LUURANKOLIHASTEN PROTEIINIEN SYNTEESI JA HAJOTUS SEKÄ NIIDEN TUTKIMINEN STABIILEILLA ISOTOOPEILLA ERITYISESTI KOLMIALLASMALLIA HYVÄKSIKÄYTTÄEN

Transkriptio

1 LUURANKOLIHASTEN PROTEIINIEN SYNTEESI JA HAJOTUS SEKÄ NIIDEN TUTKIMINEN STABIILEILLA ISOTOOPEILLA ERITYISESTI KOLMIALLASMALLIA HYVÄKSIKÄYTTÄEN Juha Hulmi Jyväskylän yliopisto Liikuntabiologian laitos Liikuntafysiologian tutkimusmetodiikka LFY.309 Seminaarityö Juha Hulmi Syksy 2003

2 1 TIIVISTELMÄ Juha Hulmi, Luurankolihasten proteiinien synteesi ja hajotus sekä niiden tutkiminen stabiileilla isotoopeilla erityisesti kolmiallasmallia hyväksikäyttäen. Liikuntafysiologian tutkimusmetodiikan seminaarityö. Jyväskylän yliopisto, liikuntabiologian laitos. 48 s. Ihmiskehossa on noin 12 kg proteiineja ja niistä vähintään puolet on luurankolihaksissa. Koko kehon proteiinien vaihtuvuus on suurta ja tämä on välttämätöntä elimistön tehokkaan toiminnan kannalta. Proteiinien nettotasapaino on proteiinien synteesin määrä vähennettynä proteiinien hajotuksen määrällä. Tämä on yleensä pidemmällä aikavälillä normaalilla aikuisella ihmisellä käytännössä nolla. Sen sijaan useissa sairaustiloissa ja paastossa nettotasapaino on negatiivinen. Vastaavasti voimaharjoittelu yhdistettynä tarvittavaan proteiinien saantiin kääntää tasapainon positiiviseksi. Proteiiniaineenvaihduntaa on tutkittu monilla menetelmillä, joista yleisin on ollut typpitase, jonka avulla saadaan informaatiota proteiiniaineenvaihdunnan tasapainosta koko kehon tasolla. Leimattujen aminohappojen avulla on saatu paljon tietoa sekä proteiinien synteesistä, että hajotuksesta. Menetelmän avulla on lisäksi mahdollista tutkia proteiinien aineenvaihduntaa yksittäisten kudosten ja yksittäisten proteiinien tasolla. Menetelmässä oletetaan, että itse infuusio ei vaikuta proteiinien aineenvaihduntaan, ja että yksittäisten aminohappojen avulla voidaan kuvata kaikkien aminohappojen aineenvaihduntaa. Nykyään leimataan aineita yleisimmin stabiileilla isotoopeilla. Tällä menetelmällä on tutkittu paljon proteiinien, hiilihydraattien ja lipidien aineenvaihduntaa. Menetelmässä suonensisäisesti elimistöön infusoidut leimatut isotoopit/isotopomeerit erotetaan luonnollisesti kehossa esiintyvistä isotoopeista yleisimmin kaasukromatografi-massaspektrometrin (GC/MS) avulla. Aineiden pitoisuudet on mahdollisuus määrittää sisäisen standardin menetelmällä GC/MS:n yhteydessä tai omana menetelmänään (HPLC). Isotooppimittausten hyvä puoli on se, että niiden avulla voi mitata aineenvaihduntaa ja sen muutoksia ja erityisesti muutoksien nopeuksia ja suuntaa. Yleisimmin käytetään yhden altaan mallia, jossa infuusio ja näytteiden keräys tapahtuu samasta altaasta eli yleensä laskimosta. Montaa allasta käytettäessä saadaan tarkemmin tietoa aineiden kulusta eri altaiden välillä. Ongelmana on menetelmän monimutkaisuus ja useat oletukset sekä yleensä suurempi invasiivisuus. G. Biolo kehitti 1990-luvulla kolmiallasmallimenetelmän proteiiniaineenvaihdunnan tutkimiseen ihmisellä in vivo. Menetelmän avulla on mahdollista arvioida samanaikaisesti aminohappojen kulkua valtimosta lihakseen, lihaksesta laskimoon, valtimosta suoraan laskimoon sekä proteiinien synteesiä, että hajotusta. Menetelmä on edistysaskel moniin aikaisempiin menetelmiin nähden. Valtimo-laskimomallin avulla sekä proteiinien synteesiä, että hajotusta aliarvioidaan. Lisäksi kolmiallasmalliin kuuluvan lihasnäytteen oton ansiosta proteiinien hajotusta voidaan arvioida aikaisempia menetelmiä tarkemmin. Kolmiallasmallin ongelmana on sen useat oletukset, joiden tulee olla voimassa mittausten aikana sekä ongelmallinen lihasnäytteen käsittely, joka helposti aiheuttaa virhettä. On osoitettu, että kolmiallasmallin avulla proteiinisynteesiä mitataan luotettavasti, ja että menetelmän toistettavuus on yleisesti ottaen melko hyvä. Tämän tutkimuksen tarkoituksena on tarkastella ihmisen luurankolihasten proteiinisynteesiä ja hajotusta sekä niiden mittausta leimatuilla aminohapoilla keskittyen erityisesti kolmiallasmenetelmään. Avainsanat: proteiinisynteesi, proteiinien hajotus, isotooppi, infuusio, kolmiallasmalli

3 2 TERMINOLOGIAA Fat flow artery muscle aminohapon kulku valtimosta lihakseen Ftv flow muscle vein aminohapon kulku lihaksesta laskimoon Fav flow artery vein aminohapon kulku suoraan valtimosta laskimoon GC/MS gas chromatography kaasukromatografi-massaspektrometri TTR tracer to tracee ratio leimatun ja luonnollisen aineen suhde E enrichment kertymä, sama kuin TTR mrna messenger-rna lähetti-rna trna transfer-rna siirtäjä-rna ICG indocyanide green indosyaniini-väriaine IRMS isotope ratio mass isotooppisuhde-massaspektrometri spectrometer PB protein breakdown proteiinien hajotus + de novo synteesi PS protein synthesis proteiinien synteesi + aminohappojen hapetus Ra rate of appearance ilmestyminen Rd rate of disappearance häviäminen

4 3 SISÄLTÖ TIIVISTELMÄ...1 TERMINOLOGIAA JOHDANTO PROTEIINIAINEENVAIHDUNTA LUURANKOLIHAKSESSA Proteiinien rakenne Vapaa aminohappoallas Proteiinien synteesi ja hajoaminen Luurankolihasten proteiiniaineenvaihduntaan vaikuttavia tekijöitä Ravinto Hormonit Kuormitus Voimaharjoituksen ja ravinnon yhteisvaikutus ISOTOOPPIEN KÄYTTÖ FYSIOLOGISISSA TUTKIMUKSISSA Yleistä isotoopeista ja niiden käytöstä Isotooppimääritykset kaasukromatokrafi-massaspektrometrillä Yhden ja monen altaan mallit LUURANKOLIHAKSEN PROTEIINISYNTEESIN MITTAUSMENETELMÄT LEIMATUILLA AMINOHAPOILLA Koko kehon taso Valtimo-laskimoero isotooppileimauksilla Kolmiallasmalli Suhteellinen proteiinisynteesinopeus, FSR KOLMIALLASMALLIIN PERUSTUVAN PROTEIINIAINEENVAIHDUNNAN TUTKIMUKSEN TOIMENPITEET Infuusio ja näytteenotto Infuusion periaatteet Infuusion ja näytteenottojen toteuttaminen Näytteiden käsittely ja mittaaminen...31

5 Periaatteet Toteuttaminen Laskutoimitukset Menetelmän oletuksista ja ongelmista POHDINTA...36 LÄHTEET...40 LIITTEET...46

