KATSAUS. Pahanlaatuisten veritautien geenihoito. Kimmo Porkka

Transkriptio

1 KATSAUS Pahanlaatuisten veritautien geenihoito Kimmo Porkka Geenihoito on asteittain tulossa osaksi pahanlaatuisten kasvainten hoitovalikoimaa. Kliinisiä sovelluksia on vielä vähän, mutta teknologian ja tietämyksen nopea kehitys avannee lähivuosina merkittävästi uusia mahdollisuuksia syövän hoitoon. Syövän geenivirheet tunnetaan puutteellisesti, eikä niiden laaja korjaus ole vielä mahdollista. Siksi luontevin geenihoitostrategia on toistaiseksi joko kohdesolun tuhoamiseen perustuva»itsemurhageenihoito» tai elimistön oman immuunivasteen tehostaminen. Pahanlaatuiset veritaudit ovat otollinen geenihoidon kohde, koska kohdekudos luuydin tai perifeerinen veri on suhteellisen helposti saavutettavissa ja lähes kaikki pahanlaatuiset solut voidaan ainakin teoreettisesti saavuttaa veriteitse. Geenihoito ei vielä pitkään aikaan korvaa solunsalpaajatai sädehoitoa, vaan se on näiden tehostaja ja kohdentaja. T a u l u k k o 1. Käynnissä olevia kliinisiä geenihoitotutkimuksia, tilanne toukokuussa 1998 (Wiley Gene Therapy Web site, lupa tietojen käyttöön saatu kustantajalta.) Tutkimuksia Potilaita n % n % Monogeeniset taudit Syöpätaudit Infektiotaudit Muut sairaudet Geenimerkintä Yhteensä Geenihoidon ensimmäiset sovellukset olivat yhden geenin virheen aiheuttamien tautien kuten adenosiinideaminaasin puutteen hoidossa (Blaese ym. 1995). Nykyisin vilkkain tutkimus kohdistuu kuitenkin monitekijäisten tautien geenihoitoon, ja erityisesti syöpätaudit ovat olleet suosiossa (taulukko 1). Tämä on yllättävää, sillä vaikka syövän genetiikasta opitaan päivittäin uutta, on patogeneesin kannalta keskeisten kysymysten ratkaisu vielä pääosin avoin (taulukko 2). Ilman tietoa onkogeneesin perimmäisistä saloista yksittäisten geenimutaatioiden korjaus ei ole mielekästä. Kaikkien syöpäsolujen useampien geenivirheiden samanaikainen korjaus on nykytekniikalla vielä mahdotonta. Syövän geenihoitoon on kuitenkin kehitetty vaihtoehtoisia menettelytapoja, joiden avulla voidaan odottaa lähitulevaisuudessa päästävän merkittäviin hoitosovelluksiin. Pahanlaatuiset veritaudit ovat otollinen geenihoidon kohde monestakin syystä. Kohdekudos eli luuydin, perifeerinen veri tai imukudos on melko helposti saavutettavissa. Veritautien molekulaarisesta patogeneesista on poikkeuksellisen paljon tietoa, kuten 9;22-translokaation merkityksestä kroonisen myelooisen leukemian synnyssä (bcr-abl-fuusiogeeni) tai c-myc-proto-onkogeenin aktivoitumisesta 8;14- tai 8;22-translokaation seurauksena Burkittin lymfoomassa. Luuytimen tai perifeeristen kantasolujen keruu ja käsittely, mitä moni geenihoitostrategia edellyttää, Duodecim 1998; 114:

2 T a u l u k k o 2. Eräitä syövän patogeneesin ratkaisemattomia kysymyksiä geenihoidon kannalta. Onko syövän synnyn kannalta keskeiset mutaatiot löydetty? Onko perättäisten mutaatioiden ajallinen esiintyminen aina samanlainen tietyssä tuumorityypissä? Onko yksittäisen tuumorin kaikissa syöpäsoluissa samat keskeiset geenivirheet? Genotyyppi vs fenotyyppi: onko histologiselta kuvaltaan samanlaisilla kasvaimilla samanlainen geneettinen tausta? Onko syöpäsolujen keskeistenkään mutaatioiden korjaus pysyvää (geneettinen epästabiilius)? on rutiinimaista toimintaa verisyöpiä hoitavissa keskuksissa. Onkin oletettavaa, että geeninsiirron ensimmäiset käytännön sovellukset ovat juuri veritautien hoidossa. Jo nyt geeninsiirto on käypää hoitoa muutamassa harvinaisessa periytyvässä veritaudissa, ADA-puutostaudissa ja kroonisessa granulomatoottisessa sairaudessa (CGD) (Blaese ym. 1995, Weil ym. 1997). Hematologisissa syövissä nykyisin käytettävissä oleva hoito on hyväksyttävän toksisuuden äärirajoilla, ja silloinkin hoitotulos on usein huono, etenkin aikuisilla. Siksi uusien joko tarkemmin taudin syyhyn vaikuttavien tai täsmällisemmin kohdennettujen hoitomuotojen tarve on suuri. Geenihoitoa käsitteleviä yleiskatsauksia on viime vuosina ilmestynyt useita (Pettersson ja Palotie 1988, Ulmanen ja Sariola 1993, Brenner 1996, Ylä-Herttuala ym. 1996, Braun ym. 1997, Roth ja Cristiano 1997). Tässä kirjoituksessa esitetään lyhyesti geenihoidon nykytila ja keskitytään geeninsiirron sovellusmahdollisuuksiin hematologisten syöpien hoidossa. Vaikka syövän geenihoidosta on käynnissä useita kymmeniä tutkimuksia, ei tuloksia juuri vielä ole julkaistu. Siksi tämän artikkelin sisältö painottuu geenihoidon teoreettisiin näkökulmiin ja julkaistuihin eläinkokeisiin. Geenihoidon peruskäsitteitä Geenihoidolla tarkoitetaan kohdesolun joko syöpäsolun tai syövän patogeneesiin osallistuvan solun perimän muokkaamista niin, että saadaan aikaan toivottu hoitovaikutus. Geenihoidon piiriin luetaan usein myös RNA-synteesin estoon perustuva pienten DNA-jaksojen (oligonukleotidien) tai ribotsyymien käyttö syövän hoidossa, ja tämä onkin lupaava tutkimusalue. Keskityn tässä katsauksessa kuitenkin geenihoidon sovelluksiin, joissa siirtogeeni viedään kohdesoluun pääasiassa virusvektorien avulla. Geenihoidon kulku ja keskeisimmät käsitteet on esitetty kuvassa 1, ja jäljempänä on lyhyt yleiskatsaus hoidon perusteista. Strategiat. Syövän geenihoito on totuttu jakamaan korjaavaan ja sytotoksiseen geenihoitoon ja elimistön omaa puolustusvastetta tehostavaan geenihoitoon (immunogeenihoito). Käytännön rajoitusten vuoksi valtaosa nykyisistä geenihoitotutkimuksista perustuu kahteen jälkimmäiseen strategiaan tai niiden yhdistelmään. Tulevaisuuden kannalta uusien geenihoitomuotojen kehittely on keskeisellä sijalla, sillä mikään