Solun tutkiminen. - Geenitekniikka

Transkriptio

1 Solun tutkiminen - Geenitekniikka

2 Tunnin sisältö 1. Bioteknologian peruskäsitteitä 2. Hieman mikroskoopeista 3. DNA:n eristäminen, puhdistaminen ja pilkkominen 4. Geenikirjasto 5. PCR 6. Elektroforeesi 7. Sekvensointi 8. Geenitekniikka h"p://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/6/69/dollyscotland.jpg/250px- Dollyscotland.JPG

3 Bioteknologia = eliöiden elintoimintojen, solujen, solujen osien tai solussa esiintyvien molekyylien toimintojen hyödyntämiseen perustuvaa tekniikkaa. à lääkkeet, rokotukset, yksilöntunnistus, satomäärien lisäys Lukion opetussuunnitelmassa mm: geenien etsintä- ja tunnistusmenetelmiä geenien siirtämisen tekniikan pääpiirteet geeni- ja biotekniikan keskeiset käsitteet biotekniikan tarjoamia sovellusmahdollisuuksia eri biotieteissä ja teollisuudessa Biologia kurssi 5!

4 MIKÄ ON GEENI? MITÄ GEENI SISÄLTÄÄ?

5 Geeni: = DNA-jakso, joka sisältää jonkin proteiinin tai RNA:n valmistusohjeen Geeni sisältää: Säätelyalueen (säädellään ilmentymistä) Promoottorin (polymeraasin kiinnittymiskohta) Eksonit (informatiivinen osa) Intronit (silmikoidaan pois) PIIRRÄ GEENI!

6 Aktiiviset geenit ovat vain pieni Toistojaksot Sammuneet geenit Hiljennetyt geenit Transposomit osa DNAsta h"p://fi.wikipedia.org/wiki/tiedosto:geeni.png KAIKISSA YKSILÖN SOLUISSA ON TÄSMÄLLEEN SAMANLAINEN DNA, MUTTA ERI GEENIT AKTIIVISIA!

7 Miten euryootin ja prokaryootin perimät eroavat toisistaan?

8 Prokaryootin DNA: Bakteereilla on n geeniä vrt. ihmisellä Ei tumaa Yksi pyöreä kromosomi, perimää myös plasmideissa Haploidinen perimä Ei histoneita tai pakkautumista Ei introneita tai geenin ulkopuolista aluetta Operonit

10 Valomikroskooppi Koostuu joukosta linssejä, joiden avulla valo ensin ohjataan tutkittavan näytteen läpi. Sen jälkeen valo kerätään ja kuvaa suurennetaan objektiivin ja okulaarin avulla. Valomikroskoopin erotuskyky on parhaimmillaan 0.2 µm. Solut täytyy värjätä! M = Mob x Mok h"p://

11 Elektronimikroskooppi Valon lähteenä elektronisuihku, jota ohjaavat sähkömagneettiset linssit TEM= läpäisyelektrinimikroskooppi - kuva muodostuu fluoresoivalle levylle, kun elektroneja ohjataan näytteen läpi magneettilinssien avulla. SEM= pyyhkäisyelektronimikroskooppi - kuva muodostuu näytteen sisäisen rakenteen elektroneista, jotka irtoavat tai heijastuvat näytteen pinnasta, kun sitä pyyhitään edestakasin kapealla elektronisuihkulla. - pintakuva Erotuskyky n. 2nm Miksi TEM ja SEM vaaavat tyhjiön?

