Vasikoista eristettyjen maitohappobakteerien probioottiset ominaisuudet

Transkriptio

1 Vasikoista eristettyjen maitohappobakteerien probioottiset ominaisuudet Ruchama Hovestadt Pro gradu tutkielma RavitsemustiedeTerveystieteiden tiedekunta Itä-Suomen yliopisto

2 ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Terveystieteiden tiedekunta Ravitsemustiede HOVESTADT, RUCHAMA: Vasikoista eristettyjen maitohappobakteerien probioottiset ominaisuudet Pro gradu-tutkielma, 62 s. Ohjaajat: Prof. Atte von Wright ja FT Jenni Korhonen Toukokuu 2016 Avainsanat: Maitohappobakteeri, probiootti, vasikka, vasikkaripuli VASIKOISTA ERISTETTYJEN MAITOHAPPOBAKTEERIEN PROBIOOTTISET OMINAISUUDET Tausta. Maitohappobakteereita käytetään sekä ihmisillä että eläimillä suolistomikrobiston tasapainon säilyttämiseen ja edistämiseen. Vastasyntyneillä vasikoilla vastustuskyky ei ole vielä kehittynyt täysikasvuisen tasolle ja ne ovat erityisen alttiita infektioille. Esimerkiksi vasikkaripuli on monisyinen tauti, jotenvasikoille tarkoitettuihin juomarehuihin olisi hyvä lisätä tutkittuja probiootteja. Suomessa markkinoilta löytyy muutamia probiooteilla täydennettyjä vasikoille tarkoitettuja juomarehuja muun muassa Valiolta, WK Agro Oy:ltä ja Vilomixiltä. Tavoite. Työn tavoitteena on selvittää laboratoriossa tehtävillä in vitro testeillä vasikoiden ulosteesta eristettyjen maitohappobakteerien mahdollisuuksia selviytyä elävänä vasikan suolistokanavasta sekä inhiboida patogeeneja.. Maitohappobakteerien tulisi selviytyä elävänä suolistokanavasta ja antimikrobiset ominaisuudet tukisivat muun muassa vasikkaripulin ehkäisyyn tarkoitetun maitohappobakteerin hyväksymistä probiootiksi. Aineisto ja menetelmät. Tutkimukseen valittiin 57 antibiooteille sensitiivistä maitohappobakteeria, jotka ovat laktobasilleja ja weisselloita. Ensimmäisen vaiheen in vitro testeillä testattiin maitohappobakteerien kasvukykyä +37 ºC:ssa, matalan ph:n sietoa, sappihapporesistenttiyttä ja vasikkaripulia aiheuttavien patogeenien inhibointia. Lopuksi bakteerien DNA sekvensoidaan ja varmistetaan bakteerilajit. Tulokset. 14 hyvin +37 ºC:ssa kasvavaa maitohappobakteeria selvisivät ph- ja sappihappotestistä yli 70 % elinkykyisyysprosentilla. Elinkykyisimmät bakteerit olivat Lactobacillus plantarum ja L. brevis bakteerilajeja. ph- ja sappihappotesteistä selvinneet bakteerit eivät kuitenkaan inhiboineet vasikkaripulia aiheuttavia Escherichia coli ja Salmonella infantis patogeeneja. Johtopäätökset. Tutkimuksessa havaittiin, että on haasteellista löytää maitohappobakteeri, jolla olisi kaikki toivotut probioottiset ominaisuudet. L. plantarum -lajin bakteereilla oli eniten toivottuja ominaisuuksia, joita ovat nopea kasvu +37 C:ssa, ph- ja sappihapporesistenttiys ja antibioottisensitiivisyys. Mikään tutkituista maitohappobakteereista ei kuitenkaan osoittanut antimikrobisia ominaisuuksia patogeenien inhibointitestissä.

3 UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of Health Sciences Nutrition Science HOVESTADT, RUCHAMA: Probiotic properties of lactic acid bacteria isolated from calves Master s thesis, p. 62 Supervisors: Prof. Atte von Wright and PhD Jenni Korhonen May 2016 Key words: Lactic acid bacteria, probiotic, calf, calf diarrhea PROBIOTIC PROPERTIES OF LACTIC ACID BACTERIA ISOLATED FROM CALVES Background. Lactic acid bacteria are used in both humans and animals to promote their intestinal flora balance. In newborn calves intestinal immunity has not yet developed to the level of adult animals, and they are particularly sensitive to infections. For example calf diarrhea is a complex disease. Well characterized probiotics that enhance gut immunity could be added to milk replacers used for calves. In Finland, there are few milk replacers on the market with added probiotics from producers such as Valio, WK Agro Ltd and Vilomix. Aim. The aim is to find out in in vitro assays the ability of lactic acid bacteria isolated from calves feces to survive in calf s intestinal tract and to inhibit pathogens. In order to be approved as probiotics meant for preventing calf s diarrhea, lactic acid bacteria should be able to survive through the intestinal tract and further antimicrobial properties, among other things, would support the approval. Material and methods. 57 antibiotic-sensitive lactic acid bacteria, which were lactobacilli and weissellas, were selected for the study. The first steps in in vitro assays were testing growth ability in +37 ºC and resistance to low ph and bile acids. The ability of lactic acid bacteria to inhibit pathogens that causes diarrhea in calves was also tested in the study.. Finally, the bacterial DNA was sequenced to ensure the identity of bacterial species. Results. Altogether fourteen (n=14) lactic acid bacteria that grew well in +37 ºC survived well also in low ph and were resistant to bile acids. These bacteria were strains from species Lactobacillus plantarum and L. brevis. The bacteria that survived well did not, however, inhibit calf diarrhea caused by pathogenic Escherichia coli and Salmonella infantis. Conclusions. Some strains of L. plantarum bacteria species were found to possess the most of the desirable properties, such as rapid growth at +37 C, ph and bile acid resistance as well as antibiotic sensitivity. However, none of the lactic acid bacteria showed antimicrobial properties in pathogen inhibition tests. It is challenging to find any lactic acid bacteria strain, which expresses all the recommended probiotic characteristics.

4 Sisältö 1. JOHDANTO MAITOHAPPOBAKTEERIT Laktobasillit Weissellat MAITOHAPPOBAKTEERIN HYVÄKSYMINEN PROBIOOTIKSI Identifiointi Turvallisuus Alkuperä ja lajispesifisyys Patogeenisyys Antibioottiresistenttiys Funktionaaliset ominaisuudet Teknologiset ominaisuudet Probiootit juomarehujauheissa Eläinprobiooteille asetetut erityisvaatimukset MAITOHAPPOBAKTEERIEN ROOLI VASIKOILLA Vasikoille tarkoitettuja probiootteja VASIKOIDEN IMMUUNIPUOLUSTUS Vasikkaripulin ehkäisy Vasikkaripulia aiheuttavat mikrobit Vasikkaripulin diagnosointi Suomessa Maitohappobakteerit vasikkaripulin ehkäisyssä TUTKIELMAN TAVOITE MATERIAALIT JA MENETELMÄT Maitohappobakteerien identifiointi Kasvu +37 C Maitohappobakteerien kasvukäyrät Bioscreenilla Gram-värjäys ph-testi Sappihappotesti Patogeenien inhibointi Antibioottisresistenttiys DNA:n sekvensointi DNA:n eristys DNA:n monistus PCR:llä PCR-tuotteen puhdistus... 39

5 8. TULOKSET Kasvu +37 C Gramvärjäys ph-testi Sappihappotesti Patogeenien inhibointi Antibioottiresistenttiys DNA:n sekvensointi POHDINTA Kasvu +37 C ph- ja sappihapporesistenttiys Patogeenien inhibointi Johtopäätökset Lähteet... 57

