LOPPURAPORTTI. NK-solujen merkitys työperäisessä astmassa

Transkriptio

1 LOPPURAPORTTI NK-solujen merkitys työperäisessä astmassa Minna Anthoni Karolinska Institutet, Stockholm Elokuu 2010

2 Abstract Asthma is a common occupational disease caused by exposure to sensitizing agents in the work environment, proteins, polysaccharides, peptides or chemicals. The most common form of asthma, allergic asthma, is characterized by airway inflammation and airway hyperreactivity, typically a massive infiltration of eosinophils, lymphocytes and mast cells into the airways causing the symptoms. The symptoms of asthma are wheezing, mucus production, shortness of breath, and coughing due to reversible airway obstruction. Natural killer (NK) cells are granular lymphocytes that comprise 5-15% of peripheral blood lymphocytes and they are a first line of defence against cancer. They are known to control microbial infections by limiting their growth and spread and subsequent tissue damage. NK cells are normally present in the human lung, but their possible function and role in asthma pathogenesis is unknown. NK cells have a potent immunoregulatory function and are engaged in reciprocal interactions with dendritic cells (DC), macrophages, T cells and endothelial cells thereby being able to both limit and exacerbate immune responses. Only very few studies on NK cells in the context of asthma pathogenesis exist. The aim of this research project is to study in detail NK cells and also their interactions with other cells types in the human airways and lung. This study concentrates to explore the phenotype, function and possible interactions with other cell types within the context of human asthma.

3 TIIVISTELMÄ Astma on työikäisellä väestöllä yleinen, monitekijäinen sairaus, jonka kehittymiseen vaikuttavat sekä perintö- ja ympäristötekijät. Astma voi syntyä työntekijän herkistyttyä työssä esiintyville altisteille. Työympäristössä on myös monia tekijöitä, jotka pahentavat astmaa ja sen oireita. Lisäksi astman kaltainen tulehdus voi aiheuttaa työhön liittyvää astmaattista oireilua. Astman yleisin muoto on allerginen astma. Siinä ilmateiden tulehdusreaktiolle tyypillistä on eosinofiilien, lymfosyyttien ja syöttösolujen massiivinen keräytyminen hengitysteihin aiheuttaen astman oireita, yskää, liman erittymistä, hengenahdistusta. Kuitenkin astman muissa muodoissa, tulehdusoireet liittyvät usein neutrofiilien kerääntymiseen ilmateihin ja hengitysteiden infektioihin. Ammattiastmassa työhön liittyvää nuhaa tai silmien sidekalvojen ärsytystä esiintyy usein ennen keuhko-oireita. Luonnolliset tappajasolut (natural killer, NK-solut) muodostavat merkittävän lymfosyyttipopulaation ihmisen keuhkossa. Näillä soluilla on merkittävä rooli immuunivasteiden säätelijöinä. Niiden tiedetään toimivan vuorovaikutuksessa monien eri solutyyppien kuten dendriittisolujen, makrofaagien, T-solujen ja endoteelisolujen kanssa. NK-solut toimivat puolustusjärjestelmän eturintamassa syövässä ja mikrobi-infektioissa rajoittaen mikrobien kasvua, leviämistä ja niistä aiheutuvia kudosvaurioita. NK-soluja on normaalisti ihmiskeuhkossa, mutta niiden toiminta ja merkitys astman patogeneesissä on tuntematon. Tässä tutkimuksessa on aloitettu NK-solujen roolin, toiminnan, kudoslokalisaation ja fenotyypin tutkiminen ihmiskeuhkossa liittyen astman patogeneesiin. NKsolujen tiedetään olevan tärkeitä toimijoita syövän patogeneesissä ja mikrobiinfektioissa, niiden tarkempi karakterisaatio antaa uutta tietoa niiden mahdollisesta toiminnasta ja merkityksestä astman patogeneesissä.

