KATSAUS Uutta imua lymfasuoniston biologiaan Lotta Jussila, Kari Alitalo ja Arja Kaipainen Imusuonet ovat osa verenkiertoa. Niiden pääasiallinen tehtävä on palauttaa ylimääräinen kudosneste takaisin verenkiertoon ja huolehtia proteiinien ja lymfosyyttien kierrätyksestä. Verisuonten uudismuodostusta eli angiogeneesiä on tutkittu jo vuosikymmeniä, ja verisuoniendoteeliin vaikuttavia kasvutekijöitä ja -reseptoreita on löydetty jo useita. Imusuonten muodostumista eli lymfangiogeneesiä on tutkittu vähemmän, ehkä siksi, että sopivia ja spesifisiä tunnistusmenetelmiä ei ole ollut käytettävissä sen tarkasteluun. Äskettäin on kuitenkin löydetty imusuonen endoteelin kasvutekijä ja sen imusuonispesifinen reseptori. Nämä ovat ensimmäisiä spesifisesti imusuonen fysiologiaan vaikuttavia molekyylejä. Italialainen lääkäri Gasparo Aselli kuvasi ensimmäisenä lymfaattiset suonet vuonna 1622 (Aselli 1627). Hän käytti obduktiomateriaalina koiraa ja kirjasi muistiinpanoihinsa seuraavan innostuneen kuvauksen:»i suddenly beheld a great number of cords as it were, exceedingly thin and beautifully white, scattered over the whole of the mesentery and the intestine, and starting from almost innumerable beginnings. I pricked one of these cords and indeed one of the largest of them, I had hardly touched it, when I saw a white liquid like milk or cream forthwith gush out» Hän oli löytänyt mesenteriumin imusuonet. Imusuoniston anatomia selvitettiin tämän jälkeen nopeasti, mutta vasta sata vuotta sitten alettiin ymmärtää imusuoniston fysiologiaa ja yhteyttä verenkiertoon. Imusuonet osana verenkiertoa Imusuonet alkavat kudoksista umpinaisina kapillaarihaaroina, jotka yhtyvät suuremmiksi imusuoniksi. Ne kulkevat rinnakkaisesti verisuonien kanssa, usein ympäröiden laskimoita pienin imusuonihaaroin. Imusuonet kerääntyvät lopulta alaruumiista ja yläruumiin vasemmalta puolelta rintatiehyeen (ductus thoracicus), suurimpaan lymfaattiseen suoneen, joka kulkee rintanikamien etupuolella ja laskee vasemman sisemmän kaulalaskimon ja solislaskimon yhtymäkohtaan. Pään oikeasta puoliskosta, oikeasta käsivarresta ja osasta rintakehää imuneste palaa systeemiseen verenkiertoon oikean imunestetiehyen (ductus lymphaticus dexter) kautta (kuva 1). Kapillaarien kohdalla osa verenkierron nesteestä kulkee suonten ulkopuolisessa soluvälitilassa. Koska kapillaarien hydrostaattinen paine on suurempi kuin soluvälitilan, työntyy plasmaa ulos kapillaareista soluvälitilaan. Noin kymmenesosa nesteestä, joka tihkuu verisuonista (noin 2 4 litraa päivässä), ei palaa takaisin kapillaareihin, vaan poistuu soluvälitilasta imusuonia pitkin. Imuneste siis suodattuu kudosnesteestä ja on koostumukseltaan lähellä soluvälitilan nestettä. Soluvälitilan proteiinipitoisuus vaikuttaa kudosnesteen osmoottiseen paineeseen, joka säätelee veren tih- Duodecim 114: 343 348, 1998 343