6 6 1. JOHDANTO Maitohappobakteerit ovat osa terveen vasikan ja lehmän suolistomikrobistoa. Vasikka saa synnytyksen aikana steriiliin suolistoonsa ensimmäiset maitohappobakteerit lehmän synnytyskanavasta. Lehmän ternimaito sisältää myös vasikan vastustuskykyä tukevia maitohappobakteereita, joita vasikka saa imetyksen kautta. Nykyään markkinoilla on erilaisia juomarehujauheita vasikoille, joita käytetään ternimaidon korvikkeena. Jauhe sekoitetaan veteen ja tarjotaan vasikalle maidon tapaan. Maitohappobakteereita sisältäviä juomarehujauheita on markkinoilla jo muutamia. Vasikkaripulin ehkäisyssä saattaa olla apua vasikoille tarjottavista juomarehusta, joihin on lisätty tutkittuja vasikkaripulia ehkäiseviä maitohappobakteereita. Maitohappobakteerien tutkiminen on pitkä prosessi ja positiivisten vaikutusten lisäksi on tunnistettava bakteeri ja varmistuttava bakteerin turvallisuudesta ja alkuperästä sekä katsottava selviytyykö bakteeri elävänä suolistokanavan alkuosan läpi. Aluksi tehdään testejä laboratoriossa ja myöhemmin, jos kanta on läpäissyt testit, siirrytään eläinkokeisiin. Tämän tutkimuksen tarkoituksena on selvittää 57 vasikan ulosteesta eristetyn antibioottisensitiivisen maitohappobakteerin kasvukykyä +37 ºC:ssa, ph- ja sappihapporesistenttiyttä sekä kykyä inhiboida vasikkaripulia aiheuttavia patogeeneja.

7 7 2. MAITOHAPPOBAKTEERIT Maitohappobakteerit ovat käymisreaktion seurauksena maitohappoa tuottavia bakteereita (Bomba ym. 2012). Tuotettu maitohappo alentaa ympäristön ph:ta. Maitohappobakteerit luokitellaan Firmicutes pääjaksoon, Bacilli luokkaan ja Lactobacillales lahkoon (Holzapfel ja Wood 2014). Bakteerit ovat sopivassa ympäristössä jakautumalla lisääntyviä yksisoluisia pieneliöitä (Evira 2015, Yleistä mikrobeista). Kasvuolosuhdevaatimukset muun muassa kosteuden, lämpötilan ja happamuuden mukaan vaihtelevat bakteerilajeittain. Parhaiten bakteerit viihtyvät kosteissa olosuhteissa ja neutraalissa ph:ssa 6-8. Lämpötilan suhteen eri bakteerilajeilla voi olla paljon eroavaisuuksia. Siksi bakteereita on luokiteltu kolmeen eri kasvulämpötilaryhmään; psykotrofiseen, mesofiiliseen ja termofiiliseen. Maitohappobakteereita löytyy sekä ihmisiltä että eläimiltä suolistosta ja niitä käytetään suolistomikrobiston tasapainon säilyttämiseen ja edistämiseen (Maldonado ym. 2012). 2.1 Laktobasillit Laktobasillit ovat gram-positiivisia, happea sietäviä, sauvan muotoisia, yleensä itiöimättömiä ja katalaasi-negatiivisia maitohappobakteereita (Felis ja Pot 2014). Laktobasilleja löytyy ravinnepitoisesta ja erityisesti hiilihydraattirikkaasta ympäristöstä, kuten ruoasta, maaperästä, vedestä ja jätevedestä. Maito-, liha-, vilja- ja kalatuotteet sekä erilaiset happamat elintarvikkeet, kuten hapankaali ja säilykevihannekset ovat yleisiä ruokia, joissa on laktobasilleja joko luonnostaan tai lisättynä. Laktobasilleista suurin osa on homofermentatiivisia, eli ne tuottavat käymisreaktiossa heksoosisokereista maitohappoa. Muutamat lajit ovat heterofermentatiivisia ja tuottavat lopputuotteena maitohapon lisäksi etanolia. Muita mahdollisia käymisreaktion sivutuotteita ovat asetaatti, hiilidioksidi, muurahaishappo ja meripihkahappo (Felis ja Pot 2014). Laktobasillien pääjakso, luokka, lahko, heimo ja suku on esitetty kuvassa 1. Laktobasilleja on yli 160 eri lajia (Felis ja Pot 2014). Nykyään bakteerilajien tunnistaminen on edistynyt ja uusia lajeja tulee lisää sekä vanhoja lajeja arvioidaan ja saatetaan luokitella uudelleen (Barrangou ym. 2012). Yleisiä tunnettuja laktobasilleja ovat Lactobacillus casei, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. plantarum, L. rhamnosus, L. salivarius ja L. acidophilus. Niitä käytetään ruoan ja rehun fermentointiin ja probioottilisänä sekä ihmisille että eläimille.

8 8 Firmicutes Pääjakso Bacilli Luokka Lactobacillales Lahko Lactobacillales Heimo Lactobacillus Suku Kuva 1. Laktobasillien pääjakso, luokka, lahko, heimo ja suku. 2.2 Weissellat Weissellat ovat gram-positiivisia, fakultatiivisesti anaerobisia, lyhyen sauvan muotoisia, itiöimättömiä ja heterofermentatiivisia maitohappobakteereita (Huys ym. 2012). Weisselloiden taksonomia on esitetty kuvassa 2. Weissellat kuuluvat Leuconostocaceae heimon alle, joka on evolutiivisesti lähellä laktobasilleja (Endo ym. 2014). Heterofermentatiiviset laktobakillukset ja weissellat eroavat muun muassa solun muodon ja hapen siedon suhteen. Heterofermentatiiviset laktobasillit ovat pääasiassa sauvan muotoisia, kun weissellat puolestaan ovat lyhyitä sauvoja tai kokkeja. Happi saattaa inhiboida heterofermentatiivisten laktobasillien kasvua, mutta weisselloiden kasvuun happi ei vaikuta. Firmicutes Pääjakso Bacilli Luokka Lactobacillales Lahko Leuconostocaceae Heimo Weissella Suku Kuva 2. Weisselloiden pääjakso, luokka, lahko, heimo ja suku.

9 9 3. MAITOHAPPOBAKTEERIN HYVÄKSYMINEN PROBIOOTIKSI Probiootti on tarkasti määritelty, elävä ja turvallinen mikro-organismi, joka riittävissä määrin käytettynä edistää käyttäjän terveyttä. Yleisesti käytettyjä probiootteja löytyy muun muassa laktobasilleista, streptokokeista, enterokokeista, bifidobakteereista ja propionibakteereista (Bomba ym. 2012). Useat probiootteina käytettävät maitohappobakteerit ovat saaneet FDA:n (American Food and Drug Administration) GRAS statuksen (Generally Recognized as Safe). GRAS statuksen saannissa otetaan huomioon mikro-organismin käyttökohde. QPS (Qualified Presumption of Safety) on Euroopan Unionissa EFSA:n (European Food Safety Autrhority) yleinen riskin arviointi menettely (Leuschner ym. 2010). QPS-listalle pääsevien mikro-organismien arvioinnissa huomioidaan taksonomia, käyttöhistoria, kirjallisuusnäyttö, kliininen näkemys, teolliset sovellukset, ekologia ja turvallisuuskysymykset. Lisäksi QPS-listalla olevia mikroorganismeja saa käyttää vain arvioidulla käyttökohteella. Lista päivitetään vuosittain ja mikroorganismit arvioidaan kantakohtaisesti. Eri probiootit tuottavat käyttäjälle erilaisia vasteita (Antoine 2012). Lisäksi probioottikanta voi muiden kantojen kanssa yhdessä nautittuna tuottaa erilaisen vasteen, kuin yksin nautittuna. Tämän vuoksi maitohappobakteerit tulee testata juuri käytettävässä muodossa ja käytettävällä kohteella. Positiivisen vaikutuksen aikaansaamiseksi on probiootteja nautittava päivittäin ja usein käytön lopettamisen jälkeen vaikutus loppuu. Maitohappobakteerien matka probiootiksi on pitkä (kuva 3) ja kallis. Siihen kuuluu bakteerikannan fenotyypin ja genotyypin selvittäminen, funktionaalisten ominaisuuksien selvittäminen ja turvallisuuden testaus. Aluksi tehdään laboratoriossa in vitro -testejä ja myöhemmin, jos kanta on läpäissyt in vitro -testit, siirrytään spesifisiin eläimellä ja mahdollisesti ihmisellä suoritettaviin in vivo -testeihin.