nykyisistä strategioista ei yksinään ole osoittautunut tarpeeksi tehokkaaksi laajoja kliinisiä sovelluksia ajatellen. Teoreettisen tiedon ja teknisen taidon kehittyessä eri hoitovaihtoehtojen määrä kasvaa, mihin pääosin perustuvat myös geenihoitoon kohdistuvat suuret toiveet. Geeninkuljettimet (vektorit). Geeninsiirron ongelmat keskittyvät vektoreiden ympärille. Lähes kaikille vektoreille yhteisiä rajoituksia ovat sattumanvarainen integraatio genomiin (insertionaalisen mutageneesin vaara), huono kapasiteetti (vain yksi siirtogeeni kerrallaan; käytettävä cdna-molekyyliä natiivin DNA:n sijaan) ja vaatimaton transduktio- eli geeninsiirtoteho (keskimäärin 1 5 % tutkimuksen ja viruksen mukaan). Valtaosa ihmisillä tehdyistä geenihoitokokeiluista on tehty virusvektoreilla, pääosin inaktivoiduilla adeno- ja retroviruksilla. Näistä ainoastaan retrovirukset integroituvat pysyvästi genomiin, mikä on esimerkiksi kantasolugeeninsiirron ehdoton edellytys. Retrovirukset eivät transfektoi muita kuin jakautuvia soluja, mikä on luonnollisesti suuri haitta ajatellen hyvin harvakseltaan jos lainkaan jakautuvia soluja, kuten neuroneita tai primitiivisiä kantasoluja. Lisäksi retrovirusten kapasiteetti on huono (siirtogeeni < emäsparia), niiden saavutettavissa oleva pitoisuus (10 7 ) on liian pieni suuria tuumoreita ajatellen, eikä niiden laaja tuotanto ole helppoa (ongelmana on 1276 K. Porkka

3 Tuotantosolulinja (retrovirukset) Pääsy kudokseen Sitoutuminen Sytoplasminen kuljetus Ekspressio Toiminta TUMA DNA KOHDE- SOLU GEENIHOITO Siirtogeenin valinta Siirtovektorin tuotto Pääsy kohdekudokseen Kohdesolun transfektio Transduktio Ekspressio (vakaa, terapeuttisella tasolla) K u v a 1. Geenihoidon peruskäsitteet. replikaatiokykyisten virusten ilmaantuminen tuottajasolulinjaan). Retroviruksia tuottavien pakkaussolujen käyttö pelkän retroviruksen asemesta on tehokas keino suurentaa paikallista viruspartikkelipitoisuutta. Adenovirukset infektoivat monentyyppisiä soluja riippumatta niiden mitoottisesta aktiivisuudesta. Adenovektoreiden tuotto on helpompaa ja saavutettavissa olevat pitoisuudet (>10 11 ) ovat suurempia kuin retroviruksilla. Adenovirus ei kuitenkaan integroidu kohdesolun genomiin, ja täten sen vaikutus on vain lyhytaikainen ja vaatii toistuvan annon. Ongelmana uudelleen annossa in vivo on vektoriin kohdistuvan immuunivasteen muodostuminen, joka nopeasti inaktivoi viruksen. Toisaalta pyrittäessä sytotoksiseen vaikutukseen ei lyhyt vaikutusaika välttämättä ole käytön este. Myös adenoviruksen kuljetuskapasiteetti on pieni. Mielenkiintoinen adenovirusvariantti ONYX-015 (Onyx Pharmaceuticals, Richmond, USA), josta E1B-geeni on poistettu, replikoituu ainoastaan syöpäsoluissa, joissa kasvunrajoitegeeni p53 on viallinen tai puuttuu. Näin on mahdollista kohdistaa viruksen sytotoksinen vaikutus ainoastaan syöpäsoluihin ja tehostaa hoitoa (Heise ym. 1997). Muita mahdollisesti tulevaisuudessa laajempaan käyttöön tulevia vektoreita ovat herpesvirukset, AAV (adenoassociated virus) sekä lehmänrokko- ja bakulovirukset. Retrovirusten alalaji lentivirukset, kuten HIV- 1 tai visnavirus, olisivat ideaalisia vektoreita, koska ne infektoivat tehokkaasti ja pysyvästi myös jakautumattomia soluja (Naldini ym. 1996). Turvallisuusseikat ovat kuitenkin toistaiseksi estäneet HI-virusten käyttöönoton geeninsiirroissa (Emerman 1996). Eräs mahdollisuus olisi käyttää muiden lajien lentiviruksia, joilla on tarkka tropismi ja joiden rakenne tunnetaan hyvin. Lupaavia tuloksia on äskettäin saatu mm. kissan immuunikatoviruksesta (FIV), jonka promoottorialuetta muokkaamalla on saatu tehokas transduktio jakautuviin, jakautumattomiin ja postmitoottisiin ihmissoluihin (Poeschla ym. 1998). Vaikka eri virusten rakenteesta tiedetään jo paljon ja ns. villin tyypin viruksen esiintyminen tuotantosolulinjoissa pystytään tehokkaasti estämään, virusten käyttöön liittyy yhä vaaratekijöitä (mm. rekombinaatio in vivo, insertiomutageneesi). Tämän vuoksi ei-viraalisten vektorien kehitys jatkuu vilkkaana. Yleisimmin käytettyjä ei-viraalisia vektoreita ovat liposomit, molekylaariset konjugaatit ja paljas (naked) DNA mekaanisesti annettuna (elektroporaatio,»gene gun»). Liposomien lipidi- DNA-kompleksi kykenee kuljettamaan siirtogeenin useisiin solutyyppeihin. Sen kapasiteetti on hyvin suuri, jopa kymmeniä kokonaisia geenejä, mutta haittapuolena on erittäin heikkotehoinen Pahanlaatuisten veritautien geenihoito 1277

4 transduktio, joka lisäksi tapahtuu ainoastaan paikallisesti antokohdassa. Liposomeilla on kuitenkin käyttöä ex vivo geeninsiirtokokeissa ja paikallisesti in vivo annettavassa hoidossa (esim. rokotteet). Proteiini-DNA-konjugaatit ovat mielenkiintoisia vektoritulokkaita (»synteettisiä viruksia»), joita on jo kaupallisestikin saatavilla (Directin, Saphorin). Kohdennus syöpäsoluun. Syöpäsolun kuolemaan ei sen geenivirheiden korjaukseen perustuva geenihoitostrategia vaikuttaa toteuttamiskelpoiselta, ja siksi vaaditaan kykyä transfektoida tarkasti vain kohdesoluja. Kohdennus voidaan saavuttaa useammalla tasolla: vektoria muokkaamalla, kudosspesifisillä promoottoreilla, muuttamalla antotapaa ja käyttämällä hyväksi immunoreseptoreja. Useilla viruksilla on luontaisesti kudoshakuisuutta: mm. adenovirukset infektoivat mieluiten keuhkojen epiteelisoluja. Virusten pintaproteiineja muuttamalla voidaan päästä tarkempaan kohdennukseen käyttämällä hyväksi syöpäsoluspesifisiä reseptoreja. Vain syövälle ominaisia reseptoreja tunnetaan kuitenkin hyvin rajallisesti, mutta esimerkiksi