Bioprosessiteollisuus: Entsymaattiset prosessit

Transkriptio

1 Bioprosessiteollisuus: Entsymaattiset prosessit Voidaan mieltää myös elintarvike-, metsä-, kemianteollisuudeksi riippuen siitä kuinka suurta osaa entsymaattinen käsittely näyttelee kokonaisuudessa 3 esimerkkiä: Luonnollisen makeuttajan valmistus tärkkelyksestä Fruktoosin valmistus juurikassokerista Aspartaamin entsymaattinen synteesi Entsymaattisissa prosesseissa olosuhteet mahdollistavat biologisten komponenttien (siis entsyymit) toiminnan => yleensä myös mikrobit pystyvät toimimaan prosessiolosuhteissa => mikrobiologisten ongelmien vaara Mikrobiologisten ongelmien minimointi: Prosessiolosuhteet vähemmän suotuisiksi mikrobeille (ph, T, kemikaalit) Viipymäajat: jos prosessiliuokset viipyvät prosessissa/sen osissa siten, etteivät mikrobit ehdi kasvaa, voidaan kontaminaatiot välttää/minimoida Liuosten ja laitteiden mikrobiologisen kuorman vähentäminen (sterilointi, desinfiointi, aseptinen toiminta, hygieeninen toiminta, laitossuunnittelu) Kontaminaatio: väärä mikrobi väärässä paikassa

2 Entsymaattinen prosessi: Glukoosin ja siirappien valmistus Viljojen jyvien tärkkelyspitoisuus on korkea: % Tärkkelys on glukoosin homopolymeeri, jossa on pitkiä suoria glukoosipolymeeriketjuja, joissa glukoosimolekyylien väliset sidokset ovat muotoa α-1,4 (= amyloosi) Tärkkelyksen toinen pääkomponentti on hyvin haaroittunut rakenne, jossa glukoosimolekyylien väliset sidokset haarakohdissa ovat muotoa α-1,6 (= amylopektiini) Amyloosin ja amylopektiinin molekyylikoot (DP= degree of polymerization) vaihtelevat eri lähteiden tärkkelyksissä: Tarvittavat amylolyyttiset entsyymit: α-amylaasi (endo-entsyymi), glukoamylaasi (ekso-entsyymi) ja usein myös pullulanaasi sekä maltoosia tuotettaessa β- amylaasi Vaiheet: Koon pienennys Kuorten poisto tärkkelys Tärkkelyksen liuotus: 80/110 o C ; α-amylaasi; ph n. 7 Sokerointi: 50 o C;pH n.5; home glukoamylaasi [tai β-amylaasi maltoosi] Glukoosin isomerointi glukoosi/fruktoosi (HFCS): glukoosiisomeraasi

3 Tärkkelyksen rakenne

4 Entsymaattinen prosessi: Glukoosin ja siirappien valmistus Vehnä Vesi Jauhaminen Erotus Lese etc. Tärkki Ca 2+ Nesteytys o C ph 6,5-7 α-amylaasi Pullulanaasi Happo β-amylaasi Sokerointi Maltoosisiirappi Glukoamylaasi Sokerointi o C ph 4,5-5 Glukoosisiirappi Emäs Ionivaihto Isomerointi o C ph 6,5-7 HFCS Ca 2+ Ionit Glukoosiisomeraasi

5 Siirappi/makeuttajabusiness Luonnolliset makeuttajat : Sakkaroosi (1); disakkaridi, sokerijuurikas ja sokeriruoko, makeus 1, vuosituotanto n. 175 Mt 4 kcal/g sokeria Rypälesokeri (glukoosi) (2): makeus 0,7 Hedelmäsokeri (fruktoosi) (3): makeus 1,4 Inverttisokeri (glukoosi + fruktoosi): 1,1 1 2 Siirapit:: Elintarviketeollisuudelle Maltoosi-, glukoosi-, HFCS HFCS: vuosituotanto n. 17 Mm 3 /v (pääasiassa USAssa maissin tuotanto!) Sokerit ja makeuttajat ovat kansallisesti tärkeitä omavaraisuuden kannalta <kaikkialla 3 Sokerin maailmanmarkkinahinta: n. 0,3 /kg (sakkaroosi) Muita makeuttajia: Polyolit (sokerialkoholit): ksylitoli, sorbitoli, maltitoli, erytritoli (2,4 kcal/g, makeus 0,6-1; paitsi erytritoli, joka on kaloriton) Intensiivimakeuttajat: aspartaami (makeus ), alitaami (makeus 2000), neotaami (makeus ), sakariini (makeus ), sukraloosi (makeus n. 500) Aspartaami: n. 60 /kg

