Genomin ylläpito TIINA IMMONEN MEDICUM BIOKEMIA JA KEHITYSBIOLOGIA

Transkriptio

1 Genomin ylläpito TIINA IMMONEN MEDICUM BIOKEMIA JA KEHITYSBIOLOGIA

2 Luennon sisältö Tuman kromosomien rakenne ja pakkautuminen Pakkautumisen säätely: histonien modifikaatiot DNA:n kahdentuminen eli replikaatio Replikaatiovirheiden ja DNA-vaurioiden korjaus DNA-katkosten korjaus ja sen rooli genomin muuntumisessa

3 Kromosomien rakenne ja pakkautuminen

4 Ihmisen perimä Genomi = tuman + mitokondrioiden DNA Diploidin solun tumassa 22 autosomaalista kromosomiparia 2 sukukromosomia 2 x 3 x 10 9 emäsparia Mitokondriossa n. 16,5 x 10 3 emäsparia Figure 4-11 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

5 Kromosomi koostuu emäsparien muodostamasta DNA-kaksoiskierteestä

6 Tumassa on DNA:ta noin 1,8 m DNA-rihma pitää pakata tiiviisti. Pakkaamisessa auttavat siihen kiinnittyneet histoniproteiinit, jotka neutraloivat DNAkaksoiskierteen negatiivisen varauksen Ennen solunjakautumista kromatiini (DNA + proteiinit) on kiertynyt kaikkein tiiveimmin (n x)

7 Kromatiinin pakkautumista auttavat proteiinit Histonioktameeri + sen ympärille kiertynyt DNA + H1 = nukleosomi Histonit positiivisesti varautuneita

8 Histonihäntien kovalenttiset modifikaatiot Lysiinit (K) voivat asetyloitua tai metyloitua Seriinit (S) voivat fosforyloitua

9 Asetylaatio poistaa positiivisen varauksen, metylaatio stabiloi sitä Asetylaatio heikentää histonien positiivista varausta - > heikentää histonien ja DNA-rihman välistä vetovoimaa -> löyhentää pakkausta ja helpottaa DNA:n luentaa Metylaatio stabiloi histonien positiivista varausta ja ylläpitää histonien ja DNA-rihman välistä sähköistä vuorovaikutusta -> ylläpitää pakkausta -> vaikeuttaa DNA:n luentaa

10 Seriinien fosforylaatio lisää negatiivisen varauksen Löyhentää pakkausta (neg. DNArihman ja histonihäntien välinen sähköinen hyljintä) - helpottaa DNA:n informaation lukemista ja geenien ilmentymistä

11 DNA:n pakkautuminen säätelee sen aktiivisuutta Eukromatiini sisältää kromosomialueita joista geenien luenta l. ilmentyminen on mahdollista Heterokromatiini on erityisen tiukkaan pakkautunutta kromatiinia. Se ei sisällä aktiivisia geenialueita.

12 Geenit sijaitsevat kromosomeissa Kahdentunut kromosomi ennen solunjakautumista

13 DNA:n kahdentuminen eli replikaatio

14 Tuman kromosomit kahdentuvat ennen mitoosia S-faasi Figure fig. from ch. 17, 5 and 4 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

15 Tumakromosomien replikaatio Kussakin kromosomissa on useita replikaation aloituskohtia Replikaatio etenee aloituskohdista kahteen suuntaan, jolloin muodostu 2 replikaatiohaarukkaa Replikaatio jatkuu kunnes replikaatiohaarukat yhtyvät toisiinsa ja saavuttavat myös kromosomin päät Replikaatiohaarukassa replikaation etenemissuunta on toisen juosteen kopioinnissa sama kuin DNA-synteesin suunta, mutta toisessa juosteessa sille vastakkainen Figure 4-21 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

16 Tuma-DNA replikoituu tasan kerran solusyklin aikana Valmistautuminen (G1-vaihe): ORC eli kromosomissa olevan replikaation aloituskohdan tunnistava proteiinikompleksi kiinnittyy aloituskohtaan ORC houkuttelee paikalle muita replikaatioon tarvittavia proteiineja, jolloin muodostuu prereplikatiivinen kompleksi S-vaiheessa tuman sykliiniriippuvaiset kinaasit aktivoituvat pre-replikatiivinen kompleksi hajoaa,helikaasit ja ORC fosforyloituvat, replikaatio alkaa Pre-replikatiivinen kompleksi voi muodostua uudestaan vasta solunjakautumisen jälkeen kun ORC defosforyloituu G1-vaiheessa

17 Replikaation tärkein entsyymi on DNA-polymeraasi II Osaa tehdä uutta DNA-juostetta vain 5 3 Osaa liittää nukleotidin (datp, dgtp, dttp, dctp) pariutuneen juosteen vapaaseen 3 -OH-ryhmään Ei osaa aloittaa synteesiä

18 Replikaatio ja replikaatiokoneisto Figure 5-19a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

19 Histonit purkautuvat replikaatiohaarukan edessä ja kootaan uudestaan sen takana

20 Pakkautuminen säilyy solunjakautumisessa

21 Kromosomien päissä on telomeerit Kromosomien päissä on repetitiivistä sekvenssiä sisältävät telomeerit geenit eivät siis ulotu päähän asti

22 Telomeraasi-entsyymi kantaa mukanaan aluketta ja pidentää replikaatiossa lyheneviä päitä

23 DNA:n korjausmekanismit

24 Replikaatiovirheet ja niiden korjaus DNA-polymeraasi tekee n virhettä / genomi Korjausten jälkeen jää n. 1/replikaatio/ genomi Table 5-1 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

25 DNA-polymeraasi poistaa itse väärin liitetyn nukleotidin DNA-polymeraasissa on 3-5 eksonukleaasi-aktiivisuus: editointitasku poistaa heti väärän nukleotidin, sillä muuten seuraavan nukleotidin liittäminen vaikeutuu. Väärä nukleotidi tunnistetaan, sillä se ei pariudu vastinemäksen kanssa riittävän tiukasti.