fibroblastikasvutekijä (bfgf) on osoittautunut tehokkaaksi ligandiksi syöpäsolujen pinnalla usein yliekspressoituneelle FGF-reseptorille (FGFR-1; Wang ja Becker 1997). Syöpäspesifisten promoottoreiden löytäminen on myös osoittautunut vaikeaksi. Syövän geenihoitotutkimuksissa yleisimmin käytetty promoottori on sytomegaloviruspromoottori, joka aktivoituu pääosin vain nopeasti jakautuvissa soluissa. Se on myös eräs voimakkaimmista tunnetuista promoottoreista. Sytotoksisia tai tuumoriin infiltroivia lymfosyytteja (TIL) voidaan ohjata spesifisesti tuumorisoluihin ekspressoimalla niissä tuumoriantigeeneja tunnistavia reseptoreja, kuten MART-1-melanooma-antigeenia tunnistavia reseptoreja Jurkat-soluissa (Cole ym. 1995). Genominen kohdennus. Geenihoidon tehokkuutta ja turvallisuutta ajatellen kohdennusta tarvitaan myös DNA-tasolla. Nykyisin käytössä olevat vektorit liittävät siirtogeenin sattumanvaraisesti genomiin. Teoreettisesti on hyvinkin mahdollista, että integraatio tapahtuu kohtaan, joka aiheuttaa onkogeeniaktivaation. Koska siirtogeeni ainoastaan lisätään genomiin, jatkuu mutatoituneen geenin toiminta ennallaan, ja jos sen vaikutus on dominantti, ei terveen siirtogeenin lisäys korjaa tilannetta. Muokkaamaton AAV integroituu tarkasti kromosomin 19 tiettyyn kohtaan. Kuitenkin rekombinantti AAV vektorina, josta on poistettu useita viraalisia proteiineja, näyttää menettävän paikkaspesifisen integraatiokykynsä (Halbert ym. 1995). Etenkin kantasolugeenihoidossa, jossa samasta solusta syntyy usean linjan erilaistuneita soluja, genominen kohdennus olisi tärkeää. Viallisten geenisekvenssien korjaaminen terveillä homologisen rekombinaation avulla, mikä on osoittautunut käyttökelpoiseksi ratkaisuksi mm. poistogeenisiä eläimiä tuotettaessa, ei toistaiseksi ole riittävän tehokas menetelmä nykyisellä vektoritekniikalla (Yanez ja Porter 1998). Äskettäin Krenin työryhmä raportoi lupaavasta vaihtoehtoisesta menetelmästä, jossa aiheutetaan kimeerisillä RNA/DNA-oligonukleotideilla hyytymistekijä IX:n mutaatio rotan maksasoluihin (Kren ym. 1998). Mutageneesi onnistui sekä in vitro että in vivo noin 40 %:ssa geenikopioista ja vähensi koagulaatioaktiivisuutta 50 %. Tämäntasoinen geenivirheen korjaus riittäisi parantamaan useita monogeenisia sairauksia, mikäli tekniset edellytykset viallisten solujen saavuttamiseksi täyttyvät. Kantasolugeeninsiirto Sairauden korjaavan geenin siirto hematopoieettiseen kantasoluun on tavoitelluin ja ideaalisin geenihoidon muoto. Se antaisi mahdollisuuden hoitaa laajaa joukkoa sairauksia, myös monia muita kuin veritauteja (useita monogeenisia sairauksia sekä autoimmuuni- ja infektiotauteja). Monessa pahanlaatuisessa veritaudissa, kuten myelodysplastisessa syndroomassa, epäillään perusgeenivirheen olevan jo kantasolussa ja siksi korjaava geenihoito on mahdollista vain kantasolutasolla. Mikäli pysyvä integraatio ja ekspressio saavutettaisiin, olisi mahdollista tuottaa lähes loputtomasti erilaistuneita soluja, joissa olisi siirretty geeni. Kantasolugeeninsiirroissa on vektoreina käytetty lähes yksinomaan retroviruksia, koska pysyvää integraatiota ei muilla yleisesti käytössä olevilla virusvektoreilla voida saavuttaa. Ensimmäiset tulokset yli kymmenen vuotta sitten hiirillä teh K. Porkka

5 dyissä kantasolugeeninsiirroista olivat hyvin lupaavia; pysyvä geeninsiirto pluripotentteihin soluihin saatiin helposti aikaan (Williams ym. 1984, Dick ym. 1985). Suuremmilla eläimillä, kuten koirilla ja apinoilla sekä ihmisillä transduktio onnistui korkeintaan alle prosentin teholla, jos laisinkaan (Chu ym. 1998). Kantasoluja on luuytimessä hyvin vähän, noin yksi sataatuhatta mononukleaarista solua kohden. Niiden tunnistaminen on myös vaikeaa, koska todellisen pluripotentin kantasolun spesifistä pinta-antigeenirakennetta ei täysin tunneta. Valitsemalla luuytimestä soluja, jotka ilmentävät CD34- antigeenia ja ovat negatiivisia muiden linjaspesifisten antigeenien suhteen, voidaan kantasolusaalis rikastaa kertaiseksi, mikä olisi riittävä määrä geeninsiirtosovelluksiin. Suurin osa näistä kantasoluista on kuitenkin lepotilassa ja täten huonosti tavoitettavissa retrovirusvektoreilla. Geeninsiirron tehokkuutta on voitu parantaa käyttämällä»kasvutekijäkoktaileja» (eri sytokiineja), stroomasoluja ja pitkäaikaisia luuydinviljelyjä, mutta useimmissa aikuisilla tehdyissä tutkimuksissa siirtogeeni on ollut osoitettavissa vain alle 1 %:ssa veren tai luuytimen soluista vuoden kuluttua muokatun kantasolusiirteen palautuksesta (Chu ym. 1998). On todennäköistä, että nykyisin tunnetut kantasolujen jakautumista stimuloivat tekijät aikaansaavat myös kantasolun erilaistumisen, jolloin geenihoitoa ajatellen tärkeä kantasolujen pluripotenttisuus häviää. Jostain syystä tulokset ovat olleet lapsilla parempia, sillä siirtogeeni on ollut havaittavissa useissa solulinjoissa jopa 42 kuukauden kuluttua kantasolujen palautuksesta (Brenner ym. 1993). Lupaavia tuloksia on saatu myös käyttämällä uudentyyppisiä adenovirusvektoreita (Frey ym. 1998) tai lentiviruksia (Naldini ym. 1996). Hoitosovelluksia ajatellen suurin ongelma on edelleenkin puutteellinen kyky tunnistaa ja infektoida pysyvästi ja riittävällä terapeuttisella tasolla luuytimen tai veren primitiivisiä kantasoluja. Napaveren solut ovat kiintoisa tulokas kantasolugeeniterapiaan (Cairo ja Wagner 1997). Syntymän yhteydessä kerätty napaveri sisältää runsaasti pluripotentteja kantasoluja, ja napaverta onkin käytetty menestyksekkäästi allogeenisen luuytimensiirron kantasolulähteenä lapsilla. Geeninsiirto