12 Kaavakuva eri mikroskoopeista Atomivoimamikroskopia Kohokuva molekyylin pinnasta h"p://en.wikipedia.org/wiki/file:microscopesoverview.svg

13 TEM, SEM, valomikroskooppi vai atomivoimamikroskooppi? h"p://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/b/be/ Leish_amast_WBC1_DPDx.JPG h"p://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/e/e8/ AFMimageRoughGlass20x20.JPG h"p://en.wikipedia.org/wiki/file:bacillus_subqlis.jpg h"p://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/c/ca/ant_sem.jpg

14 TEM, SEM, mikroskooppi, stereomikroskooppi vai atomivoimamikroskooppi? TEM SEM AFM Mikrosk. h"p://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/b/be/ Leish_amast_WBC1_DPDx.JPG h"p://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/e/e8/ AFMimageRoughGlass20x20.JPG h"p://en.wikipedia.org/wiki/file:bacillus_subqlis.jpg h"p://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/c/ca/ant_sem.jpg

16 Entsyymisanastoa Entsyymi DNA- polymeraasi RNA- polymeraasi RestrikQoentsyymi Ligaasientsyymi Käänteiskopioijaentsyymi Proteaasi Merkitys Rakentaa DNA:ta nukleoqdeistä emäspariperiaa"een mukaisesq Rakentaa RNA:ta DNA- ohjeen mukaisesq Katkaisevat DNA- rihman oikeasta kohdasta Lii"ää katkaistut DNA- juosteiden päät yhteen Kopioi RNA:n emäsjärjestyksen DNA:n emäsjärjestykseksi à cdna Proteiineja pilkkova entsyymi esim. mahalaukun pepsiini, haiman trypsiini + nukleaasit = hajoi"avat DNA:ta & RNA:ta Lähde: Bios 5, WSOY

17 Voiko bakteerin genomiin siirtää ihmisen DNAta? Miten se voisi käytännössä tapahtua?

18 Ihmisen DNAta bakteeriin Eristetään RNAta ihmisen solusta Eristetään käänteiskopioijaentsyymiä (mistä löytyy?) Käännetään RNA cdnaksi. Siirretään cdna bakteeriin, yleensä plasmidiin, käyttämällä vektoria

19 Mitä vektoreita voisit käyttää?

20 Vektorit: = geenin kuljetin. Virukset (=bakteriofagi) Liposomit Plasmidit (sähkön avulla soluun) Keinotekoiset kromosomit

22 DNA:n eristäminen ja puhdistaminen Ennen kuin DNA:ta voi tutkia, pitää se eristää ja puhdistaa Prokaryoottien DNA solulimassa ja sitä on vähän à DNA on helppo eristää Eukaryoottien DNA on tumassa kromosomeissa à ensin on hajotettava lipidija proteiinirakenteet (esim. histonit ja tumakotelo) Koska DNAt ovat pitkiä, ne pitää pilkkoa pienemmiksi

23 Eristyksen ja puhdistuksen rautalankamalli 1. Solujen murskaaminen Jäädyttäminen nestemäisellä typellä à murskaus Proteiinit pilkotaan proteaaseilla ja lipidilautat hajotetaan detergenteillä 2. Proteiinien ja lipidien poistaminen Ne uutetaan liuottimeen (esim. fenoliin) h"p:// equip.cn/ewebeditor%5cuploadfile%5c914.jpg

24 Sama homma jatkuu 3. Sentrifugointi DNA ja vesi ovat kevyitä, lipidit ja proteiinit ja fenoli painavia à erottelu. 4. DNA:n saostaminen DNA saostetaan kylmällä isopropanolilla Saostunut DNA vielä liuotetaan veteen. Sentrifugin toiminta perustuu pyörimisliikeeseen! h"p://en.wikipedia.org/wiki/file:tabletop_centrifuge.jpg

25 DNA pitää pilkkoa ennen tallentamista Puhdistuksen jälkeen DNA pilkotaan pieniin pätkiin. Restriktioentsyymi katkaisee DNA tiettyjen emästen kohdalta Katkaisukohtaan jää usein tarrapinta Rihmat voidaan liittää takaisin ligaasientsyymin avulla h"p://fi.wikipedia.org/wiki/tiedosto:restricqon_enzyme.jpg

