vat ryhmät poistetaan. Kuten jo on mainittu, tapahtuu oligosakkaridin yhdistyminen kantajan kanssa joko X(XO-):n tai Y(-OY):n kautta. Jos X ja Y olisivat kaavassa 1 nyt vetyjä, olisi suojaavat ryhmät lisättävä jälleen ennen kuin kantajan kanssa yhdistymiseen tarvittava ryhmä voi- 2 taisiin lisätä. X on sen vuoksi mieluummin vety ja Y(-OY) on jokin muista ilmoitetuista ryhmistä, tai Y on vety ja X(XO-) on jokin muista ilmoitetuista ryhmistä. Kun tästä lähtien käytetään ilmausta "X" tai "Y" tai termiä "reaktiokykyinen ryhmä", tarkoitetaan myös ta- 25 pausta, jossa reaktiokykyisen ryhmän muodostaa reaktiokykyinen ryhmä -NH 2 tai -SH, jolloin tulee käsittää -NH 2 tai -SH vastaavasti ryhmäksi X- tai -OY. Tämän keksinnön mukainen oligosakkaridi päättyy siten mieluimmin toisessa päässä hydroksyyliryhmään ja toisessa päässä reaktiokykyi- 3 seen ryhmään tai ryhmään, jonka sitoutumattomassa päässä on hydrofobinen ketju. Näiden kanden ryhmätyypin välillä tehtävän valinnan ratkaisee tapa, jolla oligosakkaridin ja kantajan yhdistäminen toteutetaan. Periaatteessa on tätä tarkoitusta varten käytettävissä kaksi sinänsä tunnettua 35 menetelmää. Ensimmäisen menetelmän mukaan oligosakkaridi

6 sidotaan kantajaan. Siinä tapauksessa kantajana on tavallisesti proteiini. Toisen menetelmän mukaan saadaan oligosakkaridin liittyminen aikaan hydrofobisen vuorovaikutuksen avulla sellaisen oligosakkaridiin sidotun ryhmän, jos- 5 sa on sitoutumattomassa päässä hydrofobinen ketju, ja kantajan välillä, jolloin kantaja on miselli, vesikkeli tai liposomi, tai oligosakkaridien keskinäisen hydrofobisen vuorovaikutuksen avulla. Ensimmäisessä tapauksessa hydrofobinen ryhmä osallistuu hydrofobiseen vuorovaikutukseen 1 misellissä, vesikkelissä tai liposomissa olevien amfifiilisten yhdisteiden (lipidien) hydrofobisten alueiden kanssa, kun taas oligosakkaridi päätyy misellin, vesikkelin tai liposomin jakopinnalle. Tunnetaan reaktiokykyisiä ryhmiä, jotka kykenevät 15 muodostamaan, suoraan tai epäsuorasti, sidoksen proteiinin kanssa. Epäsuoralla sidoksella tarkoitetaan tässä yhteydessä, että reaktiokykyisen ryhmän ja proteiinin välinen sidos muodostetaan lisäyhdisteen avulla. Jos X tai Y on kaavassa 1 reaktiokykyinen ryhmä, ovat kaikki sellaiset 2 reaktiokykyiset ryhmät periaatteessa sopivia, jotka kykenevät muodostamaan sidoksen karboksyylin, amiinin tai proteiinin muun, siihen mandollisesti lisätyn reaktiivisen ryhmän kanssa, tai jotka voidaan sitoa lisäyhdisteen välityksellä karboksyyliin, amiiniin tai proteiiniin muuhun, 25 siihen mandollisesti lisättyyn reaktiokykyiseen ryhmään. Esimerkkejä sellaisista reaktiokykyisistä ryhmistä ovat ryhmät, joissa on seuraava reaktiokykyinen funktionaalinen ryhmä: 3 - NH 2,, -SH, -S-S- ja -C

7 joissa R = -H, -N3, --alkyyli(c242 ), - 6F 5, -H, -Br, -Cl tai 5 --N Reaktiokykyinen ryhmä voi muodostua yhdestä näistä 1 reaktiokykyisistä funktionaalisista ryhmistä, tai jos reaktiokykyinen ryhmä on suurempi, se voi sisältää yhden mainituista reaktiokykyisistä funktionaalisista ryhmistä, jossa tapauksessa ryhmä mieluimmin päättyy yhteen mainituista reaktiokykyisistä funktionaalisista ryhmistä. 15 Koska immunogeenisyyden tehostamisen kannalta on edullista, jos oligosakkaridissa olevat riboosi-ribitolifosfaatti-yksiköt ovat jonkin matkan päässä proteiinista sen jälkeen kun oligosakkaridi on sidottu proteiiniin, on reaktiokykyinen ryhmä mieluimmin melko pitkä ryhmä, jossa 2 on yksi yllä mainituista reaktiokykyisistä funktionaalisista ryhmistä. Kuten on sanottu, sijoitetaan reaktiokykyinen ryhmä oligosakkaridirungon päähän mieluimmin kun mainittu runko on vielä suojattuna. Kun yhden mainituista reaktiokykyi- 25 sistä funktionaalisista ryhmistä sisältävä reaktiokykyinen ryhmä on lisätty, voidaan mainittu reaktiokykyinen funktionaalinen ryhmä muuttaa joksikin toiseksi reaktiokykyisistä funktionaalisista ryhmistä, jos oligosakkaridirunko on vielä suojattuna, mutta myös jos rungosta on suojaus jo 3 kokonaan poistettu. Siten reaktiokykyiset ryhmät, jotka sisältävät funktionaalisen ryhmän -NH 2, kuten esimerkiksi 35 +CH 2 j a 4 CH 2, NH-4amino4-NH 2 a 6 happo

8 jossa a= -16, b= -2, c= 1-1 ja pääteaminohappo on mieluimmin glysiini, voidaan muuttaa sellaisen yhdisteen avulla, joka sisältää aktiivisen esteri- ja maleimidifunktionaalisen ryhmän, reaktiokykyiseksi ryhmäksi, joka 5 sisältää maleimidi- funktionaalisen ryhmän; mainituista ryhmistä saadaan seuraavan yhdisteen avulla 1 R-C jossa R:llä on edellä annettu merkitys, ryhmät 15 *C112. b NH-C CH1-N ja' 2 (-CH2 b appo 4T-NH-C CH2-N O 25 Lisäksi voidaan reaktiokykyiset ryhmät, jotka sisältävät funktionaalisen ryhmän -N14 2, muuttaa sellaisen yhdisteen avulla, joka sisältää kaksi aktiivista esteri- 3 tai aldehydi- funktionaalista ryhmää, reaktiokykyiseksi ryhmäksi, joka sisältää reaktiokykyisenä funktionaalisena ryhmänä aktiivisen esterin tai aldehydin, esimerkiksi ryhmäksi

9 H -N-C-(CH 2 ) d-c-r 5 jossa R:llä on edellä annettu merkitys ja d = 1-6, tai sellaisen yhdisteen avulla, joka sisältää funktionaaliset ryhmät aktiivinen esteri ja -SH, reaktiokykyiseksi ryhmäksi, joka sisältää funktionaalisen ryhmän -SH, esimerkiksi 1 seuraaviksi 15 -NH-C-(CH 2 ) d-sh tai -NH-C-CH-(CH 2 ) d-sh, joissa d = 1-6 ja II NHAc Ac=asetyyli. Reaktiokykyiset ryhmät, jotka sisältävät funktionaalisen ryhmän -SH, voidaan muuttaa sellaisen yhdisteen avulla, joka sisältää aktiivisen esteri- ja maleimidifunktionaalisen ryhmän, reaktiokykyiseksi ryhmäksi, joka 2 sisältää aktiivisen esterin reaktiokykyisenä funktionaalisena ryhmänä, esimerkiksi seuraavaksi 25 \ R Reaktiokykyiset ryhmät, jotka sisältävät ryhmän 3 reaktiokykyisenä funktionaalisena ryhmänä, voidaan muuttaa suorittamalla reaktio sellaisten yhdisteiden kanssa, jotka sisältävät funktionaaliset ryhmät -NH 2 ja -SH tai funktionaaliset ryhmät maleimidi ja -NH 2, reaktiokykyiseksi ryhmäksi, joka sisältää vastaavasti ryhmän -SH tai male- 35 imidiryhmän reaktiivisena funktionaalisena ryhmänä.

