11111111111 111 111111111 111 11 11 1 1111111111111111111 1 F1000B (12) PATENTTI JULKAISU PATENTSKRIFT (10) FI B (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats 30.09.1998 (51) Kv.lk.6 - Int.k1.6 SUOMI-FINLAND (FI) A 61K 39/095, C 12N 15/31, 15/63, 1/20 (21) Patenttihakemus - Patentansökning 945110 (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag 31.10.1994 (24) Alkupäivä - Löpdag 23.11.1988 Patentti- ja rekisterihallitus Patent- och registerstyrelsen (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig 31.10.1994 (86) Kv. hakemus - Int. ansökan PCT/US88/04225 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet 24.11.1987 US 124727 P 09.09.1988 US 242758 P (73) Haltija - Innehavare 1. The University of North Carolina, Chapel Hill, NC 27514, USA, (US) (72) Keksijä - Uppfinnare 1. Carbonetti, Nicholas 14., 1102A East Franklin Street, Chapel Hill, NC 27514, USA, (US) 2. Sparling, P. Frederick, 303 Weaver Road, Chapel Hill, NC 27514, USA, (US) (74) Asiamies - Ombud: Berggren Oy Ab, Jaakonkatu 3 A, 00100 Helsinki (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benåmning Tippuribakteerien rokotteiden valmistusmenetelmä Framställningsförfarande av vaccin för gonorrdbakterier (62) Jakamalla erotettu hakemuksesta - Avdelad frän ansökan: 902569 (83) Mikro-organismitalletus - Deposition av mikroorganism: 18263 NRRL 53808 ATCC 67775 ATCC (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer Infection and Immunity vol. 36 (1982) nro 3, pp 1042-1053, Infection and Immunity vol. 54 (1986) nro 2, pp 333-338 (57) Tiivistelmå - Sammandrag Tämä keksintö liittyy geenijaksoon, joka koodaa Neisseria aonorrhoeaen I-proteiinia, ja tämän sisältävään kloonausvektoriin ja isäntäorganismeihin. Kuvataan myös oligonukleotidit, jotka ovat käyttökelpoisia diagnostisia koettimia N. 00- norrhoeae -infektion havaitsemiseksi. Denna uppfinning hänför sig tili en gensekvens som kodar för I-protein av Neisseria aonorrhoeae och en kloningsvektor och värdorganismer innehållande densamma. Även oligonukleotider användbara som diagnostiska testmedel för detektering av N. oonorrhoeae-infektioner beskrivs.
Tippuribakteerin rokotteiden valmistusmenetelmä 5 Tämä hakemus on jakamalla erotettu hakemuksesta 902569. Tippuri on tållå hetkellä laajimmalle levinnyt sukupuolitauti, jota esiintyy kaikkialla maailmassa, ja pelkästään Yhdysvalloissa tavataan vuosittain useita miljoonia tapauksia. Taudin aiheuttaja on gonokokki NP -isrpria gnnnrrhnere, 10 bakteeri, joka on koko historiansa aikana kehittänyt vastustuskyvyn sekä perinteistä antibioottihoitoa että jossain määrin normaalia ihmisen seerumin bakteereja tappavaa aktiivisuutta vastaan. Tämänhetkinen keinojen puute infektion kontrolloimiseksi perinteisin menetelmin on tehnyt in- 15 fektion tehokkaasti estävän rokotteen kehittämisen erittäin tärkeäksi. Tämä keksintö tarjoaa käytettäväksi DNA-jakson, joka koodaa spesifistä N. gnnnrrhnpapn ulkokalvon proteiinia; tämän nimenomaisen jakson kloonattu tuote tuo käytettåvåksi sopivan lähtökohdan tällaista rokotetta varten. 20 Tåmå keksintö tarjoaa myös lajispesifisiä oligonukleotidijaksoja, jotka ovat käyttökelpoisia diagnostisia koettimia tippuritartunnan havaitsemiseksi. Mitä tahansa tiettyä infektion aiheuttajaa vastaan suun- 25 natun suojaavan immuunivasteen muodostuminen selkärankaisilla riippuu ensi vaiheessa siitä, että isännän immuunijärjestelmä saa asianmukaisen kiihokkeen. Useina kiihokkeen antavina yhdisteinä tai antigeeneinä toimivat itse infektoivan eliön omaan solukalvokoostumukseen luonteen- 30 omaisesti kuuluvat aineet sinänsä tai tästä organismista isännän ruumiiseen vapautuvat metaboliatuotteet. Nämä immunologisen järjestelmän vieraiksi tunnistamat aineet, jotka ovat tavallisesti suurempia molekyylejä, kuten proteiinit, lipopolysakkaridit tai glykoproteiinit, saavat 35 isännän reagoimaan yhdellä tai useammalla tavalla hyökkäävän organismin poistamiseksi tai sen saattamiseen toimintakyvyttömäksi. Antigeeni voi aiheuttaa sen, että muodostuu herkistyneitä, soluvålitteisen immuniteetin tuottavia lymfosyyttejä. Vaihtoehtoisesti antigeeni voi
2 stimuloida vapaan vasta-aineen vapautumisen vereen ja muihin ruumiinnesteisiin (humoraalinen immuniteetti). Kehon suojaavan immuniteetin kehittyminen riippuu toisen tai molempien näiden systeemien stimulaatiokynnyksen saa- 5 vuttamisesta. Väliaikainen immuniteetti infektiota vastaan voidaan useissa tapauksissa saada antamalla yksilölle toisen saman lajin yksilön ennakolta muodostamia vasta-aineita. 10 Tämä tunnetaan passiivisena immuniteettina. Yksi esimerkki tästä immuniteetista on sikiön ja vastasyntyneen saama suoja äidin vasta-aineiden siirtymisestä istukan kautta sekä vasta-aineiden siirtymisestä maidon välityksellä. Toinen esimerkki on yhdistetty aikuisten gamma- 15 globuliini, jota käytetään usein estämään tai muokkaamaan altistumista tuhkarokolle, vesirokolle, hepatiitille, isorokolle ja jäykkäkouristukselle. Nämä saadut vastaaineet kuluvat vähitellen vuorovaikutukseen antigeenin kanssa tai ne pilkkoutuvat kehossa ja tästä syystä suoja 20 lopulta häviää. Säilyvämpi suoja saadaan aktiivisella immunisoinnilla. Rokotuksesta syntyy aktiivinen suojaava immuniteetti käyttämällä immuunijärjestelmän ensivaiheisena kiihokkee- 25 na vaaratonta tai ei-virulenttia antigeenin muotoa (esim. tapettua tai geneettisesti muunnettua bakteeria tai soluseinästä eristettyä glykoproteiinia). Tämä synnyttää vasta-aineiden tuotossa melko hitaan vasteen, joka nousee huippuunsa ja häipyy pois. Keho on kuitenkin saa- 30 nut hälytyksen antigeenin olemassaolosta, ja kun altistuminen tapahtuu uudelleen, mandollisesti elävällä ja virulentilla organismilla, esiintyy sekundäärinen vaste, jolloin vasta-ainetta tuotetaan paljon nopeammin ja runsaammin. Tämä sekundäärinen vaste riittää tyypillisesti es- 35 tämään mikro-organismin asettumisen kehoon siten, että se voisi aiheuttaa täysimittaisen infektion. Rokote voi esiintyä useassa eri muodossa, joista jotkin ovat toisia tehokkaampia antamaan haluttua suojaavaa vai-
3 kutusta. Aiemmin monia rokotteita on valmistettu tappamalla tai inaktivoimalla kiinnostuksen kohteena olevaa tautia aiheuttava mikro-organismi ja käyttämällä tapettuja soluja aktiivisena immunogeenisenä aineena. Tämän- 5 tyyppisiä rokotteita on käytetty lavantautia, koleraa ja poliota vastaan (Saik -rokote). Tämäntyyppisen rokotteen ongelma on, että mikro-organismin tappamiseen tarvittu käsittely, kuten formaldehydi, voi usein muuntaa tai tuhota mikrobin käyttökelpoisia antigeeneja ja näinollen 10 saatu immuniteetti voi olla huono tai epätäydellinen. Rokotteen vaihtoehtoinen muoto on heikennettyjä mikro- organismeja käyttävä rokotemuoto. Heikennetty mikro-or- ganismi on sellainen, joka on vielä elävä ja annostelun 15 jälkeen lisääntymiskykyinen kehossa, mutta joka on muunnettu jollain tavalla ei-virulentiksi tai vaihtoehtoisesti tämä on kanta, joka on virulentti toisille eliöille, mutta ei ole virulentti ihmiselle. Heikennetyn organismin käytöstä saadaan se etu, että heikentäminen ei taval- 20 lisesti muuta antigeenisyyttä, jolloin tämä tuottaa tehokkaan kiihokkeen immuunijärjestelmälle. Heikennetyt rokotteet tuhkarokkoa, vihurirokkoa ja poliota vastaan ovat päässeet laajaan käyttöön. Heikentäminen suoritetaan tavallisesti muuttamalla mikro-organismin kasvatus- 30 25 olosuhteita tai, viimeaikaisemmin, muuntamalla geneettisesti organismin virulenssia. Vaikka elävät organismit ovat yleensä tehokkaampia kuin tapetut rokotteet, on kuitenkin olemassa se vaara, että niiden virulenssi palautuu, josta on seurauksena taudinoireiden ilmaantuminen. Kokonaisista organismeista valmistettuihin rokotteisiin liittyvien ongelmien johdosta on yksittäisten suojaavien antigeenien käyttö rokotekoostumusten aktiivisina aineina yleistynyt viime vuosina. Vaikkakaan ei ole aina yksin- 35 kertaista eristää ja tunnistaa joitakin tiettyjä suojaavan vasteen herättäviä organismin antigeeneja, tämä menetelmä tarjoaa tehokkaan ja haitattoman vaihtoehdon kokonaisista organismeista valmistetuille rokotteille sitten, kun nämä antigeenit on tunnistettu.