6 5 1 JOHDANTO Koko kehon proteiineista luurankolihas käsittää % eli 70 kg:n painoisella miehellä noin 7 kg. Lisäksi luurankolihaksessa noin 120 grammaa on vapaina aminohappoina. Tuhansia erilaisia proteiineja on jakautuneena soluihin ja kehon nesteisiin. Luurankolihaksen proteiinit ovat pääasiassa myofibrillaarisia proteiineja. Kehossa tapahtuu jatkuvasti proteiinien rakennusta eli synteesiä sekä myös hajotusta. Normaalilla terveellä aikuisella ihmisellä proteiinisynteesi on pitkällä tähtäimellä yhtä suurta kuin proteiinien hajotus, mikä kertoo siitä, että koko kehon proteiiniaineenvaihdunta on tasapainossa. Monissa sairaustiloissa ja paastossa proteiinien hajotus on suurempaa kuin synteesi. Lisäksi ravinnolla ja fyysisellä aktiivisuudella on vaikutusta geenien ilmentymään erityisissä soluissa ja sitä kautta muutokseen solujen proteiinin määrässä (adaptaatio). Tiedetään, että voimaharjoittelu lisää myofibrillaaristen proteiinien ilmentymää ja sitä kautta niiden määrää lihaksissa. Vastaavasti kestävyysharjoittelu johtaa monien kuljetus- ja hapetusentsyymien määrän lisääntymiseen. Ilman ravinnon, erityisesti proteiinin saantia, proteiinitasapaino jää kuitenkin negatiiviseksi. (Rasmussen & Phillips 2003; Wagenmakers 1999.) Stabiilien isotooppien käyttö ihmisen aineenvaihdunnan tutkimisessa on lisääntynyt valtaisasti viimeisen 20 vuoden aikana. Tietämys proteiinien aineenvaihdunnasta perustuu hyvin pitkälti lukuisiin tutkimuksiin, joissa käyttäen hyväksi isotoopeilla leimattuja aminohappoja on selvitelty sekä ihmisillä, että eläimillä aminohappojen liikettä kehon eri proteiinialtaiden välillä, sekä proteiinien synteesiä ja hajotusta. Proteiiniaineenvaihdunnan pioneerityön tekijä oli Schoenheimerin tutkimusryhmä 1930-luvulla, jossa he jo käyttivät leimattuja aminohappoja (Schoenheimer ym. 1939). Gianni Biolo kehitti ihmisen aminohappokinetiikan ja proteiinien synteesin ja hajotuksen tutkimiseen niin sanotun kolmiallasmenetelmän (Biolo ym a, c). Kolmiallasmalli kuvaa aminohappojen liikettä kolmen eri aminohappoaltaan: valtimon, laskimon ja lihaksen välillä. Kolmiallasmallissa käytetään isotooppi-infuusio -menetelmää, jossa koehenkilöihin infusoidaan suonensisäisesti isotoopilla leimattua aminohappoa. Tämän tutkimuksen tarkoituksena on tarkastella yleisesti proteiinisynteesiä ja hajotusta ihmisen luurankolihaksissa, sekä niiden mittausta leimatuilla aminohapoilla keskittyen erityisesti kolmiallasmalliin.

7 6 2 PROTEIINIAINEENVAIHDUNTA LUURANKOLIHAKSESSA Kehon lepoenergiankulutuksesta keskimäärin noin 20 % kulutetaan proteiinien hajotukseen ja synteesiin. Arvioiden mukaan 1-2 % luurankolihaksen proteiineista syntetisoidaan ja hajotetaan päivittäin. Vaikkakin luurankolihaksen proteiiniaineenvaihdunta onkin muihin kudoksiin verrattuna melko hidasta, niin se silti käsittää % koko kehon proteiiniaineenvaihdunnasta. (Rasmussen & Phillips 2003; Wagenmakers 1999.) Koko kehon proteiinien vaihtuvuus on tutkimusten mukaan 70 kg:n painoisella miehellä keskimäärin noin 300 grammaa vuorokaudessa (Wagenmakers 1999). Luurankolihaksen kyky adaptoitua vaatii proteiinien synteesin ja hajotuksen säätelyä kehon tarpeita vastaavaksi. Lihasten kasvu eli hypertrofia voi tapahtua vain, kun lihasten proteiinien synteesi on suurempaa kuin proteiinien hajoaminen. (Rasmussen & Phillips 2003.) Lihasten kasvu on voimaharjoittelun yhteydessä lähinnä lihaksen supistuvien osien, myofibrillaaristen proteiinien lisääntymistä (Tipton & Wolfe 2001), joita on luurankolihasten proteiineista yli 80 % (Nelson & Cox 2000, 233). 2.1 Proteiinien rakenne Proteiinit koostuvat aminohapoista, jotka sisältävät aminoryhmän (-NH + 3 ) ja karboksyyliryhmän (-COO - ) kiinnittyneenä samaan hiiliatomiin, johon on kiinnittyneenä myös vety sekä sivuketju. Kullakin aminohapolla on sille ominainen sivuketjunsa. Aminohappojen välinen liitos on peptidisidos. Kaksi aminohappoa kiinni toisissaan on dipeptidi ja kolme vastaavasti tripeptidi. Kun aminohappoja on liittyneinä toisiinsa useita, niin tätä kutsutaan polypeptidiksi. Aminohappoja on 20 erilaista ja niillä on lisäksi lukuisia johdannaisia (liite 1). (Nelson & Cox 2000, ) 2.2 Vapaa aminohappoallas 70-kiloisen miehen kehonpainosta noin 12 kg on proteiineja ja g vapaita aminohappoja (vapaa aminohappoallas). Luurankolihaksisto käsittää noin % koko kehon painosta ja sisältää noin 7 kg proteiineja. Noin 120 g vapaista aminohapoista on

8 7 lihaskudoksessa, kun taas vain noin 5 g on verenkierrossa. (Maughan & Burke 2002, 26-27; Wagenmakers 2001.) Proteiinien ja vapaan aminohappoaltaan välillä on jatkuvaa vaihtoa, kun proteiineja syntetisoidaan ja hajotetaan. Vapaaseen aminohappoaltaaseen tulee aminohappoja kolmella tavalla: ravinnon nauttimisesta, kudosten proteiinien hajottamisesta tai ei-välttämättömien aminohappojen synteesistä (de novo synteesi). On neljä tapaa, joilla aminohappoaltaasta voi poistua aminohappoja: eritys suolistoon, uusien proteiinien muodostus, hapetus ja muuttaminen hiilihydraateiksi tai rasvoiksi. (Lemon 2001.) Vapaa aminohappoallas vaihtuu keskimäärin kuusi kertaa päivässä (Mero 1999). 2.3 Proteiinien synteesi ja hajoaminen Proteiinisynteesi. Tuman DNA molekyylien sisältämän spesifin informaation avulla kootaan tarvittavat proteiinit. Ensimmäinen vaihe proteiinisynteesissä on lähetti-rna:n (mrna) muodostus. Tätä vaihetta kutsutaan transkriptioksi ja se tapahtuu tumassa. Seuraavassa vaiheessa eli translaatiossa siirtäjä-rna (trna) tuo soluliman ribosomien pinnalle sellaisia aminohappoja, jotka vastaavat mrna:n kodonia. Monet ribosomit voivat suorittaa translaatiota samalle mrna:lle yhtä aikaa. Synteesiprosessi lopetetaan mrna:n lopetuskodoniin. Translaation jälkeen aminohappoketjua muokataan vielä translaation jälkeisessä modifioinnissa, jonka jälkeen proteiini on valmis toimimaan. (Wolfe 1992, ) Mekanismi luurankolihasten proteiinisynteesin kasvulle on joko lisääntynyt mrna:n määrä ja sitä kautta translaatio tai yksittäisten mrna-molekyylien lisääntynyt translaationopeus (Welle ym. 1999). Solujen mrna:n määrä kertoo proteiinisynteesin potentiaalista (Wolfe 1992, 380), mutta se ei näytä olevan rajoittava tekijä lihasten proteiinisynteesin nopeuden säätelyssä (Welle ym. 1999). Näyttää siltä, että rajoittava tekijä on translaatiovaihe, joka on paljon hitaampi kuin transkriptio (Goldspink & Harridge 2003; Welle ym. 1999). Solun ribosomien ja polyribosomien määrä ja niiden suhteet ilmentävät mrna:n määrää paremmin proteiinisynteesin nopeutta ja määrää (Wolfe 1992, 380). Lisääntyneen lihassyiden myofibrillien proteiinisynteesin tärkein välittävä tekijä näyttääkin olevan ribosomien synteesi ja sitä kautta tehokkaampi mrna:n translaatio (Goldspink & Harridge 2003, 239; Welle ym. 1999; Chesley ym. 1992). Translaatiota sääteleviä tekijöitä ovat voimaharjoittelun yhteydessä ainakin eif2b (initiation factor)

