PATENTTIJULKAISU PATENTSKRIFT FI B. (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats C12N 15/62, 15/31, A61K 39/00, 39/015, 39/02, 39/12

Transkriptio

1 (12) PATENTTIJULKAISU PATENTSKRIFT (10) FI B (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats SUOMI - FINLAND (FI) PATENTTI- JA REKISTERIHALLITUS PATENT- OCH REGISTERSTYRELSEN (51) Kv.lk.7 - Int.kl.7 C12N 15/62, 15/31, A61K 39/00, 39/015, 39/02, 39/12 (21) Patenttihakemus - Patentansökning (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag (24) Alkupäiva - Löpdag (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig (86) Kv. hakemus - Int. ansökan PCT/US89/01932 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet US P (73) Haltija - Innehavare 1 American Cyanamid Company, One Cyanamid Plaza, Wayne, NJ , AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) 2 -The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University, Stanford, CA 94305, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) (72) Keksijä - Uppfinnare 1 Marjarlan,William Robert, 17 Green Hill Lane, Pittsford, NY 14534, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) 2 Stocker,Bruce Amold Dunbar, 410 La Mesa Drive, Menlo Park, CA 94025, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) 3 Cardozo Newton,Salete Maria, 2680 Fayette Drive 211, Mountain View, CA 94040, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) (74) Asiamies - Ombud: Kolster Oy Ab Iso Roobertinkatu 23, Helsinki (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Menetelmä flagelliinifuusloprotelinin, sitä koodaavan geenin ja mikro-organismin valmistamiseksi Förfarande för framställning av ett flagellinfusionsprotein, en gen som kodar det och en mikroorganism (83) Mikro-organismitalletus - Deposition av mikroorganismb7685 ATCC, ATCC, ATCC, ATCC ATCC, ATCC (56) Viitejulkaisut - Anförda pubiikationer EP A (C 12N 15/00), WO A (C 07K 15/04), Joumal of Bacteriology vol. 168 (1986) p ), Science vol. 231 (1986) p (57) Tiivistelmä - Sammandrag Tämä keksintö kohdistuu yhdistelmägee- aiheuttamia. Erityisessä sovellutusmuodosneihin ja niiden koodaamiin proteiineihin, sa voidaan heikennettyjä ja elimistöön jotka ovat flagelliinin yhdistelmäfuusio- tunkeutumiskykyisiä bakteereja, jotka ilproteiineja. Nämä fuusioproteiinit käsit- mentävät tämän keksinnön mukaisia yhdistävät aminohappojaksoja, jotka määräävät telmä-flagelliinigeenejä, käyttää elävissä flagelliinin rakennegeenin koodaamaa epi- rokoteformulaatioissa. Tätä keksintöä kutooppia ja heterologisen organismin epi- vataan esimerkkien avulla, joissa malarian tooppia, joka on immunogeeninen silloin sirkumsporotsoiittiantigeenien, koleratokkun se viedään fuusioproteiinina selkä- siivin B-alayksikön, hepatiitti-b:n pintarankaisisäntään. Tämän keksinnön mukaisia antigeenien ja esivaihepinta-antigeenien, yhdistelmägeenejä ja proteiineja voidaan rotaviruksen VP7-polypeptidin, HIV:n vaipkäyttää rokoteformulaatioissa antamaan paglykoproteiinin, ja Streptococcuksen suojaa heterologisen organismin aiheutta- m-proteiinin epitooppeja ilmennetään flamaa infektiota vastaan tai antamaan suojaa gelliinin yhdistelmäfuusioproteiineina, sellaisia sairaustiloja tai tauteja vas- taan, jotka ovat organismin antigeenin

2 jotka rakentuvat toiminnallisiksi flagelloiksi ja jotka aiheuttavat selkärankaisisännässä heterologisia epitooppeja vastaan suunnatun immuunivasteen Föreliggande uppfinning avser rekombinanta gener och deras kodade proteiner, vilka består av rekombinanta flagellinfusionsproteiner. Dylika fusionsprotein omfattar aminosyrasekvenser som specificerar en epitop, vilken kodas av en flagellinstrukturgen, och en epitop av en heterolog organism, vilken är immunogenisk vid införandet av fusionsproteinet i en värd av ordningen ryggradsdjur. De rekombinanta generna och proteinen enligt föreliggande uppfinning kan användas i vaccinsammansättningar för åstadkommande av skydd mot infektion genom den heterologa organismen, eller för åstadkommande av skydd mot störingstillstånd, vilka förorsakas av en antigen från organismen. I ett specifikt utförande kan dämpade, anfallande bakterier, vilka exprimerar de rekombinanta flagellingenerna enligt uppfinningen, användas i levande vaccinsammansättningar. Uppfinningen illustreras genom exempel, i vilka epitoper av malariacircumsporozoitantigener, B-underenheten av Choleratoxin, yt- och förytantigener av Hepatitis 8, VP7-polypeptid av rotavirus, skalglykoprotein av HIV och M-protein av Streptococcus exprimeras i rekombinanta flagellinfusionsproteiner, vilka sammangår till funktionell flagella, och vilka framkallar ett immungensvar, vilket riktar sig mot den heterologa epitopen, hos en värd av ordningen ryggradsdjur.

