Astman ja atopian genetiikka miten ehdokasgeenitutkimuksien tuloksia tulkitaan? Tarja Laitinen, Lauri A. Laitinen ja Juha Kere

Genomi Astman ja atopian genetiikka miten ehdokasgeenitutkimuksien tuloksia tulkitaan? Tarja Laitinen, Lauri A. Laitinen ja Juha Kere Astman ja atopian genetiikaa käsittelevien julkaisujen määrä on viimeisten viiden vuoden aikana kasvanut useisiin satoihin. Suurimmassa osassa niissä julkaistuista tutkimuksista on verrattu jonkin sairauden patogeneesin pohjalta valittujen geenien monimuotoisuutta kyseistä sairautta potevissa ja verrokkeissa. Uusia ehdokasgeenejä on esitelty lyhyessä ajassa kymmeniä. Monia havaintoja ei kuitenkaan ole voitu toistaa myöhemmissä tutkimuksissa, mikä on aiheuttanut hämmennystä tutkijoiden keskuudessa ja vähentänyt koko tieteenalan uskottavuutta. Tilastollisesti ja biologisesti merkitsevän assosiaation ongelmaa pohdittiin genetiikan alan johtavan lehden Nature Geneticsin pääkirjoituksessa toukokuussa 1999. Ns. ehdokasgeenien alleeliassosiaatiotutkimuksista kertovien artikkelien todettiin olevan riski sekä lukijalle että julkaisevalle lehdelle, mutta toisaalta assosiaatiotutkimuksen arvo myös tunnustettiin ja hyviä tutkimuksia luvattiin julkaista vastakin. Julkaistaviksi valittavissa tutkimuksissa tullaan kiinnittämään huomiota erityisesti otoskokoon, assosiaation tilastolliseen merkitsevyyteen ja löydöksen biologiseen järkeenkäypyyteen. Alkuperäinen havainto tulee myös voida toistaa toisessa, riippumattomassa otoksessa. Monien Mendelin lakien mukaisesti periytyvien sairauksien geenivirhe on selvinnyt koko kromosomiston kattavan geenipaikannuksen avulla. Tämä on innoittanut tutkijoita aloittamaan myös tavallisten tautien molekyyligeneettisen tutkimuksen, vaikka tutkimusasetelmassa tarvitaankin kymmenien perheiden asemesta satoja. Suurien näytemäärien tutkimisen ja hallinnan ovat tehneet mahdolliseksi laboratoriomenetelmien automatisoiminen ja nopeasti kehittynyt tietotekniikka. Astman osalta koko genomin kattavia geenihakuja on julkaistu neljä (Daniels ym. 1996, The Collaborative Study on the Genetics of Asthma 1997, Ober ym. 1998, Wjist ym. 1999). Niistä vain yhdessä raportoitiin tilastollisesti merkitseviä löydöksiä kromosomeista 4q, 6p21, 7p15, 11q13, 13q ja 16q (Daniels ym. 1996). Vaikka jokaisella näistä alueista sijaitsee astman patogeneesin kannalta mielenkiintoisia geenejä, on hyvä muistaa, että kytkentäalueet ovat laajoja ja niistä kullekin mahtuu tunnettujen geenien lisäksi satoja tuntemattomia. Genomin tutkimuksen myötä tieto näistä geenialueista kasvaa nopeasti, mikä antaa uusia mahdollisuuksia jatkotutkimuksille. Suurin osa sadoista astmageenejä koskevista julkaisuista on vielä keskittynyt yksittäisten tunnettujen geenien monimuotoisuuteen ja sen merkitykseen sairauden puhkeamisessa (ns. ehdokasgeenitutkimukset). Julkaisut on koottu yhteen tietokantaan, johon voi helposti tutustua Internetin kautta (Asthma Gene Database cooke. gsf.de). Analyysimenetelmiä on useita (taulukko 1). Duodecim 2000; 116: 1743 9 1743