9 8 ja p-70-kda S6 proteiinikinaasi ja ravinnon yhteydessä eif4e 4G (Rasmussen & Phillips 2003). Proteiinien hajoaminen. Proteiinien hajoaminen koostuu toiminnallisen proteiinin hydrolyysistä alkuperäisiksi aminohapoiksi ja niiden jatkohajotuksesta. Proteiinien hajotus tapahtuu proteolyyttisten eli proteiineja hajottavien entsyymien avulla. Vaikkakin jotkut proteolyyttiset entsyymit ovat solulimassa, niin suuri osa sijaitsee lysosomeissa. Lysosomaalisia entsyymejä syntetisoidaan karkeassa endoplasmisessa retikulumissa, josta ne siirtyvät Golgin laitteeseen muokattaviksi. Golgin laitteessa muodostuu lopulta vesikkeleitä, lysosomeja. Oletetaan, että proteiineja hajotetaan sen mukaan, kuinka hyvä sitoutumisaffiniteetti niillä on lysosomien membraaneihin. (Wolfe 1992, ) Proteiinisynteesin lisääntymisestä vain noin 9-20 % käytetään lihasten kasvuun ja loput proteiiniaineenvaihdunnan lisäykseen, joka käsittää muun muassa hajotettujen proteiinirakenteiden uudistuksen (Viru & Viru 2001, 14). Jopa yli puolet supistumiskoneiston proteiineista hajotetaan ja korvataan uusilla proteiineilla noin viikossa (Goldspink & Harridge 2003). Tämä on adaptaatiokyvyn kannalta tärkeää (Wolfe 1992, 377). 2.4 Luurankolihasten proteiiniaineenvaihduntaan vaikuttavia tekijöitä Luurankolihasten proteiiniaineenvaihduntaan vaikuttaa monet tekijät, kuten fyysinen aktiivisuus, ravinto, hormonit ja sairaudet ja vauriot (Rasmussen & Phillips 2003). Proteiinisynteesiä säädellään kolmella tasolla: transkriptio, translaatio ja translaation jälkeinen kontrolli (Viru & Viru 2001, 15) Ravinto Proteiinisynteesiprosessissa uusien peptidisidosten muodostumiseen aminohappojen välille vaaditaan paljon energiaa, jota saadaan ATP:n ja GTP:n hydrolyysistä, joiden muodostumiseen tarvitaan ravintoa (Hernandez ym. 2000). Aterian jälkeen luurankolihaksissa proteiinien synteesi lisääntyykin (Tipton ym. 1999). Proteiinien nauttiminen vaikuttaa lihaksen anaboliaan lähinnä lisäämällä proteiinien synteesiä, ei niinkään vähentämällä proteiinien hajoamista (Tipton ym. 2001; Rasmussen ym. 2000; Biolo ym.

10 9 1997). Proteiinien synteesin ja hajoamisen välinen positiivinen korrelaatio on kuitenkin suuri (Tipton ym. 2002; Phillips ym. 1999; Phillips ym. 1997). Tipton ym. (2002) raportoivatkin, että voimaharjoitus yhdistettynä aminohappojen saantiin lisäsikin sekä proteiinien synteesiä, että myös hajotusta, vaikutuksen ollessa kuitenkin proteiinien nettotasapainon kannalta positiivinen. Proteiinisynteesiä kiihdyttääkin ilmeisesti sekä ravinnosta, että proteiinien hajotuksesta saadut aminohapot (Tipton & Wolfe 2001). Aminohappojen nauttimista seuraava lihaksen proteiinisynteesin lisääntyminen johtuu oletettavasti useista tekijöistä: hormonit, parakriiniset aineet, vasodilaattorit (Tipton ym. 1999) ja myös joidenkin yksittäisten välttämättömien aminohappojen, kuten leusiinin kyky stimuloida suoraan proteiinisynteesiä aktivoimalla mrna:n translaatiota (Smith ym. 1998). Proteiiniaineenvaihduntaan vaikuttavista hormoneista selvästi merkittävin ravinnon yhteydessä näyttää olevan insuliini. Ravinnon vaikutus proteiinisynteesin kiihtymiseen 1-3 tuntia ravinnonsaannin jälkeen on tutkimusten mukaan mrna:n translaation kiihdyttäminen useiden solun signalointireittien kautta, eikä niinkään geenien transkriptio, joka oletettavasti myös vaikuttaa, mutta mahdollisesti myöhemmin. (Rasmussen & Phillips 2003.) On osoitettu, että aminohappojen nauttiminen suun kautta on yhtä tehokasta lihasten proteiinisynteesin kannalta verrattuna infuusioon (Tipton ym. 1999; Biolo ym. 1997). Proteiinien saannin on raportoitu lisäävän lihasten proteiinisynteesiä paastotilassa noin 150 % (Biolo ym. 1997). Voimaharjoituksen jälkeen lihasten verenkierto on lisääntynyt (esim. Biolo ym. 1997), joten voisi olettaa, että tällöin proteiinin nauttiminen olisi tehokkaampaa kuin myöhemmin (Borsheim ym. 2002). Esmarck ym. (2001) raportoivatkin, että proteiini-hiilihydraatti-rasva yhdisteen nauttiminen oli tehokasta lihasten kasvun kannalta 12 viikon voimaharjoitustutkimuksessa iäkkäillä koehenkilöillä vain heti harjoituksen jälkeen, mutta ei enää kaksi tuntia myöhemmin. Sen sijaan Rasmussenin ym. (2000) tutkimuksessa välttämättömien aminohappojen (6 g) sekä hiilihydraattien (35 g sakkaroosia) nauttiminen tunti ja kolme tuntia voimaharjoituksen jälkeen vaikuttivat yhtä positiivisesti lihaksen proteiinisynteesiin ja nettotasapainoon. Tätä tulosta tukee myös Borsheimin ym. (2002) tutkimus, jossa 6 g aminohappoja tunti voimaharjoituksen jälkeen aiheutti samanlaisen anabolisen vasteen lihaksessa kuin vastaavan juoman nauttiminen tunti myöhemmin. Phillipsin ym. (1997) tutkimuksen mukaan proteiinisynteesi on lisääntynyt jopa 48 tuntia kovan voimaharjoituksen jälkeen. Näin ollen kaikki syöminen 48 tunnin sisällä voimaharjoituksen jälkeen lisää mahdollisesti lihasten anabo-

11 10 lista tilaa, eikä ajoituksella mahdollisesti ole suurtakaan merkitystä (Tipton & Wolfe 2001). Tutkimusten mukaan välttämättömien aminohappojen, toisin kuin ei-välttämättömien aminohappojen nauttiminen voimaharjoituksen jälkeen lisää lihasten anabolista tilaa, lähinnä proteiinisynteesin lisääntymisen kautta (Borsheim ym. 2002; Smith ym. 1998). Tiptonin ym. (2001) tutkimuksessa kuusi liikunnallisesti aktiivista nuorta nautti aminohappo-hiilihydraattijuoman (AHH) joko välittömästi ennen voimaharjoitusta, tai välittömästi sen jälkeen. AHH sisälsi 6 g välttämättömiä aminohappoja ja 35 g sakkaroosia sekä 500 ml vettä. Proteiinisynteesi oli harjoituksen jälkeen selvästi suurempaa, kun AHH nautittiin ennen harjoitusta verrattuna harjoituksen jälkeen. Tutkijoiden selitys tulokselle oli, että liikunnan aikana lihasten verenkierto oli lisääntynyt huomattavasti, joten aminohappojen saanti tällöin tai aikaisemmin on erityisen tehokasta (Tipton ym. 2001), koska proteiinisynteesi stimuloituu maksimaalisesti, kun aminohappojen kulkeutuminen lihaksiin on suurta (esim. Biolo ym. 1997). Liikunnan jälkeen verenkierto on myös lisääntynyt (esim. Biolo ym. 1997), mutta ei yhtä paljon kuin harjoituksen aikana (Tipton & Wolfe 2001). Aminohappojen nauttiminen ennen voimaharjoitusta, tai sen aikana voi mahdollisesti näin luoda lihaksille paremmat olosuhteet kasvua varten. Saattaa tosin olla, että tutkimuksessa ollut pitkä paastotila ennen voimaharjoitusta korosti tulosta, koska yleensä voimaharjoitusta ei tehdä niin, että edellisestä syömisestä olisi kulunut useita tunteja. Proteiinien ja hiilihydraattien nauttimisella harjoituksen jälkeen on Millerin ym. (2003) tutkimuksen mukaan kumuloiva vaikutus proteiinitasapainoon. Jos energiansaanti on alhaisempi kuin mitä energiankulutus, niin elimistön funktionaalisia proteiineja ja rakenneproteiineja aletaan käyttämään energiaksi lisääntyvässä määrin korjaamaan tätä epäkohtaa (Goranzon & Forsum 1985). Myös alhainen hiilihydraattien saanti aiheuttaa proteiinien hajoamisen lisääntymisen (Borsheim ym. 2003; Roy ym. 1997; Lemon & Mullin 1980). Hiilihydraattien vaikutus proteiiniaineenvaihduntaan ei ole kuitenkaan yhtä suuri kuin aminohapoilla (Borsheim ym. 2003). Kehossa vain noin 20 % proteiinisynteesissä tarvittavista aminohapoista saadaan ravinnosta, loput 80 % saadaan kierrättämällä proteiinien hajotuksesta saatuja aminohappoja (Wolfe 1992, 377). Uusien proteiinien muodostus ja varastointi on rajallista, joten ylimääräisestä ravinnosta saatavasta proteiinista poistetaan aminoryhmät, jotka käytetään