4 TAUSTA Astma on työikäisen väestön yleinen sairaus. Astma voi syntyä työntekijän herkistyttyä työssä esiintyville altisteille. Työympäristössä on myös monia tekijöitä, jotka pahentavat astmaa ja sen oireita. Lisäksi astman kaltainen tulehdus voi aiheuttaa työhön liittyvää astmaattista oireilua. Astma on monitekijäinen sairaus, jonka kehittymiseen vaikuttavat sekä perintö- ja ympäristötekijät. Allergisessa astmassa, joka on astman yleisin muoto, ilmateiden tulehdusreaktiolle tyypillistä on eosinofiilien, lymfosyyttien ja syöttösolujen massiivinen keräytyminen hengitysteihin aiheuttaen astman oireita. Astman tyypillisiä oireita ovat yskä, sitkeän liman erittyminen, hengityksen ajoittainen vinkuna ja hengenahdistus. Ammattiastmassa työhön liittyvää nuhaa tai silmien sidekalvojen ärsytystä esiintyy usein ennen keuhko-oireita. Hiljattain, T-solujen uudella alapopulaatiolla, invariant natural killer (inkt), T-tappajasoluilla on osoitettu olevan tärkeä tehtävä taudin patogeneesissä allergisen hengitystietulehduksen hiirimallissa. inkt-solujen tiedetään olevan vahvoja immuunijärjestelmän muokkaajia, jotka aktivoituessaan ovat kykeneväisiä tuottamaan valtavia määriä erityyppisiä sytokiinejä, solujen välisiä viestittäjiä. inkt-solut ovat vaikeasti havaittavia ja on mahdollista, että viime vuosien tutkimuksissa niiden osuus on jäänyt vähemmälle huomiolle ja niiden todellista merkitystä ei ole havaittu. Toiseksi, luonnollisia tappaja-t-soluja (natural killer, NK) koskevat tutkimukset on tehty pääasiassa hiirillä ja tällä hetkellä ongelmana on kliinisen mallin puuttuminen. Vaikka hiiritutkimukset ovat antaneet arvokasta tietoa ja ovat toimineet äärettömän hyvänä työvälineenä perusimmunologiselle tutkimukselle, tarvitsemme kliinisesti käyttö-kelpoisempia malleja nimenomaan ihmisen immuunijärjestelmän ja ihmisen immunologisen terveyden mittareina.

5 Luonnolliset tappajasolut, NK -solut, muodostavat päälymfosyytti-populaation ihmiskeuhkoissa, peräti 10 % soluista ihmiskeuhkoissa kuuluvat tähän soluluokkaan. Tästä huolimatta niiden toiminnasta ihmi-sen astmassa tiedetään hyvin vähän. Nämä solut muodostavat yhteyksiä dendriittisolujen, makrofagien, T-solujen ja endoteelisolujen kanssa. Tässä tutkimuksessa on tutkittu NK-solujen esiintymistä ja niiden merkitystä ihmisen keuhkossa (astmapotilaat). Ihmisestä peräisin olevia näytteitä (keuhkokudos, bronkoskopia, veri, keuhkohuuhteluneste, sylki) tutkitaan metodologisesti uusin menetelmin. Ammattiastman aiheuttajia tunnetaan yli 250 ja uusia todetaan vuosittain. Astmaa aiheuttavat altisteet voivat olla valkuaisaineita, polysakkarideja ja peptidejä (eläinepiteelit, jauhot, entsyymit), kemikaaleja (orgaaniset happoanhydridit, isosyanaatit, formaldehydi), lääkeaineita ja metallien suoloja. Ammattiastman mekanismit ovat edelleen vain osittain tiedossa. Tämän tutkimuksen keskeisenä tavoitteena on astmaan liittyvien mekanismien selvittäminen ja hoitomuotojen kehittäminen sekä allergia- ja astmadiagnostiikan parantaminen sekä astmaa aiheuttavien altisteiden vaikutusten selvittäminen keuhkossa. NK-solujen fenotyypin ja biologisen toiminnan syvällisellä analysoinnilla on mahdollista saada uutta tietoa tämän solutyypin merkityksestä astman syntymiseen, kehittymiseen ja sen oireiden ilmenemiseen.

