Nykyaikainen mykobakteeridiagnostiikka

Mykobakteeri JUSSI ESKOLA JA HANNA SOINI Nykyaikainen mykobakteeridiagnostiikka Vaikka tuberkuloosin ilmaantuvuus on Suomessa tasaisesti pienentynyt, eristetään potilasnäytteistä vuosittain Mycobacterium tuberculosis lähes 400 kertaa. Samanaikaisesti laboratoriossa eristettyjen atyyppisten mykobakteerien määrä on kasvanut. Hitaan kasvun takia mykobakteerien viljely, lajinmääritys ja lääkeherkkyysmääritys kestävät useita viikkoja. Uudet nestemäiset elatusaineet ja kasvuautomaatit ovat kuitenkin nopeuttaneet viljelyä huomattavasti. Laboratoriodiagnostiikan nopeuttamiseksi on kehitetty myös mole kyylibiologiaan perustuvia menetelmiä. Geenimonistusta voidaan käyttää M. tuberculosiksen nopeaan osoittamiseen suoraan värjäyspositiivista näytteistä. Viljelyssä kasvaneiden mykobakteerien eri lajit tunnistetaan entistä tarkemmin ja nopeammin hybridisaatioon ja DNA:n sekvensointiin perustuvilla menetelmillä. Geenimonistusta ja sekvensointia voidaan käyttää myös moniresistentin tuberkuloosibakteerin nopeaan toteamiseen. M ykobakteerilajeja tunnetaan lähes 100, ja näistä tärkein on tuberkuloosin aiheuttajabakteeri Mycobacterium tuberculosis. Muiden, nk. epätyypillisten eli ym päristömykobakteerien taudinaiheuttamiskyky vaih telee. Suomessa potilasnäytteistä eristetään vuosittain lähes 800 mykobakteeria, joista noin 400 kuuluu M. tuberculosis -kompleksiin (M. tuberculosis -bakteeri lähisukulaisineen, ks. kuva 1) ja loput ovat atyyppisia mykobakteereja. Näistä tavallisimpia ovat M. avium, M. intracellulare, M. fortuitum ja M. malmoense, jotka ovat ehdollisia eli opportunistisia taudinaiheuttajia, sekä M. gordonae, joka on yleinen ympäristöbakteeri. Toisin kuin M. tuberculosis atyyppiset mykobakteerit eivät tartu ihmisestä toiseen, vaan tartunta saadaan ympäristöstä. M. leprae aiheuttaa lepran, ja se saatetaan todeta maahanmuuttajilla tai pitkään tropiikin maissa oleskelleilla. Tuberkuloosin ilmaantuvuus Suomessa on viime vuosikymmeninä pienentynyt tasaisesti maamme ansiokkaan tuberkuloosintorjuntaohjelman ja hoitojärjestelmän ansiosta (Tala- Heikkilä 2003). Vuonna 2002 ilmaantuvuus oli 9,1/100 000 (Kansanterveyslaitos 2003). Uusista tuberkuloositapauksista runsaat 10 % todetaan maahanmuuttajilla. Tilanne Venäjällä ja Baltian maissa on kuitenkin huolestuttava, sillä näillä alueilla taudin esiintyvyys ei juuri ole pienentynyt joillakin alueilla se on jopa lisääntynyt. Esimerkiksi vuonna 2002 tuberkuloosin ilmaantuvuus oli Virossa 38,2/100 000 ja Leningradin alueella 65,2/100 000 (Statistics 2003). Huolestuttava piirre on se, että näissä maissa moniresistentit tuberkuloosibakteerit (MDR-TB) ovat yleisiä. MDR-TB-kannalla tarkoitetaan WHO:n määritelmän mukaan kantaa, joka on resistentti vähintään isoniatsidille ja rifampisiinille. Onneksi näitä kantoja on meillä todettu vain muutamia vuosittain hyvän tuberkuloosin valvonnan ja hoidon ansiosta. Uhkana kuitenkin on, että matkailun lisääntyessä ja rajojemme vapautuessa näiden kantojen aiheuttamat tautitapaukset Duodecim 2004;120:22329 J. Eskola ja H. Soini