onnistuu paremmin napaveren kantasoluihin kuin vastaaviin soluihin lasten tai aikuisten luuytimessä. Kliinisiä tutkimuksia on meneillään napaverigeeninsiirron käytöstä muun muassa ADA-puutostaudin hoidossa (Kohn ym. 1995). Syöpärokotteet Kiinnostus syöpärokotteisiin on lisääntynyt uudelleen viime vuosina, kun elimistön immunivasteen säätelytekijöistä on saatu lisää tietoa. Syöpärokotuksen tavoitteena on kehittää kasvainta kohtaan aktiivinen, systeeminen puolustusvaste, joka pystyisi spesifisesti estämään metastaaseja ja muodostaisi pitkäaikaisen immunologisen muistin tuumorirelapsin varalle. Koska vain syövälle ominaisia antigeeneja tunnetaan melko vähän, eräs ratkaisu on ollut käyttää tuumorikudosta sinänsä rokotteena. Muokkaamaton tuumorikudos stimuloi kuitenkin useimmiten hyvin heikosti elimistön puolustusjärjestelmää, ja siksi immunogeenisuutta on pyritty parantamaan siirtämällä tuumorisoluihin sytokiineja (esimerkiksi IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, gammainterferoni, lymfotaktiini, G-CSF, GM-CSF) tai ns. kostimuloivia molekyylejä (B7.1, B7.2) ex vivo ja käyttämällä näin modifioituja kasvainsoluja rokotteena itse syöpää kohtaan (Gilboa 1996). Kostimulaattorien puute solukalvon pinnalla näyttäisi olevan keskeinen tekijä juuri leukemiasolujen huonossa immunogeenisuudessa, sillä toisin kuin monissa kiinteissä kasvaimissa leukemiasoluissa ovat muut T-soluaktivaatiossa tarpeelliset tekijät (luokan I MHCantigeenit ja soluadheesiomolekyylit, Hirano ym. 1996). Immuunivasteen muodostumiselle on keskeistä tuumorispesifisten T-solujen aktivaatio (usein sekä CD4+T-solut ja CD8+-T-solut) sekä tehostunut antigeenipresentaatio joko dendriittisolujen tai itse tuumorisolujen avulla. Käytännön ongelmaksi on usein muodostunut riittävän tuumorisolumäärän saanti rokotteen valmistusta varten (»antigen dose»). Kasvainsolujen viljely, joka on edellytys geeninsiirtoon elimistön ulkopuolella, on usein vaikeaa tai mahdotonta. Hematologiset syövät soveltuvatkin näistä syistä hyvin syöpärokotteen valmistukseen: diagnoosivaiheessa Pahanlaatuisten veritautien geenihoito 1279

6 suurtenkaan tuumorisolumäärien saanti luuytimestä, perifeerisestä verestä tai imusolmukkeista ei ole ongelmallista, ja esimerkiksi leukeemisten blastien viljely onnistuu jo kohtalaisen hyvin. Eläinkokeissa on lisäksi todettu, että ns. viereisvaikutus näyttäisi toimivan myös rokotteissa, sillä tehokas immuunivaste on saatu syntymään myös sekoittamalla rokotteessa tuumorisoluja ja ei-maligneja soluja, jotka erittävät geeninsiirron vaikutuksesta sytokiineja (Golumbek ym. 1991). Jo nyt olisi useimmissa verisyöpiä hoitavissa keskuksissa valmiudet tuumorisolujen keräykseen ja säilöntään sekä sytokiinilähteinä toimivien solujen valmistukseen, ja kyseinen strategia olisi toteutettavissa nykyisten geeninsiirtomahdollisuuksien puitteissa. Erityisen lupaavia tuloksia on saatu kostimulaattori B7.1:n siirrosta myelooisiin blasteihin (AML). Kokeellisessa hiirimallissa saatiin aikaan 5 6 kuukautta kestänyt immuniteetti muokkaamattomia AML-soluja kohtaan yhdellä kertainfuusiolla AML-soluja, joihin oli siirretty B7.1- cdna (Dunussi-Joannopoulos ym. 1996). Taudin alkuvaiheessa annettuna B7.1-posititiivinen AML-solurokote aikaansai pysyvän remission silloin, kun tuumorimassa oli suhteellisen pieni. Saman työryhmän tuoreessa raportissa paras immunisaatioteho saatiin aikaan käyttämällä siirtogeeninä GM-CSF-geeniä. Se oli tehokas myös niillä hiirillä, joiden tuumorikuorma oli suuri (Dunussi-Joannopoulos ym. 1998). On mahdollista, että parempaan lopputulokseen päästäisiin käyttämällä kahden geenin samanaikaista siirtoa (sytokiini+kostimulaattori), mihin uusimmat polysistroniset vektorit antaisivatkin mahdollisuuden (Gallardo ym. 1997). Äskettäin Hirstin työryhmä onnistui siirtämään kymmenen aikuispotilaan AML-blasteihin MPSV-retrovirusvektorilla B7.1-kostimulaattorin ja selektoimaan solut niin, että % blasteista ilmensi siirrettyä geeniä (Hirst ym. 1997). Muokatut solut saivat aikaan vahvan T-soluvasteen (sekä CD4+ ja CD8+), mikä vahvisti hiirillä saatuja tuloksia ja antoi lähtökohdan ihmisillä tehtäviin rokotetutkimuksiin. Tämän strategian soveltuvuus leukemiapotilaiden hoitoon varmistuu 1 2 vuoden kuluttua ja samaa menettelytapaa käytetään myös muissa verisyövissä. On todennäköistä, että syöpärokotus tai muu immunoterapia on tehokkaimmillaan ns. minimitaudin hoidossa eli silloin, kun syöpäsolujen määrä elimistössä on hyvin pieni. Siksi tuntuisi luontevalta yhdistää rokotus solunsalpaajahoitoon, jonka tehtävänä olisi raivata suurin tautimassa pois. Useat solunsalpaajat, kuten syklofosfamidi, saavat aikaan syvän immunosuppression, joka taas saattaa olla tehokkaan tuumori-immunisaation esteenä rokotusta ajatellen. Eri solunsalpaajien immunosuppressiiviset ominaisuudet kuitenkin vaihtelevat, ja esimerkiksi doksorubisiinilla on todettu olevan jopa immunostimulatorisia vaikutuksia (Macubbin ym. 1992). Useissa kroonisissa veritaudeissa, kuten myeloomassa ja follikulaarisessa lymfoomassa, sitkeä lääkeresistentti minimitauti on keskeinen ongelma, jolloin onnistuneesta tuumorispesifisestä immunisaatiosta saattaisi olla merkittävää hyötyä. Lääkeherkkyyden muokkaus Tehokasta solunsalpaajahoitoa rajoittaa usein hematologinen toksisuus. Hoidon intensiivisyyttä on pyritty parantamaan siirtämällä lääkeresistenssigeenejä luuytimen kantasoluihin. Yleisimmin käytetty geeni on MDR1, jonka geenituote P-glykoproteiini toimii solukalvopumppuna poistaen solusta mm. veteen liukenemattomia solunsalpaajia. Luuytimessä sijaitsevat hematologiset syövät eivät ehkä ole kaikkein otollisin lääkeresistenssigeenihoidon kohde, sillä vaarana on siirtogeenin joutuminen kantasolujen lisäksi myös pahanlaatuisiin soluihin. On myös edelleen epäselvää, kuinka suuri lisäys hoitotehoon saataisiin nykyisiä annoksia suurentamalla, kuinka tehokkaan suojan P-glykoproteiinin lisääminen kantasoluun antaisi, ja kuinka pian ongelmaksi muodostuisi ei-hematologisiin kudoksiin kohdistuva kestämätön toksisuus. Jo nyt hoidon intensiivisyys tuntuu olevan lähellä suurinta siedettyä annosta ja aiheuttaa merkittäviä haittoja niin lyhyellä (sytopeniat ongelmineen, alopesia, limakalvovauriot) kuin pitkällä aikavälillä (hedelmättömyys, sekundaarisyövät), joten houkutus lisätä solunsalpaajaannoksia ei ole kovin suuri K. Porkka

