Katsaus Anne Tyybäkinoja ja Sakari Knuutila Molekyylikaryotyypitys raja sytogenetiikan ja molekyylibiologian väliltä häviämässä Lääketieteellisessä tutkimuksessa ja diagnostiikassa käytetään yhä enemmän mikrosiruihin perustuvia menetelmiä. Geenien kopiomäärien tutkiminen mikrosirun avulla eli molekyylikaryotyypitys on uusi sytogenetiikkaa ja molekyylibiologiaa yhdistävä menetelmä. Menetelmällä voidaan tutkia periaatteessa jokaisen geenin kaikkien eksonien kopiomäärämuutoksia. Tässä katsauksessa käsitellään molekyylikaryotyypitystä ja sen mahdollisuuksia kliinisessä diagnostiikassa sekä selostetaan omia viimeaikaisia kokemuksiamme menetelmän käytöstä syöväntutkimuksessa. I hmisen genomin sekvensointi mahdollisti mikrosirutekniikkaan perustuvien menetelmien kehittelyn myös sytogenetiikan alalla. Yksi tällainen menetelmä on mikrosirulla tehtävä vertaileva genominen hybridisaatio (mikrosiru VGH, array CGH), jolla tutkitaan geenien kopiolukumuutoksia. Koko genomin laajuista DNA:n kopiolukumuutosten tutkimista mikrosirutekniikalla kutsutaan molekyylikaryotyypitykseksi. Tavanomaisten sytogeneettisten menetelmien kuten G raitakaryotyypityksen, FISH:n (fluoresence in situ hybridization, Knuutila ym. 1993) ja VGH:n (Kallioniemi ym. 1992) rinnalle tulleessa mikrosiru VGH:ssa tutkimuksen kohteena ovat kromosomien sijaan geenit tai tunnetut DNA jaksot ja uusien menetelmien erotuskyky on jopa 1 kb 1 Mb (Salman ym. 2004). Mikrosirumenetelmällä voidaan selvittää periaatteessa jokaisen geenin kaikkien eksonien kopiomäärä. Käytössämme on nykyään noin 50 000 koettimen mikrosiru, ja kaupallisesti saataville on piakkoin tulossa noin 300 000 koettimen siru. Menetelmällä saatuja tuloksia on jo julkaistu runsaasti (NCBI:n PubMed tietokannassa lähes 400 artikkelia), ja mikrosiruanalyysit ovat siirtyneet tutkimuksen puolelta myös diagnostiikkaan. Käsittelemme seuraavassa sytogenetiikan kehitysnäkymiä keskittyen molekyylikaryotyypitykseen ja sen mahdollisuuksiin kliinisessä diagnostiikassa. Lisäksi selostamme omia kokemuksiamme molekyylikaryotyypityksen käytöstä syövän ja kehityshäiriöiden diagnostiikassa ja tutkimuksessa. Molekyylikaryotyypityksen periaate Molekyylikaryotyypityksessä testi DNA (esim. syöpä DNA) ja normaalista kudoksesta peräisin oleva referenssi DNA merkitään erivärisillä fluoresoivilla leimoilla ja hybridisoidaan mikrosirulle. Sirulle on kiinnitetty DNA:ta säännölliseen järjestykseen jopa kymmenistätuhansista geeneistä tai muista genomin alueista. Näyte ja referenssi DNA sitoutuvat kilpailuperiaatteella spesifisesti mikrosirulla oleviin DNA koettimiin. Lasit luetaan laserskannerilla, joka rekisteröi koe Duodecim 2006;122:2018 22 A. Tyybäkinoja ja S. Knuutila
tintäplien suhteelliset fluoresenssit ja muodostaa värillisen kuvan (kuva 1). Useimmiten testi DNA leimataan Cy5 dutp värillä, joka näkyy kuvassa punaisena, ja referenssi Cy3 dutp värillä, joka näkyy vihreänä. Kuva analyysiohjelma muuntaa kuvan sisältämän tiedon numeeriseen muotoon. Geenien kopiomäärää kuvaa fluoresoivien leimojen suhdeluku jokaista täplää kohden. Häviämä näkyy normaalitilannetta pienempänä ja monistuma suurempana suhdelukuna. Molekyylikaryotyypityksessä käytettäviä