Näytteen esikäsittely Värjäys neg Värjäys Alustava vastaus TB-geenimonistus Atyyppinen mykobakt. HKS M. tbc -kompleksi Dekontaminaatio 13 eri mykobakteerilajia Alustava vastaus Viljely Herkkyysmääritys (KTL) Viljely neg (KTL) TB-geenimonistus TbNhO M. tbc -kompleks i KUVA 1. Nykyaikaisen mykobakteeridiagnostiikan eteneminen HUSLABin mykobakteriologian yksikössä. Eri työvaiheet on kuvattu neliöissä (tarkemmin tekstissä) ja annettavat vastaukset ympyröissä. Kaikki eristetyt kannat lähetetään Kansanterveyslaitoksen myko bakteerilaboratorioon lääkeherkkyysmääritystä ja M. tuberculosiksen genotyypitystä varten. TbNhO = M. tuberculosis, nukleiinihapon osoitus, KTL = Kansanterveyslaitos. HKS = haponkestävä sauva. M. tbc -kompleksi: M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG (rokotekanta), M. Africanum, M. microti ja M. canettii. lisääntyvät meilläkin. Laboratorioissa eristettyjen atyyppisten mykobakteerien määrä on hieman lisääntynyt viimeisen vuosikymmenen aikana. Näistä bakteereista noin puolet kuuluu MAC-ryhmään (M. avium ja M. intracellulare). Laboratoriot tutkivat kaikista potilasnäytteistä myös atyyppiset mykobakteerit, vaikka tutkimuspyyntö koskisikin vain tuberkuloosibakteeriviljelyä. Sen sijaan kaupallisia geenimonistustestejä käytetään lähes yksinomaan M. tuberculosis -kompleksiin kuuluvien bakteerien osoittamiseksi. Näytteet Mykobakteerien esiintyminen eritteissä on epäsäännöllistä. Tästä syystä mm. yskös- ja virtsanäytteitä olisikin otettava vähintään kolmena peräkkäisenä päivänä tuberkuloosin varmistamiseksi. Yksittäiseen positiiviseen viljelylöydökseen on suhtauduttava varoen, koska kyseessä saattaa olla esimerkiksi laboratoriokontaminaatio. Normaalisti steriilien alueiden osalta yksikin positiivinen näyte on merkittävä. Atyyppisten mykobakteerien löydöksiin on suhtauduttava aina kriittisesti, koska nämä bakteerit ovat ympäristössä hyvin yleisiä (Katila ym., tässä numerossa). Tällöin vain toistuva löydös yhdessä kliinisen taudinkuvan perusteella oikeuttaa diagnoosiin. Tarkemmat näytteenotto-ohjeet löytyvät laboratorioiden ohjeistoista. Mykobateerien nykyaikaisesta laboratoriodiagnostiikasta on esimerkkinä kuvassa 1 esitetty kaavio diagnostiikan etenemisestä HUSLABin mykobakteriologian yksikössä. Värjäys Nykyaikaisimmissakin mykobakteriologian laboratorioissa ns. haponkestävien sauvojen (HKS) värjäys on enimmäinen toimenpide mykobakteeri-infektioita epäiltäessä (Woods 2002). Haponkestävyys perustuu mykobakteerien soluseinämän runsaaseen mykolihappokoostumukseen. 2233