10 Sellaiset reaktiokykyisen ryhmän muuttamiset ovat sinänsä tunnettuja kirjallisuudessa. Täten valmistetut keksinnön mukaiset oligosakkaridit kytketään proteiiniin tai peptidiin. Proteiinissa ole- 5 vat reaktiokykyiset ryhmät -NH 2, -COOH tai -SH voidaan muuttaa joksikin yllä kuvatuista muista reaktiokykyisistä ryhmistä yllä kuvattuja menetelmiä vastaavalla menetelmällä. Keksinnön mukainen oligosakkaridi ja proteiini voi- 1 daan sitten kytkeä toisiinsa muun muassa seuraavasti: oligosakkaridi-maleimidi + HS-proteiini immunogeeni oligosakkaridi-sh + maleimidi-proteiini -. immunogeeni 15 oligosakkaridi-sh + «V-S-S-proteiini immunogeeni oligosakkaridi-s-s- + HS-proteiini immunogeeni 2 oligosakkaridi-c-r + H 2N-proteiini immunogeeni oligosakkaridi-nh 2 + R-C-proteiini R:llä on sama merkitys kuin edellä. 25 epäsuorasti. immunogeeni, joissa Sellaiset kytkemiset voidaan toteuttaa suoraan tai Lisäksi oligosakkaridit, joissa on reaktiokykyinen funktionaalinen ryhmä -NH 2, voidaan esimerkiksi kytkeä proteiinin NH 2 -ryhmään kytkevän aineen, kuten esimerkiksi bis[n-hydroksisukkiini-imidi]estereiden tai glutaaridial- 3 dehydin avulla. Jos X tai Y on kaavassa 1 ryhmä, joka sisältää sitoutumattomassa päässä hydrofobisen ketjun, ovat tähän tarkoitukseen sopivia sellaiset ryhmät, jotka kykenevät olemaan hydrofobisessa vuorovaikutuksessa misellin, vesik- 35 kelin tai liposomin kanssa tai kykenevät muodostamaan mi- sellin hydrofobisten vuorovaikutusten avulla.

11 Hydrofobinen ketju on mieluimmin hiiliatomia sisältävä alkyyliryhmä. Parhaimpina pidetään ryhmiä, joissa hiiliatomia sisältävä alkyyliryhmä muodostaa mainitun ryhmän. 5 Vielä mieluummin ryhmä on haarautumaton alkyyliryhmä, joka sisältää hiiliatomia. Tämän keksinnön mukaiset oligosakkaridit sopivat käytettäviksi rokotteen valmistamiseen HIB-sairautta vastaan. Koska tämän keksinnön mukaiset oligosakkaridit eivät 1 sellaisinaan ole immunogeenisiä, ne tulisi yhdistää kantajaan, joka saa yhdistelmästä immunogeenisen. Periaate on sinänsä tunnettu niin kutsuttujen hapteenien yhteydestä, jotka voidaan, vaikkakaan ne eivät sellaisinaan ole immunogeenisia, saada immunogeenisiksi yhdistämällä ne kanta- 15 jaan. Sopivia kantajia ovat proteiinit, peptidit, misellit, vesikkelit ja liposomit. Parhaimpina pidetään proteiineja tai misellejä. Erityisen sopivina proteiineina ja peptideinä voidaan mainita tetanustoksiini, tetanustoksoidi, difteria- 2 toksiini, difteriatoksoidi, pertussistoksiini, pertussistoksoidi, pertussis- rihmainen hemagglutiniini, pertussiskarvat, pertussis-ulkokalvoproteiinit, meningokokin (Neisseria meningitidis) ulkokalvoproteiinit, Haemophilus influenzaen ulkokalvoproteiinit, Haemophilus influenzaen 25 karvat, polioviruksen alayksikköproteiinit ja tuhkarokkoviruksen alayksikköproteiinit. Parhaimpina pidetään Haemophilus influenzaen proteiineja. Eräs sellaisten kantajien hyvä puoli on, että niitä käytetään tai voidaan käyttää olemassa olevissa DPTP-rokotteissa. Mainitut proteiinit 3 ovat sinänsä tunnettuja ja samoin tunnetaan myös sellaisten proteiinien eristysmenetelmiä. Tunnetaan myös menetelmiä sakkaridien yhdistämiseksi sellaisiin proteiineihin. Tavallisesti on kysymyksessä kovalenttinen sidos sakkaridin ja proteiinin välillä.

12 Jos X tai Y on kaavassa 1 ryhmä, joka sisältää hydrofobisen ketjun sitoutumattomassa päässä, voidaan oligosakkaridi saada immunogeeniseksi sopivalla tavalla yhdistämällä mainittu oligosakkaridi miselleihin, vesikkeleihin 5 tai liposomeihin. Yhteenliittyminen saadaan aikaan hydrofobisen ketjun ja misellin, vesikkelin tai liposomin hydrofobisten osien välisen hydrofobisen vuorovaikutuksen avulla. Sellaiset yhdistämismenetelmät ovat sinänsä tunnettuja. 1 Jos X tai Y on kaavassa 1 reaktiokykyinen ryhmä, voidaan haluttaessa ensin suorittaa reaktio sellaisen yhdisteen kanssa, joka sisältää reaktiokykyisen ryhmän ja hydrofobisen ketjun. Näin saatu tuote voidaan sitten liittää miselleihin, vesikkeleihin tai liposomeihin. 15 Toinen menetelmä keksinnön mukaisten oligosakkaridien saamiseksi immunogeeniseksi on käsitellä oligosakkarideja, joissa X tai Y on hydrofobisen ketjun sitoutumattomassa päässä omaava ryhmä, sellaisella tavalla, että mainitut hydrofobiset ketjut muodostavat misellirakenteen 2 hydrofobisen vuorovaikutuksen avulla. Tässä tapauksessa immunogeenisyyttä ei saavuteta yhdistämällä oligosakkaridi kantajan kanssa, vaan siten, että useat oligosakkaridimolekyylit liittyvät keskenään yhteen. Vielä eräs mandollinen tapa valmistaa immunogeeni 25 on kytkeä kaavan 1 mukaiset oligosakkaridit, joissa X tai Y on reaktiokykyinen ryhmä, amfifiiliseen adjuvanttimolekyyliin kovalenttisella sidoksella mainitun reaktiokykyisen ryhmän avulla. Tämä kytkeminen voi tapahtua suoraan tai epäsuorasti. Oligosakkaridin ja adjuvantin toisiinsa 3 kytkemisen jälkeen voi adjuvantin sitoutumaton pää muodostaa misellin, mandollisesti yhdessä sitoutumattoman adjuvantin tai muiden lipidiaineiden kanssa. Sopivia amfifiilisia adjuvantteja ovat esimerkiksi avridiini (N,N-dioktadekyyli-N',N'-bis(2-hydroksietyyli)propaanidiamiini), li- 35 poidiamiini 4-aminometyyli-1-(2,3-(di-n-dekyylioksi)-n-