jen sisimmät osat, lihasten endomysium ja luut. Myös näissä on kuitenkin alkeellisia lymfaattisia suonia, jotka johtavat varsinaisiin imusuoniin. Lymfaattiset kapillaarit Imusuonten ja verisuonten kapillaarit eroavat toisistaan rakenteeltaan. Imukapillaari on laajempi (jopa 5 8 kertaa), kokoon painunut ja epäsäännöllisempi rakenteeltaan kuin verisuonen kapillaari. Imusuonen endoteelisolua ympäröivä tyvikalvo on epäjatkuva, ja lisäksi elastiset ankkurisäikeet, joita verisuonissa ei esiinny, liittävät lymfaattisen endoteelin ympäröivään kudosväliaineeseen (kuva 2). Imusuonten endoteelisolujen välillä ei myöskään ole tiiviitä liitoksia kuten verisuonissa, vaan endoteelisolut sijaitsevat osittain toistensa päällä heikosti kiinni toisissaan. Imusuonissa, kuten laskimoissa, on myös varsinaisia läppiä, jotka estävät imunesteen virtaamisen väärään suuntaan. Imusolmukkeet ja immuunipuolustus K u v a 1. Kaavio kehon imusuonista. Imusuonet keräävät kudosnestettä eri puolilta kehoa ja palauttavat sen rintatiehyen kautta takaisin verenkiertoon. Imusuonet kulkevat imusolmukkeiden kautta, jossa kudosnesteestä suodattuu hiukkasia ja elimistölle vieraita aineita. Näitä vastaan imusolmukkeiden valkosolut muodostavat vasta-aineita. Imusolmukkeet ovat elimistön infektiopuolustuksesta huolehtivien solujen toimintakeskuksia. kumista kapillaareista kudosten käytettäväksi. Verisuonten korkeampi osmoottinen paine puolestaan ylläpitää veritilavuutta. Lymfaattisen kapillaarin hydrostaattinen ja osmoottinen paine on lähes sama kuin soluvälitilassa, mutta koska lymfaattisen kapillaarin seinämä on läpäisevämpi kuin kapillaaria seuraavan pikkulaskimon, riittää lihassupistuksesta, valtimoiden liikkeistä ja esimerkiksi hengityksestä syntyvä oskillaatio aiheuttamaan lymfaattisen imun ja nestevirtauksen imusuonistoon (kuva 2). Imusuonia on lähes kaikissa kudoksissa. Poikkeuksena ovat ainoastaan ihon pinnallisimmat kerrokset, keskushermosto, perifeeristen hermo- Imusuonet kulkevat imusolmukkeiden kautta. Tulehdusprosessissa mikrobiperäisiä antigeeneja ja toksiineja kulkeutuu kudoksesta imunesteen mukana lähimpään imusolmukkeeseen, jossa ne joutuvat kosketuksiin immuunipuolustuksen fagosyyttien sekä T- ja B-lymfosyyttien kanssa. Mikäli elimistö toteaa antigeenin vieraaksi, syntyy imusolmukkeeseen uusi reaktiokeskus. Reaktiokeskuksessa lymfosyytit puolustautuvat vieraita molekyylejä vastaan tuottamalla liukoisia vastaaineita. Imusuonet huolehtivat myös lymfosyyttien kuljetuksesta imusolmukkeista verenkiertoon. Imusuoniston kehitys Verisuonet muodostuvat kahdella eri mekanismilla: sikiökaudella verisuonen endoteelisolut erilaistuvat mesodermin kantasoluista, muodostavat putkimaisia rakenteita ja kehittyvät lopulta verisuoniksi. Tätä prosessia kutsutaan vaskulogeneesiksi. Angiogeneesi taas on verisuonten uudiskasvua lähinnä aikuisessa elimistössä jo olemassa olevista suonista. Siinä kapillaareista versoaa uusia 344 L. Jussila ym.
