NGS:n haasteet diagnostiikassa 9.10.2014 Soili Kytölä, dos. sairaalageneetikko HUSLAB, genetiikan laboratorio
Sidonnaisuudet Kokousmatkoja: Novartis Luentopalkkioita: AstraZeneca, Roche, Pfizer, Lilly
NGS:n haasteita näytteen haastavuus logistiikan toimivuus moniammatillista (mm. bioinformaatikkojen saatavuus) sovituissa toimitusajoissa pysyminen laitteiden, analyysiohjelmien toimiminen data pilvipalvelussa oman serverin hankkiminen raakadatan pitkäaikainen ja rajallinen säilöminen tuntemattomat variantit, merkintä, kliininen merkitys ja lausuminen ituratamutaatiot lausuntojen selkokielisyys lääkäreille potilaiden pääsy lausuntoihinsa (kanta)
Next generation sequencing, NGS sekvensoidaan moninkertaisesti useita geenialueita useilta potilailta samanaikaisesti nopea analytiikka kohdennetut geenipaneelit, transkriptomit, eksomit, koko genomi
NGS-laitevertailua
Illuminan MiSeq vai Ion Torrentin PGM? Illumina MiSeq Ion Torrent PGM
Suuren kapasiteetin NGS-laitteet
Ion Torrent Proton eksomisekvensointi transkriptomit non-invasiivinen cfdnaanalytiikka (sikiöperäinen, kasvainperäinen) koko genomin sekvensointi
Ion Torrent, puolijohdetekniikka perustuu H + irtoamiseen polymeraasin liittäessä nukleotidin, mitataan ph-muutoksena
ph-muutos
NGS-vaiheiden kesto paljon tietoa yhdellä kerralla tulos jopa parissa vuorokaudessa hinta inhimillinen
Kirjaston tekeminen
Emulsio-PCR Emulsio Monistus Rikastus
Sekvensointi
Analysointi Peitto (coverage) kertoo = kuinka monta kertaa kukin emäs on sekvensoitu Herkkyys laskennallinen peiton mukaan
Laatukriteerit, sirun lataus hyvä 80-90 %
Laatukriteerit, yhteenveto
Laatukriteerit, juosteiden lukupituus
Barcode-näyte-sarja
VariantCaller
VariantCaller, cosmic
IonReporter, filtteröinti
p.gly13val
http://cancergenome.broadinstitute.org/ NEJM, 2013
Mutaatiot ja niiden merkinnät c.1733_1735delatg p.asp579del c.1961t>c p.val654ala c.1799_1800deltginsaa p.val600glu
Väärät positiiviset homopolymeerit, >6 alukkeiden väärä sitoutuminen (katkenneet juosteet) kompleksiset variantit useita variantteja alhaisella frekvenssillä
21318 Ts-NGSsCA1 NGS syöpägeenipaneeli 1 kiinteiden kasvainten somaattisille muutoksille Type Name Covered Chromosome Num_Ampl Total_Bases _Bases Missed_Bases GENE PIK3CA chr3 40 3627 3576 51 GENE EGFR chr7 36 4614 4614 0 GENE KIT chr4 28 3575 3575 0 GENE KRAS chr12 7 792 781 11 GENE MET chr7 37 4768 4768 0 GENE NRAS chr1 5 654 654 0 GENE PDGFRA chr4 28 3732 3732 0 BRAF V600 chr7 1 61 61 0 GENOME_ REGION paneelin koko 21.82 kb
21316 Ts-NGSsHS1 NGS hotspot syöpägeenipaneeli 1 kiinteiden kasvainten somaattisille muutoksille paneelin koko 5.69 kb Gene COSMIC Gene COSMIC Gene COSMIC ABL1 19 FGFR2 8 NRAS 35 AKT1 6 FGFR3 17 PDGFRA 26 ALK 8 FLT3 30 PIK3CA 93 APC 164 GNA11 5 PIK3CA_ENST00 000263967 4 ATM 24 GNAQ 6 PTEN 159 BRAF 77 GNAS 9 PTPN11 28 CDH1 7 GNAS_ENST00 000371100 3 RB1 18 CDKN2A 106 HNF1A 10 RET 17 CDKN2A_ENST 00000361570 1 HRAS 24 SMAD4 31 CDKN2A_ENST 00000446177 1 HRAS_ENST00 000397594 3 SMARCB1 11 CSF1R 8 IDH1 15 SMO 5 CTNNB1 73 IDH2 12 SRC 1 EGFR 123 JAK2 5 STK11 23 ERBB2 19 JAK3 6 TP53 1010 ERBB4 13 KDR 11 TP53_ENST0000 0269305 52 TP53_ENST0000 EZH2 7 KIT 139 EZH2_ENST000 00350995 4 KRAS 63 0413465 35 TP53_ENST0000 0414315 21 TP53_ENST0000 0545858 32 FBXW7 13 MET 18 FBXW7_ENST0 0000281708 4 MLH1 1 VHL 124 FBXW7_ENST0 0000534231 4 MPL 10 FBXW7_NM_01 8315_2 4 NOTCH1 20 Kaikki yhteensä 2855 FGFR1 2 NPM1 28
Lausuntomalli
Lausuntomalli, ei mutaatiota
Tunnettu mutaatio
Muu tunnettu mutaatio
Tuntematon mutaatio
Tulevaisuuden suunnitelmia kohdennetut paneelit kaupalliset community custom transkriptomit, RNA-pohjainen cfdna:n määrittäminen (non-invasiivinen diagnostiikka) sikiöperäinen kasvainperäinen alkiodiagnostiikka (PGD-NGS) eksomit, koko genomit
NGS:n haasteita näytteen haastavuus logistiikan toimivuus moniammatillista (mm. bioinformaatikkojen saatavuus) sovituissa toimitusajoissa pysyminen laitteiden, analyysiohjelmien toimiminen data pilvipalvelussa oman serverin hankkiminen raakadatan pitkäaikainen ja rajallinen säilöminen tuntemattomat variantit, merkintä, kliininen merkitys ja lausuminen ituratamutaatiot lausuntojen selkokielisyys lääkäreille potilaiden pääsy lausuntoihinsa (kanta)
Kiitos!