26 Miten luot bakteeriviljelmän, jossa tuotetaan ihmisen insuliinia?

27 Bakteeriviljelmän luominen 1) Eristetään m-rnata haiman beeta-soluista 2) Muutetaan m-rna cdnaksi käänteiskopioija entsyymillä. 3) Katkaistaan bakteerin plasmidi samalla restriktioentsyymillä kun cdna 4) Liitetään insuliinigeeni plasmidiin ligaasientsyymin avulla ja siirretään plasmidi bakteeriin (transformaatio, sähkö) 5) Samaan plasmidiin täytyy myös liittää antibiottiresistenssigeeni 6) Laitetaan bakteerit kasvamaan antibiottimaljalle, jolloin vain insuliini+antibiottiresistenssigeenin omaavat bakterit kasvavat ja tuottavat insuliinia

28 Aiemmin insuliinia kerättiin eläimistä ja kuolleista ihmisistä? Mitä etuja bakteeriviljelmä tarjoaa näihin menetelmiin nähden?

29 Saatavuus taattu Mahdolliset proteiinitaudit Proteiinien eroava toiminta/rakenneà Toimiiko? Mahdolliset immuunipuolustusreaktiot

31 Geenit tallennetaan geenikirjastoon =järjestämätön kokoelma kloonattuja DNA-jaksoja DNA:n eristämisen, puhdistamisen ja pilkkomisen jälkeen se pitää tallentaa à Luodaan geenikirjasto Geenikirjaston avulla pystytään helposti säilömään geenejä Jotta geenit olisi helposti löydettävissä viljelmistä, bakteeriin lisätään yleensä antibiottiresistenssigeeni Geenikirjastossa voidaan myös monistaa geenejä bakteerien jakautuessa

32 Geenikirjaston luominen 1. Bakteerin plasmidista poistetaan pätkä samalla restriktioentsyymillä, millä DNA on katkaistu Saadaan samanlaiset leikkauskohdat 2. Geeni (DNA-pätkä) liitetään plasmidiin ligaasientsyymillä 3. Plasmidi siirretään takaisin bakteeriin. h"p://www2.le.ac.uk/departments/geneqcs/vgec/educaqon/under18/topics/ recombinan"echniques

33 Kirjasto sisältää koko genomin, myös intronit. Miten saadaan kokoelma vain aktiivisista geeneistä?

34 cdna- geenikirjaston luominen 1) Eristetään DNA:n sijasta l-rna:ta 2) Eristetään käänteikopioijaentsyymiä 3) Tehdään l-rna:sta cdna:ta 4) Tämän jälkeen toimitaan samalla tavalla kun DNA-geenikirjastoa luotaessa

35 PCR-tekniikka eli polymeraasiketjureaktio Tarkoituksena monistaa haluttua DNA-pätkää Perustuu DNA-polymeraasin käyttöön ja lämpötilojen vaihteluun Tuottaa alkuperäisestä DNA:sta alukkeiden avulla jopa miljoonia kopioita Paljon nopeampi kuin bakteeriviljelmä Tarvitaan: - monistettava DNA-pätkä - nukleotidejä (A, T, C, G) - alukkeita - DNA- polymeraaseja - korkeaa lämpöqlaa. Miksi alukkeita tarvitaan?

36 PCR-rautalankamalli 1. Kuumennus (+95 C ) DNA-juosteet erkanevat 2. Viilennys (+55 C ) Alukkeet liittyvät DNA-juosteisiin 3. Juosteen rakentaminen (+72C ) DNA-polymeraasi rakentaa uuden juosteen eli syntyy kaksi DNAmolekyyliä (kaksoisjuostetta) 4. Toistetaan vaiheet Jokaisella kierroksella DNAn määrä kaksinkertaistuu! eksponentiaalinen määrän lisääntyminen! h"p://en.wikipedia.org/wiki/file:pcr.svg

37 Mihin PCR tarvitaan?

38 PCR Jos DNAta on vähän niin se kannattaa monistaa ennen muita tutkimuksia (rikostutkimukset) Koettimien/mikrosirujen valmistus Sikiödiagnostiikassa esim. suurien deleetioiden määrittämisessä Bakteerien ja virusten lajimäärityksissä & määrän tarkkailussa Geenien etsiminen, alukkeilla rajataan etsittävä pätkä