Taulukko 1. Paljon käytettyjä strategioita geenivaikutusten etsimiseksi tavallisissa taudeissa. Strategia Periaate Edut Haitat Kytkentäanalyysi Verrataan taudin periytymistä Tilastollisesti voimakas menetel- Tuottaa vääriä negatiivisia tuloksia, jos perheissä sellaisten DNA- mä, jos tauti selvästi periytyvä periytymismalli väärä tai geenejä merkkijaksojen periytymiseen, ja malli oikea useita joiden sijainti kromosomeissa Sukujen etsiminen työlästä tunnetaan Sisarus- tai muu Tutkitaan, onko sairailla sisa- Ei edellytä mitään etukäteis- Edellyttää yleensä melko suuria aisukulaisparianalyysi ruksilla jossain kohdassa tietoa periytymismallista neistoja, tilastollisesti heikko meneperimää satunnaista telmä useammin yhteisiä vanhem- Paikannustarkkuus huono milta perittyjä DNA-merkkijaksoja (sisaruksilla keskimäärin puolet perintötekijöistä on yhteisiä) Assosiaatioanalyysi Onko jokin DNA-merkki- Ei edellytä mitään etukäteis- Hyvin herkkä verrokkien valinta ominaisuus potilailla tietoa periytymismallista virheille, tuottaa vääriä positiivisia yleisempi kuin verrokeilla? tuloksia Tilastollisesti voima vaihtelee ja on heikko, jos testataan sokeasti lukuisia geenejä Eläinmallit Tutkitaan luonnollisen tai Aineiston kokoa helppo kas- Vastaavuus ihmisen tautien kanssa kokeellisen taudin perinnöl- vattaa tarpeen mukaan epävarma ja usein huono lisyyttä koe-eläimillä ja teh- Mahdollisuus kokeellisiin tautidään esim. kytkentäanalyysi malleihin Perheaineisto antaa vahvuutta ja mahdollisuuden monipuoliseen perinnöllisyystutkimukseen. Suurten perheaineistojen kerääminen on kuitenkin työlästä ja kallista verrattuna yksittäisten potilaisnäytteiden keruuseen. Kustannustekijät ja assosiaatiotutkimuksen tilastollisen analyysin näennäinen yksinkertaisuus ovat tehneet ne ehdokasgeenitutkimuksessa hyvin suosituiksi. Assosiaatiotutkimuksella saattaa olla myös etuja totunnaiseen kytkentäanalyysiin nähden, kuten ApoE*4-alleeliassosiaatio Alzheimerin tautiin osoitti (Liu ym. 1996). Jos tutkittava sairaus on hyvin tavallinen, kuten astma (esiintyvyys 5 15 %) ja IgE-välitteiset allergiat (esiintyvyys 15 30 %), on mahdollista, että samankin perheen jäsenten sairastuminen johtuu eri geeneistä (sairauden fenokopiot). Samoin alttiusalleelin vähäinen penetranssi (kaikki alttiusalleelin kantajat eivät sairastu) heikentää kytkentäanalyysin voimaa. Assosiaatiotutkimuksella voi olla erityisasema eristyneissä väestöissä, joissa geeniperimä on tavallista homogeenisempi ja taudin puhkemiseen vaikuttavien alttiusgeenien määrä pienempi. Vasta viime aikoina on tunnetuista geeneistä alettu etsiä järjestelmällisesti monimuotoisuutta. Aluksi ehdokasgeenitutkimuksessa jouduttiin turvautumaan tutkittavan geenin lähellä esiintyviin monimuotoisiin geenimerkkeihin. Niiden alleelitaajuuksia analysoitiin sairastuneilta ja verrattiin verrokkien taajuuksiin olettaen, että geenimerkkien monimuotoisuus tunnistaisi alttiuskromosomin. Geenimerkkien paikantaminen suhteessa tutkittavaan geeniin oli monesti epätarkkaa. Genomitutkimuksen myötä geenien ja geenimerkkien sijainti tunnetaan koko ajan paremmin. Tavallisten kansantautien ei uskota puhkeavan sellaisten geenivirheiden seurauksena, joissa toiminnallista proteenia ei synny lainkaan (esim. geenin deleetiot, lukukehyksen muutokset). Jo yksikin emäsmuutos DNA-molekyylissä (pistepolymorfia) voi aiheuttaa koodattavan proteiinin kolmiulotteisessa rakenteessa merkitseviä muutoksia, varsinkin jos aminohappo korvautuu biokemiallisilta ominaisuuksiltaan erilaisella aminohapolla tai muutos sijaitsee proteiinin toiminnan kannalta keskeisellä alueella. Tämä tarkoittaa sitä, että sairastuneellakin geeni koodaa 1744 T. Laitinen ym.