4 Esimerkkejä antigeenityypeistä, jotka ovat tyypillisesti käyttökelpoisia tähän tarkoitukseen, ovat puhdistetut solun tai kapsidin komponentit, kuten bakteeritoksiinit, 5 (joiden toksisuus on hävitettävä, jotta saadaan toksoidi), bakteerin tai viruksen toksiinialayksiköt, solunseinän polysakkaridit tai kapsidin glykoproteiinit. Nämä komponentit ovat usein hyvin tehokkaita immuniteetin tuottamiseen, mutta vaikeuksia syntyy varsinaisessa puh- 10 distamisessa. Kriittistä on se, että kiinnostuksen kohteena oleva antigeeni eristetään enemmän tai vähemmän täydellisesti muista ylimääräisistä solumateriaaleista, joiden läsnäolo voi usein aiheuttaa haitallisen immunologisen tai aineenvaihduntaa koskevan vasteen samanaikai- 15 sesti halutun immuniteetin tuottavan reaktion kanssa. Tarvittavat puhdistusmenetelmät ovat usein monimutkaisia, vaivalloisia ja kustannuksiltaan niin korkeita, ettei niiden käyttöönotto tule kyseeseen ja tulokset eivät aina ole täysin ennustettavia. Tämä ongelma voidaan joissakin 20 tapauksissa välttää valmistamalla synteettisesti pieniä peptidijaksoja, jotka vastaavat mikrobiantigeenilla olevia epitooppeja. Joissakin olosuhteissa tämän menetelmän varjopuoliin kuuluu se, että vaikka aminohappojärjestys vastaa luonnollista epitoopin aminohappojärjestystä, kon- 25 formaatio ei mandollisesti ole parentaaliseen antigeeniin verrattuna riittävässä määrin samanlainen asianmukaisen immuunivasteen herättämiseksi. Monet edellisiin rokotetyyppeihin liittyvät haitat voi- 30 daan välttää yhdistelmä-dna-tekniikkaa käyttäen. Mandollisuus kloonata kokonaista tärkeää mikrobiantigeenia tai tämän osaa koodaavat geenit tarjoaa suhteellisen taloudellisen ja helppokäyttöisen tarvittavan immunogeenimateriaalin lähteen, joka on olennaisen puhdas kontaminoivas- 35 ta proteiini- tai geneettisestä materiaalista. Lyhyesti kuvattuna tähän menetelmään puhdistettujen antigeenien tuottamiseksi kuuluu tätä antigeenia koodaavan spesifisen DNA-jakson liittäminen DNA-vektoriin sellaisen yhdistelmä-dna-molekyylin muodostamiseksi, jota isäntäsolu voi
5 monistaa. Nykyisin on runsaasti menetelmiä, joilla yhdistelmä-dna-molekyylejä voidaan valmistaa. Yksi hyvin tunnetuista menetelmistä on Cohenin ja Boyerin US-patentissa n:o 4 237 224 kuvaama menetelmä, johon sisältyvä 5 oppi liitetään tähän hakemukseen viittauksella. Tässä menetelmässä yhdistelmäplasmidit tuotetaan restriktioentsyymejä ja ligaasireaktiolla suoritettua yhdistämistä käyttäen; saadut plasmidit viedään sitten yksisoluiseen isäntäsoluun, joka näin transformoituu ja aloittaa vie- 10 raan DNA:n monistamisen. Toinen, bakteriofaagivektoreita käyttävä menetelmä on kuvattu US-patentissa n:o 4 304 863, joka myös liitetään tähän hakemukseen viittauksella. Kloonausmenetelmä tarjoaa suurimmat mandollisuudet tuoda vaivattomasti saataville helppokäyttöiset ja taloudelli- 15 set materiaalilähteet rokotteiden valmistamiseksi; sitä ei kuitenkaan voi soveltaa vaikeuksitta, sillä asianmukainen tunnettua immunogeenistä antigeeniä vastaava geeni täytyy ensin eristää ja sekvenssoida, liittää plasmidiin asianmukaisen lisääntymisen, transkription ja translaati- 20 on varmistamiseksi ja liittää sitten yhteensopivaan isäntäsoluun. Epäonnistumisen mandollisuus halutun geenituotteen ilmen- tämisessä on erityisen suuri, jos yksikin geenin trans- 25 kriptiosta, RNA:n translaatiosta tai translaation jälkeisestä prosessoinnista ja polypeptidin sijoittumisesta soluun koostuva vaihe ei tapandu oikein. Jotta kloonattu liitosjakso toimisi transkriptiossa, vaaditaan sellaista promoottoria, jonka isännän RNA-polymeraasi voi tunnis- 30 taa. Varsinainen translaatio vaatii sen, että RNA:ssa on ribosomin sitoutumiskohta. Translaation jälkeiseen proteiinien muokkaukseen liittyy usein proteiinit solukalvon läpi ohjaavan signaalijakson pilkkominen. Isäntämikroorganismin tuottaman vieraan proteiinin hajottamista voi 35 myös tapahtua, jos aminohappojakson konfiguraatio ei suojaa niitä isännän solunsisäisten proteaasien vaikutukselta. Vaikka näiden menetelmien voitaisiin kuvitella olevan ihanteellinen keino saada vihdoinkin konstruoiduksi
6 Neisseria -rokote, niitä ei ole aiemmin sovellettu tippurirokotteen valmistamiseksi. Jotkin Neisseria aonorrhoeaen antigeenit ovat tarkoin 5 tutkittuja ja luokiteltuja. Gonokokkien pilusten on havaittu olevan antigeenisia (Buchanan et al., (1973) J. Clin., Invest. 52, 2896-2909) ja ne koostuvat pääasiassa molekyylipainoltaan noin 20 000 suuruisista proteiinialayksiköistä. Tämän materiaalin synteettinen muoto on 10 formuloitu rokotevalmisteeksi (Schoolnik et al., (1983) Prog. Allergy 33, 314-331). N. aonorrhoeaen lipopolysakkaridi on myös antigeeninen, ja sen P-1,4-sidoksella kytkeytyneet galaktoosi-glukoosiryhmät ovat pääasiallisin determinantti. Tämän alan tutkimuksen suurin keskittymi- 15 nen on kuitenkin viime vuosina luultavasti kohdistunut ulkokalvon proteiineihin, proteiinikompleksiin, jonka osuutta immunogeenisyydessä ei vielä täysin ymmärretä. Ulkokalvon proteiinien koostumuksen tiedetään vaihtelevan jossain määrin kannasta toiseen ja tämän perusteella on 20 tunnistettu ainakin 16 erilaista serotyyppiä (Johnston et al., (1976) J. Expt. Med. 143, 741-758). Aiemmin on kuvattu joitakin rokotekoostumuksia, joissa on käytetty gonokokkien kalvon osia, esimerkiksi US-patentissa n:o 4 203 971, US-patentissa n:o 4 228 557 ja US-patentissa n:o 25 4 681 761. Useimmat näistä koostumuksista sisältävät kuitenkin proteiinin ja muun materiaalin seoksen ja ne kaikki vaativat melko työläitä puhdistusmenetelmiä aktiivisten komponenttien eristämiseksi ja erottamiseksi bakteerisolusta. Näiltä rokotteilta saattaa siten puuttua 30 haluttu immunologinen spesifisyys ja niihin tarvitaan suuri määrä mikrobiperäistä lähtömateriaalia, jotta tuotetta voitaisiin tuottaa kaupallisia määriä. Mandolliseksi rokotekoostumuksen perustana olevaksi eh- 35 dokkaaksi on myös ehdotettu spesifistä ulkokalvon prote- iinia, joka tunnetaan proteiinina I eli PI:nä. PI on N. gonorrhoeaen runsaimmin esiintyvä ulkokalvon proteiini, joka toimii poriinina (Douglas et al., (1981) FEMS Mic- robiology Letters 12, 305-309), proteiinina, jonka us-