mikrosiruja valmistetaan samoilla menetelmillä kuin geenien ilmentymisen tutkimiseen käytettäviä siruja. Mikrosirujen valmistusta on kuvattu aiemmin tässä lehdessä (Monni ym. 2002). Mikrosiru VGH sovelluksessa käytetään erityyppisiä siruja, kuten ns. BAC, c DNA ja oligonukleotidisiruja. Molekyylikaryotyypityksessä käytettävien mikrosirujen erotuskyky riippuu sirulle painettujen DNA jaksojen pituudesta ja siitä, kuinka kattavasti ne edustavat genomia. Sovellusalueet ja käytäntö Kuva 1. Fluoresoivaa DNA:ta sitoutuneena koetinpisteisiin mikrosirulla. Mitä uutta molekyylikaryotyypityksellä on mahdollista saada selville? Menetelmällä on löydetty uusia kopiolukumuutoksia, ja syövässä ja kehityshäiriöissä esiintyviä tunnettuja muutoksia on karakterisoitu tarkemmin (Davies ym. 2005, Pinkel ja Albertson 2005, Sanlaville ym. 2005). On myös kehitetty spesifisiä mikrosiruja tiettyyn tarkoitukseen esimerkiksi diagnostiikkaan soveltuva siru, joka kattaa kroonisen lymfaattisen leukemian yleisimmät kromosomimuutosalueet (Schwaenen ym. 2004). Koska molekyylikaryotyypityksellä voidaan määrittää kromosomimuutosalueiden rajat tai epätasapainoisten translokaatioiden katkoskohdat sekä selvittää muuntuneet geenit, menetelmää on voitu käyttää uusien syöpä ja syövänestäjägeenien seulontaan. Taulukko. Molekyylikaryotyypityksen aiheet synnynnäisten kehityshäiriöiden ja syövän diagnostiikassa ja tutkimuksessa. Aihe Diagnostiikka Normaali karyotyyppi syöpä synnynnäinen kehityshäiriö toistuvat keskenmenot Markkerikromosomi Kromosomideleetio Tasapainoinen kromosomipoikkeavuus syöpä synnynnäinen kehityshäiriö Tutkimus Mikrohäviämäoireyhtymät, syövän tunnetut mikrohäviämät Epätasapainossa olevat translokaatiot Kliinisesti tai sytogeneettisesti karakterisoidut syövät ja kehityshäiriöoireyhtymät Odotettu löydös ja sen merkitys Mikrohäviämä, mikromonistuma Monistuneet, hävinneet, fuusioituneet geenit Hävinneiden geenien tunnistus Mikrohäviämä, mikromonistuma, fuusiogeenit Tautigeenien löytyminen Uusien fuusiogeenien löytyminen Tautigeenien löytyminen ja diagnostiikkaan sovellettavissa olevat uudet löydökset Molekyylikaryotyypitys raja sytogenetiikan ja molekyylibiologian väliltä häviämässä 2019
Laboratoriossamme käytetään molekyylikaryotyypitystä syövän ja synnynnäisten kehityshäiriöiden diagnostiikassa muiden menetelmien tukena ja antamassa lisätietoa sekä eri syöpien molekyylipatologian tutkimukseen. Taulukossa on esitetty käyttöaiheet kliinisessä diagnostiikassa. Olemme kuvanneet kopiomäärän profilointia mm. mahasyövässä, osteosarkoomissa ja keuhkosyövässä (Varis ym. 2002, Atiye ym. 2005, Wikman ym. 2005). Keskeisenä tavoitteena on luokitella syöpäpotilaat geenien kopiomäärän profiloinnilla hyvän ja huonon ennusteen potilaisiin. Molekyylikaryotyypityksellä olemme löytäneet kromosomaalisista monistuma alueista uusia syöpägeenejä. Uusien spesifisten kohdistettujen syövänhoitojen kehittämisen kannalta keskeistä on uusien syöpägeenien seulominen. Viimeisimmässä työssämme havaitsimme akuuttia myelooista leukemiaa (AML) sairastavalla potilaalla molekyylikaryotyypityksen avulla geenimonistuman sisällä olevan deleetion kromosomissa 11 (kuva 2C), joka oli muodostanut MLL/LARG