toimivaa proteiinia mutta toiminnallisesti erilaista verrattuna väestössä esiintyvän valta-alleelin koodaamaan proteiiniin (ns. alttiusalleeli tai toiminnallinen geenivariantti). Kullakin meistä arvellaan olevan 24 000 40 000 emäseroa äidiltä ja isältä perittyjen geenien koodaavien alueiden välillä (alle yksi heterotsygoottinen emäspari geeniä kohti) (Cargill ym. 1999). Osa niistä ei muuta geenin tuottaman proteiinin rakennetta lainkaan (silent polymorphism), osa ei aminohappopoikkeamasta huolimatta muuta proteiinin toimintaa ja osa muuttaa syntyvän proteiinin toimintaa, minkä seurauksena henkilö on alttiimpi sairastumaan. Koska kyseessä on pikemminkin toiminnallinen eroavaisuus kuin geenivirhe, ympäristötekijöillä ja geenien interaktioilla on suuri vaikutus sairauden puhkeamiseen. Tavallisten tautien alttiusalleelien merkitys sairauden puhkeamisessa on siis aina sidoksissa paikkaan ja aikaan, jossa tutkittavat elävät. Erot esimerkiksi ilmastollisissa olosuhteissa, ravinnossa, elintasossa, lapsuuden ajan infektiokirjossa tai rokotuskäytännössä voivat aiheuttaa todellista vaihtelua tutkittavien populaatioiden välillä. Tiedetään myös, että atooppisten sairauksien esiintyvyydet poikkeavat toisistaan niin, että ne ovat suurimmillaan anglosaksisissa maissa ja pienehköjä Pohjoismaissa. Tätä voivat osaltaan selittää geneettiset erot alttiusalleelien kirjossa ja taajuuksissa. Koska viime vuosina on julkaistu runsaasti nimenomaan assosiaatiotutkimuksia, joiden tulosten arvionti on osoittautunut puutteelliseksi tai jopa virheelliseksi, keskitymme tässä artikkelissa seikkoihin, joihin lukijan tulee kiinnittää huomiota arvioidessaan assosiaatiotutkimuksen tuloksen merkitsevyyttä. Monet tässä käsiteltävät seikat ovat tärkeitä myös muissa geenitutkimuksissa, joskin niiden painotuksessa voi olla eroa. Astman ja atopian ehdokasgeenejä Taulukossa 2 on luettelo geeneistä, joita on tutkittu joko assosiaatiota tai kytkentää käyttäen astmassa tai siihen vahvasti korreloituvissa ilmiöissä (veren suuri eosinofiliilipitoisuus, epäspesifinen bronkiaalinen hyperreaktiivisuus, seerumin suuri kokonais-ige-pitoisuus, allergiat ihotestien tai seerumin spefisten IgE-pitoisuuksien perusteella määritettyinä). Julkaistuja tutkimuksia on satoja ja vain harva niistä läpäisee tulosten ja niistä tehtyjen päätelmien kriittisen tarkastelun. Mikään luettelon geeneistä ei ole saavuttanut yhtä kiistatonta asemaa astman alttiusgeeninä kuin esimerkiksi ApoE*4 Alzheimerin taudissa, HLA-DR*3/4 tyypin 1 diabeteksessa, tai HLA-DQ*2 keliakiassa. Eniten tutkimuksia on julkaistu kromosomista 5q31, jossa sijaitsee useita allergiseen tulehdukseen vaikuttavia geenejä (taulukko 2). Genomiin ryväksinä sijoittuneiden geeniperheiden lisäksi mielenkiintoisia tutkimuskohteita ovat kokonaiset signaalinvälittäjäketjut. Interleukiini 4 (IL4), sen reseptori IL4RA tai STAT6-geenin (välittää tämän reseptorin aktivoitumista tumaan) poisto hiiren genomista aiheuttaa sen, että hiirelle ei kehity hengitysteiden eosinofiilista tulehdusta eikä IgEvastetta kananmunan valkuaiseen toistuvasta altistuksesta huolimatta. Vaikka eläinmallin perusteella voidaan olettaa, että IL4-viestinnällä on keskeinen merkitys atooppisen astman patogeneesissä, on edelleen epäselvää, esiintyykö ihmisellä näissä geeneissä toiminnallisia variantteja, jotka altistavat atooppisille sairauksille. Jotta jokin geeni voisi olla geneettinen säätelijä, on väestössä esiinnyttävä siitä erilaisia toiminallisia muotoja. Monomorfinen geeni eli geeni, jossa ei esiinny rakenteellista variaatiota yksilöiden välillä, ei voi toimia geneettisenä säätelijänä. Potilaiden valinta Assosiaatiotutkimus on altis erityisesti virheille potilasaineiston ja