10 10 Kuva 3. Ohjeet elintarvikkeisiin lisättävien probioottein arviointiin. (FAO/WHO Working Group Report 2002, käännetty/muokattu). 3.1 Identifiointi Bakteerin fenotyyppi ja genotyyppi täytyy identifioida ja näin selvittää bakteerin laji sekä kanta, sillä bakteerin vaikutukset ovat kantaspesifisiä (FAO/WHO Working Group Report 2002). Genomi koostuu mitokondrionaalisesta ja nukleaarisesta DNA:sta, jota voidaan hyödyntää bakteerin genotyypin tunnistuksessa genomin rakenteellisten erojen perusteella. PCR on polymeraasiketjureaktio, jolla voidaan monistaa DNA:ta. DNA:n monistus mahdollistaa genomin sekvensoinnin molekyylitekniikkaa hyödyntävillä menetelmillä.

11 11 Sekvensointi on nukleotidijärjestyksen selvittämistä halutusta DNA-pätkästä. RNA:ta voidaan myös sekvensoida. RNA:n sekvensoinnissa RNA katkaistaan lyhyiksi jaksoiksi ja muutetaan käänteisellä transkriptiolla DNA:ksi, jota voidaan sekvensoida samalla tavalla kuin DNA:ta. Bakteerilajin genotyyppiä selvitettäessä FAO/WHO:n työryhmän 2002 raportissa suositellaan DNA-DNA hybridisointia ja 16S rrna sekvensointia. Bakteerikannan selvittämiseen suositellaan molekyylitekniikkaa hyödyntäviä PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) ja RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) menetelmiä. 3.2 Turvallisuus Turvallisuuden selvittäminen on tärkeä kohta maitohappobakteerien matkassa probiootiksi. Bakteerin turvallisuuden testaukseen kuuluu alkuperän selvittäminen, patogeenitestit ja antibioottiresistenttiystestit (Saarela ym. 2000). Tulevaisuudessa probioottien kohdalla tullaan todennäköisesti vaatimaan koko genomin sekvensointia, koska näin saadaan maksimoitua ja helpotettua uusien probioottien turvallisuuden kartoittamista (Zhang ym. 2012). Maitohappobakteerin turvallisuuden testauksessa koko genomista nähdään esimerkiksi toksiineja tai punasoluja hajottavia proteiineja ja lipidejä koodaavia geenejä. Koko genomin sekvensointi ei kuitenkaan poista in vitro -testien, eläinkokeiden ja ihmisillä suoritettavien tutkimusten tärkeyttä, koska osa geeneistä voi pysyä hiljaisina, jolloin RNA-polymeraasi ei pysty sitoutumaan geeniin ja transkriptiota ei tapahdu. Näin haitallisia ominaisuuksia ei näe genomin sekvenssistä Alkuperä ja lajispesifisyys Maitohappobakteerin alkuperä on selvitettävä, eli mistä bakteeri on eristetty (Saarela ym. 2000). Esimerkiksi sairaasta suolistosta eristetyt maitohappobakteerit voivat olla riski. Parhaiten ja turvallisimmin bakteerit toimivat alkuperäisessä ympäristössään. Ihmisistä eristetyt maitohappobakteerit toimivat ihmisillä ja vasikasta eristetyt maitohappobakteerit vasikoilla.

12 Patogeenisyys On tärkeää, että probiootti ei aiheuta infektioita tai tuota toksiineja (Donohue ja Gueimonde 2012). Patogeenisuuteen vaikuttaa bakteerin lisäksi myös isäntä, jos bakteeri on opportunisti. Isännän heikentynyt immuunipuolustus antaa opportunistille mahdollisuuden aiheuttaa infektion. Laktobasillien ajatellaan yleisesti olevan vain harvoin patogeeneja tai opportunisteja. Uuden maitohappobakteerikannan tulisi osoittaa ei-patogeenisyytensä useammassa kuin yhdessä tutkimuksessa (Saarela ym. 2000) Antibioottiresistenttiys Probiootti ei saa kantaa liikkuvaa antibioottiresistenttiyttä sisältävää geeniä. Jos eläinten rehuun lisättävissä probioottilisissä on resistenttiyttä ilmentäviä geenejä, niin antibioottiresistenttiys voi levitä rehun välityksellä eläimeen ja siitä ihmiseen eläimestä peräisin olevan ruoan tai juoman välityksellä (EFSA Journal 2012). Antibioottiresistenttiys on testattava EFSA:n ohjeen mukaan seuraavilla antibiooteilla: ampisilliini, vankomysiini, gentamysiini, kanamysiini, streptomysiini, erytromysiini, klindamysiini, tetrasykliini ja kloramfenikoli (EFSA Journal 2012). EFSA on määritellyt antibiootille lajikohtaiset tutkimusdataan perustuvat pienimmät sallitut raja-arvot, jolla antibioottiresistenttiyttä saa esiintyä (taulukko 1). Bakteeri määritellään antibiootille resistentiksi, mikäli se selviytyy raja-arvon ylittävästä pitoisuudesta kyseistä antibioottia. Antibioottiresistenttiystestit on tehtävä kansainvälisten standardien mukaisesti. ISO 10932:2010 standardi on kansainvälisesti hyväksytty ohje bifidobakteerien ja muiden maitohappobakteerien antibioottiresistenttiyksien testaukseen, pois lukien enterokokit.

13

14 14 Taulukko 1. EFSA:n vaatimat lajispesifiset antibioottiresistenttiyksien raja-arvot eli MIC (minimum inhibitory concentration = pienin pitoisuus antibioottia, joka estää bakteerin kasvun) (mg/ml). (EFSA Journal 2012, käännetty). Ampisilliini Vankomysiini Gentamysiini Kanamysiini Streptomysiini Erytromysiini Clindamysiini Tetrasykliini Lactobacillus (oblikaatti homo fermentatiivinen) Lactobacillus acidophilus Lactobacillus (oblikaatti hetero fermentatiivinen) Lactobacillus reuteri Lactobacillus (fakultatiivi hetero fermentatiivinen) Lactobacillus plantarum/ pentosus Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus casei/ paracasei Bifidobacterium Pediococcus Leuconostoc Lactococcus lactis Streptococcus thermophilus Bacillus spp Propionibacterium ,5 0, Muut Gram ,5 0, Enterococcus faecium Escherichia coli Kloramfenicol

15 15 Antibioottiresistenttiyksissä on myös poikkeuksia (kuva 4). Jos antibioottiresistenttiys on jo maitohappobakteerilla itsessään alun perin ollut olemassa, voidaan se vielä hyväksyä probiootiksi. Jos siis antibioottiresistenttiys on syntynyt geneettisen mutaation seurauksena ilman resistenttiyttä aiheuttavan antibiootin läsnäoloa, hyväksytään se EFSA:n mukaan. Esimerkiksi laktobasilleja esiintyy laajasti synnynnäistä antibioottiresistenttiyttä. Charteris ym. 1998a tutkimuksessa ihmisistä ja maitotuotteista eristetyt 46 Lactobacillus kantaa olivat 14 eri antibiootille resistenttejä. EFSA:n vaatimista antibiooteista resistenttiyttä esiintyi gentamysiinille, kanamysiinille ja streptomysiinille.