K u v a 2. Kaavio lymfaattisesta kapillaarista. Endoteelisolut ovat osittain toistensa päällä, jolloin muodostuu sisäänpäin aukeavia läppiä. Ankkurifilamentit kiinnittävät endoteelisolut ympäröivään soluväliaineeseen. haaroja, jotka kasvavat ja yhtyvät edelleen suuremmiksi suoniksi (Risau ja Flamme 1995, Risau 1997). Imusuonten kehittymisestä eli lymfangiogeneesistä on olemassa kolme eri teoriaa. Sabinin (1902) mukaan lymfaattiset suonet syntyvät sikiökaudella laskimoista. Hänen teoriansa mukaan endoteelisolut irtautuvat verisuonen seinämästä, erilaistuvat imusuonen endoteelisoluksi ja muodostavat saarekkeita, joista imusuonet muodostuvat versomalla ja kasvamalla pituutta. Huntingtonin ja McCluren (1908) ja Kampmeierin (1912) teorian mukaan lymfaattinen suonisto, kuten verisuonistokin, kehittyy sikiökautisesta mesenkyymistä, kun taas van der Jagt (1932) esitti teoriassaan yhdistelmän sekä laskimo- että mesenkyymiperäisestä kehityksestä. Kehityksen säätely Endoteelisolu on pitkälle erilaistunut solu, joka tarvitsee tiettyjä signaaleja toimiakseen. Reseptorityrosiinikinaasit ovat tärkeitä solun jakautumisen ja erilaistumisen säätelijöitä. Nämä reseptorit ovat solun ulkokalvon läpi ulottuvia tyrosiinikinaaseja, joiden välittämät biokemialliset tapahtumaketjut säätelevät endoteelisolujen metaboliaa, läpäisevyysominaisuuksia, geeniekspressiota ja solusykliä. Endoteelisoluspesifiset reseptorityrosiinikinaasit säätelevät endoteelisolujen käyttäytymistä useissa fysiologisissa ja patologisissa tilanteissa, kuten keltarauhasen muodostumisessa, haavan paranemisessa, kasvaimen verisuonten muodostuksessa, ateroskleroosissa ja psoriaasissa (Folkman ja Klagsbrun 1987). Solujen erittämät verisuonikasvutekijät sitoutuvat läheisten endoteelisolujen reseptoriin, endoteelisolut reagoivat monimutkaisella geenien uudelleenohjelmoinnilla, ja verisuonisto alkaa kasvaa kudosta kohden. Verisuoniston kasvutekijöistä tunnetaan ns. VEGF-perhe (vascular endothelial growth factor), johon kuuluvat VEGF, VEGF-B, VEGF-C ja VEGF-D. Näitä kasvutekijäsignaaleja vastaanottavia reseptoreita on kloonattu tähän mennessä kolme: VEGFR-1, -2 ja -3. Tie/Tek-reseptoriperhe ja sen angiopoietiineiksi kutsutut kasvutekijät säätelevät lähinnä verisuonen endoteelin ja sileälihas- ja perisyyttisolujen suhteita (kuva 3). VEGF- ja Tie-reseptorit ja niihin sitoutuvat kasvutekijät osallistuvat verisuoniston kehittymiseen sikiökaudella. Niiden esiintymistä on tutkittu mm. hiiren sikiöillä organogeneesin elimien muodostumisen aikana. Näiden tutkimusten mukaan eri kasvutekijä- ja kasvutekijäreseptorigeenit kytkeytyvät toimintaan noin vuorokauden välein hiiren sikiöajan keskivaiheilla ja esiintyvät Uutta imua lymfasuoniston biologiaan 345