Väriaineen päästyä bakteerisolun sisään mykolihapot estävät sen liukenemisen happo-alkoholikäsittelyssä, joka liuottaa värin pois tavallisista bakteereista. Yleisimmin väriaineena käytetään karbolifuksiineja tai fluorokromeja (kuva 2). Yleisimmin käytettyjä karbolifuksiinimenetelmiä ovat ZiehlNeelsenin ja Kinyounin värjäykset. Preparaatteja tarkastellaan valomikroskoopilla 100-kertaisesti suurentavalla öljyimmersio-objektiivilla, jolloin värjäyspreparaatista nähdään kerralla vain pieni alue. Preparaatin tulkitsemiseen negatiiviseksi vaaditaan 300 näkökentän tarkastelu, joka vie 1520 minuuttia. Tästä syystä menetelmä ei sovellu paljon näytteitä tutkiviin laboratorioihin. Auramiini-, akridiinioranssi- ja auramiini-rodamiinivärjäykset perustuvat fluorokromin käyttöön. Preparaatteja tarkastellaan fluoresenssimikroskoopilla 25-kertaisesti suurentavalla objektiivilla. Tällöin 50 näkökentän tarkastelu riittää, ja siihen kuluu enintään kaksi minuuttia. Värjäystulos ilmoitetaan asteikolla neg.,, ja. Lisäksi voidaan ilmoittaa muutaman haponkestävän sauvan toteaminen, jolloin suositellaan lisänäytteitä. Värjäyksen herkkyys on vain noin 10 4 bakteeria millilitrassa näytettä. Tuberkuloosipotilaiden yskösnäytteistä noin 50 % on värjäyksen suhteen positiivisia. Elimistön nesteissä (likvori, pleuraneste yms.) mykobakteerien määrä on yleensä paljon pienempi, jolloin konsentroimaton näyte jää usein värjäyksessä negatiiviseksi. Mykobakteerien tunnistaminen pelkän värjäyksen perusteella on mahdotonta. Nopeasti kasvavat mykobakteerit saattavat värjäytyä heikosti fluorokromeilla, jolloin sama preparaatti kannattaa värjätä uudelleen karbolifuksiinivärjäyksellä. Leprabakteeria ei laboratorio-oloissa saada viljeltyä, ja sen osoittamiseksi ja hoidon tehon seuraamiseksi käytetäänkin karbolifuksiinivärjäystä. Kun värjäyksessä todetaan haponkestäviä sauvoja, näytteestä voidaan tehdä geenimonistustesti tuberkuloosibakteerin osoittamiseksi (kuva 1). Jos tulos on positiivinen, potilas on syytä tartuntavaarallisena eristää ja lääkehoito kohdistetaan tuberkuloosiin jo ennen viljelyn valmistumista (Viljanen ym. 2003). Jos testitulos on negatiivinen, löydös puhuu atyyppisten A B KUVA 2. M. tuberculosis -bakteereja happovärjäyksen jälkeen. A) ZiehlNeelsenin karbolifuksiinivärjäys, B) auramiini-rodamiinifluorokromivärjäys. mykobakteerin puolesta, jolloin hoidon aloittamisella ei yleensä ole kiire. Tällöin tuberkuloosiin suunnattu hoitokin voidaan keskeyttää, koska testi on tuberkuloosille hyvin spesifinen (lähes 100 %) ja värjäyspositiivisissa näytteissä sen herkkyys on erittäin hyvä. 2234 J. Eskola ja H. Soini

Geenimonistustekniikat Geenimonistuksesta on odotettu uutta, no peaa menetelmää mykobakteerien osoittamiseksi. Suomessa onkin kaupallisesti saatavilla kolmeen eri tekniikkaan perustuvia testejä tuberkuloosibakteerin nukleiinihapon osoittamiseksi. Näistä polymeraasiketjureaktioon (PCR) perustuu Amplicor MTB (Roche), transkriptiovälitteiseen monistukseen AMTD2 (Gen-Probe) ja SDA-reaktioon (strand displacement amplification) perustuva ProbeTec ET DTB (Becton Dickinson). Kaksi ensin mainittua on Yhdysvaltojen FDA hyväksynyt hengitystienäytteiden tutkimiseen, ja niiden on suomalaisessakin tutkimuksessa osoitettu nopeuttavan tuberkuloosin diagnostiikkaa (Vuorinen ym. 1996). Kaikki testit toimivat hyvin silloin, kun värjäyksessä todetaan haponkestäviä sauvoja. Värjäysnegatiivisen