12 11 urean muodostukseen ja vastaavasti hiilirungot hapetetaan energiaksi tai varastoidaan glykogeeniksi tai rasvaksi (Maughan & Burke 2002, 26) Hormonit Voimaharjoitteluun liittyvä lihasten optimaalinen rakentuminen tarvitsee avukseen suotuisan hormonaalisen tilan. Insuliini on anabolinen hormoni, jonka on useissa tutkimuksissa osoitettu lisäävän aminohappojen sisäänottoa ja vähentävän proteiinien hajotusta (Kraemer & Mazzetti 2003) sekä lisäävän myös proteiinisynteesiä lihaksissa jos olosuhteet ovat suotuisat, eli lähinnä kun aminohappoja on tarpeeksi saatavilla lihaksissa (Tipton & Wolfe 2001; Biolo ym. 1995b). Insuliini näyttää stimuloivan proteiinisynteesiä ensin translaatio- ja vasta myöhemmin transkriptioprosessin kautta (Kramer & Mazzetti 2003; Liu & Barrett 2002). Proteiinien hajotuksen vähennyksessä insuliini toimii ainakin inhiboimalla lysosomaalisen sekä ATP-riippuvaisen uquitiinisysteemin toimintaa (Kramer & Mazzetti 2003). Insuliinin vaikutus proteiiniaineenvaihduntaan näyttää olevan hidas esimerkiksi verrattuna nautittujen vapaiden aminohappojen imeytymiseen, joten nopeasti vaikuttavien proteiinien nauttiminen kannattaa ehkä ajoittaa hieman myöhäisemmäksi kuin hiilihydraattien (Borsheim ym. 2003). Insuliininkaltainen kasvutekijä IGF-I (somatomediini-c) vähentää proteiinien hajotusta ja lisää proteiinisynteesiä lihaksissa (Kraemer & Mazzatti 2003; Viru & Viru 2001). IGF-I:n lihaksen proteiinien hajotuksen inhibointi näyttää välittyvän lähinnä IGF:I:n stimuloiman solujen glukoosin oton tehostumisen kautta. Ilman aminohappojen saantia IGF:I:n vaikutukset proteiinisynteesin stimuloimiseen ovat vähäisemmät. (Liu & Barrett 2002.) IGF-I geenin on tunnistettu ilmentävän kahta kasvutekijää, jotka ovat L-IGF-I ja MGF (mechanogrowth factor). MGF näyttää olevan vain lihaksen paikallinen kasvutekijä, mutta L-IGF-Ikulkeutuu myös verenkiertoon. MGF näyttää olevan erittäin potentiaalinen lihaksen kasvun stimuloija. Näitä lihaksen kasvutekijöitä ja maksan erittämää IGF-I (IGF-Iea) säädellään erilailla. (Goldspink & Harridge 2003, ) Kasvuhormoni on hormoni, joka edistää kasvua eri kudoksissa. Kasvuhormonin vaikutukset proteiiniaineenvaihduntaan ovat: lisääntynyt aminohappojen kuljetus solukalvojen läpi, lisääntynyt mrna:n translaatio ja DNA:n transkriptio mrna:ksi sekä vähentynyt proteiinien ja aminohappojen hajotus. (Viru & Viru 2001, 94.) Suuri osa kasvuhormonin vaikutuksista välittyy IGF-I:n (Kraemer & Mazzatti 2003) ja myös mahdolli-

13 12 sesti insuliinin lisääntyneen erityksen kautta (Viru & Viru 2001, 95) ja suoraan insuliinireseptoreihin vaikuttamalla (Liu & Barrett 2002). Kasvuhormoni kuitenkin myös mahdollisesti blokkaa insuliinin proteiinien hajotusta vähentävää vaikutusta vaikuttaen näin myös katabolisesti (Liu & Barrett 2002). Testosteroni lisää lihasten kasvua stimuloimalla lähinnä transkriptiotason kautta proteiinisynteesiä, mutta ei ilmeisesti niinkään vaikuta proteiinien hajotukseen eikä aminohappojen kuljetukseen lihassolujen sisälle (Tipton & Wolfe 2001; Ferrando ym. 1998). Testosteronilla on eniten vaikutusta nopeiden lihassolujen kasvuun (Viru & Viru 2001, 104). Saattaa olla, että testosteronin vaikutukset välittyvät myös ainakin osittain stimuloimalla kasvuhormonin ja IGF-I:n eritystä (Kraemer ja Mazzetti 2003; Tipton & Wolfe 2001). Testosteroni on ilmeisesti vähemmän anabolinen hormoni kuin insuliini ja IGF-I johtuen mahdollisesti siitä, että sen aiheuttamissa vasteissa tulee oletettavasti raja vastaan androgeenireseptorien saturoituessa suurelle määrälle testosteronia (Kraemer & Ratamess 2003). Kortisoli kiihdyttää lihaskudoksen hajoamista erityisesti tyypin II-lihassoluissa ja inhiboi proteiinisynteesiä (Kraemer & Ratamees 2003). Kortisoli on kuitenkin tärkeä myös proteiinisynteesin ja erityisesti proteiinien vaihtuvuuden kannalta, koska se lisää lihasten vapaan aminohappoaltaan kokoa (Viru & Viru 2001, 88). Näyttää siltä, että kilpirauhasen erittämillä hormoneilla tyroksiinilla ja trijodityroniinilla on rooli lisäämässä mitokondriaalisten proteiinien ja oksidatiivisten entsyymien synteesiä kestävyysharjoittelun yhteydessä (Viru & Viru 2001, 16-17; Viru & Viru 2001, 98). Joillain hormoneilla on siis anabolinen vaikutus molempiin prosesseihin, eli ne lisäävät proteiinisynteesiä ja vähentävät proteiinien hajotusta (insuliini, IGF-I), joillain hormoneilla vaikutus on anabolinen vain toisen prosessin kautta (testosteroni) ja joillain hormoneilla vastaavasti vaikutus on pelkästään katabolinen (kortisoli) (Liu & Barrett 2002) Kuormitus Pelkkä liikunta, erityisesti voimaharjoitus lisää proteiinisynteesiä luurankolihaksissa harjoituksen jälkeen (noin 100 %), kun sen intensiteetti on tarpeeksi kova (Pitkänen ym. 2003; Welle ym. 1999; Phillips ym. 1997; Biolo ym. 1995a). Sen sijaan liikunnan ai-