16 16 Kuva 4. Antibioottiresistenttiyden hyväksyminen, jos pienin hyväksytty raja-arvo MIC (mimimal inhibitory concentration) ylittyy. (EFSA Journal 2012, käännetty/muokattu). 3.3 Funktionaaliset ominaisuudet Probioottien funktionaalisiin ominaisuuksiin kuuluvat suolisto-olosuhteista selviytyminen sekä hyödylliset probioottiset ominaisuudet (Saarela ym. 2000; EFSA Journal 2012). +37 C lämpötila, mahalaukun alhainen ph, ohutsuolen alkuosasta erittyvät sappihapot ja kilpailevat bakteerit luovat haasteita maitohappobakteerien selviytymiseen elinkykyisinä. Kiinnittyminen epiteelisolun pintaan sekä kolonisoituminen ovat myös olennaisia probioottisia ominaisuuksia. Hyödyllisiä probioottisia ominaisuuksia ovat lisäksi antimutageenisyys ja antikarsinogeenisyys, immuunipuolustuksen vahvistaminen, vasta-aineiden tuottaminen ja patogeenien inhibointi. Antimikrobiset ominaisuudet kuuluvat probioottisiin ominaisuuksiin, mutta eivät ole välttämättömiä (Birri ym. 2013). Antimikrobisuus johtuu useimmiten bakteriosiineista, jotka ovat ribosomaalisesti tuotettuja peptidejä tai proteiineja. Muita bakteerien tuottamia aineita, joilla on antimikrobisia ominaisuuksia, voivat olla jotkin orgaaniset hapot ja aineenvaihduntatuotteet, vetyperoksidi, antifungaaliset yhdisteet ym. (Fontana ym. 2012). Maitohappobakteerin antimikrobista ominaisuutta testataan aluksi laboratoriossa patogeenien inhibointitestillä. Antimikrobisuutta voidaan testata esimerkiksi mittaamalla maitohappobakteerin ympärille syntyvän estokehän laajuutta alustalla, jossa kasvaa patogeenia. Patogeenin inhibointi voi vaihdella bakteerilajin sisällä, joten inhibointikyky on kantaspesifinen. Maitohappobakteerien kykyä inhiboida patogeeneja testataan käyttötarkoituksen mukaan. Esimerkiksi vasikkaripulin ehkäisyyn tarkoitettujen maitohappobakteerien antimikrobisia ominaisuuksia testataan vasikkaripulia aiheuttavilla patogeeneilla. Muun muassa Escherichia coli ja Salmonella aiheuttavat vasikkaripulia (Millemann 2009). 3.4 Teknologiset ominaisuudet

17 17 Ei riitä, että maitohappobakteeri selviytyy suolisto-olosuhteista, sen on selviydyttävä myös ympäristössä, johon se lisätään, kuten vasikoiden juomarehujauheessa ja veteen sekoitetussa juomassa (Saarela ym. 2002). Suolisto ja juomajauhe sekä nesteeseen sekoitettu valmis juoma ovat hyvin erilaisia ympäristöjä. Rajuja muutoksia tapahtuu muun muassa lämpötilassa, ravinteissa, happipitoisuudessa ja muiden mikrobien määrissä (Antoine 2012). Teollisuuden käsittely suuressa mittakaavassa sekä varastointiaika luovat haasteita bakteerien elossa pysymiseen (Gomes ym. 2011). Jotkut maitohappobakteerit voivat jatkaa kasvua tuotteessa, johon ne on lisätty ja voivat tuottaa makuun, aromiin ja rakenteeseen vaikuttavia sivuaineita. Maitohappobakteerikannoilla täydennetyn lopputuotteen ph, hapettumis- ja pelkistymisaste, mikrobeita inhiboivat aineet, säilytyslämpötila ja bakteereille kelpaavien ravinteiden puute muun muassa vaikuttavat bakteerien selviytymiseen (Gomes ym. 2011) Probiootit juomarehujauheissa Maito kuivataan maitojauheeksi kylmäkuivaamalla tai spraykuivaamalla, mikä on bakteereille haastavaa (Saarela ym. 2002). Maito on kuitenkin ravintorikas ympäristö bakteereille. Maidon sisältämä heraproteiini voi auttaa bakteereita selviytymään suoliston happaman alkuosan läpi, sillä hera nostaa ph:ta ja toimii puskurina. Lisäksi heraproteiini inhiboi proteiineja pilkkovia ruoansulatusentsyymejä, minkä arvellaan Charteris ym tutkimuksessa myös suojaavan bakteereita mahalaukun läpäisyssä. Charteris ym. 1998b tutkimuksessa 14 maitohappobakteeria 15:sta laktobasilli- ja bifidobakteerilajeista menettivät in vitro simuloidussa mahanesteessä (ph 2) kolmen tunnin aikana yli 90 % elinkykyisyydestään. Lisättäessä maidon heraproteiinia, yksi laktobasilli ja yksi bifidobakteeri lisäksi selviytyivät mahanesteestä 100 %:lla elinkykyisyydellä. 3.5 Eläinprobiooteille asetetut erityisvaatimukset Maitohappobakteereita on ollut luonnostaan jo pitkään rehussa, vaikka niitä ei ole määritelty (von Wright 2012). Rehujen lisäaineiden hyväksymismenettely on yhteinen koko Euroopan Unionille. Komission direktiivissä 1831/2003/EY vaaditaan, että rehuun lisättävistä lisäaineista

18 18 on selvitettävä tehokkuuden lisäksi turvallisuus eläimille, ihmisille ja ympäristölle. Komission direktiivissä 93/113/EY on selvitetty tarkemmin rehuihin lisättyjen mikro-organismien käyttöön ja markkinoille saattamiseen liittyviä seikkoja. Uusien lisäaineiden on käytävä läpi lupaselvitys, sillä ainoastaan luvan saaneet lisäaineet sallitaan markkinoilla. Eläinten rehuun lisättävät lisäaineet on luokiteltu taulukossa 2. Eniten lisäaineita luokitellaan luokkiin 1. Teknologiset lisäaineet ja 4. Eläinteknologiset lisäaineet. Rehuun lisättävät mikro-organismit kuuluvat teknologisiin tai eläinteknologisiin lisäaineisiin käyttötarkoituksesta riippuen. Rehun pilaantumista hidastavat ja säilörehun valmistukseen tarkoitetut mikro-organismit luokitellaan teknologisiin lisäaineisiin. Eläinprobiootit luokitellaan eläinteknologisiin lisäaineisiin, sillä niiden tarkoitus on edistää eläimen terveyttä vaikuttamalla positiivisesti suolistomikrobistoon. Taulukko 2. Eläinten rehuun lisättävien lisäaineiden luokittelu EU:ssa. (Komission direktiivi 1831/2003/EY). Lisäaineluokka Esimerkkejä 1. Teknologiset lisäaineet Säilöntäaineet, antioksidantit, emulgointiaineet, stabilointiaineet, happamuudensäätöaineet, säilörehun lisäaineet 2. Sensoriset lisäaineet Aromiaineet, väriaineet 3. Ravitsemukselliset lisäaineet Vitamiinit, mineraalit, aminohapot, hivenaineet 4. Eläintuotantoon vaikuttavat Ruuansulatusta edistävät yhdisteet, suolistoflooran lisäaineet stabiloivat yhdisteet 5. Kokkidiostaatit ja histomonostaatit -