tuberkuloosin yhteydessä niiden herkkyys on eri tutkimuksissa ollut 4090 % (Piersimoni ja Scarparo 2003). Menetelmien tarkkuus on yli 95 %, joten positiivinen tulos on yleensä merkittävä, mutta negatiivinen tulos ei sulje tuberkuloosia pois (Viljanen ym. 2003). Menetelmiä käytetään usein tuberkuloosin pikadiagnostiikassa, ja sen lisäksi niillä on arvoa värjäyspositiivisen näytteen alustavassa lajinmäärityksessä (kuva 1). M. aviumin, M. intracellularen ja M. kansasiin nukleiinihapon osoitukseen on myös kaupallisia sovelluksia, joilla voidaan nopeuttaa viljelyssä todettujen mykobakteerien tyypitystä (Katila ym. 2000). Käytännössä epätyypillisten mykobakteerien osoittamiseen tarkoitettujen geenimonistusmenetelmien käyttö on vähäistä, koska diagnoosi ei ole niin kiireellinen. Myös laboratorioiden itsensä kehittämiä menetelmiä muiden epätyypillisten mykobakteerien osoittamiseksi on käytössä, mutta niistä saatava tieto on kyseenalaista, sillä epätyypillisiä mykobakteereja esiintyy yleisesti. Viljely Viljely on edelleen mykobakteeridiagnostiikan kulmakivi, sillä se mahdollistaa värjäyksessä todettujen haponkestävien sauvojen tunnistamisen, lääkeaineherkkyyksien määrittämisen sekä tuberkuloosibakteerin epidemiologisen seurannan ja tartuntareittien selvittelyn (Woods 2002). Viljelyn herkkyys on 10100 bakteeria näytemillilitraa kohti näytetyypin ja viljelymenetelmän mukaan. Viime vuosina rutiinikäyttöön tulleet nestemäiset elatusaineet ovat selkeästi nopeuttaneet aiemmin hitaaksi tunnettua viljelyä. Lisäksi nestemäisten elatusaineiden myötä markkinoille on tullut niitä käyttäviä viljelyautomaatteja, jotka analysoivat viljelmiä jopa tunnin välein. Hidaskasvuisuutensa takia mykobakteerit peittyvät helposti näytteessä usein mukana olevien tavallisten bakteerien (»normaalifloora») kasvuston alle. Tästä syystä mykobakteeriviljelyyn tarkoitetut näytteet joudutaan käsittelemään muiden bakteerien tuhoamiseksi eli dekontaminoimaan. Tähän tarkoitukseen on olemassa erilaisia happo-, emäs- ja detergenttikäsittelyjä. Tavallisimmin käytetään ns. NALC-NaOH -käsittelyä, jossa N-asetylyyli-L-kysteiini (NALC) tekee erityisesti yskösnäytteet juoksevammiksi ja NaOH tuhoaa näytteen muut bakteerit. Koska NaOH vaikuttaa myös mykobakteereihin, käsittelyaika ja emäksen neutralointi on säädettävä tarkasti. Tavallisilla bakteereilla kontaminoituvien viljelmien sopivana taajuutena pidetään 35 %:a. Tätä suurempi osuus merkitsee liian heikkoa käsittelyä ja pienempi osuus merkitsee sitä, että käsittely vaikuttaa myös mykobakteereihin liian paljon. Muitakin dekontaminaatioaineita on käytössä. Normaalisti steriilien alueiden näytteistä (mm. syvät kudosnäytteet, likvori, pleuraneste) tehdään rinnakkaisviljelmä myös ennen dekontaminaatiota. Veri- ja luuydinnäytteisiin ei dekontaminaatiota kohdisteta. edellyttää sekä kiinteän että nestemäisen elatusaineen käyttöä (Woods 2002). Kiinteinä elatusaineina käytetään joko munapohjaisia (esim. Löwenstein-Jensen) tai agarpohjaisia elatusaineita (esim. Middlebrook 7H11). Nämä ovat hyviä yleiselatusaineita kaikkien mykobakteerien kasvattamiseen, ja niitä voidaan tehdä paremmin selektiivisiksi epätyypillisiä mykobakteereja varten muuttamalla ph:ta pienemmäksi. Kontaminoivien bakteerien kasvun estämiseksi näissä käytetään yleensä malakiittivihreätä. Nestemäisissä elatusaineissa muiden bakteerien ja sienten 2235