6 TAVOITTEET Luonnolliset tappajasolut, NK -solut, muodostavat päälymfo-syyttipopulaation ihmiskeuhkoissa, peräti 10 % soluista ihmiskeuhkoissa kuuluvat tähän soluluokkaan. Tästä huolimatta niiden toiminnasta ihmisen astmassa tiedetään hyvin vähän. Nämä solut muodostavat yhteyksiä dendriittisolujen, makrofagien, T-solujen ja endoteelisolujen kanssa. Astmaan liittyvien mekanismien selvittäminen A. NK solujen karakterisointi terveillä ja astmaattisilla yksilöillä erityyppisissä näytteissä - NK-solujen kuvantaminen ihmiskudoksessa (bronkiaalibiopsiat ja keuhkokudos) sekä vuorovaikutus muiden solutyyppien kanssa. Astmaa aiheuttavien altisteiden vaikutusten tunteminen keuhkossa sekä allergia- ja astmadiagnostiikan parantaminen B. NK-solujen kemokiiniekspression tutkiminen vasteena relevanteille allergeeneille Tutkimuksessa minulla on ollut mahdollisuus osallistua ns. keinokeuhkon ja -ihon kehittämistyöhön. Karoliinisessa Instituutissa (KI) on jo aiemmin ollut kehitteillä ns. keinokeuhkomalli, jonka kehittäminen mahdollistaisi allergeenien (esim. proteiinit, kemikaalit, lääkeaineet) vaikutusten tutkimisen ihmisen todellista keuhko- ja/tai ihokudosta ja sen toimintaa läheisesti jäljittelevässä ympäristössä.

7 Menetelmällä pyritään tutkimaan erilaisia allergeeneja, niiden vaikutusta kudoksessa, niiden vuoro-vaikutuksia muiden solutyyppien kanssa, uusia altisteita, ristireagoivia altisteita sekä monia muita mekanismeja, joiden tunteminen on välttämätöntä astma- ja allergiadiagnostiikkaa kehitettäessä. TOTEUTUS Potilasnäytteet, menetelmät ja tutkimusasetelma Tutkimus on toteutettu yhteistyössä Karoliinisen Yliopistosairaalan (Tukholma) kanssa. Siten tutkimukseen on saatavissa potilasnäytteitä: - keuhkokudosta (kirurgisista toimenpiteistä) - keuhkobiopsiat (bronkoskopia) - keuhkohuuhteluneste (BAL) ja harjausnäytteet (potilaat + terveet kontrollinäytteet) - sputum-näytteet (astmaatikot ja terveet kontrollit) - perifeerinen verinäyte (astmaatikot ja terveet kontrollit) Kaikkiin yllämainittujen näytteiden ottamiseen ja tutkimiseen on myönnetty eettiset luvat (Karoliininen Instituutti). Yllämainituista potilasnäytteistä sekä terveistä kontrolleista, mahdollisuuksien mukaan, eristetään lymfosyytit, jotka analysoidaan solutasolla KI:n laboratoriossa kehitetyillä tekniikoilla (mm. multiparametrivirtaussytometria) mahdollistamaan samanaikaisen fenotyyppisen ja funktionaalisen analyysin humaani NK-soluista. Fenotyyppisellä karakterisaatiolla määritetään reseptori- ja ligandiekspressio, funktionaalisella analyysillä määritetään solujen proliferaatio, signalointi, intrasellulaarinen lymfokiiniekspressio sekä sytotoksisuus.

8 Kuvantamistekniikoilla (immunofluoresenssimikroskopia) täydennetään tutkimusta visualisoimalla solujen välisiä interaktioita ja eri lymfosyyttialaluokkien 3D -järjestymistä kudoksissa. Tutkimuksen tarkoituksena on käyttää näitä tekniikoita yllämainittuihin kudos- ja solunäytteisiin. TULOKSET Tutkimusprojekti voidaan jakaa viiteen osioon: 1) Tämänhetkisen tietämyksen evaluointi astmassa; laaja kirjallisuushaku ja katsaus. 2) Kliinisten näytteiden organisointi- ja keräys. 3) Uusien menetelmien ja tekniikoiden suunnittelu, kehittäminen ja käyttöönotto. 4) Fenotyyppisten ja funktionaalisten tutkimusten tekeminen näytteillä. 5) Tiedon analysointi ja julkaisu : - Projekti aloitettiin laajalla kirjallisuuskatsauksella evaluoimalla tämänhetkistä, olemassa olevaa tietoa NK-solujen merkityksestä astmassa. - Multiparametrisen virtaussytometrin käyttöönotto tutkimalla laajasti NK-solujen reseptoriekspressiota CD4+CD28- T-soluilla. Tässä tutkimuksessa käytettyä vastaainepaneelia voidaan hyödyntää eri lähteistä peräisin olevien NK-solujen karakterisoinnissa.