3 Menetelmä flagelliinifuusioproteiinin, sitä koodaavan geenin ja mikro-organismin valmistamiseksi Esillä oleva keksintö kohdistuu menetelmään fuu- 5 sioproteiinin ilmentämiseksi ja valmistamiseksi, joka proteiini käsittää ensimmäisen epitoopin, jota koodaa Salmonellan tai Shigellan flagelliinin rakennegeeni ja ainakin yhden heterologisen organismin epitoopin, joka organismi on muu kuin se organismi, josta ensimmäinen epitooppi on 10 peräisin ja joka epitooppi ei oleellisesti ole sama kuin flagelliinigeenin koodaama epitooppi ja jonka flagelliiniosan oleellinen antigeenisuus säilyy. Keksintö koskee myös menetelmää fuusioproteeinia koodaavan yhdistelmägeenin ja sitä sisältävän nukleiinihappokloonin valmistami- 15 seksi sekä menetelmää mainitun geenin sisältävän mikro- organismin valmistamiseksi. Keksinnön tausta Yhdistelmä-DNA-tekniikka ja geenien ilmentäminen Yhdistelmä-DNA-tekniikkaan kuuluu spesifisten DNA- 20 jaksojen liittäminen DNA-kantajaan (vektoriin) sellaisen yhdistelmä-dna-molekyylin muodostamiseksi, joka kykenee lisääntymään isäntäsolussa. Liitetty DNA-jakso on yleensä vastaanottavan DNA-kantajan suhteen vierasta DNA:ta, ts. liitetty DNA-jakso ja DNA-vektori ovat peräisin organis meista, jotka eivät luonnossa vaihda keskenään geneettistä informaatiota, tai liitetty DNA-jakso voi olla kokonaan tai osittain synteettisesti valmistettua. On kehitetty useita yleisiä menetelmiä, joiden avulla yhdistelmä-dnamolekyylien konstruointi voidaan suorittaa. 30 Huolimatta siitä, mitä konstruointimenetelmää käy-. tetään, täytyy yhdistelmä-dna-molekyylien olla yhteensopivia isäntäsolun kanssa, ts. kykeneviä lisääntymään itsenäisesti isäntäsolussa tai liittyneitä pysyvästi isäntäsolun yhteen tai useampaan kromosomiin tai plasmidiin. 35 Yhdistelmä-DNA-molekyylillä tulisi olla edullisesti mark-

4 keritoiminto, jonka avulla haluttu(tut) yhdistelmä-dnamolekyyli(t) voidaan selektoida. Jos lisäksi yhdistelmävektorissa kaikki asianmukaiset replikaatio-, transkriptio- ja translaatiosignaalit ovat järjestyneet oikein, 5 vieras geeni ilmenee tarkoituksenmukaisella tavalla esim. transformoiduissa bakteerisoluissa bakteeriperäisten ilmentämisplasmidien ollessa kyseessä tai permissiivisissä solulinjoissa tai isäntäsoluissa, jotka on infektoitu yhdistelmäviruksella tai joissa on asianmukaisen replikaa- 10 tioalkukohdan omaava yhdistelmäplasmidi. Erilaiset geneettiset signaalit ja prosessointitapahtumat ohjaavat geenien ilmentymisen kuten DNA:n transkription ja lähetti-rna:n (mrna:n) translaation tasoja. DNA:n transkriptio riippuu siitä, että saatavilla on 15 promoottori, joka on RNA-polymeraasin sitoutumista ohjaava ja siten mrna:n synteesiä edistävä DNA-jakso. Eukaryoottien promoottorien DNA-jaksot eroavat prokaryoottien vastaavista jaksoista. Eukaryoottien promoottorit ja niihin liittyvät geneettiset signaalit saattavat lisäksi 20 jäädä tunnistamattomiksi tai toimintakyvyttömiksi prokaryoottisessa systeemissä ja prokaryoottien promoottorit jäävät tämän lisäksi tunnistamatta ja toimintakyvyttömiksi eukaryoottisoluissa. Samoin mrna:n translaatio prokaryooteissa riippuu 25 asianmukaisten prokaryoottien signaalien läsnäolosta ja nämä signaalit eroavat eukaryoottien signaaleista. mrna:n tehokas translaatio prokaryooteissa vaatii mrna:ssa olevan ribosomien sitoutumiskohdan, jota kutsutaan Shine-Dalgarno (S/D) -jaksoksi [Shine, J. ja Dalgarno, L., (1975) Nature , 34-38]. Tämä jakso on mrna:n lyhyt nukleotidijakso, joka sijaitsee ennen aloituskodonia, joka on tavallisesti AUG ja joka koodaa tämän proteiinin aminoterminaalisessa päässä olevaa (formyyli)metioniinia. S/D-jaksot ovat komplementaarisia 16S rrna:n (ribosomaalisen RNA:n) 3'-pään 35 suhteen ja ne luultavasti edistävät mrna:n sitoutumista 1