fuusiogeenin (Tyybäkinoja ym. 2006). Tämä esimerkki osoittaa molekyylikaryotyypityksen kyvyn löytää komplisoituneesta poikkeavuudesta biologisesti ja kliinisesti merkitykselliset geenimuutokset ja kyvyn tuoda esiin Kuva 2. Profiileja erilaisista kopiolukumuutoksista. Sininen viiva on miljoonan emäsjakson liikkuva keskiarvo, ja piikit edustavat kopiolukumuutosalueita. Nollaa pienemmät arvot vasemmalla edustavat häviämää ja suuremmat arvot oikealla monistumaa. A) Monistuma kromosomialueella 8q24.21 (~4,1 Mb, kahdeksan geeniä) normaalikaryotyypin AML potilaalla (punainen nuoli). B) Häviämä alueella 12p12.3 (~3,8 Mb 11 geeniä) normaalikaryotyypin AML potilaalla (vihreä nuoli). C) Häviämän (vihreä nuoli) ja fuusiogeenin sisältävä geenimonistuma (punaiset nuolet) AML potilaalla, jolla oli markkerikromosomeja. D) 9p21.2-21.3 häviämä (~7 Mb, 25 geeniä) AML potilaalla balansoituneen translokaation yhteydessä (vihreä nuoli). 0 0 A 0 0 C B D 2020 A. Tyybäkinoja ja S. Knuutila
fuusiogeenin uudentyyppisen syntymekanismin. Aiemmin leukemioiden ja sarkoomien fuusiogeenejä on tunnettu noin 200, ja ne ovat kaikki syntyneet kromosomitranslokaatioiden kautta. Esimerkkimme kaltainen deleetion kautta syntynyt fuusiogeeni ja sen monistuminen kromosomaalisella mekanismilla voi olla hyvinkin yleinen ilmiö, joten kromosomimonistumien sisältä tuleekin seuloa erityisesti deleetioita uusien fuusiogeenien löytämiseksi. Molekyylikaryotyypityksellä voidaan niin ikään saada vastaus tärkeään kysymykseen fuusiogeenien osuudesta synnynnäisten kehityshäiriöiden aiheuttajina. Yksi päämäärämme on ollut selvittää, liittyykö tasapainoisiksi tulkittuihin translokaatioihin geenitason kopiolukumuutoksia, joita on raportoitu esiintyvän muun muassa kehityshäiriöissä (Gribble ym. 2005) ja leukemioissa (Kolomietz ym. 2001). Olemmekin havainneet molekyylikaryotyypityksellä submikroskooppisen häviämän AF9 geenissä ja sen lähialueella (kuva 2D). Tämän AML potilaan leukeemisissa soluissa oli todettu FISH tutkimuksilla kromosomien 9 ja 11 välinen tunnettu tasapainoinen AF9/MLL geenifuusion muodostava translokaatio. Löydöksen merkitys ennusteen kannalta jää nähtäväksi. Aiemmin Philadelphia translokaatioon on liitetty osassa tapauksia ennustetta huonontava deleetio (Sinclair ym. 2000, Kolomietz ym. 2001). Tavoitteenamme on ollut myös löytää uusia muutoksia normaalikaryotyypin leukemioista, ja niitä onkin löytynyt osassa tapauksista (kuvat 2A ja B) Normaalikaryotyyppisistä leukemioista löytyvillä mikrodeleetioilla on ollut välitöntä kliinistä merkitystä seurantamerkkien löytymisen kannalta. Nämä merkit olemme varmentaneet ennen kliinistä seurantaa FISH menetelmällä. Pidämmekin tärkeänä, että diagnostista molekyylikaryotyypitystä tehdään laboratoriossa, jossa on valmiudet varmistaa tulokset tarvittaessa muilla menetelmillä, kuten FISH:lla, PCR:llä tai immunosytokemialla. Hyödyt, haasteet ja tulevaisuus Yksi molekyylikaryotyypityksen eduista on, ettei tarvita soluviljelyä, vaan analyysi tehdään suoraan kudoksen DNA:sta. Tämä mahdollistaa esimerkiksi muutosten tutkimisen myös sellaisista syöpäkasvaimista, joita on vaikea viljellä. Myös parafiiniin valetusta leikemateriaalista voidaan eristää