verrokkien valinnassa (taulukko 3). Monitekijäisten sairauksien diagnostiset kriteerit ovat harvoin täysin yksiselitteiset ja ovat usein muotoutuneet hoidollisista lähtökohdista. Molekyyligeneettisestä näkökulmasta katsottuna potilaiden fenotyypityksen tärkein kriteeri on löytää ne perheet tai potilaat, joissa sama geeni tai samat geenit ovat tärkeitä taudin puhkeamisen kannalta. Yleisimmin tämä ongelma on pyritty ratkaisemaan rajaamalla potilaiden fenotyyppi mahdollisimman kapeaksi tai tutkimalla jotain astmaan vahvasti assosioituvaa mitatta- Astman ja atopian genetiikka miten ehdokasgeenitutkimuksien tuloksia tulkitaan? 1745

Taulukko 2. Geenejä, joiden monimuotoisuutta on tutkittu atooppisissa sairauksissa alleeliassosiaation tai kytkennän keinoin. Koska geeneillä on monia nimiä, taulukkoon on lisätty Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) -tietokannan numero (www.ncbi.nlm.nih.gov/omim), jonka avulla voi saada päivitettyä tietoa kunkin geenin nimistä, rakenteesta, monimuotoisuudesta ja mahdollisista tautikytkennöistä sekä tärkeimmistä julkaisuista. Geenin englanninkielinen nimi Lyhenne OMIM-numero Sijainti Arachidonate 5-Lipoxygenase ALOX5 152390 10 Interleukin 10 IL10 124092 1q31 Clara Cell-Specific 16 kd Protein CC16 192020 11q12.3-q13.1 Fc Fragment of IgE High Affinity Receptor, β subunit FCER1B 147138 11q13 γ-interferon IFNG 147570 12q14 Neuronal nitric oxide synthase NOS1 163731 12q24 Endotelin B Receptor EDNRB 131244 13q22 α-1-antitrypsin AAT 14q Mast cell chymase MCC 118938 14q11 T Cell Antigen Receptor, a subunit TCRA 186880 14q11.2 α-1-antichymotrypsin AACT 107280 14q32.1 Sialophorin, Leukosialin CD43 182160 16p11.2 Interleukin 4 Receptor, α subunit IL4RA 147781 16p12.1-11.2 Eotaxin SCYA11 601156 17q21 Angiotensin-converting enzyme ACE 17q23 Fc Fragment of IgE Low Affinity Receptor CD23, FCER2 151445 19p13.3 Complement component 3 C3 120700 19ptr Transforming Growth Factor, β1 subunit TGF-B1 190180 19q13.1-q13.3 Fibroblast Growth factor 1 FGF1 131220 5q31 Interleukin 13 IL13 147683 5q31 Interleukin 9 IL9 146931 5q31.1 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor GM-CSF 138960 5q31.1 Interferon Regulatory Factor 1 IRF1 147575 5q31.1 Interleukin 3 IL3 147740 5q31.1 Interleukin 4 IL4 147780 5q31.1 Interleukin 5 IL5 147850 5q31.1 Platelet-Derived Growth Factor Receptor, β subunit PDGFRB 173410 5q31-32 Monocyte Differentation Antigen CD14 158120 5q31-33 β2- Adrenergic Receptor ADRB2 109690 5q32-34 Leukotriene C4 synthase LTC4S 246530 5q35 Transporter antigen peptides gene TAP1 170261 6p Human Leukocyte Antigen A HLA-A 142800 6p21.3 Human Leukocyte Antigen B HLA-B 142830 6p21.3 Human Leuckocyte Antigen DR1, β subunit HLA-DRB1 142857 6p21.3 Tumor Necrosis Factor A TNFA 191160 6p21.3 Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator CFTR 602421 7q31.2 T Cell Antigen Receptor, β subunit TCRB 186930 7q35 Interleukin 9 Receptor, α subunit IL9RA 300007 Xq28/Y12 vaa suuretta, kuten seerumin IgE-pitoisuutta taikka metakoliini- tai histamiini-altistuksen PD 15 -arvoja. On todennäköistä, että koko maailman väestössä ehkä kymmenet eri geenit ovat tärkeitä astman puhkeamisen kannalta. Eri populaatioissa, perheissä ja yksilöissä alttiusgeenien kirjo vaihtelee, ja yksilötasolla niistä vain murto-osa riittää aiheuttamaan sairauden puhkeamisen. Laskelmilla, jotka perustuvat astman yleisyyteen väestössä, astman periytymiseen perheissä sekä eroihin monotsygoottisten ja ditsygoottisten kaksosparien sairastuvuudessa, voidaan astman periytyminen mallintaa jopa yhden pääasiallisen alttiusgeenin avulla; muut lokukset lisäävät riskiä enää suhteellisen vähän (Mannila ym., julkaisematon havainto). 1746 T. Laitinen ym.

