BIOprosessitekniikka - Johdanto

Bioprosessitekniikka BIOprosessitekniikka - Johdanto

Tero Eerikäinen 1979 TKK Kemia 1980-1981 Laivasto 1986 DI 1989 TkL 1993 TkT 1991-1992 Detmold Saksa; tutkija 1989-1998 TKK laboratorioinsinööri 1998-2003 TKK yliassistentti 2003- TKK opettava tutkija 5/2015 Aalto yliopisto-opettaja 8/2015 7/2016 Aalto research fellow BIOprosessitekniikka - Johdanto

Bioprosessitekniikka CHEM-C2310 Kurssin suoritettuaan opiskelija osaa: kuvailla biotekniikkaa teollisuuden alana ja sen tuotteita ja menetelmiä sekä sovelluksia eri alueilla ja käsitellä teollisen biotekniikan mahdollisuuksia ja haasteita esittää bioprosesseissa esiintyviä siirtoilmiöitä (aine- ja energia-) kvalitatiivisesti ja kvantitatiivisesti sekä esittää arvioita biologisten komponenttien (solut, proteiinit, substraatit, tuotteet, entsyymit) käyttäytymisestä prosessiolosuhteissa tunnistaa aseptiikan vaatimukset laite- ja prosessiratkaisuissa sekä käytännön toteutuksessa konseptitasolla yhdistää bioprosessitekniikan yksikköoperaatioita prosessiratkaisuiksi ja tunnistaa näissä esiintyviä ilmiöitä ja vaikuttavia tekijöitä muodostaa yksinkertaisia aine- ja energiataseisiin sekä differentiaaliyhtälöihin perustuvia prosessimalleja soluja entsyymiprosesseille nimetä bioprosessien avainmuuttujat ja kuvailla niihin liittyviä mittaustekniikoita ja laskennallisia ratkaisuja sekä prosessien säädön periaatteita. Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 3

Sisältö Entsyymit: entsyymit teollisina tuotteina, tasapainoreaktiot, käytännön kinetiikka, reaktioiden termodynamiikka, entsyymien toiminta molekyylitasolla, toiminta reaktoreissa, immobilisoidut entsyymit ja aineensiirron vaikutukset periaatetasolla, koentsyymien tarve ja regeneraatio, inaktivoituminen ja sen kinetiikka, entsyymin annostelu Solut: toiminta reaktoreissa, kasvun ja tuoton kinetiikka ja kvantitointi, dynaamiset ilmiöt, prosessien toteutustavat ja niihin liittyvät yksinkertaiset matemaattiset käsittelyt, aineenvaihdunnan perusteet systeemisessä tarkastelussa. (Bio)reaktorit: tyypilliset ratkaisut, siirtoilmiöt, scale-up/scale-down suunnittelu- ja tutkimusmenetelminä, aseptiikka reaktorien suunnittelussa, mittaus- ja säätötekniset ratkaisut. Prosessit: tyypillisten yksikköoperaatioiden perusteet, aine- ja energiataseiden hyödyntäminen, biologisten tekijöiden huomioonottaminen prosessisuunnittelussa. Ilmiöiden, operaatioiden ja prosessien matemaattisen mallintamisen perusteet erityisesti biokomponentit huomioiden. Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 4

Opetusmateriaalit & kurssin suoritus E-kirja: Pauline M. Doran: Bioprocess engineering principles, 2. painos, 2012, soveltuvin osin; luettavissa linkistä: http://libproxy.aalto.fi/login?url=http://www.sciencedirect.com/science/book/978012220 8515 Luento-, labratyö- ja laskarimateriaalit täydennettynä omilla muistiinpanoilla Kotitehtäviä, joista saa lisäpisteitä Arvostelu: tentti: max 30 p (tehtävät 6 + 6 + 8 + 10 = 30 p) kotitehtävät: max 5 p labratyö: max 5 p yhteensä max 40 p; min 16 p Bioprosessitekniikka CHEM-C2310 - Johdanto 5