6 Entsymaattinen prosessi: Fruktoosin valmistus Invertaasi Lese etc. Vesi Emäs Sakkaroosi Vesi Invertointi 60 o C, ph 5 Biokemistin näkemys: Invertointi Isomerointi Insinöörin näkemys: Prosessi Entsymaattiset vaiheet vain osa DuPont (ent. Suomen Sokeri)/Kotka on johtava fruktoosin valmistaja Glu+ Fru Kromatografinen erotus Fru Haihdutus Vesi Glu Kierrätysfraktio Haihdutus Kiteytys Kromatografinen erotus ja palautus Ionit Linkous Isomerointi o C ph 6,5-7 Glu+ Fru Emäliuos (ryönä) [glu+fru] Fruktoosi

7 Entsymaattinen prosessi: Aspartaamin valmistus CO 2 H Ph O Ph H 2 N H O NH H CO 2 Me N H 2 H NH CO 2 H H CO 2 Me α-l-aspartyl-l-phenylalanine methyl ester [α-aspartame (APM)] Makea β-l-aspartyl-l-phenylalanine methyl ester Kitkerä Aspartaami: Intensiivimakeuttaja, low-calorie sweetener, x makeampi kuin sakkaroosi ( pöytäsokeri ) Kahden aminohapon (L-aspartaatti ja L-phenylalaniini-metyyliesteri) dipeptidi Reaktiiviset ryhmät: karboksyyli- (-COOH) ja amino- (-NH 2 ), jotka muodostavat peptidisidoksen => useita vaihtoehtoisia dipeptidejä => tarvitaan 1) spesifinen katalyytti tai 2) suojataan (protection) kemiallisesti ne ryhmät, joiden ei haluta reagoivan, ja lopuksi puretaan suojaukset (deprotection) Eräs tietty entsyymi (termolysiini) on spesifinen ja tekee halutun sidoksen => yksinkertaisempi prosessi Sama entsyymi katalysoi sidoksen katkeamista, mutta reaktiossa APM saostuu ja näin katkeaminen estyy ja reaktio menee loppuun

8 Entsymaattinen prosessi: Aspartaamin valmistus X N H H CO 2 H CO 2 H Amine-protected (X) L-aspartic acid (Z-L-Asp) + N H 2 H Ph CO2 Me Methyl ester of L-phenylanaline (L-PM) thermolysin X N H H CO 2 H NH H O (APM) Ph CO 2 Me + OH 2 Termolysiini on proteaasi = entsyymi, joka pilkkoo proteiineja katkomalla niissä aminohappojen välisiä peptidisidoksia; proteolyyttinen entsyymi Vettä tuottavat entsyymit (esim. hydrolaasit, kuten proteaasit) voidaan saada syntetisoimaan yhdisteitä (poistamaan vettä) pitämällä veden pitoisuus erittäin alhaisena

9 Toinen bioprosessien päätyyppi: Fermentointiprosessit Perustuvat mikrobien aineenvaihduntaan Tuotteet: Proteiinit (esim. entsyymit, biofarmaseuttiset proteiinit) Polysakkaridit (esim. ksantaani) Monomeerit, aineenvaihduntatuotteet (kemikaalit, lääkeyhdisteet (esim. antibiootit, statiinit, syöpälääkkeet ) Itse mikrobimassa Mikrobit tarvitsevat ravinteita (C/energialähde, N-, P-, hivenainelähteet) kasvaakseen ja tuottaakseen tuotteita 1. luennossa lista tuotteista Prosessien toimivuuden edellytys: aseptinen prosessi = puhdasviljelmä (vrt. jätteiden käsittely) Fermentointiprosesseja/laitoksia Suomessa: DuPont/Genencor Jämsänkoski ja Hanko Altia&ABF/Roal Rajamäellä Valion hapatetuotanto Vantaalla St1 Biofuelsin polttoaine-etanolin tuotanto Panimot ja pienpanimot

10 Entsyymit teollisina tuotteina Maailmanmarkkina = 3,1 G /a (2014) Tärkeimmät käyttösegmentit: Pesuaine-entsyymit (proteo-, amylo-, lipolyyttiset) Tekniset entsyymit (sellulo-, hemisellulo-, lipolyyttiset...) Elintarvike-entsyymit (oksidaasit, isomeraasit, amylo-, hemisellulolyyttiset...) Rehuentsyymit (proteo-, hemisellulolyyttiset, fytaasi...) Tärkeimmät tuottajat: Novozymes (Tanska) Genencor/DuPont (USA) DSM (Hollanti)