7 kotaan toimivan solussa pienimolekyylipainoisten aineiden kanavoimisessa hydrofobisen lipidiulkokalvon läpi. Lukuisat piirteet tekevät PI:stä mielenkiintoisen huomion kohteen: ensiksikin se on ainakin osittain vastuussa 5 Neisseria -suvun serotyyppispesifisyydestä ja proteiini I:n antigeenisten serotyyppien määrä on melko pieni. Tietyn nimenomaisen PI-serotyypin omaavat gonokokit on myös liitetty vaikeisiin gonokokki-infektioihin. Se näyttää lisäksi olevan natiivissa tilassaan pinnalla 10 esiintyvä ja näyttää stimuloivan opsoniinien tuottoa (Sarafian et al., (1983) J. Infect. Dis. 148, 1025-1032). Opsoniinit ovat vasta-aineita, jotka sitoutuvat infektoivien organismien pintaan edistämään organismin joutumista fagosyyttien sisään. Sen immunogeeninen potentiaali on 15 jo osoitettu rokotetuissa hiirissä (Jiskoot et al., (1986) Infect. Immun. 54, 333-338). Gonokokeissa on osoitettu esiintyvän kahta eri pääasiallista PI-molekyylityyppiä, PIA ja PIB (Barrera et al., 20 (1984) Infect. Immun. 44, 565-568) peptidikartoituksen ja proteolyysiherkkyyden perusteella (Blake et al., (1981) Infect. Immun. 33, 212-222). Tämän jaottelun on havaittu korreloivan serologisista ryhmistä saatavien esikuvien (Sandstrum et al., (1982) Infect. Immun. 38, 25 462-470) ja patogeneesin mukaan. Proteiinia IA ilmentävät gonokokit liittyvät systeemisiin infektioihin, kun taas proteiinin IB omaavat gonokokit liittyvät paikalliseen infektioon (Buchanan et al., (1981) Infect. Immun. 32, 985-994; Hildebrandt et al., (1978) Infect. Immun. 30 20, 267-273). Huolimatta siitä huomiosta, jota PI:n kehittämiseen yh- tenä mandollisena rokote-ehdokkaana on kohdistettu, ei vielä ole tuotettu PI:hin perustuvaa tehokasta rokotetta. 35 Ei myöskään ole selvitetty sen tuottoa ohjaavaa geenisekvenssiä ja proteiinin rakenteesta tiedetään vähän. Tämä keksintö tarjoaa käyttöön ensimmäisen kuvauksen kokonai- sesta PI-geenin sekvenssistä, PIA-rakennegeenistä sekä kloonatun geenin tuotteesta. Kuvataan myös uuden PIB-
8 geenin sekvenssi sekä näistä jaksoista johdetut yhtåjaksoiset PIA-PIB-kimeerat. Nämä kimeerat ovat käyttökelpoisia 5 peptidikartoituksessa sekä tarjoavat myöskin perustan rokotteen kehittämiselle. 1 0 Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa. On kuvattu NeiRseria gonnrrhnpagm proteiinien IA ja IB täydellinen nukleotidijärjestys sekä niiden ennustettu aminohappojärjestys. Kuvataan myös menetelmät ja koostumukset PIA- ja PIB-geenien kloonaamiseksi ja ilmentämiseksi yksi- 15 soluisessa isåntåorganismissa sekä kimeeristen PIA-PIB-proteiinituotteiden kloonaamiseksi ja ilmentämiseksi. Kuvataan myös menetelmät uuden isåntåorganismin viljelemiseksi geenituotteiden tuottoa varten. Käytettyjen yhdistelmä-dnamenetelmien tuotteet soveltuvat käytettäväksi kokonaisina 20 tai antigeenisilta osiltaan immunogeeneiksi tippurin ehkäisyyn tarkoitettuihin rokotekoostumuksiin. PIA- ja PIB-geenit eristettiin bakteerigenomista hybri- disoimalla DNA-fragmentit uusilla oligonukleotidikoetti- 25 milla. Kun geenit oli paikallistettu spesifiseen DNAjaksoon, tämän nukleotidijärjestys määritettiin ja tätä vastaava aminohappojårjestys ennustettiin. Kukin geeni liitettiin sitten kloonausplasmidivektoriin, joka toimii geenin monistamisyksikkönä. Yhdistelmäplasmidia käytettiin 30 sitten transformoimaan tämän kanssa yhteensopiva isäntäsolu, joka ilmentää geenituotetta. Tässä patenttihakemusjulkaisussa kuvataan myös menetelmät, joiden avulla ilmentyneet tuotteet eristetään ja kukin näistä formuloidaan rokotekoostumuksiksi. Erityisesti esitetään rokotekoostumuk- 35 siksi PIA/PIB-hybridiproteiinin käsittäviä koostumuksia.
9 10 Kuva 1 Kannan R10 PI:n ryhmien 1-12 aminohappojärjestys, 5 näitä koodaava lähetti-rna-jakso, johon sisältyy vaihtoehtoiset emåkset ja syntetisoidut oligonukleotidit. Siellä, missä vaihtoehtoisia emåksiå esiintyi, valittiin jaksot, jotka perustuivat muiden sekvenssoitujen gonokokkigeenien koodisanojen käytöstä saatuihin tuloksiin. Kuva 2 FA 19 genomin DNA:n RII3A I- ja Taq I -fragmentit, joihin sisältyy osia PI-geenistä. Fragmentit kloonattiin vektoriplasmidiin pgem-2, josta saatiin tässä esitettyjen tunnusten mukaiset rekombinanttiplasmidit. PI:a koodaavan 20 15 alueen suhteellinen asema genomissa on esitetty tämän yläpuolella olevalla avoimella suorakaiteella (varjostettu suorakaide vastaa N-terminaalista signaalijaksoa) ja oligonukleotidikoettimien suhteellinen asema on esitetty fragmenttien alapuolella. Kuva 3 FA19:n PI-geenin DNA-jakso. Ennustettu aminohappojärjestys on esitetty DNA:n yläpuolella, (-35 ja -10) ja ribosomin sitoutumiskohta (RBS) on myös esitetty, samoin kuin Tae' I- ja,113a I -kohdat ja punc7:n konstruktioon 25 käytettyfre III -kohta. Kunkin rivin viimeisen emäksen numero on esitetty oikealla. Kuva 4 N. gonnrrhneren runsaimpina esiintyvien ulkokalvon proteiinien PI, PII ja PIII ja F rolin poriinien OmpF ja 30 OmpC hydropaattisuus; sp - signaalipeptidi; a.a. - aminohapporyhmåt.