13 propyyli)-4-fenyylipiperidiini, dimetyylidioktadekyyliammoniumbromidi, lauryylimuramyylidipeptidi, lauryylitetrapeptidi, (N 2 -[N-(N-lauryyli-L-alanyyli)-Y-D-glutamyyli]- N6 -(glysyyli)-d,d-l,l-2,6-diaminopimeliinihappo, L-tyrosii- 5 ni ja sen alkyylijohdannaiset, maltoositetrapalmitaatti, pluronic-polyolit,l-tyrosiini-atsobentseeni-p-arsonaatti, sorbitaanimono-oleaatti (Span 8), trehaloosijohdannaiset (kuten esimerkiksi trehaloosidimykolaatti), retiinihappo ja sen johdannaiset, D,L-a-tokoferoli (vitamiini E), lipi- 1 di A ja analogit ja glykosidit, kuten esimerkiksi saponiinit (esimerkiksi Quil A, joka on saatu Quillaja-saippuayrtin Molina niinestä). Sellaisia immunogeeneja ja menetelmiä näiden immunogeenien valmistamiseksi tunnetaan sinänsä EP-patenttiha- 15 kemuksesta 86,2,23,7. Lipidi A ja analogeja tunnetaan adjuvantteina NL-patenttihakemuksesta Saponiinien käyttö adjuvantteina ja misellien muodostaminen antigeenideterminantteihin kytketyistä saponiineista tunnetaan NL-patenttihakemuksesta Tämän keksinnön mukaiset immunogeenit sopivat käytettäviksi rokotteen valmistamiseen HIB-sairautta vastaan. Immunogeenisyyden tehostamiseksi edelleen voidaan edullisesti käyttää adjuvantteja. Sellaisten adjuvanttien käyttö ja mainitut adjuvantit ovat sinänsä tunnettuja. Adjuvantit 25 voidaan lisätä immunogeeniin. On myös mandollista liittää adjuvantteja yhteen immunogeenin kanssa. Sellaiset menetelmät immunogeenisyyden parantamiseksi ovat myös sinänsä tunnettuja. Tämän keksinnön mukaiset immunogeenit käsittävät siten paitsi oligosakkaridien yhdistelmiä kantajien 3 kanssa ja oligosakkaridien keskenään muodostamia yhdistymiä, myös mainittua kahta tyyppiä olevia yhdistelmiä, joihin on myös yhdistetty adjuvantti. Em. immunogeeneja voidaan myös formuloida rokotteisiin. Tavallisesti immunogeeni on rokotteessa vesiliuok- 35 sessa, -emulsiossa tai -suspensiossa, joissa voi esiintyä

14 rokotteissa tavanomaisia lisäaineita, kuten esimerkiksi adjuvantteja, stabiloimisaineita, puskureita ja muita immunogeeneja. Sopivia adjuvantteja, joita voidaan lisätä, ovat alumiinihydroksidi, -fosfaatti tai -oksidi tai seos, 5 jonka muodostavat mineraaliöljy, esimerkiksi Marcol 52, tai kasviöljy ja yksi tai useampia emulgoimisaineita, kuten esimerkiksi Tween 8 tai Span 8, tai jokin jo yllä mainituista amfifiilisista adjuvanteista. Sopivia stabiloimisaineita ovat sellaiset hiilihyd- 1 naatit kuin sorbitoli, laktoosi, mannitoli, tärkkelys, sakkaroosi, dekstraani ja glukoosi tai sellaiset proteiinit kuin albumiini tai kaseiini. Puskureina on mandollista käyttää esimerkiksi alkalimetallifosfaatti-, alkalimetallikarbonaatti- tai maa- 15 alkalimetallikarbonaattipuskuria. Rokote voi sisältää myös muita immunogeeneja. Siinä tapauksessa on kysymyksessä niin kutsuttu cocktail, jolla on se etu, että voidaan saada aikaan immuniteetti useita taudin aiheuttajia vastaan yhden ainoan antomuodon avulla. 2 Muita immunogeeneja, joita voidaan käyttää, ovat esimerkiksi tunnetuissa DPTP-rokotteissa käytettävät immunogeenit. Rokote valmistetaan sinänsä tunnettujen menetelmien mukaan käyttäen tämän keksinnön mukaista immunogeenia, esim. liuottamalla, emulgoimalla tai suspendoimalla immu- 25 nogeeni vesiympäristöön. Yksi tai useampia tavallisista lisäaineista voidaan lisätä tai voi olla läsnä mainitussa vesiympäristössä. Tällaista rokotetta voidaan käyttää immunoimaan HIB-sairautta vastaan, mutta myös niin kutsuttuun "esikä- 3 sittelyyn" (jossa kehoa ei suoraan stimuloida muodostamaan spesifisiä vapaita vasta-aineita, vaan todellakin esikäsitellään niin, että myöhemmän tartunnan tai uudelleenrokottamisen jälkeen syntyy voimakas immuunireaktio). Rokote annetaan tavallisesti ruiskeena lihakseen tai ihon alle. 35 Yleensä immunogeenimäärä, joka annetaan ruiskeessa on,1-1 pg annosta kohden.

15 Tällainen rokote antaa periaatteessa jokaiselle yksilölle suojan HIB-sairautta vastaan ja sopii etenkin erittäin hyvin pienten lasten (alle 2 vuoden ikäisten) rokottamiseen. Johtuen tämän keksinnön mukaisen oligosak- 5 karidin puhtaudesta ei ole tarpeellista testata jokaisen valmistetun rokote-erän, joka sisältää sellaista oligosakkaridia, tehokkuutta. Lisäksi ei-toivotusti stimuloitujen vasta-aineiden määrä ja muiden sivuvaikutusten, kuten myrkyllisyyden, esiintyminen ovat vähäisiä tällaisen rokot- 1 teen yhteydessä. Tämän keksinnön mukaiset oligosakkaridit voidaan valmistaa antamalla erilaisten yhdisteiden, jotka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat yhdisteet, jotka sisältävät riboosi-, riboosi-ribitoli-, riboosi-ribitoli-fos- 15 faatti-, ribitoli-, ribitoli-fosfaatti-, ribitoli-fosfaatti-riboosi-, fosfaatti-, fosfaatti-riboosi- ja fosfaattiriboosi-ribitoli-yksikköjä, jolloin mainitut yksiköt on varustettu tarpeellisilla suojaavilla ryhmillä, reagoida keskenään erillisissä vaiheissa ja poistamalla lopuksi 2 suojaavat ryhmät. Tämän keksinnön mukaiset oligosakkaridit valmistetaan lopullisesti siten, että oligosakkarideissa, jotka käsittävät rakenteen (D-riboosi-D-ribitoli-fosfaatti)., (D-ribitoli-fosfaatti-D-riboosi). tai (fosfaatti-driboosi-d-ribitoli)., jossa m = 2, 3, 4, tai 2 ja 25 jossa vapaiden hydroksiryhmien vetyatomi on korvattu suojaavalla ryhmällä, korvataan suojaavat ryhmät vetyatomilla. Yleisluonteisesti on tunnettua, että oligosakkaridit voidaan valmistaa sitomalla suurempia tai pienempiä yksikköjä, joista lopullinen oligosakkaridi rakentuu, toisiinsa 3 erillisten reaktioiden avulla, jolloin yksiköt ovat varustettuja tarpeellisilla suojaavilla ryhmillä. Sen jälkeen kun haluttu oligosakkaridi on muodostettu, poistetaan suojaavat ryhmät. Jos toinen kaavassa 1 olevista ryhmistä X ja Y ei ole vety ja nämä ryhmät eivät esiintyneet yhdis- 35 teissä, joista oligosakkaridi muodostettiin, tulisi nämä ryhmät myös lisätä ennen kuin suojaavat ryhmät poistetaan.