14 13 kana lihasten proteiinitasapaino on negatiivinen, koska tällöin proteiinien synteesi yleensä joko laskee (Bylund-Fellenius ym. 1984) tai pysyy ennallaan (Carraro ym. 1990) ja proteiinien hajoaminen lisääntyy (Rennie ym. 1981). Kuormitukseen liittyvistä tekijöistä kudoksiin kohdistuva venytys, kudosten kasvutekijät ja hormonit sekä muut metaboliset muutokset kuten proteiinien hajotus, ovat proteiinisynteesin stimuloijia luurankolihaksissa (Tipton & Wolfe 2001; Viru & Viru 2001, 15-16). Pitkäsen ym. (2003) tuoreessa tutkimuksessa voimaharjoituksen luurankolihasten proteiinisynteesiä ja proteiinien hajotusta lisäävä vaikutus oli havaittavissa lepotilaan ja kontrolliryhmään verrattuna selvästi 195 minuuttia voimaharjoituksen jälkeen, mutta vain lievästi 135 minuuttia aiemmin. Ihmisillä tehdyissä muissakin tutkimuksissa proteiinisynteesin on havaittu kiihtyvän kolmen tunnin sisällä voimaharjoituksen jälkeen (Phillips ym. 1997; Biolo ym. 1995). Eläinkokeiden perusteella on kuitenkin viitteitä, että voimaharjoituksen vaikutus proteiinisynteesin lisääntymiseen alkaisi merkittävästi vasta yli kuusi tuntia voimaharjoituksen jälkeen (Hernandez ym. 2000). Lihasten proteiinisynteesin on osoitettu olevan kiihtynyt vielä 48 tuntia ja vastaavasti proteiinien hajoamisen 24 tuntia voimaharjoituksen jälkeen voimaharjoittelua harrastamattomilla koehenkilöillä (Phillips ym. 1997). Proteiinisynteesi lisääntyy lihaksissa voimaharjoituksen jälkeen enemmän kuin proteiinien hajoaminen, mutta proteiinien nettotasapaino säilyy negatiivisena, jos ravintoa ei saada (Pitkänen ym. 2003; Phillips ym. 1999; Phillips ym. 1997; Biolo ym. 1995a). Jos voimaharjoituksen intensiteetti ei ole tarpeeksi kova, niin voimaharjoitus ei lisää proteiinisynteesiä (Roy ym. 1997; Tipton ym. 1996). Liian kova voimaharjoitus ei oletettavasti ole sekään hyvä lihaksen kasvun kannalta (Tipton & Wolfe 2001). On osoitettu, että voimaharjoituksen aiheuttama lisääntynyt proteiinisynteesi kohdistuu juuri lihasten myofibrillaarisiin proteiineihin, erityisesti myosiinin raskasketjuun ja aktiiniin (Hasten ym. 2000; Welle ym. 1999). Kovan intensiteetin kestävyysharjoituksen on osoitettu vähentävän proteiinisynteesiä (Anthony ym. 1999; Gautsch ym. 1998). Vastaavasti hieman kevyemmässä kestävyyskuormituksessa proteiinisynteesi saattaa nousta (Carraro ym. 1990). On viitteitä siitä, että jo reilun vuorokauden kestävä normaalia vähäisempi liikkumisen määrä saattaa kääntää normaalin proteiinitasapainon negatiiviseksi (Tipton ym. 2002).

15 14 Wellen ym. (1999) tutkimuksessa voimaharjoitus lisäsi myofibrillaaristen proteiinien synteesiä, mutta kokonais RNA:n tai mrna:n määrä ei lisääntynyt. Tämän perusteella tutkijat tekivät johtopäätöksen, että voimaharjoituksen vaikutus proteiinisynteesin lisäykseen on tehokkaampi mrna:n translaatio, mikä tulee aikaisempia oletuksia ja tutkimustuloksia (Chesley ym. 1992; Wolfe 1992, 380). Voimaharjoituksen jälkeisen akuutin proteiinisynteesin on osoitettu olevan vähäisempää samalla suhteellisella harjoituksen intensiteetillä voimaharjoittelua harrastaneilla harjoittelemattomiin nähden (Phillips ym. 1999). Sama tutkijaryhmä myös osoitti, että syy ei ole pelkästään geneettisissä tekijöissä, koska kahdeksan viikon voimaharjoittelun vaikutuksesta lihaksen proteiinisynteesi vähentyi (Phillips ym. 2002). Toisaalta tässä tutkimuksessa työmäärä oli ennen ja jälkeen harjoittelujakson absoluuttisesti sama. Syy siihen, miksi voimaharjoittelu voi vähentää voimaharajoituksen aiheuttamaa akuuttia proteiinisynteesiä johtuu mahdollisesti ainakin osittain voimaharjoituksen aiheuttamista vähäisemmistä vaurioista lihaksen proteiineihin kokeneemmilla voimaharjoittelijoilla verrattuna aloittelijoihin (Gibala ym. 1995), koska proteiinien hajoamisella ja synteesillä on yhteys (Phillips ym. 1999; Phillips ym. 1997). Toisaalta tutkimukset viittaavat siihen, että voimaharjoittelun vaikutuksesta lepotilassa proteiinisynteesi ja proteiinien hajoaminen eli koko proteiiniaineenvaihdunta suurenee lihaksissa (Phillips ym. 2002; Phillips ym. 1999). Oletettavasti kuitenkin lihasten kasvu ei johdu pitkällä tähtäimellä tasaisesta proteiinisynteesin perustason lisääntymisestä, vaan väliaikaisista useiden harjoitusten aiheuttamien proteiinisynteesien lisääntymisten kumuloitumisesta (Tipton & Wolfe 2001). Voimaharjoittelu sisältää voimakasta eksentristä lihastyötä, josta seuraa lihasvaurioita ja lihasarkuutta (Ahtiainen ym. 2003). Ibuprofeeni ja asetaminofeeni (toiselta nimeltään parasetamoli) ovat yleisiä kovan liikunnan aiheuttaman lihasarkuuden ja kivun vähentämiseen käytettäviä kipulääkkeitä. Ne eivät kuitenkaan vähentäneet Trappen ym. (2002) tutkimuksessa kuormituksen aiheuttamaa lihasarkuutta. Merkittävin tulos oli kuitenkin se, että molempien lääkkeiden vaikutuksesta voimaharjoituksen normaali proteiinisynteesin lisääntyminen estyi proteiinien hajotuksen pysyessä samanlaisena plaseboon verrattuna. Tutkimuksessa koehenkilöt käyttivät ibuprofeenia 1200 mg ja asetaminofeeniä 4000 mg tutkimuspäivän aikana eli määrät olivat täysin normaalit. Tutkimuksen mukaan mekanismi proteiinisynteesin inhiboimiselle oli proteiinisynteesiä

16 15 stimuloivan prostaglandiinin PGF 2α :n synteesin vähentyminen. Eläinkokeiden avulla on osoitettu, että myös aspiriini vähentää proteiinisynteesiä koko kehon tasolla (Rodemann & Goldberg ym. 1982). Nämä tutkimustulokset tukevat aikaisempia havaintoja, joiden mukaan kuormituksen aiheuttamat luonnolliset vaurio- ja niiden korjausmekanismit näyttävät olevan tärkeitä lihasten kasvun kannalta (Gibala ym. 1995; Biolo ym. 1995a) Voimaharjoituksen ja ravinnon yhteisvaikutus Kun voimaharjoitus ja proteiinien saanti yhdistetään, niin proteiinisynteesi lisääntyy huomattavasti enemmän (yhteensä yli 200 %), kuin pelkän liikunnan tai proteiinien saannin vaikutuksesta (Tipton ym. 1999; Biolo ym. 1997). Rasmussenin ym. (2000) tutkimuksessa juoma (6 g välttämättömiä aminohappoja ja 35 g sakkaroosia) voimaharjoituksen jälkeen lisäsi proteiinisynteesiä hetkellisesti peräti 400 %. Syy näin korkeaan tulokseen oli tutkijoiden mukaan mahdollisesti hiilihydraattien aiheuttama lisääntynyt insuliinin eritys. Tiptonin ym. (2002) tutkimuksessa osoitettiin, että proteiinisynteesin lisääntyminen voimaharjoituksen ja aminohappojen nauttimisen vaikutuksesta on lisä normaaliin päivittäiseen proteiiniaineenvaihduntaan. Näin ollen ravinnon ja kuormituksen nettovaikutus proteiinitasapainoon on positiivinen myös pidemmällä tähtäimellä, eikä siis ole vain väliaikainen nousu, jonka jälkeen mahdollinen lasku normaalia tilannetta alemmas, jolloin nettovaikutus olisi nolla. Voimaharjoituksen vaikutuksesta proteiinisynteesi kiihtyy vasta voimaharjoituksen jälkeen (Hernandez ym. 2000; Phillips ym. 1997; Biolo ym. 1995). Tiptonin ym. (2001) tutkimuksessa aminohappo-glukoosi -yhdistelmän nauttiminen ennen voimaharjoitusta vaikutti kuitenkin niin, että proteiinisynteesi lisääntyi jo voimaharjoituksen aikana ollen yhtä suurta vielä tunti harjoituksen jälkeen. Saattaakin olla, että jos aminohappoja on lihaksien proteiinisynteesiin tarjolla tarpeeksi jo harjoituksen aikana, niin proteiinisynteesi ei tällöin vähene tai pysy ennallaan kuten aikaisemmissa tutkimuksissa on ollut (Carraro ym. 1990; Bylund-Fellenius ym. 1984), vaan jopa nousee. Kuviossa 1 on esitetty tämän hetken yhteenveto professori R.R. Wolfen tutkimusryhmän tutkimuksista luvulta vuoteen 2003 asti (Rasmussen ja Phillips 2003). Kuviosta nähdään, että 12 tunnin paasto saa aikaan proteiinien hajoamista enemmän kuin synteesiä (#1). Voimaharjoitus (ilman yhdistelmää ravinnon kanssa) saa aikaan sekä synteesin että hajoamisen lisääntymistä, mutta hajoaminen on edelleen suurempaa (ne-