19 19 4. MAITOHAPPOBAKTEERIEN ROOLI VASIKOILLA Maitohappobakteereita löytyy märehtijöillä yleisesti suolistosta, limakalvoilta ja iholta. Vasikat saavat lehmän synnytyskanavasta nielemällä maitohappobakteereita, joilla on merkittävä rooli suolistomikrobiston kehittymisessä (Maldonado ym. 2012). Myöhemmin maitohappobakteereita saadaan imetyksen kautta ja ympäristöstä. Kasveissa ja maaperässä on maitohappobakteereita, joita märehtijät nielevät kasvissyöjinä (Barrangou ym. 2012; Endo ym. 2010). Terve suolistofloora on yksi tärkeimmistä terveyden merkeistä nuorilla eläimillä (Agazzi ym. 2014). Hyvät suolistobakteerit kilpailevat patogeenien kanssa tilasta suolenseinämässä ja auttavat luomaan esteen, jolloin patogeenien kiinnittyminen suolen epiteelisoluihin heikkenee ja patogeenien sekä toksiinien pääsy limakalvonalaiskudokseen vaikeutuu (Maldonado ym. 2012). Tämä ehkäisee infektioita, kuten vasikkaripulia, ja vahvistaa immuunipuolustusta. Maitohappobakteereita voisi käyttää enemmän infektioiden ennaltaehkäisyyn, jolloin antibioottien käyttö sekä antibiooteille resistenttien bakteerien määrät vähenisivät (Signorini ym. 2012). Hyvät suolistomikrobit myös edesauttavat vasikoiden ruoansulatusta (Maldonado ym. 2012, Timmerman ym. 2005). Tämä tehostaa ravintoaineiden imeytymistä ja vasikoiden kasvua sekä kehitystä. Timmerman ym ja Gilliland ym tutkimuksissa on havaittu, että lajispesifisyydellä on merkitystä maitohappobakteerien kolonisoitumisessa suolen seinämään.. Vasikan ulosteesta eristetyt maitohappobakteerikannat kolonisoituivat vasikoiden suolen seinämään tehokkaammin ja pienemmillä annoksilla, kuin muista lähteistä eristetyt kannat. Suurin osa vasikan suoliston maitohappobakteereista on laktobasilleja ja streptokokkeja (Busconi ym. 2008). Ripamonti ym tutkimuksessa eristettiin 45 vastasyntyneen vasikan ulosteesta 145 eri maitohappobakteeria. Maitohappobakteereita oli eniten Bifidobacterium longum, Streptococcus bovis, Streptococcus macedonicus ja Lactobacillus animalis lajeista. Laktobasilleja eniten oli L. animalis, L. paracasei ssp. paracasei, L. salivarius ssp. salicinius, L. ruminis, L. fermentum ja L. reuteri lajeista. Busconi ym tutkimuksessa vasikan suolistossa laktobasilleja eniten oli L. mucosae lajia.

20 Vasikoille tarkoitettuja probiootteja Nykyään ovat yleistyneet vasikoilla käytettävät juomarehujauheet ja tärkeää olisi saada jauheisiin vasikoiden suolistomikrobistoa vahvistavia tutkittuja maitohappobakteereita eli probiootteja. Vastustuskyvyn vahvistus ja tautien ehkäisy on hyvä vaihtoehto antibioottien liialliselle käytölle. Suomen markkinoilla on jo muutamia juomarehujauheita probiooteilla varustettuna. Valiolla on valikoimassaan Startti Maitohappobakteeri Proplus, Startti Maito Instant ja Startti Auto juomarehut, jotka sisältävät Enterococcus faecium ja Lactobacillus rhamnosus probiootteja. Vilomixiltä löytyy vasikoille tarkoitettu Lactolus juomarehu, johon on lisätty erikseen mainitsemattomia probiootteja. WK Agro Oy:ltä löytyy Enterococcus faecium, Bacillus licheniformis ja Bacillus subtilis probiooteilla täydennettyä AgroMilk juomarehua.

21 21 5. VASIKOIDEN IMMUUNIPUOLUSTUS Vasikoiden altistumiseen muun muassa ripulille ja hengitystieinfektioille ja sitä kautta kuolemille ovat osallisena monet tekijät (Maldonado ym. 2012; Timmerman ym. 2005; Yongil Cho ja Kyoung-Jin 2014). Patogeenien lisäksi vaikuttavat ympäristö, sää- sekä tuotantoolosuhteet, stressi, ravitsemustila ja vastustuskyky (Klein-Jöbstl ym. 2014; Signorini ym. 2012; Millemann 2009). Vasikoiden kuolemat tuovat kustannuksia maitotiloille. Vastasyntyneillä vasikoilla suolistomikrobisto ja immuunipuolustus ei ole vielä täysin kehittynyt ja nämä altistuvat herkemmin erilaisille taudeille ja heikentyneelle ruoansulatukselle (Maldonado ym. 2012). Stressaavia tilanteita aiheuttavat paikasta toiseen siirtely, kauppaus, varhainen emästä vieroitus ja nopea kiinteään ravintoon siirtyminen (Ripamonti ym. 2011). Klein-Jöbstl ym tapaus-verrokki tutkimuksessa verrattiin keskenään maitotiloja, joissa esiintyi ja ei esiintynyt vasikkaripulia. Eniten vasikkaripuliriskiä lisäsi suurempi tilan koko, muiden eläinten pito samalla tilalla ja hengitystietautien esiintyvyys. Ripulia esiintyi suuremmilla keskimäärin 40 lehmän tiloilla, kun pienemmillä, keskimäärin 28 lehmän tiloilla, ei esiintynyt ripulia. Tilastollisesti merkitsevää vaikutusta oli myös vasikan poikimisympäristön ja karsinan olosuhteilla ja puhtaana pidolla. Sisällä navetassa pidetyillä vasikoilla esiintyi hieman enemmän vasikkaripulia ulkona pidettyihin verrattuna. Vieroitusaika oli tapaus- ja verrokkitiloilla lähes sama. Vasikkaripulia esiintyneillä tiloilla vasikat vieroitettiin keskimäärin kymmenen viikon ikäisinä ja verrokkitiloilla keskimäärin yhdeksän viikon ikäisinä. Ennen vieroitusta vain 6/100 tilaa käyttivät juomarehuja vasikoiden ruokinnassa. Poikiminen tulisi tapahtua erillisessä, puhtaassa ja kuivassa tilassa ja vastasyntyneen vasikan kuivaamisesta tulisi huolehtia (Eläinten terveys ETT Ry 2010, Terveydenhoitosuunnitelmatoimenpiteet ripuliongelmatilalla). Poikimisen jälkeen vasikka pitää siirtää omaan puhtaaseen, kuivaan ja vedottomaan karsinaan vuorokauden ikään saakka, minkä jälkeen terve vasikka voidaan siirtää pieneen ryhmään ikäistensä lajitovereiden seuraan (Eläinten terveys ETT Ry 2010, Vasikan hoidon ABC). Kriittisimmät ajat vasikkaripulin kannalta ovat heti ensimmäiset päivät syntymän jälkeen (Bomba ym. 2012). Vasikoiden vastustuskyvylle ihanteellista olisi antaa niiden juoda 3-4 litraa emän ternimaitoa ensimmäisen kuuden tunnin aikana syntymän jälkeen (Yong-il ja Kyoung-Jin 2014) ja yhteensä % vasikan painon