9 - 3D keuhkomallia hyödyntävät tutkimukset aloitettiin käyttämällä perifeerisestä verestä eristettyjä NK-soluja keuhkomallissa. Voitiin todeta, että NK-solut pysyvät elinvoimaisina tässä mallissa ja mallia kehitetään edelleen NK-solujen toiminnan karakterisoimiseksi. - Immunofluoresenssimikroskopiaan perustuvaa visualisointitekniikkaa on kehitetty CD56+NKp46+ NK-solujen toteamiseksi bronkoskopia-näytteistä sekä keuhkokudoksesta : - Visualisointitekniikoita kehitetään edelleen NK-solujen värjäämiseksi ihmisen keuhkokudoksessa. - Myös muiden kuin bronkoskopia- ja keuhkokudosnäytteiden NK-solujen alatyypin, lokalisaation sekä reseptoriekspression karakterisointiin liittyvät työt on aloitettu: O bronkoskopianäytteet; immunofluoresenssivärjäykset O keuhkohuuhteluneste; virtaussytometria O sylkinäytteet; virtaussytometria O perifeerinen veri; virtaussytomeria C. NK solujen fenotyyppi karakterisoidaan multiparametrisella virtaussytometrilla, joka mahdollistaa samanaikaisen fenotyyppisen (reseptori- ja ligandiekspressio) sekä funktionaalisen (proliferaatio, sytotoksisuus, intrasellulaarinen lymfokiiniekspressio) NK-solujen analyysin. NK-solut muodostavat eri alaluokkia, jotka eroavat anatomiselta sijainniltaan, toiminnoiltaan sekä fenotyypiltään. Ihmisen perifeerisessä veressä suurin osa (95%) NK-soluista kuuluvat CD56dimCD16+

10 sytolyyttiseen NK-solualaluokkaan ja vähemmistö (5%) veren NK-soluista ovat CD56brightCD16- -alaluokkaan kuuluvia. Eri NK-solualaluokat eroavat reseptoriekspressioltaan, mikä saattaa merkitä eri NKsolualaluokkien erilaista kulkeutumisvalmiutta kohti tulehtunutta kudosta kuten astmaattinen keuhkokudos. Esimerkiksi lysofosfolipidi sfingosiini 1- fosfaatin (S1P 5 ), joka ekspressoituu ihmisen NK-soluissa, on hiljattain todettu tarvittavan NK-solujen siirtymisprosessissa tulehtuneeseen kudokseen. Eri lymfosyytti-alaluokkien kulkeutumista säätelevien mekanismien tutkiminen ja selvittäminen mahdollistaa näiden solualatyyppien kohde-kudokseen kulkeutumiseen vaikuttavien reseptorispesifisten hoitomuotojen kehittämisen. Tässä tutkimuksessa pyritään selvittämään minkälaiset reseptorit (inhibitoriset, sytotoksiset vai aktivoivat reseptorit) ekspressoituvat ihmisen NK-solujen pinnalla, jotka on eristetty erilaisista näytteistä veri, sylki, keuhkohuuhteluneste, keuhkokudos. Työssä on onnistuneesti eristetty NK-soluja keuhkohuuhtelunesteestä ja NKsolujen karakterisaatioon keskitytään parhaillaan. Myös NK-solujen eristys aloitettiin niiden karakterisoimiseksi ihmisen keuhkokudoksesta.