10 Kuva 5 punc7:n konstruktiokaavio. Käyttökelpoinen Hae III -katkaisukohta, joka sijoittui PI-geenin promoottorin -35 ja -10 -alueiden väliin teki mandolliseksi poistaa - 35 -alueen ja sitä edeltävän jakson, jonka jälkeen PI- 5 geeni konstruoitiin uudelleen vektoriplasmidissa pgem-2 olevan T7-faagin promoottorin ohjaamaksi. Paksu viiva edustaa pgem-2 DNA:a ja ohut viiva FA19 DNA:a. PI-geenin PI'-osa (katkoviiva osoittaa geenin puuttuvan segmentin suuntaa); P17 - faagin T7 promoottori; MCS - kloonausten 10 keskityskohta (multiple cloning site); restriktioentsyymien kohdat: S - Sau3A I, H - Hae III, B - BamH I, (H) - Hae III/Hinc II -liitoskohta (ei kohtaa) T - Taq I. Kuva 6 punc7:ssä olevan PI-geenin ilmentyminen 15 BL21(DE3):ssa. A. NaDodSO 4 -polyakryyliamidigeelielektroforeesi kokonaisten solujen hajotusvalmisteista 15- %:sessa geelissä, joka on värjätty Coomassiesinellä. Markkeriproteiinien koot on esitetty vasemmalla. PI on merkitty ja keskellä oleva nuoli osoittaa proteiinia, 20 joka nähtävästi puuttuu kanavasta 4. B. Autoradiogrammi A:ssa esitetyn geelin Western -blottauksesta, jossa koettimena oli käytetty kuutta PIA:han suunnattua monoklonaalista vasta-ainetta. Kanavat ovat: 1. FA19; 2. BL21(DE3)pUNC7, jota oli kasvatettu 16 tuntia ilman 25 IPTG:a; 3. BL21(DE3)pUNC7, jota oli kasvatettu 3 tuntia IPTG:n kanssa; 4. BL21(DE3)pUNC7, jota oli kasvatettu 16 tuntia IPTG:n kanssa; 5. BL21(DE3)pGEM-2, jota oli kasvatettu 16 tuntia ilman IPTG:a; 6. BL21(DE3)pGEM-2, jota oli kasvatettu 16 tuntia IPTG:n kanssa. 30 cm. Kuva 7 mtn3-cat:n (V) liittäminen FA19:n PI-rakennegeenin viereen. Paksu viiva edustaa phss6:n DNA:a. mtn3-cat on pituudeltaan 1,66 ke. eikä sitä ole piirretty oikeassa mittakaavassa. PI-geenin paikka FA19 CAT Dl:n 35 genomissa on osoitettu viivan yläpuolella olevalla palkilla ja varjostettu suorakaide merkitsee signaalijaksoa.
11 PI': PI-geenin osa, joka esiintyy kloonatuissa konstruktioissa. N - Not I; B - BamH I; S - Sau3A I. Kuva 8 MS11 DNA-fragmentit, jotka on kloonattu PI-gee- 5 nin sekvenssointia varten. PI-geenin paikka on osoitettu viivan yläpuolella olevalla palkilla ja varjostettu suorakaide merkitsee signaalijaksoa. Oligonukleotidijaksojen NC1 ja NC12 paikat on esitetty. Suurempi fragmentti kloonattiin pgem-3 -vektoriplasmidiin ja pienempi frag- 10 mentti Xgtll -plasmidiin osoitetuilla merkinnöillä varustettujen konstruktioiden muodostamiseksi. Restriktioentsyymikohdat: Hf - Hinf I; K - Kpn I; S - Sau3A I; Hc - Hinc II. 15 Kuva 9 MS11:n PIB-geenin DNA-jakso. Ennustettu aminohappojärjestys on esitetty DNA:n emäsjärjestyksen yläpuolella ja sen signaalipeptidi merkitty. Otaksutut promoottorijaksot (-35 ja -10) ja ribosomin sitoutumiskohta (RBS) kuten myös asianmukaiset restriktioentsyymikohdat 20 on merkitty. Kunkin rivin viimeisen emäksen numero on esitetty oikealla. R10:n PIB:n jakson (Gotschlich et al., (1984) PNAS USA 84, 8135-8139) suhteen esiintyvien erojen merkitsemiseksi on emäkset (muut kuin ne emäkset, joita restriktioentsyymikohdat käsittävät) allevii- 25 vattu ja aminohapot ympyröity. Kuva 10 FA19:n PIA:n ja MS11:n PIB:n aminohappojaksojen vertailu ja PI-hybridigeenien rakenne. PIA:n geenijakso on merkitty avoimella palkilla ja PIB:n jakso varjoste- 30 tulla palkilla. PI-geenien ylä- ja alapuolella ovat aminohappojaksojen vertailut, pystyviiva vastaa yhtä eroavuutta ja varjostettu alue vierekkäisiä eroavuuksien aluetta. Aminohapporyhmien numero on osoitettu yläpuolisella mitta-asteikolla ja emäsparinumerot alapuolisella mit- 35 ta-asteikolla. Hybridien analysointiin käytetyt oligonukleotidit on esitetty geenien välissä ja vastaava kohta toisessa geenissä on merkitty katkoviivalla. Hybridigeenirakenteet (luokat 1-9) on esitetty alla ja ne oligonukleotidien väliset alueet, joissa crossing over ta-
12 pahtui, on kuvattu kallistuksilla. Eri hybridiluokkien serologiset reaktiivisuusryhmät on esitetty taulukossa 1. Kuva 11 punch25:ssa olevan PIB-geenin ilmentäminen 5 BL21(DE3):ssa havaittuna kokonaisten solujen hajotusvalmisteiden SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla 15- %:sessa geelissä, joka on värjätty Coomassiesinellä. PIproteiinivyöhyke on merkitty. Kanavat ovat: 1. MS11; 2. BL21(DE3) punch25 kasvatettuna ilman IPTG:a; 3-5. 10 BL21(DE3) punch25 kasvatettuna IPTG:n kanssa. IPTG (50 µg/ml) lisättiin kasvavaan viljelmään seuraavissa solutiheyksissä: 3. 5 x 10 8 solua/ml, 4. 10 9 solua/ml; 5. 2 x 10 9 solua/ml. PI:n ilmentyminen on suurin, kun viljelmä indusoidaan kasvusyklin aiemmassa vaiheessa. 15 Tämä keksintö liittyy sellaisten N. ctonorrhoeaen PIA-, PIB- ja kimeeristen PIA/PIB-proteiinien käyttöön, jotka ovat käyttökelpoisia gonorreainfektion ehkäisemiseen tarkoitetun rokotekoostumusten valmistamiseksi. Näitä pro- 20 teiineja voidaan tuottaa yhdistelmä-dna-tekniikalla tai kemiallisilla synteesimenetelmillä. Vaikka aiemmin on ollut mandollista käyttää kemiallisia eristysmenetelmiä sopivasta N. cronorrhoeae -kannasta, voi näiden tuloksena olla kontaminoituminen tietyillä muilla gonokokkiproteii- 25 neilla, jotka aikaansaavat ehkäiseviä (suojausta vastaan vaikuttavia) vasta-aineita rokotuksen jälkeen. Koska PIproteiinien tiedetään kiihdyttävän vasta-aineiden tuottoa, on mandollista käyttää kokonaisia proteiineja tai näiden mitä tahansa immunogeenistä osaa immunogeeneinä, 30 jotka suojaavat tehokkaasti rokotuksen saaneita N. gonorrhoeae -infektiota vastaan. Tässä kuvatuilla yhdistelmäplasmideilla kyetään isäntä- soluissa tuottamaan suuria määriä PI-proteiineja, jotka 35 ovat pysyviä ja vastustuskykyisiä isäntäsolussa tapahtuvaa hajoamista kohtaan ja jotka tarjoavat siten käyttöön rokotekoostumuksiin sopivan runsaan materiaalilähteen. Tässä valmisteessa ei esiinny suojausta ehkäisevistä go-