22 22 verran litroja ensimmäisen vuorokauden aikana (Eläinten terveys ETT Ry 2010, Vasikan hoidon ABC). Ternimaito sisältää paljon kaikkea mitä vasikka tarvitsee, kuten vasta-aineita, immuunijärjestelmän soluja ja ravintoaineita (Yong-il ja Kyoung-Jin 2014). Klein-Jöbstl ym tutkimuksessa tapaus- ja verrokkitiloista 99/100 annettiin vastasyntyneelle vasikalle ternimaitoa kuuden tunnin sisällä syntymästä. 5.1 Vasikkaripulin ehkäisy Vasikkaripulia aiheuttavat mikrobit Bakteereista Escherichia coli (enterotoksinen E. coli, enteropatogeeninen E. coli ja enterohemorraaginen E. coli), Salmonella (S. typhimurium ja S. dublin), Clostridium perfringens ja kampylobakteeri aiheuttavat vasikkaripulia ja ripuli leviää usein sairaan vasikan ulosteen kautta terveen vasikan suuhun (Millemann 2009; Yong-il ja Kyoung-Jin 2014). Yleisimpiä vasikkaripulia aiheuttavia bakteereita ovat enterotoksinen E. coli ja salmonellat. Viruksista ripulia aiheuttavat suolistossa viihtyvät rotavirukset ja koronavirukset. Yksisoluisista alkueläimistä kokkideihin kuuluvien kryptosporidien ja eimerien on havaittu myös aiheuttavan suolistokanavan sairauksia vastasyntyneillä vasikoilla (Bangoura ym. 2011; Yong-il ja Kyoung-Jin 2014). Kokkidit ovat muodoltaan paksukuorisia ookystia, jotka voivat ulosteen välityksellä levitä muihin eläimiin tai ihmisiin. Ookystat kestävät hyvin kuumuutta, kosteutta ja useita desinfiointiaineita. Kryptosporeista Cryptosporidium parvum, C. bovis, C. ryanae ja C. andersoni infektoivat erityisesti lehmiä. Eimerioista Eimeria bovis ja E. zuernii ovat maitotiloilla tavattavia patogeeneja, joista Eimeria zuernii on erityisesti yhdistetty vastasyntyneen vasikan ripuliin. Klockiewicz ym mukaan eimerioita esiintyy eniten suurilla tuotantotiloilla Vasikkaripulin diagnosointi Suomessa Suomessa vasikkaripulista otettavat näytteet on esitetty taulukossa 3. Ripulin aiheuttama dehydraatio ja asidoosi voivat heikentää hyvin nopeasti vasikan tilan kriittiseksi ja sen vuoksi

23 23 nopea diagnoosi on tärkeä. Patogeenisten bakteerien ja virusten tunnistuksessa nukleiinihappojen käsittelyyn perustuvat tekniikat, kuten taulukossa 3 esitetyt Eviran käyttämät PCR ja vasta-aineen käyttöön perustuva ag-elisa, ovat nopeita. Taulukko 3. Vasikkaripulitapauksissa otettavat näytteet Suomessa. (Evira 2015, Vasikkaripuli). Ikä Näyte Tutkimukset Alle 1 viikko 5 yksilöulostenäytettä Enterotoksinen E. coli (PCR) ja herkkyysmääritys Rotavirus (ag-elisa) Koronavirus (ag-elisa) Kryptosporidit (värjäys, lajimääritys) Salmonella (viljely) 1-5 viikkoa 5 yksilöulostenäytettä Rotavirus (ag-elisa) Koronavirus (ag-elisa) Kryptosporidit (värjäys, lajimääritys) Salmonella (viljely) Eimeria -kokkidit ja mahasuolistoloisten munat (McMaster, > 3 vkon ikäiset) Yli 5 viikkoa 5 yksilöulostenäytettä Salmonella (viljely) Eimeria -kokkidit ja mahasuolistoloisten munat (McMaster) Maitohappobakteerit vasikkaripulin ehkäisyssä Ennen vierottamista vasikat ovat erittäin alttiita infektioille ja maitohappobakteerien käytöllä voi ehkäistä infektioita pitämällä yllä mikrobiflooran tasapainoa (Signorini ym. 2012). Maldonado ym tutkimuksessa kuvataan maitohappobakteerien ja enteropatogeenisten bakteerien suhteiden muuttumista vasikan kasvaessa (kuva 5). Bakteerit on eristetty 42 terveen 0-4 kuukauden ikäisen vasikan ulosteesta. Kahden ensimmäisen kuukauden aikana suolistobakteeristo on vasta kehittymässä ja maitohappobakteerien määrä kasvaa ensimmäisen kuukauden aikana. Toisesta kuukaudesta eteenpäin maitohappobakteerien ja enterobakteerien määrä alkaa vakiintua. Olisi siis tärkeää vaikuttaa vasikan suolistomikrobistoon ja vasikkaripulin ehkäisyyn heti syntymän jälkeen.

24 24 Kuva 5. Vasikoiden suolistomikrobiston maitohappobakteerien (tumman harmaa pylväs), enterobakteerien (musta pylväs) ja mesofiilisten bakteerien (vaalean harmaa pylväs) kehitys. (Maldonado ym. 2012) Signorini ym meta-analyysissä käytettiin satunnaiskontrolloituja tutkimuksia, joissa tutkittiin alle 10 päivän ikäisiä terveitä vasikoita. Tarkastelluissa tutkimuksissa vasikoille syötettiin erilaisiin maitoihin lisättyjä erilaisia maitohappobakteereita ja niiden yhdistelmiä ja katsottiin väheneekö vasikkaripulin esiintyvyys merkittävästi ja muuttuuko maitohappobakteerien ja E. coli bakteerien suhde vasikoiden ulostenäytteissä. Erityisesti täysmaitoon lisätyt probiootit vähensivät vasikkaripulia. Gilliland ym tutkimus puolsi myös täysmaitoon lisättyjen probioottien vasikkaripulia vähentävää vaikutusta. Signorini ym meta-analyysissä havaittiin myös, että monta kantaa sisältävät probioottilisät toimivat paremmin, kuin yhtä kantaa sisältävät. Agazzi ym tehdyssä tutkimuksessa tutkittiin monta lajispesifistä kantaa sisältävän probioottilisän (Lactobacillus animalis SB310, Lactobacillus paracasei spp SB137 ja Bacillus coagulans SB117) vaikutusta vasikoiden suolistomikrobistoon ja kasvuun 28 päivän ajan alkaen vasikan syntymästä. Ripulin esiintyvyys väheni merkittävästi ja paino oli suurempi

25 25 probioottilisää saaneilla vasikoilla verrattuna kontrolliryhmään. Probioottien todettiin tehokkaasti kasvattavan maitohappobakteerien määrää E. coli bakteereihin verrattuna. Tämän pohdittiin olevan seurausta Lactobacillus animalis ja Lactobacillus paracasei lajien kyvystä happamoittaa ympäristöä. Positiivisia vaikutuksia löytyy myös ei-lajispesifisestä, yhdellä kannalla tehdystä tutkimuksesta. Qi ym tutkimuksessa käytettiin vastasyntyneiden vasikoiden ripuliin sian ulosteesta eristettyä Lactobacillus brevis LA-11 kantaa. Maitohappobakteeri annettiin mikrokapseloituna ja ripulia sairastavan vasikan ulosteen mikrobikoostumus muuttui terveiden vasikoiden mikrobikoostumusta vastaavaksi. Ulosteen vetisyyden muutosta tutkittiin Lactobacillus plantarum Chikuso-1 ja Candida sp. CO119 kannoilla Kawakami ym tutkimuksessa. Noin kuuden päivän ikäiset vasikat oli jaettu kontrolliryhmään ja probiooteilla täydennettyä juomarehua saavaan ryhmään. Vasikat joivat juomarehua 28 päivän ajan ja ulosteen vetisyyttä seurattiin koko tutkimuksen ajan. Ulosteen koostumus oli merkittävästi kiinteämpää juomarehua juoneilla vasikoilla verrattuna kontrolliryhmään. Suurin ero ryhmien välillä oli tutkimuksen ensimmäisen viikon jälkeen. Ulosteen vetisyydessä ei havaittu muutosta Frizzo ym tutkimuksessa. Lactobacillus casei DSPV 318T, Lactobacillus salivarius DSPV 315T ja Pediococcus acidilactici DSPV 006T - kannoilla täydennettyä juomarehua juotettiin noin 10 päivän ikäisille vasikoille 35 päivän ajan 1 x 10 9 pmy / kg annoksella. Probiootit olivat peräisin terveiden vasikoiden suolistosta, joten ne olivat lajispesifisiä. Juomarehua oli täydennetty lisäksi heraproteiinijauheella. Kontrolliryhmä sai maitoa heraproteiinijauheella, mutta ilman probiootteja. Probiootteja saaneet vasikat kasvoivat paremmin, mutta ulosteen vetisyydessä ei ryhmien välillä ollut merkittävää eroa. Hyang Mi An ym tutkimuksessa on tarkasteltu vähän vanhempia vasikoita. Eilajispesifisiä Lactobacillus acidophilus CBT, SAFELAC (eristetty Pediococcus pentosaceus CBT kannasta) ja Bifidobacterium pseudocatenulatum SPM1204 maitohappobakteereita annettiin seitsemän kuukauden ikäisille vasikoille, jotka oli jaettu kahteen neljän vasikan