5 ! ribosomeihin liittymällä dupleksiksi rrna:n kanssa siten, että ribosomi asettuu oikein [Shine, J. ja Dalgarno, L., (1975) Nature 254, 34-38]. Kloonatun geenin ilmenemisen onnistuminen vaatii 5 riittävää DNA:n transkriptiota, mrna:n translaatiota ja joissakin tapauksissa proteiinin translaation jälkeistä modifiointia. Ilmentämisvektoreita on käytetty geenien ilmentämiseen aktiivisen promoottorin ohjaamina sopivassa isännässä ja niitä on käytetty proteiinien tuoton kohotta- 10 miseen. Rokotteet Rokotteiden kehittäminen virusten, bakteerien, sienten tai loisten aiheuttamien tautien ehkäisy muodostaa kohteen, johon on suunnattu suuri tutkimuspanos. 15 Tavanomaisiin rokotteiden valmistustapoihin kuuluu inaktivoitujen tai heikennettyjen patogeenien käyttö. Patogeenisten mikro-organismien sopiva inaktivointi tekee nämä organismit haitattomiksi biologisiksi agensseiksi mutta ei tuhoa niiden immunogeenisyyttä. Näiden "tapettu- 20 jen" partikkelien antaminen ruiskeena isäntään aiheuttaa sitten immuunivasteen, joka kykenee estämään tulevaisuudessa tapahtuvan infektion elävällä mikro-organismilla. Suurena huolenaiheena tapettuja rokotteita käytettäessä (inaktivoitua patogeenia käyttäen) on kuitenkin se, että 25 kaikkia mikro-organismeja ei onnistuta inaktivoimaan. Vieläpä silloinkin, kun tässä onnistutaan, saavutettu immuniteetti on usein epätäydellistä, lyhytikäistä ja siihen tarvitaan useita immunisointeja sen vuoksi, että tapetut patogeenit eivät lisäänny isännässään tai että tähän on 30 muita tuntemattomia syitä. Inaktivointitapahtuma voi li-. säksi muuntaa mikro-organismin antigeeneja, minkä johdosta näiden immunogeeninen tehokkuus heikentyy. Heikentäminen tarkoittaa sitä, että patogeenisista mikro-organismeista tuotetaan kantoja, joista kyky sai- 35 rauden aiheuttamiseen on olennaisesti hävinnyt. Yksi keino

6 % tämän aikaansaamiseksi on altistaa mikro-organismi epätavallisille kasvuolosuhteille ja/tai viljellä sitä usein soluviljelmässä. Tämän jälkeen selektoidaan mutantteja, joista virulenssi on hävinnyt mutta jotka kykenevät kui- 5 tenkin aiheuttamaan immuunivasteen. Heikennetyt patogeenit ovat usein hyviä immunogeeneja, koska ne replikoituvat isäntäsolussa ja aiheuttavat pitkään kestävän immuuniteetin. Elävien rokotteiden käyttöön liittyy useita ongelmia, joista eniten huolta aiheuttavat ongelmat ovat riittämätön 10 heikentäminen ja riski virulenssin palautumisesta. Vaihtoehtona näille menetelmille on alayksikkörokotteiden käyttö. Tämä käsittää immunisoinnin käyttäen vain niitä komponentteja, jotka sisältävät immunogeenista materiaalia. 15 Rokotteet formuloidaan ja niillä suoritetaan rokottaminen usein eri lisäaineita käyttämällä. Lisäaineiden avulla on mandollista saada kestävämpi ja korkeammanasteinen immuniteetti käyttäen pienempiä antigeenimääriä tai harvemmin annettuja annoksia verrattuna siihen, että im- 20 munogeeni annettaisiin yksin. Lisäaineiden vaikutusmekanismi on monimutkainen eikä sitä tunneta täysin. Siihen voi kuitenkin liittyä sytokiinien tuotanto, fagosytoosi ja muita retikuloendoteelisysteemin aktiivisuuksia sekä antigeenin viivästynyt vapautuminen ja hajottaminen. Esimerk- 25 keihin lisäaineista kuuluvat Freundin adjuvantti (täydellinen tai epätäydellinen), Adjuvant 65 (sisältää maapähkinäöljyä, mannidimono-oleaattia ja aluminiummonostearaattia, pluroninen polyoli L-121, Avridiini ja mineraaligeelit, kuten aluminiumhydroksidi, aluminiumfosfaatti jne. 30 Freundin adjuvanttia ei enää käytetä ihmisille tarkoitetuissa rokoteformulaatioissa, koska se sisältää metaboloiturvatonta mineraaliöljyä ja se on mandollinen karsinogee- ni. Elävän, heikennetyn Salmonellan on osoitettu ky- 35 kenevän stimuloimaan suojaavaa immuunivastetta homologi-

7 sella virulentilla kannalla tehtyä altistusta vastaan. [Germanier, R. ja Furer, E., (1975) J. Infect Dis. 181, 533, Germanier, R., (1984) teoksessa Bacterial Vaccines, Academic Press, New York, sivut , Levine, M.M., 5 et al., (1983) Microbiol. Rev. 47, 510, Wandan, M. H., et al., (1982) J. Infect. Dis. 145, 292, Hoiseth, S. K. ja Stocker, B.A.D., (1981) Nature 291, 238, Stocker, B.A.D., et al. (1982) Dev. Biol. Std. 53, 47, Lindberg, A. A. ja Robertsson, J. A., (1983) Infect. Immun. 41, 751, Roberts- 10 son, J. A., et al., (1983) Infect. Immun. 41, 742, Smith, B. P., et al., (1984) Am. J. Vet. Res. 45, 2231, Smith, B. P., et al., (1984) Am. J. Vet. Res, 45, 59, Moser, I., et al., (1980) Med. Microbiol. Imm. 168, 119]. Useat tutkijat ovat lisäksi käyttäneet vieraita antigeeneja koodaavia 15 plasmideja sisältäviä heikennettyjä Salmonella-bakteereja näiden vieraiden antigeenien viemiseksi immuunijärjestelmään [Formal, S. B., et al., (1981) Infect. Immun. 34, 746, US-patenttijulkaisu nro , Formal et al., Clements, J. D., et al., (1986) Infect. Immun. 5, 685, 20 Maskell, D. J., et al., (1987) Microb. Path. 2, 211, Brown, A., et al., (1987) J. Infect. Dis. 155, 86, Dougan, G., et al., (1987) Parasite Immun. 9, 151]. Plasmodium-lajin sirkumsporotsoiittiproteiiniin liittyvän toistuvan immunodominantin epitoopin ajatellaan 25 olevan malariasporotsoiitteja vastaan syntyvien suojaavien humoraalisten (ja mandollisesti soluvälitteisten) vasteiden kohde [Miller, L.H. et al., (1986) Science 234, 1349], on kuvattu monoklonaalisia vasta-aineita, jotka tunnistavat näitä molekyyleja ja kykenevät suojaamaan naiiveja 30 resipienttieläimiä. Kahta näihin toistuviin epitooppeihin perustuvaa rokotetta on testattu ihmisissä ja niiden on osoitettu aiheuttavan suojaavan immuunivasteen joissakin yksilöissä. [Ballou, W. R., et al., (1987) Lancet i, 1277, Herrington, D., et al., (1987) Nature 328, 257].