7 Gansikloviiri (GCV) Ei-toksista Helppo annostelu HSV Tymidiinikinaasi Fosforyloitunut GCV Toksista Ei läpäise solukalvoa K u v a 2.»Itsemurhageenihoito»: herpes simplex -viruksen tymidiinikinaasi (HSV-TK) ja gansikloviiri. Sytotoksinen geenihoito:»itsemurhageenit» Koska syövän kaikkien geenivirheiden korjaaminen on toistaiseksi mahdotonta, on luontevinta käyttää geenihoitostrategiaa, jonka tavoitteena on syöpäsolun kuolema. Eräs varhaisimmista ehdotuksista on ns. itsemurhageenihoito, jossa syöpäsoluihin siirretään entsyymigeeni (suicide gene), joka muuttaa ei-toksisen aihiolääkkeen toksiseksi metaboliitiksi solun sisällä (Freeman ym. 1996). Tämän hoidon keskeinen edellytys on luonnollisesti kohdennus ainoastaan pahanlaatuiseen soluun. Siihen onkin keksitty useita eri tapoja, mutta ainoastaan syövälle spesifiseen kohdennukseen ei ole vielä päästy. Klassinen ja edelleen yleisimmin käytetty»itsemurhageeni» on herpes simplex -viruksen tymidiinikinaasientsyymi (HSV-TK). Se fosforyloi gansikloviirin solukalvoja läpäisemättömäksi trifosfaatiksi, joka estää DNA-polymeraasin toiminnan ja siten aiheuttaa solukuoleman (kuva 2). Gansikloviiri on yleisesti käytössä oleva viruslääke, joka on varsin hyvin siedetty. Koska HSV- TK-geenihoidon kohteena on DNA-polymeraasi, joka toimii ainoastaan solun jakautuessa, hoito on mahdollista kohdentaa vain syöpäsoluihin ympäristössä, jossa muita jakautuvia soluja on vähän tai ei ollenkaan. Pahanlaatuisten glioomien hoito tällä strategialla on aloitettu myös Suomessa (Puumalainen ym. 1997), ja alustavat vaiheen II hoitotulokset vaikuttavat lupaavilta, joskin pysyvät tulokset ovat toistaiseksi harvinaisia (Berger ym. 1997). Nykyisellä vektoritekniikalla voidaan infektoida vain pieni osa kasvainsoluista, mikä on merkittävä haitta syövän parantavaa hoitoa ajatellen.»itsemurhageenihoidossa» on kuitenkin huomattu, että kasvaimissa voidaan saada aikaan huomattava regressio, vaikka vain pieni osa kasvainsoluista saisi siirtogeenin. Kyseistä ilmiötä nimitetään viereisvaikutukseksi (bystander effect). Siinä gansikloviiri-infuusion jälkeen kuolevat HSV- TK-positiiviset solut muuttuvat toksisiksi viereisille soluille (kuva 3). On arvioitu, että merkittävään hoitovasteeseen riittäisi vain 5 10 %:n geeninsiirtotehokkuus, joka on nykyisilläkin vektoreilla saavutettavissa. Viereisvaikutuksen mekanismit ovat edelleen pääosin avoimia, mutta sekä elimistön immuunivasteella että soluseinämän aukkojen kautta kulkevilla paikallisilla toksisilla metaboliiteilla on merkitystä (Dilber ja Smith 1997, Freeman ym. 1997). Systeemisen tuumorispesifisen immuunivasteen muodostuminen voisi selittää myös ns. etävaikutusilmiön (distant bystander), jossa myös anatomisesti eri paikoissa sijaitsevat, geneettisesti muokkaamattomat tuumorisolut kuolevat siirtogeenin saaneen kudoksen myötä (Dilber ym. 1996, Kianmanesh ym. 1997).»Itsemurhageenejä» onkin liitetty syöpärokotetutkimuksiin tuumorin immunogeenisuuden tehostamiseksi (Santodonato ym. 1997). HSV-TK ei ole optimaalinen»itsemurhageeni» veritaudeissa, joissa gansikloviirilla on tärkeä osuus CMV-infektioiden hoidossa. Myös useita muita»itsemurhageenien» käyttösovelluksia on kehitetty (taulukko 3). Erityisen lupaavalta siirtogeeniltä vaikuttaa sytosiinideaminaasigeeni (CD), jonka geenituote muokkaa aihiolääke 5- fluorosytosiinin aktiiviseksi solunsalpaajaksi 5- fluorourasiiliksi. CD-pohjainen»itsemurhageenihoito» vaikuttaa jonkin verran tehokkaammalta kuin HSV-TK/gansikloviirihoito (Rogers ym. 1996). Pahanlaatuisten veritautien geenihoito 1281

8 MEKANISMEJA Soluvälitteinen immuunivaste (tuumoritaakka pienempi) Tuumorin verenkierron häiriö Apoptoottisten rakkuloiden kuljetus Metaboliittien siirtyminen solusta soluun (gap-junktiot) Etävaikutus (distant bystander effect)? Tuumori/kudos 2 Tuumori/kudos 1 Immuunivaste TK+ TK+ TNF, IL-1, IL-6 K u v a 3. Viereisvaikutus (bystander effect)»itsemurhageenihoidossa». TK = tymidiinikinaasigeeni, TNF = tuumorinekroositekijä Autologisissa eli potilaan omalla luuytimellä tehtävissä kantasolusiirroissa ongelmana ovat usein siirteessä olevat jäännöstuumorisolut, jotka geenimerkintätutkimusten perusteella ovat vähintäänkin osasyyllisiä taudin uusiutumiseen intensiivihoidon jälkeen (Brenner ym. 1993).»Itsemurhageenin» siirto ex vivo luuydinsiirteen tuumorisoluihin ja aihiolääkkeen anto siirteen palautuksen jälkeen saattaisi olla hyvin tehokas tapa taata mahdollisimman puhdas kantasolusiirre ja estää osalla potilaista taudin uusiutuminen. Kohdennus vain tuumorisoluihin olisi erityisen tärkeää, koska siirtogeenin vienti pluripotentteihin kantasoluihin estäisi täysin aihiolääkkeen käytön. Käänteishyljinnän esto Allogeenisen luuytimensiirron jälkeen