11 Teolliset entsyymit Pääosa teollisista entsyymeistä tuotetaan mikrobeilla (homeet, bakteerit joitakin myös hiivoilla) Poikkeuksia: papaiini, bromelaiini, β-amylaasi... (uutetaan kasveista) renniini eristetään vasikan mahoista lysotsyymi eristetään kananmunista AMFEP* (Assoc. of Manufacturers and Formulators of Enzyme Products) list of industrial enzymes (10/2009): 255 entsyymituotetta; tuotto bakteereilla (72), hiivoilla (11), homeilla (156) Rekombinanttituotanto (GMO): 112 entsyymiä *:

12 T&K entsyymien tuotannossa Applikaatioidea Enzyme discovery (skriinaus luonnosta, kantakokoelmista ) Protein engineering (proteiinin muokkaus) Tuotantoisännän rakentaminen Fermentointi- ja jälkikäsittelyprosessin kehitys Jatkuva tuote- ja prosessikehitys

13 Teollisten entsyymien tuotanto: prosessi Lähde: Novozymes Enzymes at work

14 Tuotantoisännät Working horses: Bacillus subtilis, B.amyloliquefaciens, B.licheniformis Streptomyces spp. (bakteereita) Aspergillus niger, A.oryzae, A.melleus Trichoderma reesei (homeita) Saccharomyces cerevisiae Kluyveromyces lactis Pichia pastoris (hiivoja) Keskeiset ominaisuudet: Molekyylibiologiset työkalut olemassa Tehokas proteiinien muodostus ja eritys ulos solusta Sopeutuminen prosessiolosuhteisiin Vähäiset/edulliset ravintovaatimukset GRAS-status (Generally Recognized As Safe)

15 Fermentointi Submerssifermentointi (= nesteessä) Panos- ja fed-batch toteutus Jokainen panos vaatii oman siirrosteensa => siirrostelinja Aseptinen fermentointi Mikrobit tuottavat tuotteen, joten prosessissa aina muodostuu myös mikrobimassaa (= soluja) Pääosin aerobisia prosesseja => hapen tarve ja lämmöntuotto (energiankulutus siirtoilmiöissä) Fermentoinnin talous: Volumetrinen tuottavuus => mittakaava => investointikustannus Tuotesaanto raaka-aineista => raaka-ainekustannus Tuotteen loppupitoisuus tai -aktiivisuus fermentoinnin jälkeen => jälkikäsittelykustannus

16 Fermentoreita Tyypillisiä fermentorikokoja Laboratoriomittakaava/tutkimus: 0,1 20 L Pilot-mittakaava/T&K: L Tuotantomittakaava: 1000 (biofarma) L (entsyymi) Solid-state fermentation

17 Jälkikäsittely Bulkkientsyymit (teolliset) ovat medium value medium volume tuotteita Puhtausvaatimukset alhaiset Speksien mukaan Ei haitallisia sivuaktiivisuuksia, tuoteturvallisuus Stabiilius (biokemiallinen, mikrobiologinen) tärkeä Tyypillinen prosessi: Fermentointi Neste/kiintoaine erotus Tuotteen konsentrointi (ultrasuodatus) Tuoteen formulointi, standardointi ja stabilointi Vakuumirumpusuodatin erottamassa kiintoainetta fermentointiliemestä; entsyymi menee suodokseen

18 Biopolttoaineiden tuotanto: 1-g etanoli Etanolin tuotannossa ei ole kysymys ainoastaan etanolista tuotteena Suomessa vuonna 2008 Altian suunnitelma aloittaa polttoaine-etanolin valmistus lisäämällä tuotantokapasiteettia: m m 3 (fermentori- kapasiteetin lisäys m 3! (1 x 800 m 3 ja 5 x 1500 m 3 ) ohraa sisään t/a t/a EtOH eläinrehu tärkkelys CO

19 1-g biojalostamo: tuotteet viljasta

20 1-g biojalostamo: viljan/tärkkelyksen prosessointi Viljat: maissi (USA, EU), vehnä ja ohra (EU) Tuotteet: EtOH, tärkkelys (A-tärkkelys), eläin rehu, CO 2, lese, energia, erikoisproteiini (esim. vehnä&ohra/gluteeni), öljy (maissista) Ongelmat: kustannukset, vaikutus elintarvikkeiden hintaan, riittävyys (pinta-ala), GHG-reduktio Prosessi etanoliksi: Glukoosin tuotto entsymaattisesti (vrt. entsymaattiset prosessit)) Fermentointi hiivalla Tislaus tisle (96 til-%) veden poisto (esim. molekyyliseuloilla) 99,5% Pohjatuotteen suodatus (kiintoaine rehu tuoreena tai kuivattuna; neste kuivattuna = DDGS=distiller s dried grain solubles) Tärkkelys hydrolysoituu helposti sokeriksi (glukoosiksi) Glukoosin fermentointi hiivalla on kypsää tekniikkaa GHG: greenhouse gas