26 26 hoitoryhmään. Heille annettiin maitohappobakteereita viiden kuukauden ajan joko 4 g tai 8 g päivässä ( pmy / g). Lisäksi tutkimuksessa oli kontrolliryhmä, joka ei saanut maitohappobakteereita. Maitohappobakteerien vaikutuksia tarkasteltiin painon lisääntymiseen ja ulosteen enteropatogeenisten bakteerien (E. coli, Salmonella spp. ja Staphylococcus spp.) määrään. 8 g päivässä maitohappobakteereita saaneet vasikat olivat merkittävästi painavampia kontrolliryhmään verrattuna. Kaikkien enteropatogeenisten bakteerien määrät olivat merkittävästi madaltuneet molemmissa hoitoryhmissä. Tässä annoksen koko ei ratkaissut, 4 g ja 8 g ryhmien välillä ei ollut merkitsevää eroa. Probioottien vaikutuksista löytyy sekä positiivisia, että neutraaleja tutkimustuloksia vasikkaripulin kannalta tarkasteltuna. Taulukossa 4 on vedetty yhteen vasikkaripuliin liittyviä tutkimuksia. Signorini ym meta-analyysi puoltaa monta kantaa sisältävää probioottilisää, mutta yhtä kantaa sisältävä probioottikin voi toimia. Lajispesifisyys näyttää monissa tutkimuksissa olevan hyvä asia, mutta ei kuitenkaan välttämättömyys. Maitohappobakteerit tulee testata aina tapauskohtaisesti ja käyttökohteen mukaisesti vasikoilla ja katsoa vähentävätkö ne vasikkaripulia. Lopputulos kuitenkin on, että probiooteilla täydennetty juomarehu voi ehkäistä vasikkaripulia ja lisätä kasvunopeutta vasikoilla. Taulukko 4. Probioottikantojen vaikutus vasikoissa. Maitohappobakteeri(t) Vaikutus Lähde Lactobacillus animalis SB310, Lactobacillus paracasei spp SB137 ja Bacillus coagulans SB117 Maitohappobakteeri/E. coli suhde kasvoi, vasikkaripulin esiintyvyys väheni. Agazzi ym Mikrokapseloitu Lactobacillus brevis LA-11 Lactobacillus plantarum Chikuso-1 ja Candida sp. CO119 Lactobacillus casei DSPV 318T, Lactobacillus salivarius DSPV 315T ja Vastasyntyneiden ripulia sairastavien vasikoiden ulosteen mikrobikoostumus muuttui terveen vasikan mikrobikoostumusta vastaavaksi. Ulosteen vetisyys oli huomattavasti suurempi kontrolliryhmällä, kuin probiootteja saaneella ryhmällä. Probiootteja saaneiden vasikoiden ja verrokkiryhmän ulosteiden Qi ym Kawakami ym Frizzo ym. 2010

27 27 Pediococcus acidilactici DSPV 006T Lactobacillus acidophilus CBT, SAFELAC ja Bifidobacterium pseudocatenulatum SPM1204 vetisyydessä ei ollut merkittävää eroa. Probiootteja saaneiden vasikoiden ulosteen enteropatogeenisten bakteerien määrä pienentyi merkittävästi. Hyang Mi An ym. 2011

28 28 6. TUTKIELMAN TAVOITE Tutkielman tavoitteena on selvittää vasikoiden ulosteesta eristettyjen maitohappobakteereiden ominaisuuksia, joita vaaditaan probiooteilta. Mahalaukun alhainen ph, sappihapot ja kilpailevat bakteerit ovat haaste maitohappobakteereille. Bakteerin on selviydyttävä elävänä suolistokanavasta, muuten siitä ei ole hyötyä. EFSA vaatii, että probioottien antibioottiresistenttiydet ovat tiettyjen rajojen alapuolella. Tutkimukseen valittiin antibiooteille sensitiivisiä ja muutamia lievästi resistenttejä maitohappobakteereita. Suoliston aiheuttamia haasteita testataan in vitro - testeillä, joilla karsitaan testeissä huonosti selviäviä bakteereita testien edetessä. Tutkimuskysymyksinä on, selviytyykö maitohappobakteeri suoliston olosuhteista ja inhiboiko se vasikkaripulia aiheuttavia patogeeneja. Suoliston olosuhteita simuloidaan in vitro -testeillä. Tehtävät laboratoriokokeet on lueteltu järjestyksessä kuvassa 6. Kasvu +37 C Gram-värjäys ph-testi Sappihappotesti Patogeenien inhibointi DNA:n sekvensointi Kuva 6. Maitohappobakteereille in vitro -tehtävät kokeet.

29 29 7. MATERIAALIT JA MENETELMÄT 7.1 Maitohappobakteerien identifiointi Tutkittavat maitohappobakteerit on aikaisemmin eristetty vasikoiden (n = 36) ulostenäytteistä (Korhonen 2010). Maitohappobakteerit on identifioitu Korhonen 2010 väitöskirjassa sekvensoimalla 16S rdna geeni ja bakteerit on tunnistettu lajitasolla BLAST-ohjelmalla (Basic Local Alignment Search Tool). Suurin osa maitohappobakteereista on Weissella spp., Streptococcus spp., Lactobacillus reuteri ja L. mucosae lajia. Mukaan valittiin 57 maitohappobakteeria 104:n joukosta (taulukko 5). Maitohappobakteerien antibioottiresistenttiys on testattu Korhonen ym väitöskirjassa ja valintaperusteena maitohappobakteerille tähän tutkimukseen on Lactobacillus tai Weissella -suku ja sensitiivisyys ampisilliinille, vankomysiinille, gentamysiinille, kanamysiinille, streptomysiinille, erytromysiinille, klindamysiinille, tetrasykliinille ja kloramfenikolille. Muutamat mukaan otetut bakteerit ovat kuitenkin tetrasykliinille lievästi resistenttejä. L. brevis kannat C208 C219, C220 ja C232 ovat tetrasykliinille lievästi resistenttejä. Taulukko 5. Tutkimukseen valitut maitohappobakteerit (n = 57). C155 Lactobacillus reuteri C160 Lactobacillus reuteri C161 Lactobacillus reuteri C178 Lactobacillus reuteri C104 Lactobacillus mucosae C105 Lactobacillus mucosae C107 Lactobacillus mucosae C119 Lactobacillus mucosae C130 Lactobacillus mucosae C131 Lactobacillus mucosae C156 Lactobacillus mucosae C169 Lactobacillus mucosae C177 Lactobacillus mucosae C192 Lactobacillus mucosae C222 Lactobacillus mucosae C231 Lactobacillus mucosae C108 Lactobacillus plantarum C120 Lactobacillus plantarum C254 Lactobacillus plantarum C230 Lactobacillus farciminis C217 Lactobacillus ruminis C158 Lactobacillus johnsonii C166 Lactobacillus johnsonii C164 Lactobacillus johnsonii/gasseri C136 Lactobacillus rhamnosus C208 Lactobacillus brevis C219 Lactobacillus brevis C220 Lactobacillus brevis C232 Lactobacillus brevis C210B Lactobacillus curvatus/sakei C111 Weissella spp. C134 Weissella spp. C138 Weissella spp. C145 Weissella spp. C147 Weissella spp. C171 Weissella spp.