K u v a 3. VEGF- ja angiopoietiinikasvutekijät ja niiden reseptorit. VEGF-C on imusuoniston endoteelisolujen kasvutekijä, joka sitoutuu VEGFR-3-reseptoriin. VEGF-D muistuttaa VEGF-C:tä ja sitoutuu todennäköisesti samaan reseptoriin (Achen ym., julkaisematon havainto). VEGF säätelee verisuonen endoteelin toimintaa reseptorien VEGFR-1 ja VEGFR-2 kautta. Istukkakasvutekijä PlGF esiintyy pääosin istukassa, ja VEGF-B ilmenee runsain määrin pääosin sydämessä ja poikkijuovaisessa lihaksessa. Tie/Tek-reseptorien kautta vaikuttava angiopoietiini 1 ei stimuloi endoteelisolujen kasvua, mutta sen oletetaan säätelevän epäsuorasti periendoteeliaalisten suonirakenteiden muodostusta. Nykytietojen mukaan Ang-2 estää Ang-1:n vaikutusta. organogeneesin loppuun asti, jolloin niiden ilmentyminen alkaa vaimeta (Kaipainen 1997). Eri kasvutekijöiden ja reseptoreiden esiintyminen samoissa kudoksissa viittaa siihen, että endoteelisoluissa on useita eri reseptoreita ja eri kasvutekijät vaikuttavat niihin samanaikaisesti tai peräkkäin säätelyn alaisessa järjestyksessä. VEGFR-1 ja -2 esiintyvät verisuonten endoteelisoluissa (Terman ym. 1991, De Vries ym. 1992). VEGFR-3:n havaittiin esiintyvän vain suonissa, jotka eivät sisällä punasoluja (Kaipainen ym. 1995). Tarkempi tutkimus osoitti, että VEGFR-3 esiintyy aikuisella lähinnä vain imusuonten endoteelisoluissa. Tämä reseptori on samalla ensimmäinen löydetty imusuonten endoteelisolulle spesifinen molekyyli, joka mahdollistaa imusuonten tarkan tunnistamisen molekyylibiologian eri menetelmillä. Hiiren alkiossa VEGFR-3 havaittiin alkeellisissa valtimoissa ja laskimoissa jo ennen imusuonien kehittymistä, ja vasta myöhemmin sikiökaudella esiintyminen rajoittuu imusuoniin (Kaipainen ym. 1995). Endoteelisoluille saattaa siis olla olemassa yhteinen kantamuoto, josta kehittyy sekä verisuonten että imusuonten endoteeli, jolloin VEGFR-3 saattaa vaikuttaa imusuonen endoteelisolujen valikoitumiseen ja erilaistumiseen. Verisuonikasvutekijöiden toiminta elimistössä VEGF sitoutuu reseptoreihin VEGFR-1 ja -2 verisuonten endoteelisoluissa säädellen verisuonten kasvua, läpäisevyyttä, vaskulogeneesiä ja angiogeneesiä (Mustonen ja Alitalo 1995). Toisen saman geeniperheen kasvutekijän VEGF-C:n 346 L. Jussila ym.
(tarttuu VEGFR-3-reseptoriin) biologista roolia tutkittiin siirtogeenisissä hiirissä, joiden ihon keratinosyytissä tuotettiin ylimäärin VEGF-C-kasvutekijää. Siirtogeenisten hiirten ihon imusuonten todettiin laajenevan moninkertaisesti endoteelisolujen lisääntymisen johdosta (kuva 4) (Jeltsch ym. 1997). Tämän havainnon perusteella VEGF-C on pääasiassa imusuonten kasvutekijä, toisin kuin VEGF. Kolmen muun kloonatun VEGF-sukuisen kasvutekijän toimintaa ei vielä tunneta yhtä hyvin. Poistogeeniset hiiret, joilta puuttuu kokonaan VEGF-reseptori, kuolevat varhaisessa sikiönkehityksen vaiheessa verisuoniston kehityshäiriöihin. VEGFR-2-geenin puuttuessa endoteelisolut eivät erilaistu, ja ilman VEGFR-1:tä taas verisuonien syntymiselle tärkeä endoteelisolujen putkimaisen rakenteen muodostus epäonnistuu. Tiereseptorien puuttuessa sikiönkehitys jatkuu hieman pidemmälle, mutta sikiö menehtyy lopulta verenvuotoihin verisuonten rakennehäiriöiden vuoksi (Puri ym. 1995). Tämän perusteella kasvutekijät VEGF ja Tie ja niiden reseptorit ovat ratkaisevassa asemassa verisuonien muodostumisessa (Hanahan 1997). Hiiret, joilta on poistettu VEGFR-3-geeni kuolevat myös sikiövaiheessa, koska verisuonet eivät muodostu normaalisti (Jussila ym., julkaisemattomia havaintoja). Imusuoniston patologiaa Imusuonistoon liittyy monia patologisia tiloja. Imusuonten