16 Tämän keksinnön mukaiset oligosakkaridit voidaan valmistaa lähtien seuraavan kaavan 2 mukaisesta yhdisteestä. 5 o- or or z o% (2) hi 1 k Tästä yhdisteestä lähdettäessä on olemassa joukko menetel- 15 miä keksinnön mukaisten oligosakkaridien valmistamiseksi. Ensimmäinen menetelmä muodostaa oligosakkaridi on lisätä jatkuvasti pieniä yksiköitä yksi kerrallaan. Tämä voidaan tehdä fosforyloimalla kaavan 2 mukaisia yhdisteitä yhdisteillä, joilla on kaava 3 2 (3) 25 liittämällä sitten yhdiste, jolla on kaava 5 3 fosforiryhmään, toistamalla näitä kahta vaihetta niin usein kuin halutaan ja päättämällä lopuksi rakenteen muodostaminen suorittamalla reaktio yhdisteen kanssa, jolla on kaava 6

17 16 Q R. okt, 1 R 4. or n t_ "7 (6) 1 minkä jälkeen on vielä poistettava suojaavat ryhmät. Toinen tapa on fosforyloida kaavan 5 mukainen yhdiste kaavan 3 mukaisella yhdisteellä, sitoa saatu tuote fosforiryhmän avulla kaavan 2 mukaiseen yhdisteeseen, toistaa tätä vai- 15 hetta niin usein kuin halutaan ja lopuksi päättää rakenteen laatiminen suorittamalla reaktio kaavan 6 mukaisen yhdisteen kanssa, minkä jälkeen on vielä poistettava suojaavat ryhmät. Keksinnön mukaiset oligosakkaridit voidaan valmistaa siten, että 2 1) yhdiste jolla on kaava 2 -ox 25 -R2 oh (2) k 3 reagoimaan yhdisteen kanssa, jolla on kaava 3 35 (3)

18 17 F joissa kaavoissa k =, jos 1 =, k = tai 1, jos 1 = 1, 1 = tai 1, 5 R i = jatkuvasti suojaava ryhmä, reaktiokykyinen ryhmä, joka kykenee muodostamaan, suoraan tai epäsuorasti, sidoksen kantajan kanssa ja joka sisältää reaktiokykyisen funktionaalisen ryhmän, joka on varustettu jatkuvasti suojaavalla ryhmällä, tai ryhmä, joka sisältää sitoutumattomassa pääs- 1 sä hydrofobisen ketjun, tai päätteenä oleva ryhmä 1- R on korvattu reaktiokykyisellä ryhmällä H 2N- tai HS-, joka reaktiokykyinen ryhmä on varustettu jatkuvasti suojaavalla ryhmällä, R 2 = jatkuvasti suojaava ryhmä, 15 A = happiatomi, joka on sitoutunut kaksoissidoksella fos- 2 foriatomiin, tai ei mitään (tässä tapauksessa fosforiatomilla on vapaa elektronipari), R 3 = reaktiokykyinen ryhmä ja R 4 = reaktiokykyinen ryhmä tai ryhmä, jolla on kaava 4 -R, 25 or S (4) q jossa q = tai 1, R 2 = jatkuvasti suojaava ryhmä ja R 5 3 jatkuvasti suojaava ryhmä, reaktiokykyinen ryhmä, joka kykenee muodostamaan, suoraan tai epäsuorasti, sidoksen kantajan kanssa ja joka sisältää reaktiokykyisen funktionaalisen ryhmän, joka on varustettu jatkuvasti suojaavalla ryhmällä, tai ryhmä, jossa on hydrofobinen ketju sitoutu- 35 mattomassa päässä, tai päätteenä oleva ryhmä -R 5 on kor-

19 18 P9172 vattu reaktiokykyisellä ryhmällä H 2N- tai HS-, joka reaktiokykyinen ryhmä on varustettu jatkuvasti suojaavalla ryhmällä, ja 2) jos R4 ei ole kaavan 4 mukainen ryhmä, vaiheessa 5 1) saadun tuotteen annetaan reagoida yhdisteen kanssa, jolla on kaava 5, 1 jossa R 2 on jatkuvasti suojaava ryhmä ja R6 on tilapäisesti suojaava ryhmä, ja näin saadusta tuotteesta poistetaan suojaus korvaamalla R 6 vetyatomilla, ja 15 3) vaihe 2) toistetaan m-2 kertaa vaiheessa 2) saa- dulla tuotteella vaiheessa 1) saadun tuotteen asemesta, ja 4) vaiheesta 2) tai vaiheesta 3) saadun tuotteen annetaan reagoida yhdisteen kanssa jolla on kaava 6, jossa R 2 = jatkuvasti suojaava ryhmä 2 R 3 = reaktiokykyinen ryhmä, R 7 = jatkuvasti suojaava ryhmä, reaktiokykyinen ryhmä, joka kykenee muodostamaan, suoraan tai epäsuorasti, sidoksen kantajan kanssa ja joka sisältää reaktiokykyisen funktionaalisen ryhmän, joka on varustettu jatkuvasti suojaavalla 25 ryhmällä, tai ryhmä, jossa on hydrofobinen ketju sitoutumattomassa päässä, tai ulkopuolinen ryhmä R 7- on korvattu reaktiokykyisellä ryhmällä H 2N- tai HS-, joka reaktiokykyinen ryhmä on varustettu jatkuvasti suojaavalla ryhmällä, n = tai 1, 3 q =, jos n =, q = tai 1, jos n = 1, ja ryhmä R l 5) näin saadussa tuotteessa jatkuvasti suojaava tai R jos se on läsnä tai jos halutaan, korvataan X:llä tai Y:llä, mikäli X tai Y ei ole vety, ja

20 ) vaiheessa 1), 4) tai 5) saadusta yhdisteestä poistetaan suojaus korvaamalla jatkuvasti suojaavat ryhmät vetyatomilla. Keksinnön mukaiset oligosakkaridit voidaan myös 5 valmistaa menetelmällä jossa 1) yhdiste, jolla on kaava 2 1 Rj. Rat (2) O T k jossa k:lla, L:llä, R i :llä ja R 2 :lla on sama merkitys kuin edellä, saatetaan reagoimaan reaktiotuotteen kanssa, jonka ovat muodostaneet yhdiste, jolla on kaava 3 'FZ3 2, (3) 25 jossa R 2 :lla, R 3 :lla ja R 4 :lla on sama merkitys kuin edellä, sillä ehdolla, että R4 ei ole yhdiste, jolla on kaava 4, 3 or S (4)

21 ja yhdiste, jolla on kaava 5, or a, otti (5) 5 or, jossa R 2 :lla ja R 6 :lla on sama merkitys kuin edellä, ja näin saadusta tuotteesta poistetaan suojaus korvaamalla R6 vetyatomilla, ja 1 2) vaiheessa 1) saadun tuotteen annetaan reagoida reaktiotuotteen kanssa, jonka ovat muodostaneet kaavan 3 mukainen yhdiste ja kaavan 5 mukainen yhdiste, ja näin saadusta tuotteesta poistetaan suojaus korvaamalla R6 vetyatomilla, ja että tämä menettely toistetaan m-3 kertaa 15 saadulla tuotteella, ja 3) vaiheessa 1) tai 2) saadun tuotteen annetaan reagoida yhdisteen kanssa, jolla on kaava 6 2 tl R7 (6) 25 n jossa n:llä, q:lla, R2 :lla, R3 :lla ja R7 :llä on sama merkitys kuin edellä, ja 4) näin saadussa tuotteessa korvataan jatkuvasti 3 suojaava ryhmä R 1 tai R 7, jos se on läsnä tai jos halutaan, X:llä tai Y:llä, mikäli X tai Y ei ole vety, ja 5) vaiheessa 3) tai 4) saadusta yhdisteestä poistetaan suojaus korvaamalla jatkuvasti suojaavat ryhmät vetyatomilla.