13 nokokkiproteiineista johtuvaa kontaminaatiota. Yksinomaan kuvaamistarkoituksissa tätä keksintöä tarkastellaan seuraavassa useina yksittäisinä vaiheina, jotka käsittä- vät: 1) PIA-geenin tai geenifragmentin tunnistamisen ja 5 eristämisen, 2) geenin tai geenifragmentin liittämisen sopivaan kloonauskantajaan, jota käytetään yhteensopivan isäntäsolun transformointiin; 3) geeniä monistavien ja ilmentävien transformoituneiden isäntäsolujen tunnistaminen ja kasvatus; ja 4) geenituotteen tunnistaminen ja 10 puhdistaminen. Tämän keksinnön mukaan PI-proteiineja voidaan tuottaa liittämällä kloonattu, kuvan 3 tai kuvan 9 mukainen jakso tai näiden hybridien jakso sopivaan kloonaus/ilmentämisvektoriin, transformoimalla sopivat isäntäsolut ja tunnistamalla ja puhdistamalla geenituote. 15 Vaihtoehtoisesti voidaan syntetisoida sinänsä hyvin tunnettuja kemiallisia synteesimenetelmiä käyttäen osia päätellystä aminohappojaksosta, joka on kuvan 3 tai kuvan 9 mukainen tai hybridien mukainen. Tässä patenttihakemusjulkaisussa on myös kuvattu PIA:n ja PIB:n jaksoihin pe- 20 rustuvia oligonukleotideja, jotka oligonukleotidit ovat käyttökelpoisia N. cronorrhoeae -infektion tunnistamisessa ja diagnosoinnissa hybridisointimenetelmillä, kuten Southern -blotit, täpläblotit, urablotit jne. 25 PIA-proteiinia vastaava koodaava nukleotidijakso on esitetty kuvassa 3. Kuten jo todettiin, kaikki N. gonorrhoeae -bakteerit eivät tuota PIA-proteiinia; mikä tahansa tietty kanta tuottaa joko PIA:ta tai PIB:tä mutta ei molempia. PIA:n esiintyminen korreloi gonokokin serologi- 30 sen ryhmän I, serotyypin 1-3 suhteen, ja siten mitä tahansa serotyyppeihin 1-3 assosioitunutta kantaa voidaan käyttää PIA-DNA:n lähteenä. Niiden tunnettujen N. clonorrhoeae -kantojen joukossa, joille PIA on luonteenomaisena piirteenä, ovat FA19, FA130, W-Ue, B-2, G-7 35 5029, R-11, E-5, D-4 ja V-15 (Knapp et al., (1984) J. Infect. Dis. 150, 44-48). Tätä keksintöä sovellettaessa voidaan kuvan 3 mukainen jakso saada useilla eri tavoilla. Esimerkiksi kun sopiva PIA:ta sisältävä kanta on määritetty, on tarpeen eristää organismin DNA, muodostaa
14 DNA-fragmentit ja tunnistaa ne fragmentit, jotka sisältävät PIA-geenin jakson. Vaihtoehtoisesti geeni tai geenin segmentit voidaan syntetisoida. 5 N. gonorrhoeaen DNA voidaan pilkkaa osiinsa useilla eri tavoilla; edullisin menetelmä on sen käsittely restrik- tioentsyymeillä, joista jokainen pilkkaa DNA:n spesifisen jakson kohdalta. Muihin menetelmiin kuuluvat DNA:n kä- sittely DNaasilla magnesiumin läsnäollessa tai fysikaali- 10 sella hajotusmenetelmällä, kuten ultraäänikäsittelyllä. Kun käytetään restriktioentsyymejä, voidaan DNA:n käsit- telemiseen käyttää yhtä entsyymiä tai entsyymien yhdis- telmää. Ainoa vaatimus on se, että nukleiinihapon pilk- kominen ei hävitä PIA:n antigeenista kohtaa tai antigee- 15 nisiä kohtia koodaavaa aluetta. Fragmenttien muodostami- sen jälkeen yksittäiset lineaariset DNA-fragmentit erote- taan sitten kokonsa perusteella millä tahansa tunnetuista menetelmistä, kuten polyakryyliamidigeelielektroforeesil- la (PAGE), agaroosigeeleillä tai pylväskromatografialla. 20 Eristetyistä fragmenteista saadaan plasmidien valmistuk- seen ja transformaatioon käytettävä geneettinen materiaa- Kiinnostuksen kohteena olevan geenijakson sisältävien 25 DNA-fragmenttien tunnistaminen voidaan suorittaa monella tavalla. Voidaan esimerkiksi käyttää immunologisia reagensseja, kuten monoklonaalisia vasta-aineita. PIA:a vastaan on muodostettu joukko monoklonaalisia vasta-aineita (Tam et al., (1982) Infect. Immuno. 36, 1042-30 1053) ja näitä voidaan käyttää kunkin eri DNA-fragmentilla transformoidun isäntäsolun tuottamien tuotteiden testaukseen; tuote, joka reagoi monoklonaalisen PIA-vasta-- aineen kanssa tunnistaa solun, joka on transformoitu PIgeenin sisältävällä fragmentilla. Toisena vaihtoehtona 35 on DNA-fragmenttien sekvenssointi, jonka avulla voidaan ennustaa kutakin fragmenttia vastaava aminohappojärjestys, jota sitten voidaan verrata mihin tahansa tunnettuihin osittaisiin aminohappojaksoihin vastaavan DNA-jakson sisältävän fragmentin tunnistamiseksi. Toinen suosittu
menetelmä on Southern -blottaus (Southern, (1975) J. Mol. Biol. 78, 503). Tässä menetelmässä denaturoidaan restriktiofragmentit omilla paikoillaan geelissä ja siirretään imeyttämällä kiinteälle alustalle, tyypillisesti 5 nitroselluloosasuodattimelle. Suodatinta käsitellään radioisotoopilla leimatuilla oligonukleotideilla, jotka sisältävät proteiinia vastaavan tunnetun tai otaksutun osittaisen DNA-jakson. Imeytetty DNA, joka on komplementäärinen valitun nukleotidin suhteen, hybridisoituu tämän 10 kanssa tunnistaen näin PI-geenin sisältävän DNA-fragmentin koon. 15 Yksityiskohtaisissa esimerkeissä PIA-geeni tunnistettiin ja eristettiin hybridisoimalla se kahta uutta oligonukle- 15 otidia käyttäen. Perustuen tunnettuun PIB:n N-terminaalisen pään aminohappojen pienen osan aminohappojärjestykseen (Blake et al., (1982) Infect. Immun. 36, 277-285; 25 Blake, (1985) teoksessa The Pathogenic Neisseria, G. Schoolnik (toim.), ASM, sivut 251-258) ja useissa muis- 20 sa DNA-jaksoiltaan tunnetuissa gonokokkiproteiineissa esiintyvästä koodisanojen käytöstä johdettuihin käyttösääntöihin, yritettiin päätellä käyttökelpoiset oligonukleotidit. Nimenomaisesti konstruoitiin kaksi jaksoa, joille annettiin merkinnät NC1 ja NC2, seuraavasti: NC1: 5' AC GCC GGC TTT GAT GGC 3 NC2: 5' GAT GTT ACC CTG TAT GG 3 1 C C 30 A G C Southern -blottaushybridisoinnissa käytettynä näitä oligomeerejä käytettiin gonokokkien genomista saatujen DNA- 25 restriktiofragmenttien seulontaan; molemmilla koettimilla onnistuttiin tunnistamaan PIA-geenin sisältävät DNA-frag- mentit. Tunnistetun geenin varmennus PIA-geeniksi suoritettiin geenituotteen ja natiivin proteiinin molekyylipainoja keskenään vertaamalla ja sen immunologisen reak-
16 tiivisuuden perusteella PIA:lle spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa. Tämän käyttötavan lisäksi määritettiin myös se, että kummatkin näistä oligonukleotideista kykenevät hybridisoitumaan sekä PIA- että PIB- 5 gonokokkikantoihin. Siten näitä tavallisia yhdisteitä voidaan käyttää myös diagnostisina koettimina Southern - blottaushybridisoinnissa N. cronorrhoeae -infektion havaitsemiseen ja tunnistamiseen tautiin sairastuneissa. 10 PI-geenin sisältävien fragmenttien tunnistusta seuraa asiaankuuluvan osan sekvenssointi Sangerin menetelmällä (PNAS USA 74, 5463-5467, 1977). Sangerin menetelmässä käytetään DNA-templaatilta tapahtuvaa DNA-vastinnauhan entsymaattista synteesiä. Vastinnauhan synteesi lopete- 15 taan liittämällä tähän dideoksinukleotidi (ddntp). Suoritetaan neljä peräkkäistä reaktiota, joista kussakin on ddatp, ddctp, ddgtp ja ddttp, jolloin syntyy neljä DNAfragmenttien joukkoa ja kukin tietyssä joukossa oleva fragmentti päättyy spesifiseen dideoksinukleotidiin. 