Taulukko 3. Seikkoja, joihin tulee kiinnittää huomiota arvioitaessa raportoidun alleeliassosiaation merkitystä sairauden puhkeamisessa. Potilaiden valinta Yhtenäiset kliiniset kriteerit Subfenotyypit Dikotomiset vs jatkuvat muuttujat Lisäkriteerit (esim. sairautta todettu 1. asteen sukulaisilla, varhainen sairastuminen) Verrokkien valinta Väestöverrokit (fenotyyppi tunnettu tai tuntematon) Perheverrokit (fenotyyppi tunnettu tai tuntematon) Assosiaation tilastollisen merkitsevyys Analyysimenetelmän valinta Tuloksen tilastollisen merkitsevyyden testaus Moninkertaisen testauksen ongelmat Empiiriset menetelmät tilastollisen merkitsevyyden testauksessa (simulaatiot) Tutkimuksen toisto alkuperäisestä otoksesta riippumattomassa aineistossa Assosiaation varmistaminen esim. eri populaatiossa Tutkimuksen voiman testaus Tutkittavan lokuksen pienin sairastavuuteen kohdistuva vaikutus, joka vielä voidaan todeta kyseisessä aineistossa käytetyillä menetelmillä Tutkittavan lokuksen suurin sairastavuuteen kohdistuva vaikutus, joka vielä voidaan sulkea pois kyseisessä aineistossa käytetyillä menetelmillä Assosiaation biologinen merkitys Ehdokasgeenin toiminnan tutkiminen kohde-elimessä in vitro ja in vivo -menetelmin Alttiusalleelin vs valta-alleelin toiminnalliset erot Vaikka luotettava ja yhtenäinen diagnostiikka on koko geneettisen tutkimuksen kulmakivi, ei tiedetä, kuinka hyvin monitekijäisten sairauksien fenotyyppi korreloi potilaan genotyyppiin. Mendelin lakien mukaan periytyvistä sairauksista tiedetään, että taudin ilmiasu voi vaihdella paljon, vaikka kyseessä olisi vain yhden geenin sama mutaatio (esim. Marfanin oireyhtymän tai neurofibromatoosin vaikeusaste ja elinkomplikaatiot sisaruksilla). Sairauden ilmiasu voi vaihdella vieläkin rajummin, kun kyseessä on saman geenin kaksi eri mutaatiota. Esimerkkinä tästä on CFTR-geeni, jonka mutaatiot aiheuttavat vaihtelevan kirjon sairauksia vaikeasti invalidisoivasta kystisestä fibroosista lapsettomuuteen, joka miehellä voi johtua siemenjohtimen molemminpuolisesta puutoksesta. Astmassa taudinkuvaa muovaavia tekijöitä tunnetaan monia, esimerkiksi ammatilliset altistukset, tupakointi, lihavuus ja huono hoitomyöntyvyys. Sellaiset seikat kuin varhainen sairastuminen, poikkeava taudinkuva tai se, että suvussa on useita sairastuneita, voivat joissain tilanteissa olla parempia merkkejä geenitutkimuksiin soveltuvista potilaista kuin hyvin ahtaasti rajattu kliininen taudinkuva (Lander ja Schork 1994). Astmaa tutkittaessa tästä on saatu kokemusta suomalaisilla kaksosilla. Geneettisen komponentin merkitys sairastuvuudessa on havaittu aikuisastmaatikoilla (kaikki yli 28-vuotiaat) selvästi pienemmäksi (35 40 %) kuin 16-vuotiaiden kaksosten ikäkohortissa (65 79 %) (Nieminen ym. 1991, Laitinen ym. 1998). Verrattaessa nuoria astmaatikkoja, joiden