11 Immunofluoresenssi, immunohistokemialliset tekniikat ja konfokaalimikroskopia Ihmisen NK -solut määritellään CD56+CD3-lymfosyyteiksi. Äskettäin aiemmin tuntematon NK-solutyyppi tai NKsolujen toimintaa läheisesti muistuttava solutyyppi löydettiin mahalaukusta. Nämä ovat RORγt ekspressoivat LTi (lymphoid tissue inducer) solut, jotka saattavat ekspressoida NK-solureseptoreita. Kuitenkaan näiden ei ole vahvistettu olevan tyypillisiä NK-soluja ja niiden toiminta on tuntematon. NKp46, joka on transmembraaninen glykoproteiini, on hiljattain esitetty olevan yhteinen markkeri NK-soluille useimmilla nisäkkäillä; NKp46 ekspressoituminen solun pinnalla määrittelee NK-solut ihmisellä, hiirikannoilla ja ainakin kolmella apinalajilla. Tässä tutkimuksessa on kehitelty värjäysmenetelmää NKp46-proteiinin värjäämiseksi ihmiskudoksessa. Kuvasssa immunofluoresenssivärjäys CD56+ NK-soluille (punainen) ihmisen kudoksessa (maksa). Uutta värjäysmenetelmää käytetään ihmisen NK-solujen lokalisaation tutkimiseksi keuhkokudoksessa. 3-D keinotekoinen keuhkomalli 3-D keuhkomalli on kehitetty Karoliinisessa Instituutissa ja se perustuu soluviljelytekniikkaan, jossa hyödynnetään epiteelisoluja, fibroblasteja ja kollageenia. Tässä tutkimuksessa ihmisestä peräisin olevia NK-soluja on injisoitu tähän malliin ja niiden on todettu pysyvän elinvoimaisina tässä mallissa noin kahden viikon ajan (julkaisematon tieto, Anthoni et al.) Tätä mallia kehitetään parhaillaan ja sitä voidaan käyttää:

12 D. Kun tutkitaan NK-solujen kulkeutumista verrattuna muihin immuunisoluihin E. Solu-solu interaktioiden (NK-solu - muut immuunisolut) tutkimiseen F. NK-solujen pinnalla ekspressoituvien reseptoreiden vaihteluun relevanttien allergeenien lisäyksen jälkeen Myös NK-solujen kemokiiniekspressiota vasteena relevanteille allergeeneille voidaan tutkia tässä mallissa. JOHTOPÄ ÄTÖKSET JA TUTKIMUKSEN HYÖTY Astmaan liittyvien mekanismien selvittäminen ja hoitomuotojen kehittäminen. Ammattiastman mekanismit ovat edelleen vain osittain tiedossa. Jotkin altisteet, esim. jotkin eläin- ja kasviperäiset tai pienimolekyyliset kemikaalit aiheuttavat allergisen astman ja voivat muodostaa näille aineille spesifisiä IgE-luokan vastaaineita. Di-isosyanaattien aiheuttamassa astmassa spesifistä IgE-vasta-ainetta kehittyy noin 20% potilaista. Toiset kemikaalit taas, kuten esim. formaldehydi, aiheuttavat IgE-responssin erittäin harvoin. Tapaturmaisen altistumisen seurauksena, jolloin altistetasot voivat olla hyvin korkeat, ärsyttävät kemikaalit voivat aikaansaada äkillisen keuhkoputkien tulehduksen, mikä johtaa keuhkoputkien suurentuneeseen supistumisalttiuteen. Ammattiastman toteamisen edellytyksenä on, että sen alkusyyksi voidaan osoittaa herkistyminen työssä esiintyvälle aineelle. Astman diagnosointi on usein vaikeaa, liittyen astman heterogeenisiin ominaisuuksiin ja oireiden vaihtelevuuteen. Astman heterogeenisten ominaisuuksien ja oireiden vaihtelevuuden vuoksi on selkeä tarve parantaa astman diagnosointimahdollisuuksia sekä kehittää mahdollisia hoitomenetelmiä. Nämä tavoitteet eivät ole mahdollisia ilman