keskeisin sairastuvuuden ja kuolleisuuden aiheuttaja perustaudin uusiutumista lukuun ottamatta on akuutti ja krooninen käänteishyljintä (GVHD). Siinä luovuttajan T-lymfosyytit hyökkäävät saajan kudosta vastaan, mikä voi näkyä ihottumana, maksavauriona, ripulina tai verenkuvan muutoksina. Käänteishyljintä ja sen hoidoksi käytetty voimakas immunosuppressiivinen lääkitys johtaa pahimmillaan monielinvaurioon ja potilaan kuolemaan. Tiedetään myös, että luovuttajan lymfosyyteillä on keskeinen osuus luuydinsiirteen tarttumisessa, saajan infektioimmuniteetin muodostumisessa ja perustaudin kurissapidossa»graftversus-leukemia»-efektin (GVL) avulla, mikä on ehkä tärkein seikka. On edelleen epäselvää, välittyvätkö GVHD- ja GVL samojen efektorisolujen kautta, vai voitaisiinko nämä kaksi hoidon hyödyn kannalta vastakkaista reaktiota erottaa toisistaan. On havaittu viitteitä siitä, että luovuttajien lymfosyyttien kokonaismäärällä on merkitystä; GVL voidaan aikaansaada pienemmällä lymfosyyttimäärällä kuin GVHD (Mckinnon ym. 1995). Kysymys on hyvin ajankohtainen, sillä luovuttajien lymfosyyttien siirto on osoittautunut tehokkaaksi luuytimensiirron jälkeen relapsoituneen kroonisen myelooisen leukemian sekä muiden verisyöpien hoidossa (Mckinnon ym. 1997). Tämän vuoksi käänteishyljintä, joka aiemmin on ollut lähes väistämätön komplikaatio lymfosyyttisiirroissa, on tärkeätä estää. Lymfosyyttisiirto luovuttajilta on myös tärkeä hoito Epstein Barrin viruksen aiheuttamassa vaikeassa nopeasti etenevässä lymfoproliferatiivisessa sairaudessa (Papadopoulos ym. 1998). Tähän mennessä ehkä kliinisesti merkittävin potilailla tehty veritauteihin liittyvä geenihoitotutkimus on milanolaisen Claudio Bordignonin työryhmän tutkimus käänteishyljinnän hallinnasta»itsemurhageenien» avulla (Bonini ym. 1997). Kyseisessä aineistossa oli mukana kahdeksan T- soludepletoidun luuytimensiirron jälkeen relap K. Porkka

9 T a u l u k k o 3.»Itsemurhageenejä» Geeni Metabolia Sytotoksinen Viereisvaikutus HSV1-TK GCV GCV-TP Kyllä Kyllä CD 5-FC 5-FU Kyllä Kyllä XGPRT 6-TX 6-TX-TP Kyllä? VZV-TK AraM AraM-MP Kyllä? DeoD MeP-dr 6-MeP Kyllä Kyllä β-glukosidaasi Amygdaliini syanidi?? β-laktamaasi Vinka-kefalosporiini vinka-alkaloidi?? TetR Tetrasykliini TetR-VP16 Kyllä? CPG2 CMDA kloorimetiini Kyllä Kyllä NR CB1954 kloorimetiini Kyllä Kyllä CYP2B1 Syklofosfamidi toksiset metaboliitit Kyllä Kyllä Ifosfamidi toksiset metaboliitit Kyllä Kyllä HSV1-TK = herpes simplex -viruksen tymidiinikinaasi, GCV = gansikloviiri, GCV-TP = gansikloviiritrifosfaatti, CD = sytosiinideaminaasi, 5-FC = 5-fluorosytosiini, 5-FU = 5-fluorourasiili, XGPRT = ksantiini-guaniinifosforibosyylitransferaasi, 6-TX = 6-tioksantiini, 6-TX-TP = 6-tioksantiinitrifosfaatti, VZV-TK = varicella-zosterviruksen tymidiinikinaasi, AraM = 6-metoksipuriiniarabinonukleosidi, AraM-MP = 6-metoksipuriiniarabinonukleosidimonofosfaatti, MeP-dr = 6-metyylipuriini-2 -deoksiribonukleosidi, MeP = 6-metyylipuriini, TetR = bakteeriperäinen Tet-repressoriproteiini, VP16 = etoposidi,.cpg2 = karboksipeptidaasi G2, NR = E. coli -bakteerin nitroreduktaasi, CYP2B1 = eräs sytokromi P-450 -entsyymi. soitunutta potilasta, jotka saivat lymfosyyttisiirron tautirelapsin hoidoksi samalta sukulaisluovuttajalta, jolta luuydinsiirre oli alun pitäen saatu. Luovuttajan lymfosyytteihin siirrettiin ex vivo retrovirusvektorilla HSV-TK-»itsemurhageeni» ja ns. reportterigeeni, jonka avulla siirtogeenin saaneet lymfosyytit voitiin erottaa. Geeninsiirto onnistui hyvin; vain yhdellä potilaalla ei havaittu toimivaa siirtogeenia lymfosyyttisiirron jälkeen. Muilla potilailla geneettisesti muokattuja lymfosyyttejä havaittiin yli vuoden ajan niin perifeerisessä veressä kuin luuytimessä. Geeninsiirto ei näyttänyt häiritsevän lymfosyyttien toimintaa, sillä tuumorin vastainen vaikutus voitiin havaita viidellä potilaalla. Kolmelle potilaalle kehittyi käänteishyljintä; kahdella se saatiin hallintaan pelkällä gansikloviiri-infuusiolla, joka nopeasti hävitti verenkierrosta siirtogeenin saaneet lymfosyytit. Vaste oli hyvin nopea: kaikki käänteishyljinnän merkit hävisivät 1 2 vuorokaudessa, eikä haittavaikutuksia todettu. Tämä poikkeaa nykyisestä GVHD:n hoidosta, jossa käytetään jättiannoksia metyyliprednisolonia, antilymfosyyttiglobuliinia ja muita hyvin immunosuppressiivisia lääkkeitä, joiden sivuvaikutukset ovat huomattavia ja teho usein riittämätön. Koska GVL näyttäisi ilmaantuvan pienemmällä lymfosyyttimäärällä kuin GVHD, antaisi kuvattu»itsemurhageenihoito» mahdollisuuden tärkeimmän tautia kurissa pitävän ominaisuuden säilyttämiseen aihiolääkkeen annosta säätelemällä. Vaikka Bordignonin työryhmän potilasaineisto oli hyvin pieni, tulokset olivat johdonmukaisia ja rohkaisevia, ja ne osoittivat, että geenihoitoa voidaan jo soveltaa kliiniseen työhön. Tutkimus on herättänyt myös kritiikkiä, koska potilaskokeisiin ryhdyttiin melko vähäisellä koe-eläinpohjaisella näytöllä (Sadelain ja Luzzatto 1997). Hiirimallilla tehty vastaavanlainen tutkimus vahvisti strategian toimivuuden (Cohen ym. 1997). Mikäli tulokset saadaan toistettua laajemmissa sarjoissa, on käänteishyljintää vastaan käytettävissä tehokas ase, jolla olisi huomattava merkitys etenkin muilta kuin sukulaisluovuttajilta tehtävissä kantasolusiirroissa. Kyseistä strategiaa voidaan tulevaisuudessa parantaa käyttämällä tehokkaampia siirtogeenejä sekä tarkoitukseen paremmin sopivia vektoreita. Tällöin immuunivasteen muokkaukseen avautuu kiehtovia uusia mahdollisuuksia ajatellen niin perustutkimusta kuin kliinisiä hoitosovelluksia (Gallardo ym. 1997). Pahanlaatuisten veritautien geenihoito 1283