Aiempi kurssikirja Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 6

BIOPROSESSITEKNIIKKA Kevät-2016 Ohjelma Viikko Päivä Pvm Klo Paikka Luento/laskuharjoitus Viikko Päivä Pvm Klo Mikrobikasvatus Entsymaattinen reaktio 9 Ti 1.3.2016 8:30-10:00 Johdanto 9 Ti 1.3.2016 12:00-16:00 To 3.3. 8:30-10:00 Laskuharjoitus 1 To 3.3. 12:00-16:00 10 Ti 8.3. 8:30-10:00 Solu tuotantolaitoksena 10 Ti 8.3. 12:00-16:00 To 10.3. 8:30-10:00 Laskuharjoitus 2 To 10.3. 12:00-16:00 11 Ti 15.3. 8:30-10:00 Solu tuotantolaitoksena 11 Ti 15.3. 12:00-16:00 To 17.3. 8:30-10:00 Laskuharjoitus 3 To 17.3. 12:00-16:00 12 Ti 22.3. 8:30-10:00 Fermentorit 12 Ti 22.3. 12:00-16:00 Ryhmä2: Mikrobikasvatus Ryhmä1: Entsyymireaktio To 24.3. 8:30-10:00 Laskuharjoitus 4 To 24.3. 12:00-16:00 Ryhmä1: Mikrobikasvatus 13 Ti 29.3. 8:30-10:00 Aseptiikka 13 Ti 29.3. 12:00-16:00 Ryhmä3: Mikrobikasvatus Ryhmä2: Entsyymireaktio To 31.3. 8:30-10:00 Laskuharjoitus 5 To 31.3. 12:00-16:00 Ryhmä4: Mikrobikasvatus 14 Ti 5.4. 8:30-10:00 Tenttiviikko 14 Ti 5.4. Tenttiviikko To 7.4. 8:30-10:00 To 7.4. 15 Ti 12.4. 8:30-10:00 Siirtoilmiöt fermentoreissa 15 Ma 11.4. 12:00-16:00 Ryhmä3: Entsyymireaktio To 14.4. 8:30-10:00 Laskuharjoitus 6 Ti 12.4. 12:00-16:00 Ryhmä5: Mikrobikasvatus 16 Ti 19.4. 8:30-10:00 Scale-up To 14.4. 12:00-16:00 Ryhmä6: Mikrobikasvatus To 21.4. 8:30-10:00 Laskuharjoitus 7 16 Ma 18.4. 12:00-16:00 Ryhmä4: Entsyymireaktio 17 Ti 26.4. 8:30-10:00 Teolliset entsyymit Ti 19.4. 12:00-16:00 Ryhmä7: Mikrobikasvatus To 28.4. 8:30-10:00 Laskuharjoitus 8 To 21.4. 12:00-16:00 Ryhmä5: Entsyymireaktio 18 Ti 3.5. 8:30-10:00 Bioteollisuuden yksikköoperaatiot 17 Ma 25.4. 12:00-16:00 Ryhmä8: Mikrobikasvatus Ryhmä6: Entsyymireaktio Ti 26.4. 12:00-16:00 Ryhmä7: Entsyymireaktio To 28.4. 12:00-16:00 Ryhmä8: Entsyymireaktio 18 Ti 3.5. 12:00-16:00 7

Biotekniikka Biotechnology is the integration of natural sciences and engineering sciences in order to achieve the application of organisms, cells, parts thereof and molecular analogues for products and services Biotekniikka yhdistää luonnontieteet ja insinööritieteet siten, että organismeja, soluja, solun osia tai molekyylianalogeja voidaan soveltaa tuotteiden ja palvelujen tekemiseen 1) Biokatalyytit =? Bioprosessitekniikka 2) Elävien organismien jaottelu 3) Bio- vs. kemialliset katalyytit (esim. Ni) Bioprosessi perustuu biokatalyyttien toiminnan hyödyntämiseen. Bioprosessitekniikka tutkii, kehittää ja soveltaa bioprosesseja. Biotekniikan värit Kurssilla näitä: ( ) Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 8

CALCULATION TOOLS Bioprosessitekniikan osa-alueet Bioreaction Engineering Principles CATALYST PERFORMANCE Steady-state balances Cell/enzyme kinetics Stoichiometry Reaction rates Energetics Ideal reactor Bioreactor performance Mass transfer Unstructured Mixing Structured Kvantitatiivinen tarkastelu prosessin tuottavuutta rajoittava tekijä =? BIOREACTOR PERFORMANCE Scale-up Modified from: Villadsen, Nielsen, Liden: Bioreaction Engineering Principles, 3rd Ed. 2011 Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 9

Biotekniikka tuotantotekniikkana Massatuotteet/ hienokemikaalit Tuottoisäntiä Mikrobit Kasvisolut Nisäkässolut Hyönteissolut Suomi tunnetaan erityisesti entsyymiteollisuudestaan BIOprosessitekniikka - Johdanto

Bioteknisiä tuotteita Tuote Tuotanto-organismi Vuosituotanto (kg) Makrotuotteita: Etanoli hiivat 2 x 10 10 Aminohappoja (erilaisia) bakteerit 2 x 10 9 Sitruunahappo sieni 8 x 10 8 Antibiootit sienet ja bakteerit 5 x 10 7 Polysakkaridit bakteerit 5 x 10 7 Entsyymit sienet ja bakteerit 8 x 10 5 Vitamiinit bakteerit 1 x 10 4 Alkaloidit sienet 5 x 10 3 Mikrotuotteita: Pigmentit levät ja kasvisolut 100 Rokotteet bakteerit, virukset, hiivat ja hyönteissolu < 50 Terapeuttiset proteiinit bakteerit, eläinsolut ja hiivat < 20 Monoklonaaliset vasta-aineet hybridomasolut ja bakteerit < 20 BIOprosessitekniikka - Johdanto