8 Koleratoksiini on prototyyppi bakteerien enterotoksiinien ryhmästä, joka välittää ripulitauteja ja jotka ovat rakenteeltaan, toiminnaltaan ja immunogeenisyydeltään toistensa kaltaisia. Muihin tämän ryhmän jäseniin kuuluvat 5 E. colin lämpöherkkä toksiini, joka on eristetty ihmisistä [Yamamoto, T. ja Yokota, T., (1983) J. Bacteriology 155, 728] ja sioista [Leong, J., et al., (1985) Infect. Immun. 48, 73], ja Salmonella typhimuriumista [Finkelstein, R. A., et al., (1983) FEMS Microbiology Letters 17, 239] ja 10 Campylobacter jejunista peräisin olevat toksiinit [Walker, R. I., et al., (1986) Microbiology Rev. 50, 81]. Yhteistä kaikille näille toksiineille on A-alayksikkö, joka välittää ADP-ribosyylitransferaasiaktiivisuutta, jonka tuloksena on adenylaattisyklaasin aktivaatio ja joka lopulta joh- 15 taa kohteena olevan solun kuolemaan. Kaikki nämä toksiinit sisältävät lisäksi immunologisesti dominantin B-alayksikön, jonka välityksellä holotoksiini sitoutuu kohdesoluunsa. Pelkkä B-alayksikkö ei ole toksinen ja immunisointi tällä molekyylillä aiheuttaa toksiinia neutraloivien vas- 20 ta-aineiden muodostumisen. On ehdotettu, että voitaisiin valmistaa rokotteita, jotka perustuvat toksiinia neutraloiviin vasta-ainevasteisiin immunisoimalla bakteerien eksotoksiinien (koleratoksiini, E. colin lämpöherkkä toksiini) ei-toksisilla sitou- 25 tumisalayksiköillä [Jacob, C. 0., et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 7611, Jacob, C. 0., et al., (1984) EMBO J. 3, 2889]. Hepatiitti-B-virioni on 42 nm:n vaipallinen rakenne, joka sisältää pienen DNA-genomin. Vaippaproteiineja 30 koodaavat S-geeni (esi-s, esi-s 2 ja S), yksi HBV:n genomin neljästä avoimesta lukukehyksestä [Tiollais, P. et al., (1985) Nature 317, 489]. Näihin polypeptideihin sisältyy hepatiitti-b-pinta-antigeeni (HBsAg). HBsAg-partikkelien, jotka on saatu ihmisen plasmasta, tai samanlaisten partik- 35 kelien, jotka on tuotettu yhdistelmä-dna-menetelmillä

9 _ (joista joiltakin puuttuvat esi-s-epitoopit), on osoitettu aiheuttavan suojaavan immuunivasteen ja puhdistetut partikkelit edustavat nykyisiä HBV:tä vastaan käytettäviä rokotteita. [Krugman, S., (1982) J. Am. Med. Assoc. 247, ]. Flagelliini Flagellat ovat organelleja, jotka liittyvät bakteerisolujen liikkumiseen. Rakenneproteiinien synteesi ja kokoonpantujen flagellojen varsinainen toiminta on moni- 10 mutkainen tapahtumasarja, joka käsittää useiden geenien ja geenituotteiden vuorovaikutuksia [katsaus esitetty julkaisussa Iino, T., (1977) Ann. Rev. Genet. 11, 161]. On määritetty yli kolmekymmentäviisi geeniä, jotka osallistuvat flagellaan liittyviin toimintoihin E. colissa ja on 15 tunnistettu geenituotteet, jotka vastaavat ainakin seitsemäätoista näistä geeneistä. Varsinainen flagellaorganelli koostuu kolmesta pääasiallisesta rakenteellisesta elementistä ja se ulottuu sytoplasmasta solukalvojen läpi ja päättyy suureen solunulkoiseen osaan. Filamentti muodostuu 20 yhdestä alayksikköproteiinista, flagelliinista ja se on tämän organellin pääasiallisin rakenneyksikkö, joka muodostaa yli 95 % kokonaismassasta. Flagelliinin rakennegeenejä nimitetään Hi:ksi ja H2:ksi Salmonellassa [Iino, T., (1969) Bacteriol. Rev. 33, ], H:ksi Bacillus 25 subtiliksessa [Joys, T. M. ja Frankel, R. W., (1967) J. Bacteriol. 94, 32-37] ja Pseudomonas aeruginosassa [Iino, T., (1969) Ann. Rep. Natl. Inst. Genet. Jpn. 20, 94] ja hag:ksi E. colissa [Armstrong, J. B. ja Adler, J., (1969) J. Bacteriol. 97, ]. Tyvikappale on tämän 30 organellin monimutkaisin osa ja se toimii sekä organellin. ankkuroinnissa soluun ja osana moottorin kaltaista laitetta, joka pyörittää filamenttia. Koukun osuutena on filamentin kiinnittäminen tyvikappaleeseen. Filamentin pyöriminen synnyttää flagellan välityk- 35 sellä tapahtuvan solujen liikkeen. Kukin filamentti koos-