26 Spontaanit DNA-vauriot: muutokset emäksissä depurinaatio Hydrolyysi voi aiheuttaa emäksen irtoamisen (depurinaatio) tai deaminaation Hallitsematon metylaatio Oksidatiiviset vauriot deaminaatio Figure 5-44 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) depurinaatio

27 Emäsvauriot on yleensä helppo tunnistaa Esimerkiksi deaminaation seurauksena DNA:n normaalien emästen paikalle syntyy poikkeavia rakenteita

28 DNA:lle vieraiden emäsrakenteiden ja puuttuvien emästen korjaus EMÄKSENPOISTOKORJAUS VAIHEET 1. Glykosylaasi poistaa virheellisen emäksen 2. Sokerifosfaattitukirangan katkaisu ja sokerifosfaatin poisto endonukleaasilla ja fosfodiesteraasilla 3. DNA polymeraasi lisää uuden nukleotidin 4. Ligaasi sulkee sokerifosfaattiketjun Korjaus kohdistuu siis vain yhteen nukleotidiin Mekanismi osaa korjata myös emäksen irtoamisesta johtuvat vauriot Figures 5-48a and 5-50a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

29 Strand-directed mismatchrepair Jonkin aikaa replikaation jälkeen on mahdollista erottaa, kumpi kaksoiskierteen juosteista on uusi Kun korjausentsyymit löytävät väärin pariutuneet emäkset, korjataan uuden juosteen nukleotidi Muuten korjaus olisi sattumanvaraista ja 50% korjauksista johtaisi mutaatioon (alkuperäisen emäsparin vaihtumiseen) koska korjauskoneisto ei enää tiedä kumpi emäksistä on väärä

30 Tehoton korjaus johtaa mutaatioihin Geenien aktiivisuutta säädellään mm. metyloimalla sytosiineja: DNA:ssa on paljon metyylisytosiineja 5-metyylisytosiinin deaminaatiossa syntyy tymiini Alkuperäinen G- m5 C pari muuttuu G-T kumpikaan juoste ei uusi korjaus sattumanvaraista tuloksena joko G-C tai A-T n. 1/3 tunnetuista yhden emäksen laajuisista tautimutaatioista syntynyt tällä tavalla Figure 5-50b Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

31 UV-säteily aiheuttaa kovalenttisia sidoksia vierekkäisten emästen välillä NUKLEOTIDIENPOISTOKORJAUS VAIHEET Pyrimidiini-dimeeri (vierekkäisten CC, CT, tai TT emästen välinen kovalenttinen sidos) aiheuttaa mutkan, joka tunnistetaan 1. Nukleaasi katkaisee sokerifosfaattirungon mutkan molemmin puolin 2. Helikaasi irroittaa katkaistun oligonukleotidin 3. Polymeraasi ja ligaasi täyttävät aukon Figure 5-48 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

32 DNA-katkokset: Ennen solunjakautumista kaikkien kromosomien pitää kiinnittyä tumasukkulaan Katkosten aiheuttajia: Ionisoiva säteily Replikaatiovirheet Hapettimet ja muut metaboliatuotteet Jos katkenneessa kromosomin palassa ei ole sentromeeriä, se häviää seuraavassa solunjakautumisessa Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

33 DNA-katkosten korjaus: kaksi tapaa Hätäkorjaus ihmisellä yleinen Mitoosissa sisarkromatidien välillä kun DNA kahdentunut Figure 5-51 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

34 Katkosten korjaus genomin monimuotoisuuden aiheuttajana

35 Epähomologinen yhdistäminen vasta-aineiden tuotannossa Epähomologista päiden yhdistämistä käytetään myös vasta-aineita tuottavien immuunijärjestelmän solujen genomin uudelleenjärjestelyissä. Kromosomit katkaistaan, jolloin korjauksessa syntyy uusia vastaaineiden variaabelialueita koodaavia nukleotidijärjestyksiä.

36 Homologinen rekombinaatio sukusolujen meioosissa HOMOLOGINEN REKOMBINAATIO VASTINKROMOSOMIEN VÄLILLÄ EMÄSJÄRJESTYS KOPIOIDAAN EPÄIDENTTISESTÄ TEMPLAATISTA Meioosissa kahdentuneet vastinkromosomit asettuvat vierekkäin jakotasoon Vastinkromosomien välillä voi tapahtua nk. crossing over, jolloin homologinen rekombinaatio tapahtuu epäidenttisten vastinkromosomien juosteiden välillä Tästä aiheutuu muutoksia kromatidien emäsjärjestykseen

37 Voi johtaa kromosomien päiden vaihtumiseen (crossing over) tai joidenkin alleelien välisten erojen kopiointiin (gene conversion)