Milloin biotekninen prosessi? Biotekninen prosessi kilpailee usein muiden menetelmien kanssa Tuotantoprosessi Valinnan ratkaisee esimerkiksi Hinta Tuotteen monimutkaisuus Ympäristöystävällisyys BIOprosessitekniikka - Johdanto

Soluprosessien (cell factory) tuotteita Tuote Tuottaja Tuotanto Sovellus Etanoli S. cerevisiae 80 Mt/a kemikaali,juoma,polttoaine Antibiootit Homeet,bakteerit, 25 G /a antimikrobilääkkeet (Streptomyces spp.) 20 000 t/a Vitamiinit bakteerit, fungit 150 M /a lääkkeet, rehut, elint. (B 12,B 2,C) Aminohapot bakteerit 1,5 Mt/a elint., rehut (MSG,Lys,Thr) (Corynebacterium spp.) 2 G /a Orgaaniset hapot homeet, bakteerit 3 Mt/a elint., kemikaalit, muovit (citric/acetic/ 2 M /a gluconic/lactic) Paksunnos- bakteerit 0,1 Mt/a elint., kosmetiikka, aineet öljynporaus Entsyymit homeet, bakteerit 3,3 G /a pesuaineet, rehut, hiivat tärkkelys pros., lääkkeet, elint. Terapeuttiset hiivat, bakteerit, > 100 G /a lääkkeet proteiinit eläinsolut Solumassat S. cerevisiae,startterit 0,5 Mt/a elintarvikkeet Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 13

Fermentointituotteita L-lysiini Nisiini B 12 -vitamiini Yksinkertaiset, ei kiraaliset yhdisteet (historia, turvallisuus, talous) Pienet kiraaliset molekyylit Monimutkaiset orgaaniset yhdisteet Tietyn rakenteen ja tarkan koostumuksen omaavat polymeerit (peptidit, proteiinit, polysakkaridit) Entsyymi Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 14

Entsymaattisten prosessien tuotteita Tuote Entsyymi Tuotanto Sovellus Glukoosisiirappi α-amylaasi, glukoamylaasi, 12 Mt/a (dw) elintarvikkeet pullulanaasi 4 G /a Maltoosisiirappi α-amylaasi, β-amylaasi elintarvikkeet HFCS kuten glukoosisiirappi + 8 Mt/a (dw in USA) elintarvikkeet glukoosi-isomeraasi 3 G /a (USA) Aspartaami Thermolysin (proteaasi) 20 kt/a elintarvikkeet 500 M /a (intensiivimakeuttaja) Akryyliamidi Nitriilihydrataasi 150 000 t/a* kemikaalit (polyakryyliamidi) 500 M /a Psikoosi D-tagatoosi-3-epimeraasi elintarvikkeet (low-caloriemakeuttaja) *: bioteknisesti dw = dry weight Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 15

Biotekniikka EU:ssa 2014-2019 Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 16

Fermentointiin perustuva prosessi Upstream Production Downstream Terapeuttisten proteiinien tuotannossa jopa 80-90 % tuotantokustannuksista kts. myös kirjan kuvat 3.14 ja 3.15 ja 3.16 Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 17

Figure 3.15 FIGURE 3.15 Quantitative flow sheet for the downstream processing of 2,3- butanediol based on fermentation of 1000 bushels of wheat per day by Aerobacillus polymyxa. Copyright 2012, Elsevier Inc. All rights Reserved. 19

Fermentointiin perustuva prosessi Kasvusto petrimaljalla Siirrostuslinja (huom: tässä labrafermentoreja) Tuotantofermentorit (n. 1 500 m 3 ) Vakuumirumpusuodatin Ultrasuodatusyksikkö Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 21

Entsymaattinen prosessi (HFCS) Amylolyyttiset entsyymit Glukoosisiirappi Glukoosi-isomeraasi John S. White: Sucrose, HFCS, and Fructose: History, Manufacture, Composition, Applications, and Production Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 22

Entsymaattiset prosessit Amylolyyttiset entsyymit halpoja => käytetään kertapanoksina ilman kierrätystä ja talteenottoa; osa myös tuhoutuu (inaktivoituu) prosessissa Glukoosi-isomeraasi hieman kalliimpi => immobilisoidaan kiinteään kantajamateriaaliin ja käytetään kolonneissa (kuvassa) useiden kuukausien ajan Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 23