10 tuu useista tuhansista kappaleista flagelliinialayksiköitä, jotka muodostavat tyypillisesti 5-10 gm:n pituisen kierteisen rakenteen [useimpien E. coli ja Salmonella -kantojen ollessa kyseessä ks. MacNab, P., (1987) teokses- 5 sa Escherichia coli and Salmonella typhimurium, Neidhardt, F.C., toim. American Society for Microbiology, Washington, DC, sivut 70-83]. Flagelliinin rakennegeenissä olevien mutaatioiden on havaittu aiheuttavan muutoksia filamentin muodostumisen tehokkuuteen, filamentin muotoon, herkkyy- 10 teen flagelloihin hakeutuvia faageja vastaan ja/tai flagellan antigeenispesifisyyteen [Yamaguchi, S. ja Iino, T., (1969) J. Gen. Microbiol. 55, 59-74, Iino, T., et al., (1974) J. Gen. Microbiol. 81, 37-45, Horiguchi, T., et al., (1975) J. Gen. Microbiol. 91, ]. Filament- 15 tien kokoaminen tapahtuu solun ulkopuolella lisäämällä flagelliinimonomeerejä toinen toisensa perään kasvavaan filamenttiin ja pidentymisen nopeus on kääntäen verrannollinen filamentin pituuteen sen kasvun pysähtymiseen asti ja tämä säätelee siten filamentin pituutta. 20 Flagellat esiintyvät etupäässä sauvan- ja spiraalinmuotoisten bakteerien pinnalla ja tällaisiin bakteereihin kuuluu jäseniä bakteerisuvuista Escherichia, Salmonella, Proteus, Pseudomonas, Bacillus, Campylobacter, Vibrio, Treponema, Legionella, Clostridia, Caulobacter ja eräistä 25 muista suvuista, vaikkakaan tämä ominaisuus ei rajoitu yksinomaan tämän tyyppisiin bakteereihin. Siitä huolimatta että nämä flagellat toimivat samoin, ne ovat eri suvuissa molekyylipainoltaan monimuotoisia alueella kda. Jopa yhdessä suvussa kuten Salmonellassa tavataan kor- 30 keanasteista antigeenipolymorfiaa ja tämä on käyttökelpoinen keino yksittäisten seroptyyppien tunnistamiseen yhden lajin sisällä [Edwards, P. R. ja Ewing, W. H., (1972) Identification of Enterobacteriaceae, 3. painos., Burgess Publishing Co., Minneapolis, MN]. Useiden bakteerien fla- 35 gellojen rakenteellisessa analyysissa on paljastunut se

11 seikka, että eri bakteereista eristetyille filamenteille on yhteistä niiden rakentuminen samalla tavalla [Wei, L.-N. ja Joys, T. M., (1985) J. Mol. Bio. 186, 791, DeLange, R. J., et al., (1976) J. Biol. Chem. 251, 705, Gill, 5 P. R. ja Agabian, J., Biol. Chem. 258, 7395]. Huomattavinta on se, että näiden molekyylien amino- ja karboksiterminaalisissa päissä on korkeanasteista proteiinisekvenssin homologiaa ja että niiden keskiosassa esiintyy polymorfinen alue, josta eri flagelloissa esiintyvä antigeenien 10 monimuotoisuus on peräisin. Bakteerien pinnalla olevien antigeenien synnyttämät vasteet isännissä ovat perusteellisesti dokumentoituja [Horowitz, S. A. et al., (1987) Infect. Immun. 55, 1314, Naito, Y., et al., (1987) Infect. Immun. 55, 832, Zhang, 15 Y. X., et al., (1987) J. Immunol. 138, 575, Norgard, M. V., (1986) Infect. Immun. 54, 500, Nagy, L. K., (1985) Vet. Rec. 117, 408, Levine, M. M., et al., (1984) Infect. Immun. 44, 409, Zak, K., et al., (1984) J. nlfect. Dis. 149, 166]. Flagellojen ja erityisesti flagellan filament- 20 tien on osoitettu olevan vahvoja immunogeenejä luonnollisissa infektio-olosuhteissa ja keinotekoisissa immunisointiolosuhteissa ja joissakin tapauksissa flagellassa esiintyvien antigeenisten determinanttien on osoitettu olevan suojaavia [Young, R. J., et al., (1979) Infect. Im- 25 mun. 25, 220, Eubanks, E. R., et al., (1976) Infect. Immun. 15, 533, Smith, H. L., Jr., (1974) App. Micro. 2, 375, Dwyer, J. M. ja Mackay, I. R., (1972) Int. Arch. Allergy Appl. Imm. 43, 434, Ebersole, J. L. ja Molinari, J. A., (1976) Infect. Immun. 13, 53, Ebersole, J. L., et al., 30 (1975) Infect. Immun. 12, 353, Stevenson, J. R. ja Stronger, K. A., (1980) Am. J. Vet. Res. 41, 650, Tamura, Y., et al., (1984) Micro. Imm. 28, Kuwajima (1988) J. Bact. 170, 485] on kuvannut hag-flagelliinigeenin keskusalueelle aiheutettujen deleetioiden avulla muodostettuja