39 Elektroforeesi Tarkoituksen on erottaa erikokoiset DNApätkät toisistaan, jotka on saatu: 1. Katkaisuentsyymillä 2. PCR:n avulla DNA on negatiivisesti varautunut!!!!!! Kun se laitetaan sähkökenttään, niin se hakeutuu kohti positiivista päätä Mitä pienempi molekyyli sitä nopeammin se kulkeutuu kohti + napaa Elektroforeesia käytetään emäsjärjestyksen selvittämisessä ja yksilöntunnistamisessa.

40 Elektroforeesi-rautalankamalli 1. DNA-näytteet pipetoidaan geeliin 2. Kytketään jännite 3. DNA:t kulkevat vaihtelevalla nopeudella kohti anodia 4. Lisätään värjäävää ainetta! DNA-palaset erottuvat UV-valossa 5.Palaset voidaan leikata irti ja ottaa tutkittavaksi joku tietty pätkä h"p://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/f/fc/ DNA_Agarose_Gel_Electrophor.jpg

41 Elektroforeesi h"p://materiaalit.interneqx.fi/fi/opintojaksot/5luonnonqeteet/biologia/geenitekniikka/kuvat/elektrof.gif

42 Miten elektroforeesin avulla suoritetaan a) isyystesti b) emäsjärjestyksen selvittäminen sekvensoinnin jälkeen

43 Isyystesti Äidiltä, isäehdokkailta ja lapselta otetaan dnanäyte. Näytteistä etsitään sama kohta (vertailukelpoisuuden vuoksi) ja leikataan samalla katkaisuentsyymillä. Koska yksilöiden dna:ssa on eroja, entsyymin käyttämä leikkauskohta löytyy eri yksilöillä eri kohdasta dna-näyttettä -> eri pituisia dna-paloja. Palat erotellaan geelielektroforeesilla. Lapsen dna on vanhempien yhdistelmä.

44 Isyystesti

45 Sekvensointi Sekvensointi eli emäsjärjestyksen selvittäminen Perustuu erimittaisten DNA-juosteiden synnyttämiseen Tarvitaan 1. PCR-laitetta 2. Elektroforeesia 3. Tunnistinlaitetta (ja siihen liitettyä tietokonetta) h"p://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/4/44/sanger_sequencing_read_display.gif

46 Sekvensointi-rautalankamalli 1) Koeputkissa on DNA-polymeraasia, alukkeita, tavallisia nukleotideja ja kussakin yhden tyyppisiä muunneltuja nukleotideja. 2) Muunnellut nukleotidit pysäyttävät dna:n kahdentumisen. Synteesi katkeaa muunnellun nukleotidin kohdalta sen mukaan mitä muunneltuja nukleotideja koeputki sisältää. 3) Vaikka koeputki sisältää tietyn nukleotidityypin muunneltuja nukleotideja, syntyvään DNA-ketjuun voi liittyä myös normaali nukleotidi. Se mahdollistaa eripituisten dnapätkien syntymisen. 4) Eripituiset DNA-pätkät erotellaan geelielektroforeesilla à saadaan selville DNA:n emäsjärjestys

47 Emäsjärjestyksen selvittäminen sekvensoinnin jälkeen Sekvensoitaessa on syntynyt eripituisia DNA-pätkiä (päättävät emäkset!!) Päättävät emäkset on värjätty fluorensoivilla väreillä Eripituiset DNA-pätkät kulkevat eripituisen matkan elektroforeesissa Emäsjärjestys voidaan lukea päättävien emästen väreistä

48 Mihin sekvensointia käytetään?

49 Sekvensointi kun geeniä ei tunneta kun geenistä etsitään esim. periytyviä sairauksia aiheuttavia mutaatioita, joihin ei ole geenitestiä kun halutaan varmistaa valmistettujen dna-yhdistelmien virheettömyys (muuntogeeniset tuotteet, geenisiirrot) helpoin tapa selvittää proteiinin aminohappojärjestys

51 Pohdittavaa Monessa geneettisessä taudissa on tapahtunut ns. loss-of-funktion mutaatio, eli solussa ei tuoteta mutatoituneen geenin ohjeen mukaan proteiinia. Miten voit selvittää pelkästään beetasoluja tutkimalla tuottavatko ne insuliinia?