kasvu pyritään estämään mikrobilääkkeillä. Pienemmissä laboratorioissa voidaan seurata silmämääräisesti nestemäisissä elatusaineissa syntyvää kasvustoa (esim. Septi-Chek AFB tai BBL MGIT, Becton Dickinson). Useammin näitä elatusaineita kuitenkin käytetään täysin automaattisissa mittalaitteissa, joissa kasvustoa seurataan jatkuvasti hapen kulutuksen (Bactec MGIT 960 -laitteisto, Becton Dickinson) tai hiilidioksidin tuoton (MB/BacT ALERT 3D -laitteisto, Organon Teknika) avulla. Veri- ja luuydinnäytteiden viljelyssä käytetään yleensä tähän tarkoitukseen soveltuvia nestemäisiä elatusaineita (esim. Bactec 13A, Becton Dickinson) ja hiilidioksidin tuottoa mittaavaa laitteistoa (Bactec 460). Mykobakteereja kasvatetaan tavallisimmin 3537 C:ssa, mutta iholta peräisin olevista näytteistä tehdään rinnakkaisviljelmä myös 30 C:n lämpötilaan M. marinumin ja M. ulceransin optimaaliseksi kasvattamiseksi. Yleisesti kiinteätä elatusainetta pidetään epäherkempänä ja hitaampana kuin nestemäistä, mutta kumpikaan viljelymenetelmä ei osoita kaikkia mykobakteereja. Siksi molempien käyttö samanaikaisesti lisää diagnostiikan tehoa (Woods 2002). Jollei viljelmissä todeta kasvua 68 viikossa, tulos on kielteinen. Jos kasvua todetaan, viljelmästä tehdään haponkestävien sauvojen vär jäys myko bakteerin alustavaksi varmistamiseksi, minkä jälkeen suoritetaan kannan lajinmääritys (kuva 1). Eri mykobakteerilajien kliininen merkitys ja niiden aiheuttamien infektioiden hoito vaihtelevat erittäin paljon, sen vuoksi mykobakteerilöydöksen tarkka lajinmääritys on tärkeää potilaan lopullisen diagnoosin, hoidon ja eristystoimien takia. Mykobaktee rien lajinmäärityksessä aiemmin käytetyt biokemialliset testit on lähes täysin korvattu molekyylibiologiaan perustuvilla menetelmillä, joiden avulla tunnistus on entistä nopeampaa ja luotettavampaa. Tärkeimmät mykobakteerilajit (M. tuberculosis complex, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii ja M. gordonae) voidaan tunnistaa DNA-hybridisaatiotestin avulla (AccuProbe, Gen-Probe). Testi perustuu synteettisiin DNAkoettimiin, jotka hybridisoituvat bakteereista vapautetun rrna:n kanssa. Testi on erittäin helppo ja sen tekeminen kestää noin kaksi tuntia. Se onkin käytössä lähes kaikissa mykobakteereja tunnistavissa laboratorioissa. Valitettavasti koettimia ei ole olemassa kaikille kliinisesti merkittäville mykobakteerilajeille, eikä M. tuberculosis complex -koetin kykene erottamaan M. tuberculosista BCG-rokotekannasta tai virtsarakkosyövän hoitoon käytetystä M. bovis BCG -kannasta (Soini ja Musser 2001). Kehittyneempi versio DNA-koettimista on liuskahybridisaatiotesti, jossa samaan testiliuskaan