17 16 gatiivinen nettotasapaino) (#2). 40 g välttämättömiä ja ei-välttämättömiä aminohappoja lepotilassa saa aikaan synteesin nousun suuremmaksi kuin hajoamisen (#3). Seuraavassa tapauksessa sama ravinto yhdessä kuormituksen kanssa lisää kumpaakin neton ollessa positiivinen (#4). Viidennessä tapauksessa 40 g aminohappoja ja 40 g sakkaroosia lepotilassa saa aikaan edelleen molempien lisääntymistä (#5). Viimeisessä tutkimustuloksessa kolme tuntia kuormituksen ja ravinnon (6 g välttämättömiä aminohappoja ja 35 g sakkaroosia) nauttimisen jälkeen proteiinien synteesi on hyvin voimakas ja hajoaminen selvästi pienempää eli netto on positiivinen eli anabolinen(#6). KUVIO 1. Aminohappojen, glukoosin ja voimaharjoituksen vaikutus lihasten proteiinien synteesiin ja hajoamiseen nuorilla aikuisilla henkilöillä. Mittaukset on tehty leimatulla fenyylialaniinilla ottamalla näytteitä valtimosta. laskimosta ja lihaksesta kolmiallasmallia hyväksikäyttäen. (mukaeltu Rasmussen ja Phillips 2003)..

18 17 3 ISOTOOPPIEN KÄYTTÖ FYSIOLOGISISSA TUTKIMUKSISSA Suuri osa tietämyksestämme ihmiskehon makromolekyylien aineenvaihdunnasta in vivo on saatu leimaamalla proteiineja, hiilihydraatteja ja lipidejä stabiileilla isotoopeilla (Patterson ym. 1997). Isotooppileimaukset ovat yleensä ideaalisia kuvaamaan aineenvaihdunnan muutoksia ja erityisesti niiden muutosnopeutta (Rennie 1999). Substraatteja leimaamalla on mahdollista tutkia aineiden kulkemisen määrää ja nopeutta sekä altaaseen, että altaasta pois, kun valtimolaskimoeron mittauksilla voidaan määrittää vain tämän erotus eli nettotasapaino (MacDonald 1999). Lisäksi isotooppimerkkiaineiden avulla on mahdollista tutkia monenlaista substraattiaineenvaihduntaa yleensä valtimolaskimo- tai mikrodialyysimenetelmiä vähemmän invasiivisesti (Coggan 1999). Proteiiniaineenvaihdunnan tutkimisessa yleisiä menetelmiä ovat olleet isotooppimittausten lisäksi koko kehon proteiinitasapainon mittaaminen typpitaseella ja proteiinien hajoamisen arviointi 3-metyylihistidiinillä (Viru & Viru 2001, 41; Lemon 2001). 3.1 Yleistä isotoopeista ja niiden käytöstä Isotoopilla tarkoitetaan saman alkuaineen atomeja, joilla on sama lukumäärä protoneita, mutta niiden neutronien määrä ja sitä kautta fyysiset ominaisuudet vaihtelevat. Isotooppien kemiallisissa reaktioissa ei ole kuitenkaan eroja, joten niitä voidaan käyttää merkkiaineina fysiologisissa tutkimuksissa. Alkuaineilla esiintyy yksi tai useampia isotooppeja, joiden massaluku on n, n+1, n+2 jne. Yleisimmät stabiilit (pysyvät) isotoopit (esim. 1 H, 12 C, 14 N ja 16 O) kattavat suuren osan ympäristöstämme ja vain pieni osa (0,02-1,1 %) esiintyy muina stabiileina isotooppeina ( 2 H, 13 C, 15 N ja 18 O). Yläindeksi kertoo isotoopin atomimassan. Radioaktiivisien isotooppien esiintyvyys on vieläkin vähäisempää kuin stabiilien isotooppien (Rennie 1999, Wolfe 1992, 1-3). Isotoopeilla leimattuja molekyylejä kutsutaan isotopomeereiksi (Patterson 1997). Nykyään on mahdollista leimata melkein mikä tahansa molekyyli harvinaisilla stabiileilla tai radioaktiivisilla isotoopeilla. Stabiilien isotooppien hyvä puoli on se, että ne eivät ole ionisoivan säteilyn lähde toisin kuin radioaktiiviset isotoopit. Stabiilien isotooppien käyttämisessä ei olekaan mitään tunnettuja fysiologisia haittoja. Useita stabii-

19 18 leilla isotoopeilla leimattuja aineita voidaan infusoida samanaikaisesti, mikä lisää tutkimuksesta saadun informaation määrää. Lisäksi mittausvaiheessa pitoisuudet ja kertymät mittaukset tapahtuvat samanaikaisesti. Hyvä puoli on myös se, että hapen ja typen pitkäkestoisia biologisesti tärkeitä stabiileja isotooppeja on olemassa, mutta ei vastaavia radioaktiivisia isotooppeja. Ongelmana stabiilien isotooppien käytössä on se, että niitä on luontaisestikin jo melko paljon (esimerkiksi 1 % 12 C), mikä aiheuttaa pienen kertymän näytteiden määrityksessä ongelmia. Lisäksi stabiilien isotooppien mittausmenetelmät eivät ole yleensä yhtä tarkkoja kuin radioaktiivisten isotooppien vastaavat. Stabiilit isotoopit ovat myös kalliimpia ja niillä leimattujen molekyylien saatavuus on toistaiseksi heikompaa kuin radioaktiivisten isotooppien, joilla markkinat ovat suuremmat. (Rennie 1999; Wolfe 1992, 1-15.) Tutkimukset stabiileilla isotoopeilla perustuvat oletukseen, että leimatut aineet jäljittelevät merkkaamattomien aineiden liikettä ja aineenvaihduntaa. (Wolfe 1992, ) Yleisimmät isotooppimenetelmät ovat jatkuva infuusio (continous infusion) ja niin sanottu kerta-annoksen -menetelmä (bolus injection) sekä näiden yhdistelmä, jossa annetaan alkuannos, jonka jälkeen aloitetaan jatkuva infuusio. Alkuannoksen avulla voidaan infuusioaikaa lyhentää joissain tapauksissa jopa alle tuntiin. Jatkuvan infuusion menetelmässä leimattua isotooppia (isotopomeeria) infusoidaan alhaisella nopeudella niin kauan, että isotooppia tulee ja poistuu altaasta samalla nopeudella. Tällöin altaaseen tulevat ja sieltä lähtevät sekä itse altaan kertymät, eli merkkiaineen ja luonnolliseen aineen suhteet ovat samoja. (Patterson 1997; Wolfe 1992, 385.) 3.2 Isotooppimääritykset kaasukromatokrafi-massaspektrometrillä Ideaalinen merkkiaine on sellainen, että se on kemialliselta toiminnaltaan identtinen luonnolliseen aineeseen nähden, mutta josta se kuitenkin eroaa jonkin ominaisuutensa perusteella, jotta tarkka määrittäminen mahdollistuu. Stabiileilla isotoopeilla erottava tekijä on massa. Massaspektrometri on paras ratkaisu erottelemaan isotoopit, joilla massat eroavat toisistaan. (Wolfe 1997.) Yleisempiä laitteet isotooppien kertymien määritykseen ovat kaasukromatografi-massaspektrometri (GC/MS) ja isotooppisuhdemassaspektrometri (isotope ratio mass spectrometry, IRMS). Lisäksi ionivalinta monitorointi massaspektrometriä (selected ion