30 30 C201 Lactobacillus plantarum C101 Lactobacillus plantarum C172 Lactobacillus plantarum C242 Lactobacillus plantarum C151 Lactobacillus plantarum C173 Lactobacillus plantarum/pentosus C184 Lactobacillus plantarum C190 Lactobacillus plantarum C210A Lactobacillus plantarum/pentosus C246 Lactobacillus plantarum/pentosus C175 Weissella spp. C233 Weissella spp. C240 Weissella spp. C241 Weissella spp. C244 Weissella spp. C248 Weissella spp. C252 Weissella spp. C253 Weissella spp. C255 Weissella spp. 7.2 Kasvu +37 C Maitohappobakteerien kasvukykyä ja -nopeutta arvioitiin silmämääräisesti MRS (de Man Rogosa Sharpe) maljoilla, sekä analyyttisemmin MRS liemessä Bioscreen laitteella, jonka avulla selvitettiin kantojen kasvua kasvukäyrien avulla. Maitohappobakteerit (n = 57) (taulukko 5) inkuboitiin +37 ºC MRS-maljalla (LabM, Englanti) 48 tunnin ajan ja katsottiin silmämääräisesti muodostavatko bakteerit pesäkkeitä Maitohappobakteerien kasvukäyrät Bioscreenilla Maitohappobakteerit (n = 57) (taulukko 5) ja kontrollikannan Lactobacillus rhamnosus GG kasvua testattiin Bioscreenillä (Labsystems, Suomi). Bakteereita kasvatettiin 24 tuntia +37 ºC:ssa MRS-liemessä (LabM, Englanti), minkä jälkeen bakteerit erotettiin MRS-liemestä sentrifugoimalla 4500 x g viiden minuutin ajan. Kasvatusliemi kaadettiin pois ja tilalle lisättiin 10 ml 0,9 % NaCl (Fisher Chemical, Englanti) ja sekoitettiin koeputkisekoittajalla tasaiseksi suspensioksi. Absorbanssi säädettiin spektrofotometrillä (Thermo, Yhdysvallat) kaikille bakteereille samaksi. 500 µl bakteerisuspensiota pipetoitiin kyvettiin ja mitattiin absorbanssiarvo (OD) 625 nm. Bakteerisuspensiota laimennettiin 0,9 % NaCl:llä, niin että absorbanssiarvo oli lopulta noin 0,1, jolloin bakteereita on noin 1 x 10 8 pmy / ml. Alkupitoisuudesta oli pipetoitava keskimäärin 100 µl 5 ml:aan 0,9 % NaCl tavoitellun sameuden saavuttamiseksi. Säädetyt bakteerisuspensiot

31 31 laitettiin odottamaan jäihin, ettei kasvua tapahtuisi ja absorbanssiarvo nousisi ennen Bioscreen ajon alkua. Säädetyt näytteet laimennettiin 1:100 pipetoimalla 100 µl näytettä 10 ml:aan 0,9 % NaCl, jolloin saavutettiin bakteeripitoisuus 1 x 10 6 pmy / ml. Honeycomb levyn kaikkiin kuoppiin pipetoitiin aluksi 200 µl MRS-lientä. Neljään ensimmäiseen kontrollikuoppaan ei lisätty bakteeriosuspensiota (steriilikontrolli). Näytekuoppiin pipetoitiin MRS-liemen lisäksi 100 µl 1 x 10 6 pmy / ml bakteerisuspensiota. Yhtä näytettä pipetoitiin aina neljään rinnakkaiseen kuoppaan. Näytteitä ajettiin Bioscreen -laitteella +37 C:ssa 48 tunnin ajan absorbanssilla 625 nm. Laitteella mitattiin absorbanssia 15 s välein. Ennen absorbanssin mittauksia laite sekoitti näytekuoppia 10 s ajan. 7.3 Gram-värjäys Maitohappobakteerit (n = 57) (taulukko 5) ja kontrollikanta Lactobacillus rhamnosus GG gramvärjättiin ja mikroskoopilla tarkastettiin bakteerin muoto ja väri. Grampositiiviset bakteerit näkyvät violetteina ja gramnegatiiviset vaaleanpunaisina, koska värjäyksessä kristallivioletin jälkeen tehtävä etanolikäsittely huuhtelee värin pois gramnegatiivisten bakteerien soluseinästä. Preparaatille pipetoitiin tippa bakteerisuspensiota ja annettiin kuivua. Bakteerit kiinnitettiin bunsenlampun liekissä. Preparaatti peitettiin kristallivioletilla (Reagena, Suomi), jonka annettiin vaikuttaa 1 minuutin ajan. Kristallivioletti huuhdeltiin pois ja tilalle tiputettiin Lugolin liuosta (Reagena, Suomi), jonka annettiin vaikuttaa myös 1 minuutti. Luoglin liuos huuhdeltiin pois ja peitettiin preparaatti 30 sekunnin ajaksi asetoniliuoksella. Asetoni huuhdeltiin pois ja tehtiin 10 sekunnin ajan vastavärjäys safraniinilla (Reagena, Suomi), joka huuhdeltiin myös pois. Preparaatin annettiin lopuksi kuivua, jonka jälkeen se mikroskopoitiin (Olympus, Japani) 100 x objektiivilla öljyimmersion läpi.

32 ph-testi Kasvukäyrien ja MRS-maljoilla ja -liemessä kasvamisen perusteella valittiin maitohappobakteerit (n = 24) (taulukko 6) ja Lactobacillus rhamnosus GG kontrolliksi phtestiin. ph-testi on kuvattu kuvassa 7. Taulukko 6. ph-testiin valitut maitohappobakteerit (n = 24). C108 Lactobacillus plantarum C120 Lactobacillus plantarum C201 Lactobacillus plantarum C101 Lactobacillus plantarum C172 Lactobacillus plantarum C242 Lactobacillus plantarum C151 Lactobacillus plantarum C173 Lactobacillus plantarum/pentosus C184 Lactobacillus plantarum C190 Lactobacillus plantarum C210A Lactobacillus plantarum/pentosus C246 Lactobacillus plantarum/pentosus C254 Lactobacillus plantarum C136 Lactobacillus rhamnosus C208 Lactobacillus brevis C219 Lactobacillus brevis C220 Lactobacillus brevis C232 Lactobacillus brevis C210B Lactobacillus curvatus/sakei C134 Weissella spp. C175 Weissella spp. C241 Weissella spp. C248 Weissella spp. C255 Weissella spp.

33 33 Bakteerit inkuboituvat 24 tuntia +37 ºC MRS-liemessä. 100 µl bakteerisuspensiota siirretään 9,9 ml:aan MRS + HCl ph 2,6 2,7. 0 h laimennussarja tehdään heti. 1 ml pipetoidaan 9 ml:aan 0,1 % peptonivettä ja siitä edelleen 1 ml seuraavaan putkeen (-7) laimennokseen asti. Bakteerit MRS + HCl ph 2,6 2,7 liemessä laitetaan 2 h inkuboitumaan +37 ºC:ssa. MRS- maljoille lanataan 100 µl laimennoksista (-4) (-7). Nyt maljoilla on laimennokset (-5) (-8). Toinen laimennossarja tehdään 2 h jälkeen. 1 ml pipetoidaan 9 ml:aan 0,1 % peptonivettä ja siitä edelleen 1 ml seuraavaan putkeen (-7) laimennokseen asti. MRS-maljoja inkuboidaan anaerobisissa oloissa +37 ºC:ssa 48 tuntia. MRS- maljoille lanataan 100 µl laimennoksista (-4) (-7). Nyt maljoilla on laimennokset (-5) (-8). Pesäkkeet lasketaan maljoilta ja kirjataan ylös. MRS-maljoja inkuboidaan anaerobisissa oloissa +37 ºC:ssa 48 tuntia. Pesäkkeet lasketaan maljoilta ja kirjataan ylös. Kuva 7. ph -testi maitohappobakteereille (Vera-Pingitore ym. 2016). 7.5 Sappihappotesti Maitohappobakteerien testaamista jätkettiin sappihappotestillä, johon valittiin ph-testistä elinkykyisinä selviytyneet maitohappobakteerit (n = 14) (taulukko 7). Kontrollina käytettiin edelleen Lactobacillus rhamnosus GG bakteeria. Sappihappotesti on kuvattu kuvassa 8.