20 DNA-fragmentit erotetaan sitten polyakryyliamidigeelissä; jakso määritetään kunkin fragmentin viimeisen nukleotidin identiteetin perusteella lyhyimmästä pisimpään lukien. Templaatteina käytettäviä yksinauhaisia DNA-molekyylejä 25 voidaan saada kaksinauhaisten DNA-molekyylien kemiallisilla käsittelyillä eksonukleaaseilla. On kuitenkin paljon tehokkaampaa käyttää Ml3mp -kloonausvektoreita, jotka on kloonausvektoriksi kehittänyt Messing (Messing et al., (1981) Nucleic Acids Res. 9, 309). M13 on koirasspesifi- 30 nen nauhamainen E. colin bakteriofaagi, joka sisältää yksinauhaista (+) DNA:a. Tätä (+)-nauhaa käytetään templaattina (-)-vastinnauhan synteesiin. Kaksinauhainen DNA-muoto on lisääntymisvaiheen muoto (RF), joka monistuu noin 200 kopioksi solua kohti. Tämä kaksinauhainen muoto 35 voidaan eristää soluista ja käyttää kloonausvektorina. Kun monistuminen pysähtyy, jatkuu vain toisen nauhan tuotto ja yksinauhainen nauha sulkeutuu faagipartikkelien sisään. Tässä on M13:n etu, nimittäin se, että partikkeleissa on yksinauhainen DNA-nauha, joka on homologinen
17 toisen kloonatun nauhan suhteen ja sen vuoksi se voi olla käyttökelpoinen templaatti Sangerin menetelmässä. Yhdestä kloonista voidaan sekvenssoida 350 emäkseen asti ja pidempien fragmenttien sekvenssointi voidaan suorittaa 5 limittäisten fragmenttien avulla. 1 0 Tämän menetelmän käyttäen on saatu selvitetyksi PIA-geenin sekvenssi, joka esitetään kuvassa 3. Kuvassa 3 esitetään myös ennustettu aminohappojärjestys. PIA-geenin sekvenssoinnilla, joka suoritettiin limittäisten fragmenttien erillisillä sekvenssoinneilla, saatiin aikaan se, että voitiin tunnistaa ja valmistaa kaksi muuta oligonukleotidikoetinta. Molemmat ovat 17 nukleotidia 15 käsittäviä oligonukleotideja, joiden jaksot ovat seuraavat: NC8: 5' GCGTTAAAACCGCTACC 3 ja 20 NC11: 5' CGGTGTCGGTCTGCGCC 3 Kummatkin nämä koettimet ovat spesifisiä ainoastaan PIAgeenille, eivätkä ne hybridisoidu PIB-DNA-jaksoihin. Siten nämä molemmat koettimet ovat käyttökelpoisia PIA- 25 organismi- ja PIB-organismi-infektioiden erottamisessa. Kuten edellä todettiin, kummatkin näistä proteiineista indikoivat tiettyä, joko systeemistä tai paikallistunutta, gonorreainfektion muotoa, ja ne voivat sen vuoksi olla erittäin tärkeitä tautiin sairastuneen hoito-ohjel- 30 man suunnittelussa. Eristettyä geeniä tai kemiallisesti syntetisoitua DNAjaksoa voidaan käyttää muodostamaan geenistä uusia kopioita kasvattamalla transformoituja isäntäsoluorganismeja, 35 eristämällä yhdistelmä-dna transformoiduista soluista ja ottamalla liitetty geeni talteen eristetystä yhdistelmä- DNA:sta.
18 PIB-proteiinia vastaava nukleotidijärjestys on kuvattu kuvassa 9. Esitetty jakso eristettiin N. gonorrhoeae:n ryhmien 4-9 kanssa ja mitä tahansa näihin serologisiin 5 ryhmiin liittynyttä kantaa voidaan käyttää PIB-DNA:n lähteenä. Niihin tunnettuihin gonorreakantoihin, joiden luonteenomaisena piirteenä on PIB:n esiintyminen, ovat MS11, FA6140, F62 ja R10. Menetelmät PIB-proteiinin proteiinivalmisteiden tekemiseksi, tunnistamiseksi ja sek- 10 venssoimiseksi ovat olennaisesti identtisiä PIA-proteiinin yhteydessä käytettyjen menetelmien suhteen. PIB-geenin spesifisessä tunnistuksessa oli avuksi koettimien NC1 ja NC12 (5'-GATACGGCGAAGGCATC-3') käyttö ja hybridi-piproteiinin PIB-osassa olevan Kpn I -restriktiokohdan tun- 15 nistaminen (Danielsson et al., (1986) Infect. Immun. 52, 529-533). Geenin kloonaus suoritettiin PIA-geenin tavoin kloonaamalla erikseen limittäisiä fragmentteja kloonausvektorissa. MS11 -kannasta. PIB:n esiintyminen korreloi serologisten 20 PIA:ta koodaava nukleotidijakso on esitetty kuvassa 3. PIB:tä koodaava nukleotidijakso on esitetty kuvassa 9. Sovellettaessa tämän keksinnön mukaista menetelmää voidaan kumpikin nukleotidijakso tai näitä toiminnallisesti vastaavat jaksot erikseen koostaa yhdistelmämolekyyleik- 25 si, joka ohjaa vastaavan PIA- tai PIB-geenin tuotteen ilmentymistä. Sekä kuvasta 3 että kuvasta 9 peräisin olevia hybridijaksoja voidaan myös konstruoida hybridi- PIA/B proteiinien tuottamiseksi. Koska nukleotidien koodaavissa jaksoissa esiintyy 30 näille ominaista vaihtoehtoisuutta, voidaan käyttää olennaisesti samoja, kuvissa 3 ja 9 esitettyjä aminohappojaksoja koodaavia muita DNA-jaksoja sovellettaessa tätä kek- sintöä PIA:n ja PIB:n kloonaukseen ja ilmentämiseen. Tällaisiin kuvien 3 tai 9 mukaisten nukleotidijaksojen 35 muutoksiin kuuluvat eri nukleotidien deleetiot, lisäykset tai korvaukset, joista on seurauksena jakso, joka koodaa samaa tai toiminnallisesti vastaavaa geenituotetta. Geenituote voi sisältää aminohapporyhmien deleetioita, lisäyksiä tai korvauksia. Korvauksia voidaan tehdä asian-
19- omaisten ryhmien polaarisuuden, varauksen, liukoisuuden, hydrofobisuuden, hydrofiilisyyden ja/tai amfipaattisen luonteen samanlaisuuden perusteella. Esimerkiksi negatiivisesti varautuneisiin aminohappoihin kuuluvat aspara- 5 giinihappo ja glutamiinihappo; positiivisesti varautuneisiin aminohappoihin kuuluvat lysiini ja arginiini; aminohappoihin, joilla on varaukseton polaarinen sivuketju tai ei-polaarinen sivuketju ja joilla on sama hydrofiilisyysarvo, kuuluvat seuraavat: leusiini, isoleusiini, valiini; 10 glysiini, alaniini; asparagiini, glutamiini; seriini, treoniini; fenyylialaniini ja tyrosiini. PIA-geenin kuvassa 3 esitetty jakso tai PIB-geenin kuvassa 9 esitetty jakso sekä hybridi A/B jaksot tai näitä 15 toiminnallisesti vastaavat jaksot voidaan liittää sopivaan kloonaus/ilmentämisvektoriin. Jotta liitetyn geenin transkriptio ja translaatio tapah- tuisi, täytyy geeni sijoittaa valitun isäntäsolun kanssa 20 yhteensopivan promoottorin ohjaamaksi. Promoottori on DNA-alue, johon RNA-polymeraasi liittyy ja aloittaa transkription. Valittu promoottori voi olla mikä tahansa isäntäsoluorganismista eristetty promoottori. Esimer- kiksi E. colissa, yleisesti käytetyssä isäntäsysteemissä, 25 on useita promoottoreita, kuten siihen liittyvät lac- tai reca -promoottorit ja sen bakteriofaagien tai plasmidien promoottorit. Voidaan myös käyttää synteettisesti tai yhdistelmätekniikkaa käyttäen tuotettuja promoottoreja, kuten X-fagin PL- ja PR-promoottorit, ohjaamaan niiden 30 viereisten DNA-segmenttien geenituotteen tuottoa suurella tehokkuudella. Tarvitaan myös aloitussignaali, jotta saavutettaisiin geenin tehokas transkriptio ja translaatio. Esimerkiksi 35 E. colin lähetti-rna:ssa ribosomin sitoutumiskohta sisältää translaation aloituskoodisanan (AUG tai GUG) ja toisen jakson, joka on komplementäärinen 16S-ribosomaalisen RNA:n 3'-päässä olevien emästen suhteen. Useita näitä