52 Kun halutaan selvittää toimiiko jokin geeni solussa, täytyy solusta eristää, joko geenin mukaan valmistettavaa proteiinia tai m-rnata. m-rna voidaan tunnistaa esimerkiksi sekvensoimalla, koettimella tai elektroforeesillä Proteiini voidaan tunnistaa esim. fluorensoitujen vasta-aineiden avulla Sekvensoimalla voidaan selvittää onko insuliinigeenissä mutaatioita, kuitenkaan se ei suoranaisesti kerro insuliinituotannosta

53 Miksi bakteereilla on nopea evoluutio? Ja miten tämä vaikuttaa biotekniikan riskeihin?

54 Bakteerien nopea evoluutio 1. Nopea, suvuton lisääntyminen Paljon mutaatioita 2. Kyky saada uusia geenejä a. Transformaatio = geenien kerääminen ympäristöstä (hajonneista bakteereista) b. Konjugaatio = Kahden bakteerin yhdistäminen pilluksen avulla ja perimän luovuttaminen toiselle c. Transduktio = Bakteerivirus ruiskuttaa perimänsä bakteerin sisälle, jossa se liittyy osaksi bakteerin perimää 3. Ympärsitön vaikutus geenien ilmentymiseen

55 Bakteerien evoluution aiheuttamat riskit Geenikirjastojen muuttuminen Bakteeriviljelmien tuottamien lääkeproteiinien muuttuminen Resistenssigeenien syntymien/ keräytyminen tiettyihin yksilöihin (=sairaalabakteerit)

56 Geenitestit Suomalaiseen tautiperintöön kuuluu n. 30 yhden geenin mutaatiosta aiheutuvaa sairautta. Suurin osa näistä sairauksista voidaan diagnosoida geenitestin avulla, sillä tautia aiheuttava mutaatio tunnetaan. Miten geenitesti toimii?

57 Geenien tunnistaminen Koetin = tunnettu DNA-sekvenssi jostain geenistä Koetin värjätään usein esim. radioaktiivisella / fluoresoivalla aineella Koettimen avulla voidaan testata, onko geeni toiminnassa jossain solussa Mikrosirut perustuvat useiden koettimien yhtäaikaiseen toimintaan Huom! Pitää tietää mitä etsii!!

58 Mikrosiru Lasilevylle kiinnitetään geenien koettimia Solusta eristetään mrna, joka käänteiskopioijaentsyymin avulla käännetään cdna:ksi cdna värjätään Katsotaan, minkä koettimien kanssa cdna pariutuu Suomi-siru

59

60 Geenin siirtäminen elävään soluun Plasmidit, virukset keinotekoiset kromosomit ja liposomit Mikroinjektio Solukalvon kemiallinen käsittely ja sähköimpulssit parantavat läpäisevyyttä Kasveilla soluseinän läpäisy Agrobakteeri geenipyssy

61 Kasvinjalostus Tavoitteena kestävämmät ja satoisammat kasvit = pysyvä muutos ja uusi lajike 1)Perinteiset valinta-/ ja risteytysjalostus 2) Keinotekoinen polyploidia: kromosomistojen moninkertaistaminen 3) Mutaatiojalostus 4) Muunto-/poistogeenisyys

62 Eläinjalostus Perinteiset valinta-/risteysjalostus Geenisiirto: kantasoluviljelmässä / suoraan alkion tumaan Esim. koe-eläimillä tautigeenien tutkiminen

63 Jalostuksen hyödyt ja haitat?

64 Jalostus + eläimet tuottoisampia, terveempiä?, hedelmällisempiä + kasvit tuholaisresistenttejä, satoisia ja kasvurytmiltään kannattavia - monimuotoisuuden väheneminen, eettiset ongelmat, paraneeko laatu oikeasti?