12 E. coli -bakteerin mutantteja, joilla flagellan antigeenisyys on muuntunut. US-patenttijulkaisu nro kuvaa bakteerien pilusten, bakteerien ulkopintaan kiinnittyneiden organel- 5 lien, puhdistettujen alayksiköiden käytön rokoteformulaatioissa. Kansainvälinen PCT-patenttijulkaisu WO 87/02 385, julkaistu 23. huhtikuuta 1987, kuvaa proinsuliinijakson ja beta-laktamaasijakson ilmentymisen fuusioproteiineina B. 10 subtiliksen hag-flagelliinigeenin kanssa. Keksinnön yhteenveto Esillä oleva keksintö koskee menetelmiä flagelliinifuusioproteiinin valmistamiseksi ja ilmentämiseksi, joille menetelmille on tunnusomaista se, mitä patenttivaa- 15 timuksissa 17 ja 21 esitetään. Keksintö koskee edelleen menetelmiä flagelliinifuusioproteiinia koodaavan yhdistelmägeenin ja sitä sisältävän nukleiinihappokloonin valmistamiseksi, joille menetelmille on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksissa 1 ja 13 esitetään. Keksinnön mu- 20 kaiselle menetelmälle mainitun geenin sisältävän mikroorganismin valmistamiseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 15 esitetään. Tämän keksinnön mukaisesti valmistetaan yhdistelmägeenejä ja niiden koodaamia proteiineja, jotka ovat fla- 25 gelliinin yhdistelmäfuusioproteiineja. Nämä proteiinit käsittävät epitoopin, joka on toiminnallisen flagelliinin rakennegeenin koodaama ja ainakin yhden heterologisen organismin epitoopin, joka epitooppi on immunogeeninen silloin, kun fuusioproteiini viedään isäntänä olevaan selkä- 30 rankaisyksilöön. Nämä epitoopit ovat B-solu- ja/tai T-soluepitooppien tunnistamia. Heterologisen organismin epitooppi voidaan liittää sellaiselle alueelle, joka ei ole välttämätön sen koodaaman flagelliinin toiminnalle ja joka ei hävitä tämän toimivuutta, kuten flagelliinin rakenne- 35 geenin suurta vaihtelua sisältävälle alueelle. Erityisen

13 edullisessa sovellutusmuodossa heterologisen organismin epitooppi liitetään Salmonellan Hl-d-geenin luonnostaan sisältämien EcoRV-kohtien väliin. Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut yhdistelmäflagelliiniproteiinit kul- 5 jetetaan solun pinnalle, jossa, edullisen sovellutusmuodon ollessa kyseessä, niistä rakentuu heterologisen epitoopin sisältävä toiminnallinen flagella. Muissa sovellutusmuodoissa flagelliinin yhdistelmäfuusioproteiinit voivat synnyttää solu-, limakalvo- tai humoraalisen vasteen. 10 Yhdistelmäflagelliinigeenejä ja -proteiineja voidaan formuloida käytettäväksi rokotteina, jotka torjuvat heterologisen organismin aiheuttaman infektion. Ne voivat myös antaa suojaa sellaista sairaustilaa tai tautia vastaan, joka on heterologisen organismin antigeenin aiheut- 15 tarra. Flagelliinin yhdistelmäfuusioproteiinina tapahtuva ilmentäminen tarjoaa käyttöön menetelmän minkä tahansa halutun epitoopin esittämiseksi immunologiselle järjestelmälle immunogeenisessä muodossa ja menetelmän immuunivasteiden stimuloimiseksi, mukaanlukien humoraalisten, lima- 20 kalvoihin liittyvien ja/tai soluvälitteisten immuunivasteiden stimuloimisen. Erityisessä sovellutusmuodossa voivat heikennetyt elimistöön tunkeutumiskykyiset bakteerit ilmentää yhdistelmäfiagelliinigeenejä elävissä suun kautta annettavissa rokoteformulaatioissa. Toisessa sovellutus- 25 muodossa flagelliinin yhdistelmäfuusioproteiineja voidaan formuloida käytettäviksi alayksikkörokotteina. Erityisissä tämän keksinnön mukaisissa sovellutusmuodoissa, jotka esitetään yksityiskohtaisesti esimerkkien yhteydessä, ilmennetään malarian sirkumsporotsoiittianti- 30 geenien, koleratoksiinin B-alayksikön, hepatiitti-b:n pinta-antigeenin ja pinta-antigeenin esimuodon, rotaviruksen VP7-polypeptidin, HIV:n vaippaglykoproteiinin ja Streptococcuksen M-proteiinin epitooppeja flagelliinin yhdistelmäfuusioproteiineissa, joista rakentuu toiminnallisia fla- 35 gelloja ja jotka aiheuttavat heterologista epitooppia vas-