10 Tulevaisuudennäkymiä Yhdistäminen tavanomaiseen syövän hoitoon. Geenihoidon rajoitteiden lähinnä huonon geeninsiirtotehon ja puutteellisen kohdistuksen johdosta on epätodennäköistä, että geenihoito syrjäyttäisi syövän tavanomaisen hoidon lähivuosien aikana. Toistaiseksi on tehty vain hyvin vähän tutkimuksia solunsalpaaja- tai sädehoidon tai molempien yhdistämisestä esimerkiksi immunogeeniterapiaan, jossa jälkimmäinen voisi olla hyvin tehokas minimitaudin kurissapitäjä. Kohdennus geneettisesti stabiiliin soluun. Kaikkien pahanlaatuisten kasvainten kasvu ja metastasointi on riippuvainen verisuonten uudismuodostuksesta eli angiogeneesistä (Folkman 1990). Angiogeneesin estoon on viime vuosina löytynyt hyviä lääkkeitä, joilla on ollut eläinkokeissa poikkeuksellisen hyvä teho eri tyyppisiin kasvaimiin (Boehm ym. 1997, O Reilly ym. 1997). Myös verisyöpien etenemisessä angiogeneesillä näyttäisi olevan merkittävä osuus (Perez-Atayde ym. 1997). Angiogeneesin systeeminen esto ei tunnu mielekkäältä, sillä monet tunnetut ja osin myös tuntemattomat fysiologiset toiminnat ovat riippuvaisia angiogeneesistä. Geenihoito vaikuttaa lupaavalta tavalta kohdentaa angiogeneesin esto vain tuumorisoluihin tai niiden läheisyyteen (Kong ja Crystal 1998). Koska hoidon kohde, endoteelisolu, on geneettisesti stabiili ei-maligni solu, on resistenssin kehittyminen hoidolle hyvin epätodennäköistä. Tämä on merkittävä etu, sillä syöpäsolun kaikkien geenivirheidenkään korjaus ei välttämättä takaa pysyvää vaikutusta syöpään olennaisesti liittyvän geneettisen epästabiiliuden takia. Perimmäiset syyt tähän epästabiiliuteen ovat tuntemattomia. Geenihoitotutkimuksiin on tähän mennessä otettu vain pitkälle edennyttä, metastasoitunutta syöpää sairastavia potilaita, mikä on osasyy melko vaatimattomiin hoitotuloksiin. Kuten muussakin syövän hoidossa, on oletettavaa, että geenihoito tehoaa parhaiten silloin, kun syöpäsoluja on vielä kohtalaisen vähän. Geenihoitoa voidaan kuvitella käytettävän myös ehkäisevästi, esimerkiksi estämään premalignin muutoksen kehittymisen pahanlaatuiseksi ja invasiiviseksi syöväksi tai estämään periytyvien syöpämuotojen geeniekspressiota. Geenihoidon tulevaisuus vaikuttaakin lupaavalta; koeputkissa ja eläimillä tehtävistä geeninsiirtotutkimuksista ollaan siirtymässä potilastutkimuksiin ja hoitokokeiluihin. Lähivuosien aikana myös pahanlaatuisten veritautien hoito hyötynee geeninsiirron sovelluksista. Kirjallisuutta al-lebban Z S, Henry J M, Jones J B, ym. Increased efficiency of gene transfer with retroviral vectors in neonatal hematopoietic progenitor cells. Exp Hematol 1990; 18: Berger M, Prados M, Van Gilder J, ym. Phase II trial of GLI 328 HSV-TK gene therapy in recurrent glioblastoma (abstract). Gene Therapy of Cancer VI, San Diego, California, November 20 22, Blaese R M, Culver K W, Miller A D, ym. T lymphocyte-directed gene therapy for ADA- SCID: initial trial results after 4 years. Science 1995; 270: Boehm T, Folkman J, Browder T, M S O Reilly. Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance. Nature 1997; 390: Bonini C, Ferrari G, Verzeletti S, ym. HSV-TK gene transfer into donor lymphocytes for control of allogeneic graft-versusleukemia. Science 1997; 276: Braun S E, Chen K, Battiwalla M, Cornetta K. Gene therapy strategies for leukemia. Mol Med Today 1997; 3: Brenner M K. Gene transfer in haematological malignancy. Ann Med 1996; 28: Brenner M K, Rill D R, Moen R C, ym. Gene-marking to trace origin of relapse after autologous bone-marrow transplantation. Lancet 1993; 341: Cairo M S, Wagner J E. Placental and/or umbilical cord blood: an alternative source of hematopoietic stem cells for transplantation. Blood 1997; 90: Chu P, Lutzko C, Stewart A K, Dube I D. Retrovirus-mediated gene transfer into human hematopoietic stem cells. J Molec Med 1998; 76: Cohen J L, Boyer O, Salomon B, ym. Prevention of graft-versushost disease in mice using a suicide gene expressed in T lymphocytes. Blood 1997; 89: Cole D J, Weil D P, Shilyansky J, ym. Characterization of the functional specificity of a cloned T-cell receptor heterodimer recognizing the MART-1 melanoma antigen. Cancer Res 1995; 55: Dick J, Magli M, Huszar D, ym. Introduction of a selectable gene into primitive stem cells capable of long term reconstitution of hematopoietic system of W/Wv mice. Cell 1985; 42: Dilber M S, Abedi M R, Bjorkstrand B, ym. Suicide gene therapy for plasma cell tumors. Blood 1996; 88: Dilber M S, Smith C I. Suicide genes and bystander killing: local and distant effects. Gene Ther 1997; 4: Dunussi-Joannopoulos K, Dranoff G, Weinstein H J, ym. Gene immunotherapy in murine acute myeloid leukemia: granulocyte-macrophage colony-stimulating factor tumor cell vaccines elicit more potent antitumor immunity compared with B7 family and other cytokine vaccines. Blood 1998; 91: Dunussi-Joannopoulos K, Weinstein H J, Nickerson P W, ym. Irradiated B7-1 transduced primary acute myelogenous leukemia 1284 K. Porkka