65 Rokotteita geenitekniikan avulla 1. Viruksen pintaproteiinia (eli antigeeniä) koodaavan geenin eristäminen 2. Yhdistetään geeni hiivasolun plasmidiin Eli saadaan viruksen pintaproteiinia koodaava plasmidi 3. Siirretään plasmidi hiivasoluun, jota kasvatetaan 4. Solukko tuottaa proteiinia, joka puhdistetaan à Saadaan valmista rokotetta h"p:// content /

66 Millaisia rokotteita käytetään?

67 Rokotetyypit 1) Heikennetty elävä taudinaiheittaja tai toksonoidi 2) Kuollut taudinaiheuttaja 3) Mikrobin eristettyä pintaproteiinia h"p://terveysneg.turkuamk.fi/juniorineg/terveyskeskuksessa/pistaminen.html

68 Miten eroavat rokotteiden aiheuttamat vasteet verrattaessa heikennettyä taudinaiheuttajaa ja mikrobin pintarakennetta?

69 Rokotetyyppien vertailua Pintaproteiini-rokote + ei aiheuta tautia - ei aiheuta mikrobia vastaavaa immuunireaktiota - tarvitaan tehosteita - Tarvitsee adjuvantin Elävä taudinaiheuttaja + aiheuttaa täysin mikrobia vastaavan immuunireaktion + tehokas - voi altistaa taudille

70 Biologisia lääkkeitä geenitekniikan avulla Tuotetaan elävissä soluissa useimmiten geenitekniikan avulla Proteiinirakenteisia Insuliini, EPO ja kasvuhormoni toimivat ns. korvaushoitoina Myös syöpälääkkeitä, kuten kasvutekijäestäjiä Kalliita, mutta tehokkaita! Miksi biologiset lääkkeet on anne"ava pistoksina?

71 Biologisten lääkkeiden tuotanto Bakteeri- tai hiivasoluviljelmissä Helposti suuria määriä Miksi hiivasolu on usein bakteerisolua parempi vaihtoehto? Muuntogeeniset eläimet, joissa esim. maidontuotantoon yhdistetään lääkeproteiinin tuotanto

72 Huomen-lehmä Kuopiossa v syntynyt siirtogeeninen vasikka Huomenin maitorauhasten genomissa ilmennettiin EPO-geeniä, jonka seurauksena Huomenista voitiin lypsää EPOA Lehmällä oli terveysongelmia, eikä sitä uskallettu saattaa tiineeksi, sillä siirtogeenin pelättiin leviävän pois maitorauhasista

73 Geeniterapia Terve geeni sairausgeenin tilalle 1) Suora menetelmä: geeni suoraan kohdekudokseen 2) Epäsuora menetelmä: siirrettävä geeni ensin soluviljelmään, josta soluja potilaaseen Vektorina käytetään liposomia, plasmidia tai virusta Pitkävaikutteisempaa kuin entsyymikorvaushoito Immuunipuutostauti ADA:n hoito Mitä ongelmia geeniterapiassa voi tulla vastaan?

74 Kantasoluhoito Kantasolut: erilaistumattomia soluja Alkiossa Aikuisella mm. luuytimessä Korvataan sairasta kudosta terveillä soluilla Palovammat, luuydinsiirrot (leukemiaan) Kantasolut saadaan erilaistumaan kasvutekijöillä

75 Jurassic Park eli nisäkkään kloonaaminen 1. Juuri irronneesta munasolusta poistetaan tuma 2. Terve solu (esim. ihon solu) siirretään tyhjään munasoluun 3. Sähköiskun avulla munasolu ja siirretty solu yhdistyvät, ja ne jakautuvat 4. Munasoluyhdistelmän siirto alkuperäiseen nisäkkään kohtuun! h"p://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/e/e7/jurassic_park_poster.jpg