14 taan kohdistuvan immuunivasteen isäntänä olevassa selkärankaisyksilössä. Määritelmät bp = emäspari 5 CRM197 = mutantti difteriatoksiinimolekyyli CS = sirkumsporotsoiitti CT-B = koleratoksiinin B-alayksikkö CTP3 = peptide, joka edustaa koleratoksiinin B-alayksikön aminohapporyhmiä [Jacob, C. 0., et al., 10 (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7893] DPAPP- NAN = peptidi (asp-pro-ala-pro-pro-asn-ala-asn), joka edustaa Plasmodium berghein sirkumsporotsoiittiproteiinin immunodominanttia toistuvaa konsensusepi- 15 tooppia DTT = ditiotreitoli ELISA = entsyymivälitteinen immunosorbenttimääritys HBsAg = Hepatiitti-B:n pinta-antigeeni HIV = Ihmisen immuunipuutostautivirus 20 kda = kilodaltonia KLH = reikäkotilon hemosyaniini Mab = monoklonaalinen vasta-aine NANP = Peptidi (asn-ala-asn-pro), joka edustaa Plasmodium falciparumin sirkumsporotsoiittiproteiinin im- 25 munodominanttia toistuvaa konsensusepitooppia PAGE = polyakryyliamidigeelielektroforeesi PBS = fosfaatilla puskuroitu fysiologinen suolaliuos RSV = respiratory syncytial -virus VP7 = rotaviruksen ulkokuoren pääasiallisin polypeptidi 30 Kuvioiden selitykset Kuvio 1. Kaavio plasmideista pls402, ppx1651 ja pls408, jotka koodaavat flagelliinin rakenne geeniä H1-d. Plasmidi pls402 eristettiin Salmonella muenchenin DNA:n 35 genomikirjastosta, joka oli konstruoitu pbr322:een [Wei,

15 L.-N. ja Joys, T. M., (1985) J. Mol. Biol. 186, 791]. H1-d flagelliinigeeniä koodaava alue (tummennettu alue) esiintyy 3,8 ke:n EcoRI genomifragmentissa ja se sisältää kaksi EcoRV-restriktiokohtaa. Tämän lisäksi vektorissa esiintyy 5 vielä yksi EcoRV-kohta. Kaksi jatkokloonia, plasmidit ppx ja pls408, konstruoitiin liittämällä ensin pls402:n 3,8 ke:n genomifragmentti puc18:n ja puc19:n EcoRI-kohtiin, tässä järjestyksessä mainittuna, ja tulokseksi saatiin konstruktiot ppx1650 ja pls405, tässä järjestyksessä 10 mainittuna. Tämän jälkeen deletoitiin kummastakin näistä plasmidista 51 ep:n EcoRV-fragmentti ja tästä oli tuloksena plasmidit ppx1651 ja pls408, joilla kummallakin oli nyt ainutkertainen EcoRV-restriktiokohta käytettäväksi vierasta epitooppia määräävien oligonukleotidien liittämiseen. 15 Kuvio 2A. Kaavio H1-d-flagelliiniproteiinista. Suurta vaihtelua sisältävä alue IV on merkitty ristiviivoituksella. Kuvassa on osoitettu EcoRV-restriktiokohtien sijainti geenijaksoissa. Kuvio 2B. H1-d flagelliinigeenin nukleotidijakso 20 ja siitä johdettu aminohappojakso [julkaisusta Wei, L. N. ja Joys, T. M., (1985) J. Mol. Biol. 186, 791]. EcoRV-restriktiokohdat on alleviivattu. Kuvio 3A. Kolmea täyttä ja kahta puolikaskappaletta P. falciparumin sirkumsporotsoiitin immunodominanttia 25 toistuvaa epitooppia (NAND) koodaavien synteettisten oligonukleotidien nukleotidijakso ja siitä johdettu aminohappojakso. Kuvio 3B. Kahta P. berghein sirkumsporotsoiitin immunodominanttia toistuvaa konsensusepitooppia (DPAPPNAN) 30 koodaavien synteettisten oligonukleotidien nukleotidijakso ja siitä johdettu aminohappojakso. Kuvio 4A. Kaavio koleratoksiinin B-alayksikköproteiinista ja CTP3-epitoopin sijainnista siinä. Kuvio 4B. Koleratoksiinin B-alayksikköä koodaavien 35 synteettisten oligonukleotidien nukleotidijakso ja siitä

16 johdettu aminohappojakso. Toisiinsa pituussuunnassa liittyneet oligonukleotidit käsiteltiin Klenow-entsyymillä tasaisten päiden muodostamiseksi ennen niiden liittämistä plasmidivektoriin kuviossa 1 esitetyllä tavalla. 5 Kuvio 5. Kaavio flagelliinin yhdistelmäfuusioproteiineista, jotka on konstruoitu esimerkissä 1 esitetyn kuvauksen mukaisesti. Ristikkäisviivoitetut alueet edustavat P. falciparumin tai P. berghein CS-proteiinien tai koleratoksiinin B-alayksikön (CT-B) heterologisia jaksoja 10 kuvassa esitettyjen merkintöjen mukaisesti. Kuvio 6. Heikennetyssä Salmonellassa ilmennettyj en yhdistelmäflagelliinien Western -blottausanalyysi. Soluuutteille suoritettiin elektroforeesi ja siirto nitroselluloosasuodattimille esimerkissä 1 esitetyn tavan mukai- 15 sesti. Yhdistelmäflagelliinimolekyylien havaitsemiseen käytetyt vasta-ainekoettimet olivat: Osa A: H1 - d:tä vastaan valmistettu kaniinin antiseerumi, Osa B: P. berghein sirkumsporotsoiittia vastaan valmistettu Mab 3.28, Osa C: P. falciparumin sirkumsporotsoiittia vastaan valmistettu 20 Mab 4D9, Osa D: koleratoksiinin aminohapporyhmistä 5064 muodostuvaa peptidiä (CTP3-peptidiä) vastaan valmistettu seerumi. Plasmidien konstruktiot ja isäntäkannat on merkitty kunkin kanavan yläpuolelle. Kuvio 7. Malariasirkumsporotsoiitti (CS) -epitoop- 25 pia vastaan suunnatun vasta-aineen havaitseminen yhdistelmäflagelliiniproteineilla immunisoiduissa hiirissä. Hiiret immunisoitiin ja niille annettiin tehosterokotukset käyttäen osittain puhdistettuja villityyppisiä flagelloja (plasmidin ppx1650 koodaamia) tai yhdistelmäflagelloja, 30 jotka sisälsivät kaksi kappaletta P. berghein immunodominanttia CS-toistumaa (plasmidin ppx1661 koodaamia). Näistä eläimistä viikoilla 0, 4 ja 6 primaari - immunisoinnin jälkeen saaduista seerumeista valmistetuista sarjalaimennoksista määritettiin ELISA:lla niiden kyky sitoutua 35 synteettisiin peptideihin, jotka koostuivat kandesta kap-