21 1-g biopolttoainetuotannon eettisyys: food for fuel? $/tonni tärkkelystä $/m 3 EtOH

22 CPI= consumer price index Raakaöljyn, soijan ja maissin todellinen ja nimellishinta USA:ssa

23 Biopolttoaineiden valmistus Corn ethanol = 1-g; Cellulosic ethanol = 2-g

24 1-g vs. 2-g biopolttoaineiden (biojalostamoiden) tuotanto

25 2-g biopolttoaineiden tuotanto: biomassalähde? perennials: monivuotiset kasvit (ruohot etc.)

26 Biomassat: vähän sanastoa Corn, maize maissi Alfalfa sinimailanen Kernel jyvä Reed canary grass ruokohelpi Stalk kasvin varsi Sugar cane sokeriruoko Corn stover lehdet & varret Sugar beet sokerijuurikas Corncob tähkän keskiosa Rape rapsi Hardwood lehtipuu Willow paju Softwood havupuu Straw olki Spruce, Fir kuusi Bagasse sokeriruokojäte Pine mänty MSW municipal solid waste Beech pyökki Oat kaura Birch koivu Wheat vehnä Aspen haapa Barley ohra Oak tammi Switchgrass luutahirssi Miscanthus mammuttiheinä

27 2-g biopolttoaineen tuotanto 2-g biopolttoaineet uusiutuvista nyt: etanoli (bensiinikäyttöiset) ja NexBTL biodiesel NexBTL/NesteOil: ei bioprosessi, mutta perustuu (pääosin) uusiutuviin/jäte rasvoihin Vaihtoehtoiset biopolttoaineet kehitettävinä: Butanoli, isobutanoli, pentanoli, pidempiketjuiset ja erityisesti haaroittuneet alkoholit Hiilivedyt (drop-in polttoaineet; myös lentokonepolttoaineet) Raaka-aineet: Yhdyskunta- ja teolliset (esim. elintarviketeollisuus) jätteet (esim. St1 Biofuels) Maatalouden sivuvirrat/jätteet (oljet, lehdet, varret, säilörehu ) Metsätalouden jätteet/sivuvirrat (korjuutähteet, sahajauhot, sellunkeiton sivuvirrat ) Kalatalouden jätteet/sivuvirrat (perkaustähteet) Energiapuu Prosessi etanoliksi (esim. olki tai metsätähde): esikäsittely sokerointi fermentointi - tislaus Lignoselluloosa on rakennekomponentti => kestävä, vaikea sokeroida taloudellisesti Vaatii mekaanisen (koon pienennys ja esim. höyryräjäytys) ja/tai termokemiallisen (esim. happo 160 o C:ssa) esikäsittelyn Lignoselluloosa: selluloosa, hemiselluloosa, ligniini mitä ligniinistä ja missä muodossa? Hydrolysoituvuus: hemiselluloosa > selluloosa

28 2-g biopolttoaineen tuotanto Rajut, kemialliset käsittelyt => sokerit hajoavat kemiallisesti muotoon, joita mikrobit (hiivat) eivät pysty käyttämään etanoliksi => sokerointi entsyymeillä (40-70 o C, ph 4-5) Esikäsittely kuitenkin tarvitaan, jotta entsyymit pääsevät käsiksi lignoselluloosan sokeripolymeereihin (hemiselluloosa ja selluloosa) Tärkkelyksestä saadaan glukoosia, hemiselluloosasta saadaan useita eri sokereita (monosakkarideja): ksyloosi, glukoosi, mannoosi, L-arabinoosi Selluloosasta saadaan glukoosia, mutta selluloosa on kova haaste entsyymeille Perinteiset hiivat eivät pysty käyttämään ksyloosia ja L-arabinoosia etanoliksi Entsyymit hemisellulloosalle: hemisellulaasit (useita entsyymejä) Entsyymit selluloosalle: sellulaasit (lähinnä EG, CBH ja β-glukosidaasi)