toiminnan heikkeneminen aiheuttaa turvotusta, kun kudosnesteen ylimäärän normaali poistuminen estyy. Imusuonen virtauksen voi estää pahanlaatuinen tuumori mekaanisesti, tulehduksen tai ärsytyksen aiheuttama fibroosi tai imusuonten kirurginen poisto. Radikaali mastektomia rintasyövän hoidossa aiheuttaa usein lymfödeemaa samanpuoleiseen käsivarteen. Lymfangiooman synnystä on esitetty useita teorioita. Weingastin (1988) mukaan sikiökautiset lymfaattisten suonten esimuodot eivät yhdy normaalisti laskimoihin. Toisen teorian mukaan taas lymfaattiset suonet kasvavat ja haaroittuvat epänormaalisti. Tutkittaessa lymfangioomaa in situ -hybridisaatiolla havaittiin VEGFR-3:n lisääntynyt ekspressio (Kaipainen ym. 1995). Epä- K u v a 4. Histologinen leike VEGF-C-siirtogeenisen hiiren ihosta (A) ja vertailu ei-siirtogeenisen hiiren ihoon (B). Siirtogeenisen hiiren ihon keratinosyytit ovat tuottaneet VEGF-C:tä ylimäärin. Se on aiheuttanut lymfaattisen endoteelin kasvua ja tämän seurauksena siirtogeenisen hiiren dermiksen imusuonet (nuoli) ovat laajentuneet (PECAM-värjäys, imusuonen endoteeli näkyy ruskeanpunaisena). Imusuonessa näkyy myös lymfosyyttejä (nuolenkärjet). Vertailuhiiren ihossa ei esiinny laajentuneita imusuonia. muodostumien lisäksi imusuonistossa esiintyy myös geneettisiä (Milroyn tauti, perinnöllinen perifeerinen lymfödeema) ja degeneratiivisia (primaarinen lymfangioskleroosi) sairaustiloja, neoplasioita (lymfooma) sekä kasvaimia (lymfangiosarkooma). Useissa kromosomaalisissa aneuploidioissa, kuten Turnerin syndroomassa ja trisomioissa (trisomia 18, 13 ja 21), esiintyy kämmenen ja jalkapöydän turpoamista. Lymfangioomaa ja lymfödeemaa on todettu esiintyvän myös muutamissa dysmorfogeenissä geneettisissä sairauksissa (Klippel Trenaunayn ja Maffluccin syndroomat). Imusuonistolla on merkitystä myös sydämen ja maksan tautitiloissa sekä hypertensiossa. Syöpäkasvain tarvitsee angiogeneesiä pystyäkseen kasvamaan muutamaa millimetriä suurem- Uutta imua lymfasuoniston biologiaan 347
maksi. Toistaiseksi ei ole todettu lymfaattisen endoteelin kasvua ja lisääntymistä kasvainten sisällä (Folkman 1996), vaan lymfaattisen endoteelin on todettu ympäröivän kasvaimia lähinnä niiden reuna-alueilla. Kuitenkin monet etäpesäkkeet kulkevat ilmeisesti imusuoniston kautta päätyäkseen imusolmukkeisiin, ja imusuonen endoteelilla saattaa olla merkitystä metastaasien ja imukudosstrooman vuorovaikutuksissa. Kasvaimien sisällä soluväliaineen paine on suurempi kuin normaalissa kudoksessa, ja imusuonien puuttuminen on todennäköisesti osasyy siihen. Korkea interstitiaalipaine vaikeuttaa plasman pääsyä kapillaareista soluväliaineeseen, ja myös lääkeaineiden pääsy syöpäkudokseen vaikeutuu. Kliiniset näkökohdat Imusuonten tutkiminen on ollut vähäistä, koska niitä ei ole pystytty tunnistamaan varmasti kuten verisuonia. Verisuonia pystytään värjäämään immunohistokemiallisesti usealla eri vasta-aineella (CD 31, vwf, PAL-E), kun taas lymfaattiselle endoteelille ei ole aiemmin ollut sopivaa antigeenista tunnistusmenetelmää. VEGFR-3 on ensimmäinen vain lymfaattiselle endoteelille spesifinen molekyyli, ja sille on onnistuttu kehittämään toimiva monoklonaalinen