on yhdistetty koettimia noin 15 eri mykobakteerilajin tunnistusta varten (GenoType, Hain Lifescience ja InnoLiPA, Innogenetics). Tutkittava mykobakteerikanta monistetaan ensin PCRtekniikalla ja tuotteen annetaan hybridisoitua testiliuskalla olevien koettimien kanssa, jolloin positiivinen tulos saadaan näkyviin värireaktiona. Testin suorittaminen kestää noin viisi tuntia ja sisältää enemmän työvaiheita kuin yksittäiset DNA-koettimet. Monistusvaiheen vuoksi liuskatesti on kuitenkin huomattavasti herkempi kuin pelkkä DNA-koetin. Sitä voidaan käyttää myös sellaisten MGIT-viljelyputkissa kasvaneiden kantojen tunnistamiseen, jotka antavat DNA-koettimilla vähäisen kasvun takia negatiivisen tulok- Y D I N A S I A T Värjäys ja viljely ovat edelleen mykobakteeridiagnostiikan kulmakiviä. Viljelymenetelmät ovat nopeutuneet. Geenimenetelmät ovat nopeuttaneet mykobakteerien tunnistusta ja mahdollistaneet tuberkuloosin epidemiologisen seurannan. Moniresistentti tuberkuloosi (MDR-TB) on Suomessa vielä harvinainen. 2236 J. Eskola ja H. Soini

KUVA 3. Suomalaisten M. tuberculosis -potilaskantojen DNA-sormenjälkiä IS6110-RFLP -menetelmällä osoitettuina. sen (Mäkinen ym. 2002). Suomessa GenoTypeliuskatestiä käytetään Kansanterveyslaitoksen mykobakteerilaboratorion lisäksi muutamassa suuressa laboratoriossa. Mykobakteerien diagnostiikkaan on myös kehitetty DNA-mikrosiru, jolla voidaan tunnistaa kaikki tunnetut mykobakteerilajit ja tärkeimmät lääkeresistenssiä aiheuttavat mutaatiot. Toistaiseksi näitä siruja on kuitenkin käytetty vain tutkimustarkoituksiin (Soini ja Musser 2001). Jos tutkittavaa mykobakteerikantaa ei todeta hybridisaatiotesteillä, voidaan lajinmääritys tehdä selvittämällä mykobakteerien 16S rrna:ta koodaavan geenin emäsjärjestys. Tämä geenialue sisältää kohtia, joissa lähes jokaisella mykobakteerilajilla on toisistaan eroavia DNA-sekvenssejä. Tutkittavasta mykobakteerikannasta eristetty DNA monistetaan ensin PCR-tekniikalla, tuotteen emäsjärjestys selvitetään sekvensoimalla, ja lopuksi saatua geenisekvenssiä verrataan tietokannassa oleviin tunnettujen mykobakteeri lajien sekvensseihin. Menetelmällä voidaan tutkia myös mykobakteereja, jotka eivät kasva tavallisissa elatusaineissa, ja löytää aivan uusia mykobakteerilajeja. Näitä toistaiseksi tunnistamattomia mykobakteerilajeja löytyy melko usein suomalaisistakin potilasnäytteistä. Sekvensointi vaatii erityisosaamista ja kalliin laitteiston, joten se sopii parhaiten referenssi laboratorion käyttöön ja tutkimustyöhön (Soini ja Musser 2001). Lääkeherkkyysmääritys Kaikista uusista M. tuberculosis -kannoista on tärkeää tehdä lääkeherkkyysmääritykset. Näin varmistetaan tehokas lääkeyhdistelmä, joka samalla vähentää resistenssiin johtavien mutaatioiden kehittymistä. Yleensä tutkitaan kannan herkkyys viidelle tärkeimmälle lääkkeelle (isoniatsidi, rifampisiini, etambutoli, streptomysiini ja pyratsiiniamidi). Jos tutkittava kanta on resistentti joillekin peruslääkkeistä tai potilaan epäillään sairastavan resistenttiä