29 Lignoselluloosan rakenne

30 Biokemikaalien tuotanto fermentointiprosessilla Fermentointiprosessina lähes identtinen teollisten entsyymien tuotannon kanssa Tuotteet: Halpoja (1-3 /kg) bulkkituotteita (satojatuhansia/miljoona t/v) (sitruunahappo, natriumglutamaatti, lysiini, maitohappo, monomeeerit ) Arvokkaampia (5-10 /kg) pienemmän voluumin (tuhansia/kymmeniätuhansia t/v) tuotteita (vitamiinit, perusantibiootit) High value-low volume tuotteita (kiloja-tonneja, > 100 /kg) (biofarma, flavorit) Tuotteet joko kyseisen tuotantomikrobin normaaleja aineenvaihduntakomponentteja tai metabolian muokkauksella aikaansaatuja tuotteita Metabolian muokkaus: Viedään tuotantoisäntään sille vieraita geenejä ekspressoituvassa (= geenin koodaama proteiini tuottuu aktiivisena) muodossa Muokataan geenien säätelyä (esim. milloin geeni on päällä tai pois) Inaktivoidaan (knock-out, deletointi) isännän omia geenejä Tavoitteena ohjata prosessin C-lähdettä (esim. glukoosi) mahdollisimman tehokkaasti tuotteeksi (joka voi olla isäntäorganismille täysin vieras yhdiste) Tietyn ravinteen sisäänoton / tuotteen erityksen tehostaminen

31 Mikrobien aineenvaihduntatuotteita

32 Etanolin tuottoon muokattu mikrobi

33 Metabolian muokkaus: C-vitamiinia mikrobeilla

34 Esimerkkejä metabolian (aineenvaihdunnan) muokkauksesta Maitohapon tuotto hiivalla: Estetään etanolin muodostus (deletointi) LDH Konstitutiivinen laktaattidehydrogenaasin (LDH) ekspressio (pyruvaatti > maitohappo) Fermentointi alhaisessa ph:ssa => jälkikäsittelykustannukset alas (alhaisessa ph:ssa maitohaposta enemmän happomuodossa kuin suolana) Hiilivedyn tuotto hiivalla (mm. farnesiini) Amyris Inc. Useiden hiivan omien geenien ekspression säätelyn muokkaus Vieraan geenin ekspressio Aromikomponentin ja lentokonepolttoaineen tuotanto Isopreenin tuotto E.coli -bakteerilla Genencor/DuPont Inc. Isoprene synthase geenin ekspressio + bakteerin oman aineenvaihdunnan muokkaus Isopreenin polymerointi -> polyisoprene = synteettinen kumi -> Goodyearin renkaat

35 Jätteiden biotekninen käsittely Jäteveden puhdistus: Aktiivilietelaitos (jatkuvasti adaptoituva mikrobien sekapopulaatio käyttää jäteveden ravinteet (BHK: biologinen hapen kulutus; N, P) kasvuunsa aerobisessa prosessissa; liete erotetaan laskeuttamalla lähtevästä, puhdistetusta vedestä Biologinen typen poisto: yhdet mikrobit hapettavat N-yhdisteet nitraatiksi (nitrifikaatio; aerobinen vaihe) ja toiset pelkistävät nitraatit aina typpikaasuksi asti (denitrifikaatio, anaerobinen vaihe) Lietettä palautetaan prosessiin ja ylijäämäliete voidaan kompostoida mullaksi ja/tai mädättää biokaasuksi Kiinteiden jätteiden kompostointi: Aerobinen prosessi adaptoituvalla sekapopulaatiolla Mikrobitoiminnassa vallitsee sukkessio: yhdet mikrobit (hydrolyyttiset) hydrolysoivat polymeereja (esim. selluloosa), toiset tuottavat muodostuneista monomeereista edelleen aineenvaihduntatuotteita ja lopulta biohajoavat komponentit hajoavat aerobisesti CO 2 :ksi ja vedeksi (tilavuus pienenee; tuottuu lämpöä); hajoamattomat komponentit muododstavat mm. humusta; lopputuotteena multaa Teollisena prosessina olosuhteita säädetään: hapen saatavuus, kosteus, T, C/N-suhde Biokaasun tuotanto: Anaerobinen mädätysprosessi, jossa myös sukkessio Biokaasu: % metaania (CH 4 ), % CO 2 => sähkön ja lämmön tuotanto; CO 2 - poiston jälkeen liikennepolttoaine

36 Bioprosessien tuotantokustannukset: raaka-aine ratkaisee Tuotesaanto raaka-aineista on tärkeä talouden kannalta Raaka-aineen kaikki komponentit pitäisi hyödyntää (= biojalostamokonsepti)

37

38

39

40