vasta-aine, joka värjää kudosnäytteestä imusuonten endoteelin ja mahdollistaa imusuonten tunnistamisen. VEGFR-3-vasta-ainetta voisi olla mahdollista hyödyntää syöpäkasvainten histopatologiassa ja ehkä yleisemminkin kasvainten etäpesäkkeiden kuvantamisessa. Lisäksi VEGFR-3:n tai VEGF-C:n spesifisyyttä lymfaattiselle kudokselle voitaisiin käyttää hyväksi kuljettamalla geeniterapeuttisia valmisteita tai lääkeaineita paikallisesti kohdekudokseen. Myös solunsalpaajien kohdistaminen imusuonistoa pitkin imusolmukemetastaaseihin saattaisi olla mahdollista VEGFR-3:n avulla. * * * Kiitämme vt. professori Seppo Merta artikkelin kriittisestä lukemisesta. Kirjallisuutta Aselli G. De Lacticus Sive Lacteis Venis. 1627. Folkman J. Angiogenesis and tumor growth. N Engl J Med 1996; 334: 921. Folkman J, Klagsbrun M. Angiogenic factors. Science 1987; 235: 442 7. Hanahan D. Signaling vascular morphogenesis and maintenance. Science 1997; 277: 48 50. Huntington G S, McClure C F W. The anatomy and development of the jugular lymph sac in the domestic cat (Felis domestica). Anat Rec 1908; 2: 1 19. van der Jagt E R. The origin and development of the anterior lymph sacs in the sea turtle (Thalassochelys caretta). Q J Microbiol Sci 1932; 75: 151 65. Jeltsch M, Kaipainen A, Joukov V, ym. Hyperplasia of lymphatic vessels in VEGF-C transgenic mice. Science 1997; 276: 1423 25. Kaipainen. Molecular control of lymphangiogenesis (väitöskirja). Helsinki: Helsingin yliopisto, 1997. Kaipainen A, Korhonen J, Mustonen T, ym. Expression of the fmslike tyrosine kinase FLT4 gene becomes restricted to endothelium of lymphatic vessels during development. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92: 3566 70. Kampmeier O F. The value of the injection method in the study of lymphatic development. Anat Rec 1912; 6: 223 32. Mustonen T, Alitalo K. Endothelial receptor tyrosine kinase involved in vasculogenesis and angiogenesis. J Cell Biol 1995; 129: 895 8. Puri M C, Rossant J, Alitalo K, ym. The receptor tyrosine kinase TIE is required for integrity and survival of vascular endothelial cells. EMBO J 1995; 14: 5884 91. Risau W. Mechanisms of angiogenesis. Nature 1997; 386: 671 4. Risau W, Flamme I. Vasculogenesis. Annu Rev Cell Dev Biol 1995; 11: 73 91. Sabin F R. On the origin of the lymphatic system from the veins and the development of the lymph hearts and thoracic duct in the pig. Am J Anat 1902; 1: 367 91. Terman B I, Carrion M E, Kovacs E, ym. Identification of a new endothelial cell growth factor receptor tyrosine kinase. Oncogene 1991; 6: 1677 83. Weingast G R. Congenital lymphangiectasia with fetal cystic hygroma: report of two cases with coexistent Down s syndrome. J Clin Ultrasound 1988; 16: 663 8. De Vries C, Escobedo J A, Ueno H, ym. The fms-like tyrosine kinase, a receptor for vascular endothelial growth factor. Science 1992; 255: 989 91. LOTTA JUSSILA, LK KARI ALITALO, LKT, akatemiaprofessori ARJA KAIPAINEN, LKT Helsingin yliopiston Haartman-instituutti ja biolääketieteen laitos, molekyyli- ja syöpäbiologian tutkimusyksikkö PL 21, Haarmaninkatu 3, 00014 Helsinki Aikakauskirjan pyytämä katsaus Jätetty toimitukselle 23.9.1997 348