vanhemmilla oli todettu astma, sellaisiin nuoriin, joiden vanhemmat olivat oireettomia, geneettisten tekijöiden todettiin selittävän sairauden syntyä ympäristötekijöitä merkitsevämmin (87 vs 57 %). Verrokkien valinta Assosiaatiotutkimus on mielekäs vain silloin, kun verrokit eivät eroa geneettiseltä alkuperältään potilaista. Jos väestöpohjaisten verrokkien fenotyyppiä ei tunneta ja jos alttiusalleelin penetraatio on vähäinen (alle 50 % alleelin kantajista sairastuu), assosiaatio laimenee. Tutkimuksen voima lisääntyy, jos verrokit voidaan valita oireettomien joukosta. Astman tai astman kaltaisten oireiden pois sulkeminen voi olla vaikeaa ja vaatii usein vielä perusteellisemman tutkimuksen kuin niiden toteaminen. Astmaan voi sairastua myös myöhemmällä iällä, mutta tapaus-verrokkiasetelma on suositeltava sairauden luonteen mukaan. Helpointa se on toteuttaa synnynnäisissä tai lapsuuden aikana puhkeavissa sairauksissa (esim. huuli-suulakihalkio tai lukihäiriö). Valitsemalla perhepohjaiset verrokit voidaan minimoida perheen yhteisten ympäristötekijöiden vaikutus sairauden synnyssä. Tällöin verrataan perheen sairailla esiintyviä kromosomeja vain terveillä esiintyviin, esimerkiksi oireettomien vanhempien sairaalle lapselle periytyneitä kromosomeja niihin, joita lapsi ei ole perinyt. Astman ja atopian genetiikka miten ehdokasgeenitutkimuksien tuloksia tulkitaan? 1747

Otoskoko ja tutkimuksen voiman mittaaminen Koska astmassa, kuten muissakin monitekijäisissä sairauksissa, alttiusalleeleilla on luultavasti vähäinen penetranssi ja tutkittavissa paljon fenokopiota, tarvitaan laajoja aineistoja, jotta saadaan esiin lokus, joka lisää alttiutta sairastua 2 5-kertaiseksi verrattuna niihin, joilla alttiusalleelia ei ole. Tämän vuoksi on tärkeää jo tutkimusta suunnitellessa laskea tutkimusasetelman voimaa. Kun otoskoko on valittu, tutkijan tulisi pystyä vastaamaan kysymyksiin, mikä on tutkittavan lokuksen pienin vaikutus sairastuvuuteen, joka aineistolla kyetään havaitsemaan, kun otetaan huomioon käytettävien geenimerkkien informatiivisuus, tutkimusperheiden rakenteet, alttiusalleelin penetranssi ja niiden potilaiden osuus, joilla kyseinen lokus vaikuttaa sairauden puhkeamiseen. Silloinkin kun tutkimustulos jää negatiiviseksi, tulisi pystyä selvittämään tutkittavan lokuksen suurin vaikutus, joka tutkimuksella pystyttiin sulkemaan pois. Otoskokoa voitaisiin suurentaa ratkaisevasti yhdistämällä usean tutkimusryhmän tulokset. Meta-analyysit kuitenkin vaativat saumatonta yhteistyötä tutkijaryhmien välillä ja myös fenotyypiltään ja perherakenteiltaan vertailukelpoisia aineistoja. Tämä on käytännössä usein iso ongelma, kun tutkimustuloksia yritetään yhdistää jälkikäteen. Näytteiden keruu on työlästä ja kallista, minkä vuoksi keruuseen yhdistetään muitakin tutkimushankkeita. Näin hankkeet