Solu tuotantolaitoksena Cell factory Bioteknisiä prosesseja, joissa biokatalyyttinä toimivat solut kutsutaan fermentoinniksi/fermentaatioksi/fermentointi-prosesseiksi Mitä sana fermentaatio alun perin tarkoittaa? vrt. Pasteur Tuotteena voi olla solumassa itse ja/tai solujen tuottama yhdiste Toteutuksen/tuotteen mukaan: olutfermentaatio, aseptinen/epäaseptinen fermentaatio, bakteeri/hiiva/home/levä/mammaalisolu/kasvisolufermentaatio, panos/fed-batch/jatkuva fermentointi etanoli/maitohappo fermentointi submerssi/solid-state fermentointi Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 24

Solu tuotantolaitoksena Cell factory Historia: 1. aikakausi: spontaani hyödyntäminen (olut, viini, leipä, hapatetut tuotteet) 2. teollinen fermentointi; aseptiikka tuntematon käsite (hapot, liuottimet) 3. submerssiteknologia; 1940-luku (antibiootit) 4. geenitekniikan aikakausi; 1980 (solujen muokkaus, terapeuttiset prot.) penisilliinin tuoton kehittyminen Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 25

Primaari- vs. sekundaarimetaboliitit Metaboliitti = aineenvaihduntatuote Primaarimetaboliitit muodostuvat solujen kasvuvaiheessa Mitkä ovat solujen kasvun eri vaiheet? Esimerkkejä: maitohappo (LAB:lla), sitruunahappo, MSG Sekundaarimetaboliittien muodostuminen ei liity solujen kasvuun Esimerkkejä: antibiootit, useat entsyymit, monet heterologisesti tuotetut proteiinit Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 26

Prim. vs. sek. metaboliitit Insinöörin tapa esittää näiden erot : dp dt 1 X = r P = f ( µ ) P: tuotepitoisuus (g/l, U/L ) t: aika µ: spesifinen kasvunopeus (h -1 ) Tuotteen muodostumisnopeutta (r P ) voidaan arvioida prosessin aikana peräkkäisistä pitoisuusmittauksista ja jälkikäteen P=f(t) ja X=f(t) käyriltä eri ajankohtina Heterologisessa proteiinituotossa on usein edullista toteuttaa tuotteen muodostuminen kasvusta riippumattomana (ns. indusoitu tuotto vastakohtana konstitutiivinen tuotto) => tuotteen muodostus ei haittaa solujen kasvua eli solumassan tuottovaihetta Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 27

Fermentoinnin toteutus (mode of fermentation) Panosfermentointi: jokaista panosta varten tuotetaan oma siirroste (engl. inoculum; monikko inocula) siirrostelinjassa (inoculum train) varsinainen tuotantoreaktori (fermentori) valmistellaan panosta varten, siirrostetaan, solut kasvavat ja tuottavat tuotteen, fermentointi lopetetaan, tuote otetaan talteen (talteenottoprosessi eli jälkikäsittelyprosessi; DSP: downstream processing) fermentointipanoksen aikana fermentoriin ei lisätä (merkittäviä määriä) ravinteita eikä fermentorista oteta pois prosessilientä (= kasvuliuosta = fermentation broth) tuotettua solumassaa hyödynnetään vain kussakin panoksessa Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena Missä kasvuvaiheessa kannattaa siirrostaa pienemmästä isompaan fermentoriin? 28

Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 29 Yksisoluisten organismien kasvun kinetiikka ) ( 1 2 ) ( 1 2 1 2 1 2 ) ( ) ( ) ( ) ( tai ) (0) ) ( ln( (0) ) ( t t µ t t µ t µ e t N t N e t X t X µ t X t X e X t X = = = = µ = spesifinen kasvunopeus kun solut kasvavat eksponentiaalisesti µ = vakio eli µ f(t) X(t): solumassan pitoisuus tai määrä hetkellä t N(t): solujen lukumäärä hetkellä t

Aineenvaihdunta (metabolia): katabolia = energian, pelkistysvoiman ja prekursorien tuotto Proteolytic enzymes C, H, N, O,. Lipolytic enzymes Amylolytic enzymes CH a O b N c Precursors : Transport CO 2 H2 O Yhdisteiden hapettuminen vapauttaa elektroneja (= energiaa); elektronit voidaan siirtää joko hapelle tai metabolian välituotteille Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 30

Aineenvaihdunta (metabolia): anabolia = synteesitoiminta Yleisesti vaatii: prekursorin (välimetaboliitti tai ravinne) pelkistysvoimaa (yleensä NADPH) energiaa (ATP tai yleisemmin NTP) Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 31

Hiivat Zymomonas mobilis bakteeri Tuotteelle voi olla useampia aineenvaihduntareittejä: etanoli Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 32

Aineenvaihdunnan eri vaiheille voidaan laskea ja mitata vuoarvoja eri olosuhteissa tai erilaisille mutanteille Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 33

Hyvin perinteinen käymisprosessi https://vimeo.com/74005653 Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 34