tuberkuloosia, tutkitaan myös muita lääkevaihtoehtoja. Määritykset tehdään joko kiinteällä (agar) tai nestemäisellä elatusaineella (MGIT) tiettyjä kriittisiä lääkeainepitoisuuksia käyttäen. Bakteerien kasvua lääkeainetta sisältävissä elatusaineissa verrataan lääkeaineettomiin vertailukasvustoihin. Viljelyyn perustuvat menetelmät ovat luotettavia mutta hitaita, ja tulosten valmistuminen kestää yleensä 34 viikkoa. Rifampisiiniresistenssin toteamiseen voidaan käyttää myös nopeampia menetelmiä, sillä resistenssiä aiheuttavat mekanismit tunnetaan melko hyvin. Rifampisiinille resistenteissä kannoissa on lähes aina mutaatio rpob-geenin 81-emäsparin mittaisella alueella. Mutaatioita on mahdollista tutkia sekvensoimalla kyseinen geenialue ja vertaamalla saatua sekvenssiä lääkkeelle herkkään kantaan. Yleisimmät mutaatiot voidaan tun- 2237

TAULUKKO. Mykobakteerien laboratoriodiagnostiikassa käytettäviä geenimenetelmiä. Menetelmä Sovellus Käyttö Geenimonistus Hybridisaatio geenikoettimilla Geenisekvensointi Geenipolymorfismin osoitus hybridisaatiolla (genotyypitys) Polymeraasiketjureaktio (PCR) Transkriptiovälitteinen geenimonistus (TMA) Strand displacement amplification (SDA) Suora hybridisaatio DNA-koettimella Monistetun geenialueeen hybridisaatio geeni - koettimia sisältävällä testiliuskalla DNA-mikrosirut 16S rdna-sekvensointi rpob-sekvensointi IS6110 RFLP (restriction fragment length polymorphism)»spoligotyypitys» (spacer oligotyping) Tuberkuloosibakteerin suora osoitus näytteestä ja rifampisiiniresistenssin osoitus ja lääkeresistenssin osoitus Rifampisiiniresistenssin osoitus Tuberkuloosibakteerin tyypitys (»sormenjälki») nistaa myös liuskahybridisaatioon perustuvalla kaupallisella testillä (LiPA, Innogenetics). Näillä menetelmillä tulokset valmistuvat yleensä 12 päivässä ja tutkimus pystytään tekemään myös suoraan värjäyspositiivisesta ysköksestä. Rifampisiiniresistenssiä esiintyy harvoin yksin, ja se on yleensä merkki MDR-tuberkuloosista. Näiden kantojen nopea toteaminen onkin erittäin tärkeää, ja rifampisiiniresistenssin pikamääritys on syytä tehdä aina MDR-tuberkuloosia epäiltäessä. Muiden tuberkuloosilääkkeiden taustalla olevat resistenssimekanismit ovat niin monimutkaisia tai puutteellisesti tunnettuja, että luotettavia pikamenetelmiä näille lääkkeille ei ole käytettävissä (Soini ja Musser 2001). Lääkeherkkyysmääritysten teko on Suomessa keskitetty Kansanterveyslaitoksen mykobakteerilaboratorioon. Epätyypillisten mykobakteerien lääkeherkkyysmäärityksiä tehdään vain tarvittaessa, sillä kliinisesti merkittävillekään lajeille ei ole olemassa standardoituja määritysmenetelmiä, eikä laboratoriotulosten korrelaatio hoitoon ole aina luotettava. Kantojen tyypitys M. tuberculosis -kantojen tartuntareittejä ja epidemiologiaa voidaan tutkia genotyypityksen eli DNA-sormenjälkitutkimuksen avulla. Jos kahden potilaan M. tuberculosis -kannoilla on sama DNA-sormenjälki, tämä viittaa yhteiseen tartuntalähteeseen. Genotyypityksen avulla paljastuvat myös mahdolliset