saavat paikallista väritystä tutkijoiden mielenkiinnon mukaan, mikä kuitenkin vaikeuttaa kansainvälistä yhteistyötä. Löydöksen merkitsevyyden testaus Potilaiden ja verrokkien valinnan tärkeys on hyvin tutkijoiden tiedossa; tulosten merkitsevyyden tulkinta hallitaan huonommin. Assosiaation merkitsevyyttä testataan usein sinällään käyttökelpoisella χ 2 -testillä. Yksinkertaisimmillaan testissä mitataan, poikkeavatko kaksi kokeellista jakaumaa (potilaat ja verrokit) toisistaan jonkin ominaisuuden (tutkittavan polymorfian) suhteen. Merkitsevyyden määrityksessä joudutaan kuitenkin usein ongelmalliseen tilanteeseen moninkertaisen testauksen vuoksi (monta tutkittavaa fenotyyppiä, useita geenimerkkejä ja geenimerkeissä useita alleeleja). Tätä on pyritty totunnaisesti korjaamaan kertomalla χ 2 -testin antama p:n arvo testien lukumäärällä (Bonferronin korjaus). Toisistaan riippumattomien testien lukumäärää ei geneettisissä tutkimuksissa ole helppo määrittää (toisiinsa kytkeytyvät geenit eivät aina täytä riippumattomuuden ehtoa), ja kaikkien testien lukumäärällä korjaaminen saattaa johtaa liian konservatiiviseen tulkintaan. Nominaalisen p-arvon merkitsevyyden testauksessa simulaatiot ovat osoittautuneet käyttökelpoisiksi (Laitinen ym. 1997). Niissä kromosomien tautistatus satunnaistetaan toistamalla satunnaistaminen satoja tai tuhansia kertoja tietokoneen avulla. Näin tuotetuissa keinotekoisissa aineistoissa havaitut assosiaatiot ovat puhtaasti sattumaa. Kustakin aineistoista lasketaan vastaava c 2 -testisuureen arvo kuin alkuperäisestäkin ainestosta. Jos esimerkiksi alkuperäinen c 2 -arvo assosiaatiolle on 6.63 (p = 0.01, kun vapausasteet = 1) ja c 2 -arvo 6.63 saavutetaan tai ylittyy kahdessakymmenessä keinotekoisessa aineistossa tuhannesta, simulaation perusteella korjattu P = 0.02. Simulaatiot eivät rajoitu tulosten merkitsevyyden arvioinnissa vain assosiaatiohin vaan soveltuvat monilla eri menetelmillä saatujen tulosten arviointiin. Ehdokasgeenitutkimuksiin perehtymistä vaikeuttaa se, että analyysimenetelmiä ja käytössä olevia ohjelmapaketteja on monia. Assosiaation rinnalla käytetään mm. kytkentään ja kytkentäepätasapainoon perustuvia menetelmiä. Ohjelma voi analysoida sairastuneita sisaruspareja tai kokonaisia sukupuita, käyttää tai olla käyttämättä periytymismallia ja analysoida dikotomisia tai jatkuvia muuttujia. Alan tutkijoistakin useimmat ovat perehtyneet yksityiskohtaisesti vain muutamaan ohjelmaan. Tämän vuoksi on tärkeää, että alkuperäiset lukumäärät, joista merkitsevyydet on laskettu, ovat näkyvissä artikkelissa, jotta lukija voi omien kokemuksiensa perusteella arvioida tuloksen merkitsevyyttä. Paras vaihtoehto on, jos tutkimusryhmä antaa artikkelin lisäksi koko aineistonsa kaikkien analysoitavaksi esimerkiksi Internetin kautta. Suoma- 1748 T. Laitinen ym.