20 19 monitoring mass spectrometry, SIM) ja viime aikoina myös positroni emissio tomografiaa (PET) on käytetty omina menetelminään tai aikaisempien menetelmien tukena tai lisänä. (Patterson ym. 1997; Young ym ) GC/MS on sopiva isotooppianalyyseihin useiden derivatisointi-, kolonni-, ja MS-ionisaatiomahdollisuuksien vuoksi. Lisäetuna on myös analysointiin vaadittava hyvin pieni näytemäärä ( 1 nmol) ja nopea analysointi. Esimerkiksi 4 mg lihasnäytteestä voidaan tehdä 100 analyysia GC/MS:llä. Luotettavat GC/MS:n kertymän mittaukset vaativat, että merkatun aineen suhde luonnolliseen aineeseen (kertymä / TTR) täytyy yleensä olla suurempi kuin 0,5 %. Tämä aiheuttaa joskus ongelmia, koska tällöin vaadittava infuusiomäärä on jo joissain tapauksissa niin suuri, että se jo itsessään voi vaikuttaa kehon toimintaan. IRMS mittaa vastaavasti jopa 0,001-0,1 %:n kertymiä. IRMS:llä pystytään kuitenkin analysoimaan vain puhtaita kaasuja ja siinä näytekoon tulee olla suurempi ( 10 nmol). GC/MS:llä on kuitenkin mahdollista päästä myös suurempiin tarkkuuksiin, eli vaadittava kertymä on vähäisempi leimaamalla useita atomeja ja käyttämällä luontaisesti hyvin vähän kehossa esiintyvää isotopomeeria (TTR = 0,005-0,10 %). (Patterson ym ) Kaasukromatokrafissa (GC) yhdisteet kuten aminohapot erottuvat liikkuvan ja paikallaan pysyvän faasin välityksellä. Kaasukromatografin käytölle vaatimuksena on analysoitavien yhdisteiden kyky höyrystyä ja stabiilius. Tästä syystä ennen määrityksiä GC/MS:llä näytteistä tehdään johdannaisia derivatisoimalla ne. Massaspektrometrissa molekyylit ionisoidaan valitulla menetelmällä, jolloin niitä voidaan kontrolloida jännitteen ja sähkökentän avulla. Ionit värähtelevät tietyllä niiden massa/varaus (m/z) -suhteelle ominaisella taajuudella. Kun halutaan lisätä GC/MS:n herkkyyttä, käytetään lisäapuna SIM-tekniikkaa (Selected Ion Monitoring). SIM-tekniikan avulla massaspektrometrisignaalista saadaan kullekin eri molekyylipainolla esiintyvälle isotoopille omat massa/varaus -suhdepiikit, joiden pinta-alojen avulla voidaan laskea kertymät vertaamalla niitä tunnetuilla standardeilla määritettyihin kertymiin. Vaihtoehtoinen menetelmä määrittää kertymä on massa/varaus -suhdepiikkien pinta-alojen suhteiden laskeminen. (Lahti 2000; Patterson 1997; Wolfe 1992, 37.)

21 Yhden ja monen altaan mallit Suurin osa substraateista on jakautunut fyysisesti selvästi toisistaan erottuviin osastoihin tai altaisiin kuten plasmaan, interstitiaalinesteisiin ja lukuisiin intrasellulaaritiin nesteisiintiloihin (compartment, pool) (Wolfe 1992, 163). Yhden altaan mallissa oletetaan, että luonnollisen aineen (tracee) ilmestyminen (Ra) ja leimatun aineen (tracer) infusointi tai injektio tapahtuvat samaan jatkuvasti tasaisesti vaihtuvaan homogeeniseen altaaseen, kuten plasmaan, josta näyte otetaan (Wolfe 1992, 119). Monen altaan mallissa voidaan laskutoimitukset suorittaa joko allasmallinnuksella (compartmental modeling) tai ei-allasmallinnuksella (non-compartmental modeling. Allasmallinnuksen hyvä puoli yhden altaan mallin ja monen altaan mallin ei-allasmallinnukseen nähden on, että sen avulla voidaan laskea myös nopeusvakioita (rate parameters) altaiden väliselle liikenteelle. Lisäksi Ra voidaan laskea jostain altaasta mistä ei oteta näytettä, jos käytetty malli on siihen kelpoinen. Etuna on myös se, että näytteenottoallasta ei oleteta homogeeniseksi toisin kuin yhden altaan mallissa ja eiallasmallinnuksessa. Allasmallinnuksen laskutoimitukset ovat kuitenkin monimutkaisempia kuin ei-allasmallinnuksen. (Patterson 1997; Wolfe 1992, ) Fysiologisesti suuri osa substraateista ilmestyy ensin intrasellulaarisiin altaisiin ja vasta sitten plasmaan. Ei-allasmallinnuksessa tämä aiheuttaa todellisen Ra:n aliarviointia. Esimerkkinä tällaisesta tilanteesta, jossa tapahtuu aliarviointia on proteiinien hajotus. Intrasellulaarinesteen ja plasman välillä on yleisesti myös interstitiaalitila, josta ei välttämättä näytettä oteta ja näin se aiheuttaa lisäongelmia eri mallien toimivuudelle. Osa substraateista ilmestyy suoraan plasmaan, jolloin myös niiden ei-allasmallinnuksella laskettu Ra kuvaa todellista. Monen altaan mallia käytettäessä on usein suositeltavaa kerätä enemmän näytteitä ja käyttää monia merkkiaineita, joiden avulla voidaan samanaikaisesti monitoroida kehon eri metaboliareittejä. (Patterson 1997; Wolfe 1992, ) Kuviossa 2 näkyy yksinkertaistettu kaaviomainen malli monen altaan systeemistä. Kaaviossa näkyvät altaat ovat erillisiä, kuvaten anatomisia (esim. aivot, maksa ja munuaiset), toiminnallisia (hengitys, verenkierto) tai biokemiallisia (glukoosi, laktaatti ja alaniini) kokonaisuuksia. Ihmisen in vivo -tutkimuksissa näytteenotto rajoittuu usein vain muutamaan altaaseen, kuten vereen ja virtsaan. Aineenvaihdunnan tutkimuksissa kiin-

22 21 nostuksen kohteena on usein kuitenkin tapahtumat elinten ja kudosten tasolla. Joissain tapauksissa informaatiota voidaankin saada halutun alueen katetroinnin avulla. Useassa tapauksessa tämä ei ole kuitenkaan eettisesti hyväksyttävää, joten vaihtoehtoisia keinoja on kehitetty kuvaamaan tapahtumia altaissa joihin ei pääse suoraan käsiksi (suljettu allas). Yleinen lähestymistapa on injektoida tutkittavaa merkkiainetta altaaseen, johon pääsee käsiksi (avoin allas), ja tutkia merkkiaineen laimentumista ottamalla toistuvasti samasta altaasta näytteitä. Näytteiden perusteella voidaan muodostaa merkkiaineen altaaseen laimentumiskäyrä, joka kuvaa leimatun aineen näytteenottoaltaasta ulosvirtauksen ja leimaamattoman aineen näytteenottoaltaaseen sisäänvirtauksen määriä. Näin päästään siis epäsuorasti myös matemaattisen mallinnuksen avulla käsiksi suljettuihin altaisiin. (Bier 1997.) KUVIO 2. Monen altaan systeemi. Kukin allas kuvaa melko homogeenistä, hyvin sekoittunutta osaa systeemistä. Nuolet kuvaavat aineiden liikettä altaiden välillä. Avoin allas tarkoittaa sitä osaa systeemistä, josta näytteenotto tapahtuu eli yleensä laskimoverta. Täytetyt, tyhjät altaat edustavat tutkijalta piilossa olevia osia systeemistä, josta näytteitä ei oteta. Merkkiaine, joka injektoidaan avoimeen altaaseen ja sitten kulkee systeemissä, antaa kuitenkin informaatiota myös näistä piilossa olevista alueista. (mukaeltu Bier 1997.)