2 0 viimemainittuja jaksoja (Shine-Dalgarno -jaksot) on tunnistettu E. colissa ja muissa sopivissa isäntäsolutyypeissä. Mitä tahansa isäntäsolun kanssa yhteensopivaa S- D-ATG-jaksoa voidaan käyttää. Näihin kuuluvat, mainit- 5 tuihin kuitenkaan rajoittumatta, lambda -kolifaagin cro - geeni tai N -geeni, tai L. colin tryptofaani E-, D-, C-, B- tai A-geenit. On olemassa useita menetelmiä DNA-fragmenttien in vitro 10 liittämiseksi kloonausvektoreihin. DNA-ligaasi on entsyymi, joka yhdistää kaksinauhaisessa DNA:ssa olevien kanden vierekkäisen nukleotidin välisiä yksinauhaisia katkoksia; tätä entsyymiä voidaan siten käyttää liittämään kovalenttisesti yhteen tiettyjen restriktioentsyymi- 15 en tuottamia, toisiinsa pitkittäin liittyneitä kohesiivisia päitä. Vaihtoehtoisesti voidaan DNA-ligaasia käyttää katalysoimaan fosfodiesterisidoksien muodostumista tasaiset päät omaavien fragmenttien välille. Lopuksi voidaan terminaalideoksiribonukleotidyylitransferaasi -entsyymiä 20 käyttää homopolymeeristen 3'-yksinauhaisten päätteiden muodostamiseksi; lisäämällä yhden populaation 3'-päähän oligo-(da) -jaksoja ja toisen populaation 3'-päähän oligo-(dt) -ryhmiä, voivat molemmat molekyylityyypit liittyä pitkittäin yhteen dimeerisiksi renkaiksi. Mitä tahansa 25 näitä menetelmiä voidaan käyttää geenisegmentin promoottorin tai muiden säätely-yksikköjen liittämiseen vektorissa oleviin spesifisiin kohtiin. Sen mukaan PI-proteiineja koodaava geeni liitetään valittuun vektoriin spesifisessä suhteessa vektorin promoottoriin ja muihin sää- 30 tely-yksiköihin siten, että jakso on oikeassa lukuvaiheistuksessa vektorin ATG-jakson suhteen. Käytettävässä vektorissa on tyypillisesti markkeritoiminto, kuten ampisilliiniresistenssi tai tetrasykliiniresistenssi, jotta transformoituneet solut voidaan tunnistaa. Käytettävä 35 menetelmä voi olla mikä tahansa tunnetuista ilmentämisvektoreista, useimmin käytettyjä ovat piasmidivektorit, kuten pbr 322, pa 105, pva 5, pacyc 177, PKH 47, pacyc 184, pub 110, pmb9, pbr325, Col El, psc101, pbr313, pml21, RSF2124, pcr1 tai RP4; bakteriofaagivektorit, ku-
5 21 ten lambda gt11 lambda gt-wes-lambdab, Charon 28, Charon 4A, lambda gt-l-lambda BC, lambda-gt-l-lambda B, M13mp7, M13mp8, Ml3mp9; SV40 ja adenovirusvektorit ja hiivavektorit. Kuten jo todettiin, tunnistettiin PIA:ta ja PIB:tä koodaavat geenisegmentit alunperin hybridisoimalla kuvatuilla uusilla oligonukleotidijaksoilla. Valitun fragmentin identtisyys PIA:ta koodaavana rakennegeeninä varmistet- 10 tiin sekä vertaamalla molekyylipainoa natiiviseen PIA:han että tuotteen reagoinnilla kaikkien kuuden testatun monoklonaalisen PIA-vasta-aineen kanssa pesäkkeiden radioimmunomäärityksellä. PIB:n tuotteen identtisyys varmistettiin sen reagoinnilla PIB-spesifisten monoklonaalisten 15 vasta-aineiden kanssa. Kloonattua PIA- tai PIB-geeniä ilmentävät E. coli -isäntäsolut tuottavat runsaasti PIproteiinia, joka reagoi asianmukaisten monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa. PIA-proteiinin puhdistusmenetelmät on kuvattu yksityiskohtaisesti artikkelissa Teerlink 20 et al., 1985 (teoksessa The Pathogenic Neisseria, G. Schoolnik (toim.) ASM 259-264).) Tämän keksinnön yhteydessä on myös muodostettu joukko PIA/B geenien hybridijaksoja ja -proteiineja. Hybridi- 25 geenit konstruoitiin käyttämällä sukkulamutageneesimenetelmää, jota oli muunneltu artikkelin Seifert et al., (1986) (Genetic Engineering, Principles and Methods osa 8, 123-134, Settin et al., toim. Plenum Press) mukaisesti valikoitavan markkerin liittämiseksi PI-geenin vie- 30 reen PIA:ta tuottavassa kannassa. Tässä tapauksessa valikoitava geeni oli kloramfenikoliasetyylitransferaasi (CAT) -geeni, joka tuo mukanaan valikoitavan kloramfenikoliresistenssin (Cmr ). CAT-DNA:n sisältävää PIA-kantaa käytettiin sitten DNA:n luovuttajana PIB:n sisältävän 35 vastaanottajakannan transformointiin. Suoritettiin myös resiprookkinen risteytys. Hybridiehdokkaat tunnistettiin valikoimalla Cm r :n suhteen ja testaamalla PI:n esiintyminen immunoblottauksella. Tutkittiin kaikki transforman-
22 tit, joissa 1) esiintyi luovuttajan DNA:a tai (2) vastaanottajan DNA oli säilynyt tai (3) joissa DNA oli parentaalimuodoista selvästi eroava. Todellisten PIA/B hybridikantojen muodostumista tapahtui molemmissa ristey- 5 tystyypeissä kohtuullisen korkealla frekvenssillä ja eri serologiset reaktiivisuusryhmät oli tunnistettavissa. Näiden hybridigeenien ja -proteiinien tuleminen saataville on mandollistanut tunnettuja monoklonaalisia vastaaineita vastaavien epitooppien paikantamisen ja antaa 10 mandollisuuden tunnistaa ja konstruoida lopulta synteettisesti sellaisia epitooppeja sisältäviä PIA/B-hybridiproteiineja, jotka saavat aikaan suojaavien vasta-aineiden muodostumisen ja joilla siksi on suurinta mielenkiintoa käyttökelpoisen rokotteen kehittämisessä. Yksityis- 15 kohtainen kuvaus näiden hybridien konstruktiosta ja tunnistamisesta on esitetty myöhempänä. Vaihtoehtoisessa sovellutusmuodossa voidaan kuvissa 3 ja 9 esitettyjen geenijaksojen koodaamat proteiinit sekä 20 näiden molempien osia sisältävät kimeeriset proteiinit syntetisoida vaivattomasti kemiallisesti sinänsä hyvin tunnetuilla menetelmillä (J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 361, 1986). Kun proteiinijaksosta on löydetty suojaa antava epitooppi, peptidisynteesi molekyylin erillisistä 25 aktiivisista alueista tarjoaa yksinkertaisen ja suhteellisen halvan menetelmän rokotevalmisteen perusmateriaalin tuottamiseksi sovellettaessa tätä keksintöä lopullisesti käytäntöön. Peptidisynteesin käyttö tarjoaa myös sopivan keinon PIA/B hybridiproteiinin tai edullisesti sekä PIA- 30 että PIB-proteiinien suojaavat epitoopit käsittävän synteettisen peptidin konstruoimiseksi. Tämä keksintö siis käsittää sekä yhdistelmätekniikalla että synteettisesti tuotetut proteiinit, jotka ovat kuvattujen jaksojen mukaiset. Tämä keksintö käsittää myös kokonaisen proteii- 35 nin fragmentit, erityisesti fragmentit, joissa alkuperäisen, lähtömuotona olevan proteiinin antigeenisyys on säilynyt ja erityisimmin sellaisia epitooppeja sisältävät fragmentit, jotka saavat aikaan suojaavien vasta-aineiden tuoton. On myös selvää, että on mandollista tehdä kor-