22 ,72 R 1 voi olla jatkuvasti suojaava ryhmä tai, jos X ei halutussa oligosakkaridissa ole vety, se voi olla sama kuin X, sillä ehdolla, että reaktiokykyinen funktionaalinen ryhmä on varustettu jatkuvasti suojaavalla ryhmällä, 5 mistä on seurauksena, että reaktiokykyinen funktionaalinen ryhmä ei osallistu mihinkään reaktioon oligosakkaridirungon muodostamisen aikana. Koska X on kaavassa 1 mieluimmin vety, on R 1 mieluimmin jatkuvasti suojaava ryhmä. R 2 on jatkuvasti suojaava ryhmä. R 3 on kaavassa 3 1 reaktiokykyinen ryhmä ja R 4 on reaktiokykyinen ryhmä tai kaavan 4 mukainen ryhmä. Koska Y mieluimmin ei ole vety, on R 5 kaavassa 4 mieluimmin muu ryhmä kuin jatkuvasti suojaava ryhmä. Koska k, 1, n ja q ovat mieluimmin nolla, on R, mieluimmin reaktiokykyinen ryhmä eikä siten kaavan 4 15 mukainen ryhmä. Termillä "jatkuvasti suojaava ryhmä" tarkoitetaan ryhmiä, joiden - muuten - reaktiokykyisiä ryhmiä suojaava vaikutus kestää koko keksinnön mukaisten oligosakkaridien valmistuksen ajan. 2 Vasta sen jälkeen kun synteesi on suoritettu aivan loppuun, poistetaan jatkuvasti suojaavat ryhmät korvaamalla ne vetyatomilla. Sellaisia suojaavia ryhmiä tunnetaan sokeri- ja nukleotidikemiassa. Ryhmät R 2 kaavassa 2, 3, 4, 5 ja 6 voivat olla sa- 25 tuoja tai erilaisia ryhmiä ja ne on mieluimmin valittu seuraavien ryhmien joukosta: bentsoyyli, bentsyyli, bentsyylioksimetyyli, 2-kloorifenyyli, bentsyylioksikarbonyyli, tert.butyylidifenyylisilyyli, 1-2 hiiliatomia sisältävä alkyyli, tetrahydropyranyyli, tert.butyylidimetyylisi- 3 lyyli ja trityyli. Mieluimmin R 2 on ribitoliyksiköissä bentsyyli. Jos R 1 tai R 5 ovat tai sisältävät jatkuvasti suojaavia ryhmiä, on mainitut ryhmät sopivasti valittu yllä mainitusta joukosta. Sama koskee kaavassa 3 olevaa R 2 :ta, 35 joka on mieluimmin 2-kloorifenyyli.

23 Kaavassa 2 muodostaa R 1 mieluimmin yhdessä riboosiyksikön asemassa 5' olevan R 2 :n kanssa ryhmän 5 -Si - - Si- ic3h3 ) 2 ( 1 C3H9 ) 2 (siinä tapauksessa ovat k ja 1 nolla) tai riboosiyksikön asemassa 5' oleva R 2 ja R 1 ovat bentsyyli. 1 Riboosiyksikön asemassa 2' oleva R 2 on mieluimmin bentsyyli, bentsyylioksimetyyli, tetrahydropyranyyli tai tert.butyylidimetyylisilyyli, joista parhaina pidetään bentsyyliä ja bentsyylioksimetyyliä, ja riboosiyksikön asemassa 5' kaavassa 4, 5 ja 6 oleva R 2 on bentsyyli, 15 bentsyylioksimetyyli, tetrahydropyranyyli, trityyli tai tert.butyylidifenyylisilyyli, joista parhaina pidetään bentsyyliä ja tert.butyylidifenyylisilyyliä. Kaavassa 3 olevat reaktiokykyiset ryhmät R3 ja R4 voivat olla ryhmiä, jotka yhdessä kykenevät saamaan ai- 2 kaan sidoksen kaavan 5 ja kaavan 2 mukaisissa yhdisteissä olevan vapaan OH-ryhmän välille. Sopivia kaavan 3 mukaisia yhdisteitä ovat: II _p_n 25 -"NNN p 1 1 "N.:..."S I I I I 3 II C1 Cl, Cl - P ' G'2 CH1, Cl R2 R2 II o ch 2 C CL3 ja (allcyyli-ci -C 1 ) 2N-P-N i -C 1 ) 2' R2 122

24 Kaavan 2 ja 3 mukaisten yhdisteiden välinen reaktio tapahtuu yleensä ilman paineessa ja lämpötilassa - 6 C 2 minuutista 3 tuntiin kestävänä aikana. Näin saadun tuotteen annetaan sitten reagoida kaa- 5 van 5 mukaisen yhdisteen kanssa, jossa R 2 on jatkuvasti suojaava ryhmä ja R 6 on tilapäisesti suojaava ryhmä. R 2 :n suhteen pätee sama mikä on jo mainittu yllä käsiteltäessä kaavaa 2. Tilapäisesti suojaavalla ryhmällä tarkoitetaan tässä yhteydessä, että käytetään ryhmää, jon- 1 ka suojaava vaikutus kestää osan aikaa oligosakkaridirunkoa rakennettaessa ja joka sitten myöhemmin, ennen kuin rakentaminen on saatettu täysin loppuun, poistetaan selektiivisesti, s.o. poistamatta jatkuvasti suojaavia ryhmiä. Sellaisia ryhmiä tunnetaan sokeri- ja nukleotidikemiassa. 15 Sopivia ryhmiä ovat: allyyli, 1-propenyyli, dimetoksitrityyli, klooriasetyyli, bromiasetyyli, levulinoyyli ja allyylioksikarbonyyli. Parhaimpina R 6 -ryhminä pidetään allyyliä ja 1-propenyliä. Reaktio kaavan 5 mukaisen yhdisteen kanssa tapah- 2 tuu tavallisesti ilman paineessa ja lämpötilassa - 6 C 2 minuutista 3 tuntiin kestävänä aikana. Sen jälkeen kun on suoritettu reaktio kaavan 5 mukaisen yhdisteen kanssa, poistetaan ryhmä R 6 selektiivisesti, tavallisesti ilman paineessa ja lämpötilassa - 6 C minuutin aikana, ja korvataan vetyatomilla. Sitten voidaan haluttaessa suorittaa reaktio yhdisteen kanssa, joka on kaavan 3 mukainen, sillä ehdolla, että R4 on reaktiokykyinen ryhmä, reaktio kaavan 5 mukaisen yhdisteen kanssa ja R 6 :n korvaaminen vetyatomilla toistaa 3 m-2 kertaa. Olosuhteet, joissa nämä vaiheet suoritetaan, ovat samat kuin jo on kuvattu yllä vastaaville vaiheille. Sitten annetaan saadun tuotteen reagoida kaavan 6 mukaisen yhdisteen kanssa. R 2 :n ja R 3 :n suhteen pätee sama mikä on jo mainittu yllä R 2 :n ja R 3 :n osalta käsiteltäessä 35 kaavoja 2 ja 3. n ja q ovat mieluimmin nolla. R 7 :11ö on