11 (AML) cells can be used as therapeutic vaccines in murine AML. Blood 1996; 87: Elonen E. Solunsalpaajaresistenssi. Duodecim 1998: (painossa). Emerman M. From curse to cure. HIV for gene therapy? Nature Biotech 1996; 14: Folkman J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent? J Natl Cancer Inst 1990; 82: 4 6. Freeman S M, Ramesh R, Marrogi A J. Immune system in suicidegene therapy. Lancet 1997; 349: 2 3. Freeman S M, Whartenby K A, Freeman J L, ym. In situ use of suicide genes for cancer therapy. Semin Oncol 1996; 23: Frey B, Hackett N, Bergelson J, ym. High-efficiency gene transfer into ex vivo expanded human hematopoietic progenitors and precursor cells by adenovirus vectors. Blood 1998; 91: Gallardo H F, Tan C, Ory D, Sadelain M. Recombinant retroviruses pseudotyped with the vesicular stomatitis virus G glycoprotein mediate both stable gene transfer and pseudotransduction in human peripheral blood lymphocytes. Blood 1997(a); 90: Gallardo H F, Tan C, Sadelain M. The internal ribosomal entry site of the encephalomyocarditis virus enables reliable coexpression of two transgenes in human primary T lymphocytes. Gene Ther 1997(b); 4: Ghazal P, Lubon H, Fleckenstein B, Henninghausen L. Binding of transcription factors and creation of a large nucleoprotein complex on the human cytomegalovirus enhancer. Proc Nat Acad Sci 1987; 84: Gilboa E. Immunotherapy of cancer with genetically modified tumor vaccines. Semin Oncol 1996; 23: Golumbek P T, Lazenby A J, Levitsky H I, ym. Treatment of established renal cancer by tumor cells engineered to secrete interleukin-4. Science 1991; 254: Halbert C, Aleksander I, Wolgamot G, Miller A. Adeno-associated virus vectors transduce primary cells much less efficiently than immortalized cells. J Virol 1995; 69: Heise C, Sampson-Johannes A, Williams A, ym. ONYX-015, an E1B gene-attenuated adenovirus, causes tumor-specific cytolysis and antitumoral efficacy that can be augmented by standard chemotherapeutic agents. Nature Med 1997; 3: Hirano N, Takahashi T, Takahashi T, ym. Expression of costimulatory molecules in human leukemias. Leukemia 1996; 10: Hirst W J, Buggins A, Darling D, ym. Enhanced immune costimulatory activity of primary acute myeloid leukaemia blasts after retrovirus-mediated gene transfer of B7.1. Gene Ther 1997; 4: Kianmanesh A R, Perrin H, Panis Y, ym. A distant bystander effect of suicide gene therapy regression of nontransduced tumors together with a distant transduced tumor. Hum Gene Ther 1997; 8: Kohn D B, Weinberg K I, Nolta J A, ym. Engraftment of genemodified umbilical cord blood cells in neonates with adenosine deaminase deficiency. Nature Med 1995; 1: Kong H L, Crystal R G. Gene therapy strategies for tumor antiangiogenesis. J Natl Cancer Inst 1998; 90: Kren B, Bandyopadhyay P, Steer C. In vivo site-directed mutagenesis of the factor IX gene by chimeric RNA/DNA oligonucleotides. Nature Med 1998; 4: Maccubbin D, Wing K, Mace K, ym. Adriamycin-induced modulation of host defenses in tumor-bearing mice. Cancer Res 1992; 52: Mackinnon S. Donor leukocyte infusions. Baillieres Clin Haematol 1997; 10: Mackinnon S, Papadopoulos E B, Carabasi M H, ym. Adoptive immunotherapy evaluating escalating doses of donor leukocytes for relapse of chronic myeloid leukemia after bone marrow transplantation: separation of graft-versus-leukemia responses from graft-versus-host disease. Blood 1995; 86: Naldini L, Blomer U, Gallay P, ym. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science 1996; 272: O Reilly M, Boehm T, Shing Y, ym. Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell 1997; 88: Papadopoulos E B, Ladanyi M, Emanuel D, ym. Infusions of donor leukocytes to treat Epstein Barr virus-associated lymphoproliferative disorders after allogeneic bone marrow transplantation. New Engl J Med 1994; 330: Perez-Atayde A R, Sallan S E, Tedrow U, ym. Spectrum of tumor angiogenesis in the bone marrow of children with acute lymphoblastic leukemia. Am J Pathol 1997; 150: Pettersson R, Palotie L. Geeniterapia. Duodecim 1988; 104: Poeschla E, Wong-Staal F, Looney D. Efficient transduction of nondividing human cells by feline immunodeficiency virus lentiviral vectors. Nature Med 1998; 4: Puumalainen A-M, Vapaalahti M, Ylä-Herttuala S. Geeniterapian mahdollisuudet aivokasvainten hoidossa. Suom Lääkäril 1997; 52: Rogers R P, Ge J Q, Holley-Guthrie E, ym. Killing Epstein Barr virus-positive B lymphocytes by gene therapy: comparing the efficacy of cytosine deaminase and herpes simplex virus thymidine kinase. Hum Gene Ther 1996; 7: Roth J A, Cristiano R J. Gene therapy for cancer: what have we done and where are we going? J Natl Cancer Inst 1997; 89: Sadelain M, Luzzatto L. Immuno gene therapy comes into its own. Gene Ther 1997; 4: Santodonato L, G D A, Santini S M, ym. Local and systemic antitumor response after combined therapy of mouse metastatic tumors with tumor cells expressing IFN-alpha and HS- Vtk: perspectives for the generation of cancer vaccines. Gene Ther 1997; 4: Ulmanen I, Sariola H. Syövän geenihoito. Duodecim 1993; 109: Wang Y, Becker D. Antisense targeting of basic fibroblast growth factor and fibroblast growth factor receptor-1 in human melanomas blocks intratumoral amgiogenesis and tumor growth. Nat Med 1997; 3: Weil W M, Linton G F, Whiting-Theobald N, ym. Genetic correction of p67phox deficient chronic granulomatous disease using peripheral blood progenitor cells as a target for retrovirus mediated gene transfer. Blood 1997; 89: Williams D, Lemischka I, Nathan D, Mulligan R. Introduction of new genetic material into pluripotent hematopoietic stem cells of the mouse. Nature 1984; 310: Yanez R J, Porter A C G. Therapeutic gene targeting. Gene Ther 1998; 5: Ylä-Herttuala S, Ollikainen A, Vapaalahti M. Ihmisen geeniterapia. Duodecim 1996; 112: KIMMO PORKKA, dosentti, hematologian apulaislääkäri HYKS:n sisätautien klinikka, hematologian toimiala PL 340, HYKS kimmo.porkka@huch.fi Pahanlaatuisten veritautien geenihoito 1285