23 vauksia koko proteiiniin ja peptidifragmenttien jaksoihin korvaamalla yksi tai useampi jakson aminohapoista tätä aminohappoa kemiallisesti vastaavalla aminohapolla; esimerkiksi negatiivisen varauksen omaavat ryhmät, kuten 5 asparagiinihappo ja glutamiinihappo voidaan vaihtaa keskenään, kuten myös positiivisen varauksen omaavat ryhmät, kuten lysiini tai arginiini. Hydrofobisiin ryhmiin kuuluvat tryptofaani, fenyylialaniini, leusiini, isoleusiini, valiini ja alaniini. Tunnetusta jaksosta on myös 10 mandollista tehdä tiettyjä deleetioita ja tai siihen voidaan tehdä tiettyjä lisäyksiä siten, että haluttu antigeeninen aktiivisuus vielä säilyy. Tässä esitetyn näitä kahta proteiinia koskevan informaation perusteella voidaan alan ammattitaidolla tehdä molekyyliin asianmukai- 15 sia muutoksia ja määrittää aktiivisuuden säilyminen. Tämä keksintö tarkoittaa siksi myös patenttivaatimuksien suojapiiriin kuuluvien proteiinien sellaisia homologeja, analogeja ja fragmentteja, jotka voivat olla joko kloonattuja tai synteettisesti tuotettuja ja jotka oleelli- 20 sesti säilyttävät lähtömuotoa edustavan molekyylin antigeenisyyden. PIA:n puhdistetussa muodossa oleva geenituote tai syn- teettisen peptidi on käyttökelpoinen gonorreabakteeri- 25 infektion ehkäisyyn tarkoitetun rokotekoostumuksen valmistamiseen. Tässä koostumuksessa voidaan immunogeenisenä aineena käyttää joko kokonaista PIA-proteiinia tai mitä tahansa tämän aktiivista osaa. Jos geenituotetta on ilmennetty osana fuusioproteiinia, proteiinia voidaan 30 käyttää kokonaisena tai isäntäsolun proteiini voidaan pilkkoa, jotta saadaan fuusioitumaton PIA-proteiini. Yhdistelmä-DNA-tekniikoilla valmistettu PIA-proteiini voidaan eristää isäntäsoluista tavallisilla proteiinien 35 eristysmenetelmillä. Puhdistettu proteiini yhdistetään sitten mihin tahansa yleisesti käytetyistä, farmaseuttisesti hyväksyttävistä kantaja-aineista, kuten veteen, fysiologiseen keittosuolaliuokseen, etanoliin, polyoleihin, kuten giyseroliin tai propyleeniglykoliin tai kas-
24 viöljyihin sekä mihin tahansa sinänsä tunnettuun rokoteapuaineeseen. PIA-tuote voidaan myös sulkea liposomeihin rokotevalmisteessa käytettäväksi. Tässä käytetyn ilmaisun "farmaseuttisesti hyväksyttävät kantaja-aineet" käsi- 5 tetään kattavan mitkä tahansa liuottimet, dispersioaineet, pinnoitusaineet, bakteerien- ja sientenvastaiset aineet, isotoniset ja absorptiota viivästävät aineet ja muut näiden kaltaiset aineet. Näiden aineiden käyttö farmaseuttisesti aktiivisina aineina on sinänsä tunnet- 10 tua. Sitä tapausta lukuunottamatta, että tavanomaisesti käytetty väliaine on yhteensopimaton aktiivisen ainesosan kanssa, on aikomuksena käyttää tätä väliainetta terapeuttisessa koostumuksessa. Muita täydentäviä aktiivisia aineita voidaan myös liittää mukaan. 15 Tämän keksinnön erityisen edullinen sovellutusmuoto on rokote, jossa aktiivinen immunogeeni on PIA/B-hybridiproteiini. Kirjallisuudessa on raportoitu kokeellisesti valmistettuja gonokokkeja, jotka ilmentävät sekä PIA- 20 että PIB-epitooppeja (Danielsson et al., (1986) Infect. Immun. 52, 529-533), mutta kimeerisen proteiinin rakennetta ei tunnistettu eikä tässä esitetty ehdotusta proteiinin mandollisesta käytöstä rokotteessa. Tällaisesta rokotteesta koituisi se hyöty, että että sillä voitaisiin 25 immunisoida henkilö molemman tyyppistä gonorreainfektiota vastaan, ts. systeemisiä infektioita vastaan, jotka liittyvät IA-proteiinia sisältäviin kantoihin ja paikallisia infektioita vastaan, jotka liittyvät IA- tai IBproteiinia sisältäviin kantoihin. Tämän keksinnön yhtey- 30 dessä kuvattujen spesifisten koettimien saatavuuden perusteella voidaan tällaisen sopivan hybridiproteiinin talteenotto suorittaa vaivattomasti alan ammattimiesten tuntemilla menetelmillä. 35 Periaatteessa kimeerinen geeni voidaan konstruoida eristämällä ensin yksittäisiä proteiineja vastaavat geenit. Menetelmä PIA-geenin eristämiseksi tämän keksinnön mukaisia PIA-spesifisiä oligonukleotidikoettimia käyttäen on jo kuvattu edellä. Samoja menetelmiä seuraten voidaan
25 PIB-geeni eristää ja tunnistaa. On tunnistettu joukko kantoja, jotka tuottavat vain PIB-proteiinia, esim. MS11, R10, FA6140, F62 ja monet muut. Kuvattuja DNA-jaksoja, joissa ei ole spesifisyyttä PIA:ta kohtaan, soveltuvat 5 PI-jakson sisältävien restriktiofragmenttien eristämiseen PIB-spesifisestä kannasta, PIB-kantojen geenikirjastosta. Vahvistus sille, että oikea tuote ilmentyy, voidaan saada transformaatiolla ja ilmentämällä ehdokkaana olevaa PIBfragmenttia isäntämikro-organismissa ja tunnistamalla 10 ilmentynyt tuote antamalla sen reagoida minkä tahansa tunnetun PIB-spesifisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa (R.C. Nowinski, Knapp, J.S., Tam, M.R. ja Sandstrom, (1984) J. Infect. Dis. 150, 44-48). Sitten, kun kukin yksittäinen geenifragmentti on eristetty, ne voi- 15 daan vaivattomasti kloonata ja koostaa millä tahansa sinänsä tunnetulla menetelmällä. PIA-jakson osat liitetään sitten ligaasilla PIB-jakson osiin siten, että kimeerinen proteiini koodautuu muodossa, joka voi osallistua transkriptioon ja translaatioon, esim. muodossa, jos- 20 sa ei esiinny translaation päätejaksojen aikaansaamia keskeytyksiä. Koko kimeerinen jakso voidaan sitten liittää ligaasilla vektoriin, joka sisältää valikoitavan markkerin ja ohjausyksiköt. Vektoria voidaan sitten käyttää transformoimaan geenituotteen ilmentämiseen ky- 25 kenevän isäntämikro-organismin, joka kykenee ilmentämään geenituotetta sellaisia määriä, että nämä voidaan saada talteen. Toisena vaihtoehtona voi tietysti olla se, että lähtökohtana käytetään yksinkertaisesti valmiiksi PIAgeenin sisältävää vektoria, kuten plasmidia, joka sisäl- 30 tyy E. coli -kantaan NRRL B-18263; PIB-jakso eristetään edellä kuvatulla tavalla ja koko jakso tai sen osa liitetään ligaasilla PIA-geenin viereen tai tämän sisään kalutun kimeerisen geenin transkription ja translaation sallivalla tavalla. PIA/B-hybridien konstruktio voidaan 35 kuitenkin suorittaa edullisesti aiemmin kuvatulla tavalla, näistä eristetään hybridigeeni ja tätä käytetään vektorin valmistamiseen transformaatiota varten. Näin konstruoitua vektoria käytetään uudelleen transformoimaan isäntämikro-organismi. Geenituotteen ilmentämisestä saa-