25 sama merkitys kuin R 1 :llä; tämä ei tarkoita, että R i :n ja R 7 :n on välttämättä oltava identtisiä. Koska toivotussa oligosakkaridissa Y mieluimmin ei ole vety, on R7 mieluimmin sama kuin Y (Y # H), sillä ehdolla, että reaktiokykyi- 5 nen funktionaalinen ryhmä on varustettu jatkuvasti suojaavalla ryhmällä. Ryhmiä, joita voidaan sopivasti käyttää tähän tarkoitukseen, ovat jo mainitut jatkuvasti suojaavat ryhmät; parhaimpana pidetään bentsyylioksikarbonyyliryhmää. 1 Olosuhteet, joissa reaktio kaavan 6 mukaisen yhdisteen kanssa tavallisesti tapahtuu, ovat seuraavanlaiset: lämpötila 1-6 C ilman paineessa, aika 15 min 6 tuntia. Oligosakkaridirungon rakentaminen on sillä tavoin 15 saatu loppuun. Haluttaessa voidaan R 1 tai R7, mikäli R 1 tai R7 on jatkuvasti suojaava ryhmä, nyt korvata X:llä tai Y:- 11ä, mikäli X tai Y # H. Tämän keksinnön mukaisissa oligosakkarideissa X on mieluimmin vety; siinä tapauksessa R 1 on mieluimmin jatkuvasti suojaava ryhmä. Koska Y mieluim- 2 min ei ole vety, on R7 mieluimmin sama kuin Y (Y # H) varustettuna jatkuvasti suojaavalla ryhmällä. Siinä tapauksessa ei R 1 :tä eikä R.,:ä tarvitse korvata X:llä tai Y:llä, mikäli X tai Y # H. Mieluimmin ei tätä vaihetta sen vuoksi suoriteta. 25 Lopuksi korvataan jatkuvasti suojaavat ryhmät vetyatomilla. Aivan kuten jatkuvasti suojaavien ryhmien käyttö ja lisääminen tunnetaan sokeri- ja nukleotidikemiassa, tunnetaan myös suojauksen poistaminen. Kuitenkin tämän keksinnön mukaisten oligosakkari- 3 dien, joissa k, 1, n ja q =, valmistaminen suoritetaan mieluimmin antamalla kaavan 2 mukaisen yhdisteen reagoida kaavan 3 mukaisen ja kaavan 5 mukaisen yhdisteen reaktiotuotteen kanssa. Sen jälkeen kun saadusta tuotteesta on poistettu suojaus poistamalla R 6, voidaan oligosakkaridi- 35 runkoa jatkaa edelleen suorittamalla reaktio kaavan 3 mu-

26 25 P>9172 kaisen ja kaavan 5 mukaisen yhdisteen reaktiotuotteen kanssa ja poistamalla saadusta tuotteesta jälleen suojaus poistamalla R6. Tämä voidaan toistaa niin usein kuin halutaan pitäen mielessä oligosakkaridirungon vaadittu pituus. 5 Oligosakkaridirungon rakentaminen päätetään suorittamalla reaktio kaavan 6 mukaisen yhdisteen kanssa. Tämän lähestymistavan etuna on, että vaiheiden lukumäärää voidaan pienentää, koska tuotetta, joka saadaan antamalla kaavan 3 mukaisen yhdisteen ja kaavan 5 mukaisen 1 yhdisteen reagoida, tarvitsee valmistaa vain kerran. Toinen etu on se seikka, että kaavan 3 mukainen yhdiste reagoi selektiivisemmin kaavan 5 mukaisen yhdisteen kanssa kuin kaavan 2 mukaisen yhdisteen kanssa. Kummassakin tapauksessa kaavan 3 mukainen yhdiste soveltuu sitomaan ai- 15 noastaan yhden kaavan 2 tai 5 mukaisen yhdisteen, kaavan 3 mukaisen yhdisteen toisen reaktiokykyisen ryhmän pysyessä koskemattomana. Kun on kysymyksessä reaktio kaavan 2 mukaisen yhdisteen kanssa, tapahtuu epäsuotavammanlaista dimeerin muodostumista. 2 Kaavan 3 mukaisen yhdisteen ja kaavan 5 mukaisen yhdisteen välinen reaktio suoritetaan lämpötilassa 1-6 C ja ilman paineessa ja se tapahtuu yleensä 1-6 minuutissa. Täten muodostuneen tuotteen annetaan myös reagoida 1-6 C:ssa ja ilman paineessa kaavan 2 mukaisen 25 yhdisteen kanssa. Tämä reaktio on yleensä kulkenut loppuun,5-3 tunnin kuluttua ja se suoritetaan mieluimmin katalyytin, kuten esimerkiksi N-metyyli-imidatsolin tai tetratsolin, läsnä ollessa tai sen jälkeen kun on aktivoitu sellaisella aktivoivalla reagenssilla tai sellaisen akti- 3 voivan reagenssin läsnä ollessa kuin esimerkiksi 1-(2,2,6- tri-isopropyylibentseeni-2'-sulfonyyli)-3-nitro-1,2,4-triatsoli tai 1-(mesityleeni-2'-sulfonyyli)-nitro-1,2,4-triatsoli. Kaavan 3 mukaiset yhdisteet, joita voidaan sopi- 35 vasti käyttää, ovat periaatteessa samoja kuin yhdisteet, jotka on jo mainittu yllä.

27 Tämän keksinnön mukaiset oligosakkaridit voidaan myös valmistaa lähtien kaavan 6 mukaisesta yhdisteestä. Tämän yhdisteen annetaan sitten reagoida kaavan 5 mukaisen yhdisteen kanssa, jossa H on korvattu R 6 :11a ja 5 R 6 on korvattu H:lla. Suojaus poistetaan sitten korvaamalla R 6 H:lla ja antamalla saadun tuotteen reagoida peräkkäin kaavan 3 mukaisen ja kaavan 2 mukaisen yhdisteen kanssa. Toinen mandollisuus on antaa kaavan 6 mukaisen yhdisteen reagoida tuotteen kanssa, joka on saatu antamalla kaavan 3 1 mukaisen yhdisteen reagoida kaavan 5 mukaisen yhdisteen kanssa, jossa H on korvattu R 6 :lla ja R6 H:lla ja antamalla saadun yhdisteen reagoida kaavan 2 mukaisen yhdisteen kanssa. Välivaiheet voidaan jälleen toistaa m-2 kertaa. Kaavan 3 mukaisten yhdisteiden asemesta voidaan 15 käyttää myös muita fosforiyhdisteitä valmistettaessa keksinnön mukaisia oligosakkarideja. Tämä koskee sekä jo kuvattuja menetelmiä että vielä seuraavia valmistusmenetelmiä. Siten voidaan antaa fosforiyhdisteiden, joissa on kolme reaktiokykyistä ryhmää, kuten esimerkiksi PC1 3 :n tai 2 salisyylikloorifosfiinin, reagoida kaavan 2 tai 5 mukaisen yhdisteen kanssa ja saatu tuote hydrolysoidaan sitten vastaavaksi fosfonaatiksi, jonka annetaan, aktivoivalla reagenssilla, kuten esimerkiksi pivaloyylikloridilla, aktivoinnin jälkeen, reagoida kaavan 5 tai 2 mukaisen yhdis- 25 teen kanssa. Sen jälkeen kun kaavan 3 mukaisen yhdisteen on annettu reagoida kaavan 2 tai 5 mukaisen yhdisteen kanssa, voidaan näin muodostunut tuote myös hydrolysoida poistaen jäljelle jäänyt vapaa reaktiokykyinen ryhmä ja jatkuvasti 3 suojaava ryhmä (joka on tässä tapauksessa tilapäisesti suojaava ryhmä) - vastaavaksi fosfonaatiksi, jonka annetaan aktivoivalla reagenssilla aktivoinnin jälkeen reagoida kaavan 5 tai 2 mukaisen yhdisteen kanssa. Jos A ei kaavassa 3 ole mitään ja fosforiyhdistees- 35 sä on siten vapaa elektronipari, tai jos keksinnön mukais-