tutkimusta varten DNA:ta. Mikrosiruanalyysiin tarvittava DNA määrä on menetelmien kehittyessä vähentynyt. On kehitetty mm. koko genomin laajuisia DNA:n monistusmenetelmiä (Guillaud Bataille ym. 2004). Genomissa esiintyy monenlaisia polymorfismeja. Yksi polymorfismin muoto on normaali vaihtelu joidenkin DNA jaksojen kopiomäärässä (Iafrate ym. 2004, Sebat ym. 2004). Joitakin hyvänlaatuisia variantteja on aiemmin tunnistettu tavanomaisella karyotyypityksellä, mutta molekyylikaryotyypityksellä niitä löytyy yhä uusia, joten niiden määrä on suurempi kuin aiemmin on luultu. Polymorfismit voivat olla myös taudille altistavia tekijöitä, vaikkeivät suoraan tautia aiheutakaan. Tulevaisuuden haasteena on selvittää, missä määrin polymorfismia esiintyy ja mitkä kopiolukumuutokset ovat yhteydessä tautien kehittymiseen. Molekyylikaryotyypityksellä ei havaita muutosten suuntaa eikä järjestystä, joten muuttuneiy d i n a s i a t Molekyylikaryotyypityksellä tutkitaan geenien kopiomäärää, ja siinä käytetään mikrosirutekniikkaa. Menetelmällä voidaan seuloa yhdessä testissä kopiolukumuutoksia koko genomin laajuudelta. Menetelmän erotuskyky mahdollistaa submikroskooppisten muutosten havaitsemisen. Mikrosiruanalyysit ovat siirtyneet tutkimuksesta myös diagnostiikkaan. Mikrosirumenetelmällä on löydetty runsaasti uusia kliinisesti merkityksellisiä mikrodeleetioita ja monistumia syövissä ja synnynnäisissä kehityshäiriöissä. Molekyylikaryotyypitys raja sytogenetiikan ja molekyylibiologian väliltä häviämässä 2021
den kromosomien rakenne ei selviä. Menetelmä ei tunnista tasapainoisia translokaatioita tai ploidiaa, jotka todetaan tavanomaisella karyotyypityksellä, sillä suhteellinen kopioluku ei muutu. Tämän vuoksi tavanomainen sytogenetiikka säilyttää vielä asemansa. Molekyylikaryotyypitys ei myöskään vielä osoita mutaatioita, eikä tavallisessa molekyylikaryotyypityksessä havaita alleelista epätasapainoa (LOH). Tällaista edustaa esimerkiksi uniparentaalinen disomia (UPD), jossa molemmat alleelit ovat peräisin toiselta vanhemmalta. On kuitenkin olemassa SNP siruja (single nucleotide polymorphism), joilla voidaan tutkia kopiolukumuutosten ohella myös genotyyppiä (Raghavan ym. 2005). Muita menetelmiä tarvitaan yhä muutoshavaintojen varmistamiseksi. Tähän käytetään paljon FISH tutkimusta. Kun tunnetaan jokin geeni molekyylikaryotyypityksen avulla selvitetyllä muutosalueella, voidaan tutkia juuri sen tilannetta. Muita mahdollisia vaihtoehtoja ovat esimerkiksi RT PCR, geeniekspressioanalyysi tai proteiinitason tutkimukset. Sytogenetiikkaa ja molekyylibiologiaa yhdistävät FISH ja mikrosiru menetelmät ovat edistyneet, ja tämä on muuttamassa sytogeneettistä tutkimusta ja diagnostiikkaa. Karyotyypityksen rinnalle tulleen molekyylikaryotyypityksen suurin etu on submikroskooppisten muutosten havaitseminen. Lisäksi tulokset tuovat tietoa kopiolukumuutoksista myös geeni ja sekvenssitasolla. Molekyylikaryotyypitykseen käytettävien mikrosirujen, menetelmien ja analysointiohjelmien kehittyessä on mahdollista havaita yhä pienempiä muutoksia entistä tarkemmin. Kirjallisuutta Atiye J, Wolf M, Kaur S, ym. Gene amplifications in osteosarcoma CGH microarray analysis. Genes Chromosomes