laisen astmatutkimuksen yksityiskohdat löytyvät osoitteesta www.genome.helsinki.fi. Tilastollisesta merkitsevyydestä biologiseen merkitsevyyteen Vaikka edellä mainitut kriteerit täyttyvät, saattaa heikohkoa assosiaatiota olla vaikea tulkita biologisesti merkitseväksi havainnoksi. Lisävahvistusta saadaan, jos löydös voidaan varmistaa esimerkiksi toisessa, riippumattomassa aineistossa eri väestössä. Lopullinen varmuus kuitenkin saadaan vain tutkimalla, onko todetulla emäsmuutoksella merkitystä geenin toiminnan kannalta. Toiminnalliset jatkotutkimukset riippuvat paljolti tutkittavan geenin luonteesta ja siitä, miten paljon sen tehtävästä jo tiedetään. Ensin tulee varmistaa, että geeni ilmentyy tutkittavan taudin kannalta mielekkäissä kudoksissa. Ilmentymistä sairaassa ja terveessä kudoksessa voidaan tutkia joko RNA- tai proteiinitasolla. Tutkimusasetelmaa on mahdollista kohdentaa jakamalla sairaat genotyypin mukaan kahteen ryhmään. Apuna voidaan käytää in vivo (siirto- tai poistogeeninen hiiri) tai in vitro -mallia (solujen transfektiota). Alleelispesifistä proteiinia voidaan myös tuottaa ja tutkia solumalleissa. Lopuksi Monitekijäisten sairauksien periytyvyyden tutkimus on tähän asti tuottanut enemmän kysymyksiä kuin vastauksia, mutta alan kehitys on nopeaa, ja uusiin haasteisiin voivat vastata vain tutkimusryhmät, joilla on valmiina laaja, kliinisesti hyvin karakterisoitu tutkimusaineisto, tutkittavan väestön populaatiohistorian hyvä tuntemus, toimiva laboratorio sekä kapasiteettia hallita ja analysoida suuria tietomääriä. Koko tämän koneiston pystyttämisessä ja taitotiedon hankkimisessa ehdokasgeenitutkimuksella on ollut tärkeä merkitys. Uusi, kattava tieto geenien monimuotoisuudesta kokonaisessa geeniperheessä tai signaalinvälittäjäketjuissa säilyttänee sairauden patogeneesin pohjalta määritettyjen ehdokasgeenien aseman niiden ehdokkaiden rinnalla, jotka löydetään koko genomin kattavissa hauissa kromosomaalisen sijaintinsa perusteella. Kirjallisuutta Daniels SE, Bhattacharrya S, James A, ym. A genome-wide search for quantitative trait loci underlying asthma. Nature 1996;383:247 50. Cargill M, Altshuler D, Ireland J, ym. Characterization of single-nucleotide polymorphisms in coding regions of human genes. Nature Genet 1999;22:231 8. The Collaborative Study on the Genetics of Asthma. A genome-wide search for asthma susceptibility loci in ethnically diverse populations. Nature Genet 1997;15:389 92. Laitinen T, Kauppi P, Ingatius J, ym. Genetic control of serum IgE levels and asthma: Linkage and linkage disequilibrium studies in an isolated population. Hum Mol Genet 1997;6:2069 76. Laitinen T, Räsänen M, Kaprio J, ym. Importance of genetic factors in adolescent asthma a population based twin-family study. Am J Resp Crit Care Med 1998;157:1073 8. Lander ES, Schork N. Genetic dissection of complex traits. Science 1994; 265:2037 48. Liu L, Forsell C, Lilius L, ym. Allelic association but only weak evidence for linkage to the apolipoprotein E locus in late-onset Swedish Alzheimer families. Am J Med Genet 1996;67:306 11. Nature Genetics. Freely associating. Nature Genet 1999;22:1 2. Nieminen MM, Kaprio J, Koskenvuo M. A population-based study of bronchial asthma in adult twin pairs. Chest 1991;100:70 5. Ober C, Cox NJ, Abney M, ym. Genome-wide search for asthma susceptibility loci in a founder population. Hum Mol Genet 1998;7:1393 8. Wjst M, Fischer G, Immervoll T, ym. A Genome-wide Search for Linkage to Asthma. Genomics 1999;58:1 8. TARJA LAITINEN, LT, tutkija tarja.laitinen@helsinki.fi Haartman-instituutti, lääketieteellisen genetiikan osasto PL 21, 00014 Helsingin yliopisto LAURI A. LAITINEN, professori, toimitusjohtaja lauri.laitinen@hus.fi PL 100, 00029 HUS JUHA KERE, professori juha.kere@helsinki.fi Suomen genomikeskus PL 21, 00014 Helsingin yliopisto ja Turun yliopisto, lääketieteellinen genetiikka 20520 Turku Astman ja atopian genetiikka miten ehdokasgeenitutkimuksien tuloksia tulkitaan? 1749