28 ten oligosakkaridien valmistuksen aikana muodostuu fosforiyhdisteitä, jotka eivät ole täysin hapettuneita, tulisi suorittaa hapettaminen, esimerkiksi I 2 /pyridiiniä tai tert. butyyliperoksidia käyttäen, jotta saataisiin vastaava fos- 5 faatti. Eräs toinen menetelmä keksinnön mukaisten oligosakkaridien valmistamiseksi on valmistus niin kutsutun kappalesynteesin avulla. Tässä tapauksessa valmistetaan halutun oligosakkaridin melko suuria palasia erikseen ja ne sido- 1 taan sitten toisiinsa. Vielä eräs menetelmä on valmistaa kohtalaisen suuri kappale ja poistaa osasta saatua kappaletta suojaus eri kohdasta kuin toisesta osasta, minkä seurauksena nämä osat voidaan yhdistää toisiinsa. Erityisesti keskinnön mukaiset oligosakkaridit voidaan valmistaa 15 sellaisella menetelmällä jossa 1) yhdiste jolla on kaava 2 2 o or orj. R, 12 2 oli (2) k saatetaan reagoimaan yhdisteen jolla on kaava or, (3) yhdisteen, jolla on kaava 5

29 R 28 Pcv:72 - or x. R.L (5) 5 reaktiotuotteen kanssa, joissa kaavoissa k, 1, A, R 1, R2, R3 ja R 6 ovat merkitykseltään jo kuvatun mukaisia ja R, on reaktiokykyinen ryhmä, 1 ja näin saadusta tuotteesta poistetaan suojaus korvaamal- la R 6 vetyatomilla, ja 2) vaihe 1) toistetaan niin monta kertaa kuin halutaan vaiheessa 1) saadulla tuotteella kaavan 2 mukaisen yhdisteen asemesta, ja 15 3) vaihe 1) ja, jos niin halutaan, vaihe 2) toiste- taan lähtien kaavan 2 mukaisesta yhdisteestä, jossa k =, 1 = 1 ja R 1 on tilapäisesti suojaava ryhmä, ja korvaten R 1 6 :n asemesta viimeisessä vaiheessa vetyatomilla, ja 4) vaiheessa 1) tai 2) saadun tuotteen ja vaiheessa 2 3) saadun tuotteen annetaan reagoida toistensa kanssa ja siten muodostuneessa tuotteessa korvataan R6 vetyatomilla, 25 ja 5) vaiheessa 4) saadun tuotteen annetaan reagoida yhdisteen kanssa, jolla on kaava 6 R., - 3 or n q jossa R 2, 11 3, R. n ja q ovat merktiykseltään jo kuvatun 35 mukaisia, ja

30 29 B ) jatkuvasti suojaava ryhmä R 1 tai R7 ' jos se on läsnä ja jos halutaan, korvataan täten saadussa tuotteessa X:llä tai Y:llä, mikäli X tai Y ei ole vety, ja 7) vaiheessa 5) tai 6) saadusta tuotteesta pois- 5 tetaan suojaus korvaamalla jatkuvasti suojaavat ryhmät vetyatomilla. Tämä valmistusmenetelmä voidaan myös suorittaa käyttäen vaiheessa 3) kaavan 6 mukaista yhdistettä kaavan 2 mukaisen yhdisteen asemesta samalla kun käytetään kaavan 1 3 mukaisen yhdisteen ja kaavan 5 mukaisen yhdisteen reaktiotuotetta. Tämä valmistusmenetelmä voidaan myös suorittaa lähtien kaavan 6 mukaisesta yhdisteestä vastaavasti kuin on jo kuvattu siltä osin. 15 Keksinnön mukaiset oligosakkaridit voidaan myös valmistaa menetelmällä, jossa 1) yhdiste, jolla on kaava k _ O T 1 (2) saatetaan reagoimaan yhdisteen, jolla on kaava 3 3 (3) ja yhdisteen, jolla on kaava 5

31 3 P 9 " 5 (5) reaktiotuotteen kanssa, joissa kaavoissa A:lla, R 2 :lla, R3 :11a ja R6 :11a on jo kuvattu merkitys ja R, on reaktiokykyinen ryhmä, k =, 1 = ja R 1 on suojaava ryhmä, ja näin 1 saadusta tuotteesta poistetaan suojaus korvaamalla R 6 vetyatomilla, ja 2) vaihe 1) toistetaan niin monta kertaa kuin halutaan vaiheessa 1) saadulla tuotteella kaavan 2 mukaisen yhdisteen asemesta, ja 15 3) osasta vaiheessa 2) saatua tuotetta poistetaan suojaus korvaamalla R 1 R 6 :n asemesta vetyatomilla, ja 4) tuotteiden, joissa R l ja R6 on korvattu, annetaan reagoida toistensa kanssa sen jälkeen kun toisen mainituista tuotteista on annettu reagoida kaavan 3 mukaisen 2 yhdisteen kanssa, ja 5) R 6 korvataan saadussa tuotteessa vetyatomilla, ja 6) vaiheessa 5) saadun tuotteen annetaan reagoida yhdisteen kanssa, jolla on kaava R?.13 o I R J, o or n 1t1, --ORy q I;//2 (6) jossa n, q, R 2, R3 mukaisia, ja ja R7 ovat merkitykseltään jo kuvatun

32 31 99'172 7) jatkuvasti suojaava ryhmä R 1 tai R 7, jos se on läsnä ja jos halutaan, korvataan täten saadussa tuotteessa X:llä tai Y:llä, mikäli X tai Y ei ole vety, ja 8) vaiheessa 6) tai 7) saadusta yhdisteestä poiste- 5 taan suojaus korvaamalla jatkuvasti suojaavat ryhmät vetyatomilla. Tämä valmistusmenetelmä voidaan myös suorittaa päinvastaisessa järjestyksessä, s.o. aloittaen kaavan 6 mukaisesta yhdisteestä ja lopettaen lisäämiseen, joka vaa- 1 ditaan kaavan 2 mukaisen yhdisteen saamiseksi. Vielä yksi näiden kappalesynteesien muunnelma on, että ennen kuin kyseiset kaksi kappaletta yhdistetään, lisätään pääteryhmä (suorittamalla reaktio kaavan 6 tai kaavan 2 mukaisen yhdisteen kanssa) toiseen kappaleista. Kap- 15 palesynteesi on erityisen edullinen, jos valmistetaan kohtalaisen suuria oligosakkarideja. Reaktiovaiheiden lukumäärää voidaan tällä tavalla pienentää huomattavasti. Olosuhteet, joissa kappaleet liitetään toisiinsa, eivät periaatteessa eroa niistä, joita on yllä kuvattu muiden me- 2 netelmien yhteydessä. Kuvatut valmistusmenetelmät voidaan sopivasti suorittaa, kokonaan tai osittain, kiinteän faasin pinnalla. Keksintöä on selitetty seuraavien esimerkkien avulla. 25 Esimerkki 1 1. Kaavan 2 mukaisen yhdisteen valmistaminen Aloittaen D-ribonolaktonista valmistettiin 1--[2- bentsyylioksimetyyli-3,5--(tetraisopropyylidisiloksaani- 1,3 -diyyli)-8-d-ribofuranosyyli]-2,3,4-tri-o-bentsyyli-d- 3 ribitoli (yhdiste 15 toimintasuunnitelmassa 1) 13 välituotteen kautta. Toimintasuunnitelmassa 1 oleva yhdiste 2 valmistettiin yhdisteestä 1 kuten on kuvattu julkaisussa Canadian J. Chem. 36 (1958) 172.