23 22 4 LUURANKOLIHAKSEN PROTEIINISYNTEESIN MITTAUSMENETELMÄT LEIMATUILLA AMINOHAPOILLA 4.1 Koko kehon taso Ihmisten luurankolihasten proteiinien synteesin ja hajotuksen säätelyä on mitattu laajasti käyttämällä leimattuja aminohappoja koko kehon tasolla tai valtimo-laskimomallien avulla. Ongelmana näissä menetelmissä on kuitenkin se, että ne eivät mittaa allasta, jossa proteiinien synteesi ja hajotus tapahtuu. Laajimmin käytetty malli on yhden altaan malli, jossa näytteenotto tapahtuu laskimosta tai valtimosta. Tässä mallissa kertymää (merkkiaine/luonnollinen aine), merkkiaineen konsentraatioita ja veren virtausta käytetään hyväksi laskutoimituksissa. Valtimon kertymän käyttö aliarvioi todellisia Ra:n ja Rd:n arvoja ja vastaavasti laskimon kertymä joko ali- tai yliarvioi. (Toffolo ym ) Proteiiniaineenvaihdunnan tutkiminen näin koko kehon tasolla ei ole enää kovinkaan suosittua, koska menetelmän avulla ei saada informaatiota yksittäisten kudosten ja niiden proteiinien tasolla ja lisäksi tutkimustieto on jo koko kehon osalta melko suurta (Wagenmakers 1999). 4.2 Valtimo-laskimoero isotooppileimauksilla Valtimo-laskimoeroisotooppitutkimuksien avulla on saatu paljon tietoa lihasten proteiinien synteesistä ja hajotuksesta. Näissä tutkimuksissa oletuksena yleisesti ottaen on, että valtimo-laskimoero kertoo pääasiassa luurankolihaksen aineenvaihdunnasta. Menetelmässä infusoidaan leimattu aminohappo jatkuvan infuusion menetelmällä alkuannoksella ja steady state -tilassa kerätään useita (vähintään neljä) verinäytteitä sekä valtimo, että laskimoverestä. Luonnollisen aineen nettobalanssi (NB) saadaan kaavasta: NB = (Ca - Cv) * BF, jossa Ca ja Cv ovat konsentraatiot valtimossa (a) ja laskimossa (v) ja BF on veren virtaus. Ei ole olemassa selkeää suositusta siitä, kumpi on suositeltavampi analysointikohde kokoveri vai plasma. Koska ei tiedetä punasolujen roolia aminohappojen aineenvaihdunnassa, on turvallista valita kokoveri. Toisaalta monille aminohapoille vaihtelut

24 23 pitoisuuksissa ja kertymissä ovat pienempiä kun käytetään plasmaa. Merkkiaineen nettobalanssi (nb) saadaan kaavasta: nb = [(Ca * Ea) - (Cv * Ev)] * BF, jossa Ea ja Ev ovat kertymät (merkkiaine / merkkaamaton aine) valtimossa (a) ja laskimossa (v). Yksinkertaisin tapa arvioida proteiinisynteesiä ja hajotusta samanaikaisesti on käyttää aminohappoa, jota ei transaminoida eikä hapeteta lihaksessa. Tällaisen aminohapon kuten fenyylialaniini ollessa kyseessä, Rd kudokseen on yhtä kuin proteiinisynteesi (PS) ja se lasketaan kaavasta: PS = Rd = nb / Ev. Vastaavasti proteiinin hajotus (PB) on yhtä kuin Ra vereen: PB = Ra = Rd - NB. Proteiinisynteesi ja hajotus esitetään µmol/h (ainemäärä n kerrotaan tilavuudella L). Tulos voidaan myös muuttaa muotoon g proteiinia / h ottamalla huomioon käytetyn aminohapon määrä lihaskudoksessa. Suurimmassa osassa valtimo-laskimoeroa hyväksikäyttävissä proteiinisynteesitutkimuksissa käytetty aminohappo on ollut fenyylialaniini, jota ei transaminoida eikä hapeteta lihaksessa, vaan kaikki verestä hävinnyt (Rd) aminohappo käytetään proteiinisynteesiin. Fenyylialaniinin määrä on 3,3 g / 100 g lihaksen proteiinista. Proteiinisynteesin ja hajotuksen lisäksi valtimo-laskimomallissa on mahdollista merkkiaineiden avulla arvioida aminohappojen kuljetusta eri kudoksiin ja sieltä pois. Valtimo-laskimoeromittauksen suuri ongelma on se, että se ei ota huomioon aminohappojen uudelleen hyväksikäyttöä proteiinisynteesiin proteeiinien hajotuksesta, joten proteeiinien synteesiä ja hajotusta aliarvioidaan. (Wagenmakers 1999.) 4.3 Kolmiallasmalli Biolo ym. kehitti ihmisen aminohappokinetiikan ja proteiinien synteesin ja hajotuksen tutkimiseen niin sanotun kolmiallasmenetelmän (Biolo ym a, c). Kolmiallasmalli kuvaa aminohappojen liikettä kolmen eri aminohappoaltaan: valtimon, laskimon ja lihaksen välillä. Kolmiallasmallin avulla saadaan lisätietoa proteiinien synteesin ja hajotuksen (kuviossa 3. PS ja PB) lisäksi myös aminohappojen kulkemisesta plasman ja lihaksen välillä (kuviossa 3. Fat ja Ftv). Menetelmässä otetaan huomioon proteiinien hajotuksesta saatujen aminohappojen käyttö proteiinisynteesiin sekä aminohappojen

25 24 virtaus suoraan valtimosta laskimoon (kuviossa 3. Fav) kulkeutumatta siis valtimosta lihakseen (Wagenmakers 1999). Menetelmä on edistysaskel aikaisempiin menetelmiin nähden (Toffolo ym. 2003) vaikka intrasellulaarisen kertymän määritys onkin epätarkka ja vaihtelu on suurta (Wagenmakers 1999). PS tarkoittaa aminohappojen häviämistä lihaksen intrasellulaaritilasta (proteiinisynteesi + hapetus sekä transaminaatio) ja PB vastaavasti aminohappojen ilmaantumista intrasellulaaritilaan (proteiinien hajoaminen + de novo -synteesi). Esimerkiksi koska fenyylialaniinia ja lysiiniä ei hapeteta lihaksessa, niin näille PS kuvaa pelkästään proteiinisynteesin määrää. Leusiinilla PS kuvaa proteiinisynteesin sekä hapetuksen määrää. Eivälttämättömillä aminohapoilla PB kuvaa proteiinien hajotusta ja de novo -synteesiä ja välttämättömien aminohappojen kohdalla pelkästään proteiinien hajotusta. (Biolo ym. 1995c.) Ei-välttämättömien aminohappojen de novo -synteesiä voidaan arvioida käyttämällä yhtä aikaa aminohappoja joita ei metaboloida lihaksessa (fenyylialaniini ja lysiini) sekä niitä joita metaboloidaan (alaniini ja glutamiini) (Wagenmakers 1999). KUVIO 3. Kolmen altaan malli aminohappokinetiikasta. A = valtimo, V = laskimo, T = lihas, PS = proteiinisynteesi (+hapetus tai transaminaatio) ja PB = proteiinien hajoaminen (+de novo synteesi), Fat = aminohapon kulku valtimosta lihakseen, Ftv lihaksesta laskimoon ja Fav suoraan valtimosta laskimoon. Kolmiallasmallin avulla voidaan laskea kaikki edellä mainitut muuttujat. (mukaeltu Toffolo ym. 2003). Kolmiallasmallia on käytetty useissa R.R. Wolfen tutkimusryhmän tutkimuksissa (Borsheim ym. 2002; Rasmussen ym. 2000; Tipton ym. 1999; Biolo ym. 1997; Biolo ym. 1995a,c) sekä myös muualla (Pitkänen ym. 2003; Nykänen 2001; Forslund 1998). Kolmiallasmallia ei sen sijaan ole käytetty kaikissa uusissa saman tutkimusryhmän tutkimuksissa, joissa on tutkittu proteiinisynteesiä (Borsheim ym. 2003; Miller ym. 2003;