13 tämänhetkistä selkeämpää käsitystä astman syntymekanismeihin keskeisesti vaikuttavista tekijöistä. Lukuisat tutkimukset ovat tuoneet esiin erilaisten immuunijärjestelmän solujen merkityksen astman kehittymiselle. Esimerkiksi Th1 ja Th2 -solujen lisäksi T-solujen alatyypit on liitetty kroonisiin keuhkosairauksiin. Näihin kuuluvat Th17 -solut ja tyypin 1 CD8+ T-solut, joiden on ajateltu tuhoavan keuhkoputkien soluseinämää aiheuttaen emfyseemaa. Toinen astmassa tutkittu solutyyppi on natural killer T (NKT) -solut. Nämä lymfosyytit tuottavat proinflammatorisia sytokiineja (esim IFN- ) ja anti-inflammatorisia sytokiineja (esim. IL-4, IL-5, IL-10, IL-13). Kuitenkin yllättäen - kirjallisuudessa ei ole juurikaan tutkimuksia NK-soluista ihmisen keuhkoissa tai NK-solujen merkityksestä astman patogeneesille. Koska tietoa NK-soluista ihmiskeuhkoissa tai NK-solujen merkityksestä astman patogeneesissä ei ole, tämän tutkimuksen tarkoituksena on selvittää NK-solujen toimintaa ja fenotyyppiä ihmiskeuhkoissa sekä niiden merkitystä ihmisellä todetussa astmassa. NK-solujen fenotyypin ja biologisen toiminnan syvällisellä analysoinnilla Karoliinisessa Instituutissa käytössä olevilla menetelmillä on mahdollista saada uutta tietoa tämän solutyypin merkityksestä astman syntymiseen, kehittymiseen ja sen oireiden ilmenemiseen. Allergia- ja astmadiagnostiikka ja sen parantaminen sekä astmaa aiheuttavien altisteiden vaikutusten tunteminen keuhkossa. Tutkimuksessa minulla on ollut mahdollisuus osallistua ns. keinokeuhkon ja -ihon kehittämistyöhön. Karoliinisessa Instituutissa on jo aiemmin kehitetty keinokeuhkoa ja -ihoa (human artificial lung and skin), jota tässä tutkimuksessa pyritään kehittämään siten että sitä voidaan käyttää NK-solujen toiminnan tutkimiseksi sekä allergeenien (esim. proteiinit, kemikaalit, lääkeaineet) vaikutusten tutkimiseksi ihmisen todellista keuhko- ja/tai ihokudosta ja sen toimintaa läheisesti jäljittelevässä ympäristössä. Menetelmällä voidaan tutkia erilaisia allergeeneja, niiden vaikutusta kudoksessa, niiden vuorovaikutuksia muiden solutyyppien kanssa, uusia altisteita, ristireagoivia altisteita sekä monia muita mekanismeja, joiden tunteminen on välttämätöntä

14 astma- ja allergiadiagnostiikkaa kehitettäessä. Keinokudosten käyttö antaa relevanttia tietoa nimenomaan ihmisen immunologisen järjestelmän toiminnasta, tällä hetkellä saatavissa oleva tieto pohjautuu eläinmalleihin. Työsuojelurahasto on osallistunut hankkeen toteuttamiseen.

15 JULKAISUJA Ljunggren HG and Kärre K. J Exp Med (1985); 162: Kärre K, Ljunggren HG, Piontek G, Kiessling R. Nature (1986); 319: Ljunggren HG, Yamasaki T, Collins P, Klein G, Kärre K. J Exp Med (1988); 167: Höglund P, Ljunggren HG, Öhlen C, Ährlund-Richter L, Scangos G, Bieberich C, Jay G, Glein G, Kärre K. J Exp Med (1988); 168: Höglund P, Öhlen C, Carbone E, Franksson L, Ljunggren HG, Latour A, Koller B, Kärre K. Proc Natl Acad Sci USA (1991); 88: Glas R, Sturmhöfel K, Hämmerling GJ, Kärre K, Ljunggren HG. J Exp Med (1992); 175: Chambers B, Salcedo M, Ljunggren HG. Immunity (1996); 5: Korsgren M, Persson CGA, Sundler F, Bjerke T, Hansson T, Chambers BJ, Hong S, Van Kaer L, Ljunggren HG, Korsgren O. J Exp Med (1999); 189: Ljunggren HG, Malmberg K. Nature Rev Immunol (2007); 7: Bryceson YT, Ljunggren HG. Nature Immunol (2008); 9: Malmberg K, Ljunggren HG. Nature Immunol (2009); 10:

16