laboratoriokontaminaatiot. Tyypitykseen käytettävät menetelmät ovat kansainvälisesti standardoituja, joten tiettyjä M. tuberculosis -kantoja voidaan jäljittää maasta toiseen (Barnes ja Cave 2003). Kansanterveyslaitoksen mykobakteerilaboratorio on vuodesta 2000 alkaen tyypittänyt kaikki uudet suomalaiset M. tuberculosis -kannat (kuva 3). Toiminta on lisäksi paljastanut laboratoriokontaminaatioita ja vähentänyt näin turhia hoitoja ja tartunnan jäljityksiä. Lopuksi Vaikka mykobakteerien laboratoriodiagnostiikka on viime vuosina huomattavasti nopeutunut, se tuntuu potilaasta ja hoitavasta lääkäristä hitaalta. Hoidon aloittamisella ei onneksi ole niin kiire kuin tavanomaisten bakteerien aiheuttamien infektioiden yhteydessä, koska mykobakteeritaudin eteneminenkin on hidasta. Viljely on edelleen diagnostiikan tärkein kulmakivi, sillä se mahdollistaa mykobakteerien tarkemman ja nopeamman tunnistamisen ja lääkeaineherkkyyksien testaamisen. Näihin tarkoituksiin on nykyaikaisessa mykobakteerilaboratoriossa käytettävissä useita molekyylibiologiaan perustuvia menetelmiä (taulukko). Lisäksi geenimonistus- 2238 J. Eskola ja H. Soini

testiä käytetään tuberkuloosin pikadiagnostisena menetelmänä ja genotyypityksellä voidaan entistä tarkemmin seurata tuberkuloosibakteerin tartuntareittejä. Kirjallisuutta Barnes BF, Cave MD. Molecular epidemiology of tuberculosis. NEJM 2003;349:114956. Kansanterveyslaitos. Tartuntataudit Suomessa 2002. KTL B8/2003. Katila M-L, Katila P, Erkinjuntti-Pekkanen R. Accelerated detection and identification of mycobacteria with MGIT 960 and COBAS AMPLI- COR systems. J Clin Microbiol 2000;38:9604. Mäkinen J, Sarkola A, Marjamäki M, Viljanen MK, Soini H. Evaluation of Genotype and LiPA mycobacteria assays for identification of Finnish mycobacterial isolates. J Clin Microbiol 2002;40:347881. Piersimoni C, Scarparo, C. Relevance of commercial amplification methods for direct detection on Mycobacterium tuberculosis complex in clinical samples. J Clin Microbiol 2003;41:535565. Soini H, Musser JM. Molecular diagnosis of mycobacteria. Clin Chem 2001;47:80914. Statistics. Notification of communicable diseases in the Baltic sea and Barents region, 2002. EpiNorth 2003;4:468. Tala-Heikkilä M. Tuberkuloosi Suomessa. Duodecim 2003;119:16218. Viljanen, M, Liippo K, Kokki M. Mykobakteerit ja nokardiat. Kirjassa: Huovinen P, Meri S, Peltola H, Vaara M, Vaheri A, Valtonen V, toim. Mikrobiologia ja infektiosairaudet, kirja I, 1. painos. Jyväskylä: Kustannus Oy Duodecim 2003, s. 14151. Vuorinen P, Vuento R, Miettinen A. Geenimonistukseen perustuvat pikamenetelmät tuberkuloosin diagnostiikassa. Suom Lääkäril 1996;51:4069. Woods GL. The mycobacteriology laboratory and new diagnostic techniques. Infect Dis Clin North Am 2002;16:12744. JUSSI ESKOLA, dosentti, osastonylilääkäri jussi.eskola@hus.fi HUSLAB, nykobakteriologian yksikkö PL 348, 00029 HUS HANNA SOINI, dosentti, laboratorionjohtaja Kansanterveyslaitos, mykobakteerilaboratorio Kiinamyllynkatu 13 20520 Turku 2239