33 ,5 ml allyyliklooriformiaattia, joka oli 1 ml:ssa kuivaa asetonitriiliä, lisättiin tipoittain, sekoittaen 4 g:n joukkoon yhdistettä 2 ja 3,5 ml:aan pyridiiniä, jotka olivat 1 ml:ssa kuivaa asetonitriiliä C:ssa. Sekoitta- 5 mista jatkettiin sitten 1 tunnin ajan C:ssa. Ylimäärä klooriformiaattia tuhottiin lisäämällä jäätä. Reaktioseos laimennettiin 1 ml:lla eetteriä ja pestiin 3 kertaa 5 ml:lla vettä. Orgaaninen kerros kuivattiin MgSO 4 :n avulla ja konsentroitiin tyhjässä. Jäännös liuotettiin 1 ml:aan 1 dikloorimetaania ja suodatettiin pienen pylvään lävitse, jossa oli pakattuna 6 g silikageeliä 6. Pylväs pestiin 4 ml:lla dikloorimetaania. Suodos ja pesuneste yhdistettiin ja konsentroitiin tyhjässä. Yhdiste 3 kiteytettiin tästä eetteri/di-isopropyylieetterillä g yhdistettä 3, joka oli 2 ml:ssa dioksaania, sijoitettiin heliumilmakehän alle. Sen jälkeen kun oli lisätty 15 mg tetrakis(trifenyylifosfiini)palladiumia, liuosta kuumennettiin 15 minuutin ajan palautusjäähdytysolosuhteissa ja reaktioseos, jossa oli yhdiste 4, konsen- 2 troitiin. 8,6 g yhdistettä 4, 3,5 g natriumboorihydridiä ja 15 ml kuivaa tetrahydrofuraania kuumennettiin 55 C:een. Lisättiin 3 ml metanolia 45 minuutin aikana sekoittaen. Sekoittamista jatkettiin sitten 1 tunnin ajan 55 C:ssa. 25 Jäähdyttämisen jälkeen reaktioseos konsentroitiin tyhjässä. Jäännöstä haihdutettiin yhdessä kuivan metanolin kanssa (3 x 5 ml), se otettiin 1 ml:aan dikloorimetaania ja pestiin 1 ml:lla 9 %:isesti kyllästettyä ammoniumkloridin vesiliuosta. Vesikerrosta uutettiin dikloori- 3 metaanilla (2 x 1 ml). Yhdistetyt orgaaniset kerrokset kuivattiin (MgSO 4 ) ja konsentroitiin tyhjässä. Jäännös puhdistettiin kromatografian avulla (eluoiden dikloorimetaani/metanolilla 1/ - 95/5). Sopivat fraktiot sisältävät yhdistettä 5. 6,2 g yhdistettä 5 liuotettiin 1 ml:aan 35 etikkahappoa, minkä jälkeen lisättiin 4 ml vettä. Liuosta

34 33 P, sekoitettiin 4 tunnin ajan 5 C:ssa. Reaktioseos konsentroitiin tyhjässä. Jäännöstä haihdutettiin yhdessä kuivan tolueenin kanssa (3 x 25 ml) ja kuivan pyridiinin kanssa (3 x 25 ml) ja se liuotettiin uudelleen 4 ml:aan pyri- 5 diiniä. Sen jälkeen kun oli lisätty 7,5 g trityylikloridia, liuosta sekoitettiin 12 tunnin ajan ympäristön lämpötilassa. Sen jälkeen kun oli lisätty 5 ml metanolia, reaktioseos konsentroitiin tyhjässä. Jäännöstä haihdutettiin yhdessä tolueenin kanssa (3 1 x 25 ml) ja se otettiin 15 ml:aan dikloorimetaania ja pestiin 15 ml:11a 1 M natriumbikarbonaattiliuosta ja 15 ml:11a vettä. Orgaaninen kerros kuivattiin (MgSO 4 ) ja konsentroitiin tyhjässä. Sen jälkeen kun oli suoritettu kromatografinen puhdistus kuten edellisessä vaiheessa, saa- 15 tiin yhdiste 6. 7,3 g yhdistettä 6 liuotettiin 4 ml:aan kuivaa N,N-dimetyyliformamidia, minkä jälkeen lisättiin 2 g natriumhydridiä pieninä annoksina. Sekoitettu reaktioseos jäähdytettiin C:een ja lisättiin 6,2 ml bentsyylibromidia 1 ml:ssa kuivaa N,N-dimetyyliformamidia tipoit- 2 tain 3 minuutin aikana. Sekoittamista jatkettiin vielä 3 minuutin ajan C:ssa ja sitten 12 tunnin ajan ympäristön lämpötilassa. Sitten lisättiin hitaasti 1 ml metanolia ja reaktioseos konsentroitiin tyhjässä. Jäännös otettiin 15 ml:aan eetteriä ja pestiin kolme kertaa 5 ml:11a H 2:ta. 25 Orgaaninen kerros kuivattiin (MgSO 4 ) ja konsentroitiin tyhjässä. Puhdistamalla konsentraatti kromatografisesti (eluoiden heksaani/dikloorimetaanilla 2/1 (4 ml) ja 1/1 (4 ml) ja sen jälkeen dikloorimetaanilla) ja haihduttamalla oikeat fraktiot saatiin yhdiste 7. 8,5 g yhdis- 3 tettä 7 liuotettiin 135 ml:aan etikkahappoa ja 15 ml:aan vettä ja kuumennettiin 9 minuutin ajan 8 C:ssa. Liuos konsentroitiin tyhjässä. Jäännös otettiin eetteriin ja pestiin vedellä (5 ml) ja 1 M natriumbikarbonaattiliuoksella (2 x 5 ml).

35 Orgaaninen kerros kuivattiin (MgSO 4 ) ja konsentroitiin tyhjössä. Jäännökseen lisättiin 1 ml dikloorimetaani/heksaania 1/1 ja suoritettiin suodatus. Suodos puhdistettiin kromatografisesti (eluoiden 4 ml:11a kloroformi/ 5 heksaani 1/1, 4 ml:11a dikloorimetaania ja dikloorimetaani/metanolilla 98/2), minkä jälkeen saatiin yhdiste 8. 3,4 g yhdistettä 9, joka oli ostettu, ja 3,1 g yhdistettä 8 kuivattiin haihduttamalla yhdessä dioksaanin kanssa (3 x 5 ml) ja liuotettiin sitten 5 ml:aan kuivaa 1,2-dikloo- 1 rietaania. Lisättiin molekyyliseuloja (4 A, 1 g aktivoituja pellettejä) ja seosta sekoitettiin ympäristön lämpötilassa 9 minuutin ajan typpivirran alla. Sitten lisättiin 3 x 3 p1 trimetyylisilyylitrifluorimetaanisulfonaattia 1 tunnin väliajoin. 1 tunnin kuluttua viimeisestä li- 15 säämisestä lisättiin 1 p1 trietyyliamiinia; molekyyliseulat poistettiin suodattamalla ja pestiin kloroformilla ja tolueenilla. Suodos ja pesuneste yhdistettiin ja konsentroitiin tyhjässä. Jäännös puhdistettiin kromatografisesti (eluoiden tolueeni/asetonilla 1/ 98/2). Yhdiste 2 1 saatiin oikeista fraktioista. 5 g siitä liuotettiin 25 ml:aan kuivaa dioksaania; sitten lisättiin 25 ml kuivaa metanolia ja 1,25 ml 1 M natriummetoksidia metanolissa. Reaktioseosta sekoitettiin 4 tunnin ajan ympäristön lämpötilassa. Sen jälkeen kun oli lisätty,25 ml 1 M natrium- 25 metoksidia metanolissa sekoitettiin vielä tunnin ajan. Sitten lisättiin 1,25 g Dowex 5 WX4:ä (H'-muotoa) ja se poistettiin jälleen 3 minuutin kuluttua suodattamalla ja pestiin metanolilla ja kloroformilla. Suodos ja pesuneste yhdistettiin ja konsentroitiin tyhjössä. Kromatografises- 3 ti puhdistamalla (eluoiden dikloorimetaani/metanolilla 1/ -4 95/5) saatiin yndiste 11, josta 2,4 g konsentroitiin kaksi kertaa 2 ml:ssa kuivaa pyridiiniä. Sitten lisättiin 2 ml kuivaa pyridiiniö. Saatua liuosta sekoitettiin typpi-ilmakehän alla C:ssa ja lisättiin 1,4 ml 35 1,3-dikloori-1,1,3,3-tetraisopropyylidisiloksaania ti-