Cancer 2005;42:158 63. Davies JJ, Wilson IM, Lam WL. Array CGH technologies and their applications to cancer genomes. Chromosome Res 2005;13:237 48. Gribble SM, Prigmore E, Budford DC, ym. The complex nature of constitutional de novo apparently balanced translocations in patients presenting with abnormal phenotypes. J Med Genet 2005;42:8 16. Guillaud-Bataille M, Valent A, Soularue P, ym. Detecting single DNA copy number variations in complex genomes using one nanogram of starting DNA and BAC-array CGH. Nucleic Acids Res 2004;32: e112. Iafrate AJ, Feuk L, Rivera MN, ym. Detection of large-scale variation in the human genome. Nat Genet 2004;36:949 51. Kallioniemi A, Kallioniemi OP, Sudar D, ym. Comparative genomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid tumors. Science 1992;258:818 21. Knuutila S,Wessman M, Nylund S, ym. Kliininen molekyylisytogenetiikka. Duodecim 1993;109:1229 37. Kolomietz E, Al-Maghrabi J, Brennan S, ym. Primary chromosomal rearrangements of leukemia are frequently accompanied by extensive submicroscopic deletions and may lead to altered prognosis. Blood 2001;97:3581 8. Monni O, Hautaniemi S, Kallioniemi O. Geenisirutekniikka ja siihen liittyvä bioinformatiikka. Duodecim 2002;118:1157 66. Pinkel D, Albertson DG. Comparative genomic hybridization. Annu Rev Genomics Hum Genet 2005;6:331 54. Raghavan M, Lillington DM, Skoulakis S, ym. Genome-wide single nucleotide polymorphism analysis reveals frequent partial uniparental disomy due to somatic recombination in acute myeloid leukemias. Cancer Res 2005;65:375 8. Salman M, Jhanwar SC, Ostrer H. Will the new cytogenetics replace the old cytogenetics? Clin Genet 2004;66:265 75. Sanlaville D, Lapierre JM, Turleau C, ym. Molecular karyotyping in human constitutional cytogenetics. Eur J Med Genet 2005;48:214 31. Schwaenen C, Nessling M, Wessendorf S, ym. Automated array-based genomic profiling in chronic lymphocytic leukemia: development of a clinical tool and discovery of recurrent genomic alterations. Proc Natl Acad Sci USA 2004;101:1039 44. Sebat J, Lakshmi B, Troge J, ym. Large-scale copy number polymorphism in the human genome. Science 2004;305:525 8. Sinclair PB, Nacheva EP, Leversha M, ym. Large deletions at the t(9;22) breakpoint are common and may identify a poor-prognosis subgroup of patients with chronic myeloid leukemia. Blood 2000; 95:738 44. Tyybäkinoja A, Saarinen-Pihkala U, Elonen E, Knuutila S. Amplified, lost, and fused genes in 11q23-25 amplicon in acute myeloid leukemia, an array-cgh study. Genes Chromosomes Cancer 2006;257 64. Varis A, Wolf M, Monni O, ym. Targets of gene amplification and overexpression at 17q in gastric cancer. Cancer Res 2002;62:2625 9. Wikman H, Nymark P, Väyrynen A, ym. CDK4 is a probable target gene in a novel amplicon at 12q13.3-q14.1 in lung cancer. Genes Chromosomes Cancer 2005;42:193 9. Anne Tyybäkinoja, FM, tutkija Haartman-instituutti, patologian osasto, molekyylipatologian laboratorio PL 21, 00014 Helsingin yliopisto Sakari Knuutila, FT, professori sakari.knuutila@helsinki.fi Haartman-instituutti, patologian laitos, molekyylipatologian laboratorio PL 21, 00014 Helsingin yliopisto ja HUSLAB PL 400, 00029 HUS 2022