17 paleesta P. berghein CS-toistumajaksoa, jotka oli kytketty reikäkotilon hemosyaniiniin (KHL). Esitetyt koetulokset ovat keskiarvoja, jotka on laskettu viiden eläinyksilön muodostamasta ryhmästä. a: plasmidi ppx1650 viikolla 0, b: 5 plasmidi ppx1650 viikolla 4, c: plasmidi ppx1650 viikolla 6, d: plasmidi ppx1661 viikolla 0, e: plasmidi ppx1650 viikolla 4, f: plasmidi ppx1661 viikolla 6. Kuvio 8. Malariasirkumsporotsoiitti (CS) -epitooppia vastaan suunnatun vasta-aineen havaitseminen f1agel- 10 liinin yhdistelmäfuusioproteiineja ilmentävällä elävällä heikennetyllä Salmonellalla immunisoiduissa hiirissä. Hiiret immunisoitiin ja niille annettiin tehosterokotukset esimerkissä 1 esitetyn tavan mukaisesti. Näistä eläimistä viikoilla 0, 4 ja 6 primaari-immunisoinnin jälkeen saa- 15 duista seerumeista valmistetuista sarjalaimennoksista määritettiin ELISA:lla niiden kyky sitoutua synteettisiin peptideihin, jotka koostuivat kandesta kappaleesta P. berghein CS-toistumajaksoa, jotka oli kytketty KHL:ään. Esitetyt koetulokset ovat keskiarvoja, jotka on laskettu 20 viiden eläinyksilön muodostamasta ryhmästä paitsi viikon 6 ollessa kyseessä, jolloin ryhmää kohti jäi vain yksi eläin. a: plasmidi ppx1650 viikolla 0, b: plasmidi ppx1650 viikolla 4, c: plasmidi ppx1650 viikolla 6, d: plasmidi ppx1661 viikolla 0, e: plasmidi ppx1650 viikolla 4, f: 25 plasmidi ppx1661 viikolla 6. Kuvio 9 esittää vasta-ainevasteet viidestä hiirestä, jotka oli immunisoitu SL5929:11ä, koleratoksiinin B- alayksikön CTP3-epitooppia ilmentävällä, formaliinilla tapetulla Salmonella dublin -rokotteella. 30 Kuvio 10 esittää HBsAg (ayw):n S-alueen ja esi-s 2 -alueen aminohappo- ja synteettiset oligonukleotidijaksot ja flagelliinigeenin kartan. Tummennettu alue edustaa suurta vaihtelua sisältävää aluetta. H on HindIII, R on EcoRV P on PstI ja K on KonI.

18 Kuvio 11 esittää kloonatut plasmidin pls405 rekombinantit. Kuvio 12 esittää vasta-ainevasteet kaneissa, jotka on immunisoitu lihaksensisäisesti elävällä S. dublin 5 SL5928:11a, joka on transformoitu S16:11a tai ps2l:lla. Kuvio 13 esittää vasta-ainevasteet hiirissä, jotka on immunisoitu suun kautta elävällä 5L5928:11a, joka ilmentää HBsAg-epitooppia. Kukin "X" edustaa yksittäisen hiiren vasta-ainetiitteriä. 10 Kuvio 14 esittää koetulokset, jotka on saatu, kun SJL-hiiret esikäsiteltiin yhdistelmäflagelloilla, villityypin flagelloilla tai CRM197-proteiinilla ja imurauhassolut stimuloitiin uudelleen in vitro synteettisellä peptidillä, joka koodaa CRM197-proteiinin aminohappoja Kuvio 15 esittää koetulokset, jotka on saatu käyttäen kuviossa 14 esitetyllä tavalla esikäsiteltyjä imurauhassoluja, jotka stimuloitiin puhdistetulla CRM197-proteiinilla. 20 Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Tämä keksintö liittyy flagelliinin yhdistelmärakennegeeneihin, jotka ilmentyvät flagelliinin yhdistelmäfuusioproteiineina. Nämä yhdistelmägeenit käsittävät jakson, joka koodaa flagelliinin rakennegeenin määräämää epi- 25 tooppia ja jakson, joka koodaa heterologisen organismin epitooppia, joka epitooppi on immunogeeninen vietäessä fuusioproteiini selkärankaisisäntään. Heterologisen organismin epitooppi voidaan liittää alueelle, joka koodaa flagelliinia mutta ei ole välttämätön tämän toiminnalle. 30 Tämän liittymäjakson ei kuitenkaan tule tehdä flagellaa toimintakyvyttömäksi. Edullisessa sovellutusmuodossa heterologisen organismin epitooppi voidaan liittää flagelliinin rakennegeenin suurta vaihtelua sisältävälle alueelle (esim. Salmonellan Hl-d-geenin luontaisten EcoRV-kohtien 35 väliin).

19 Tämä keksintö liittyy myös näiden geenien koodaamiin fuusioproteiineihin ja näiden geenien ja proteiinien käyttöön rokoteformulaatioissa, suojaamaan heterologisten organismien infektioita vastaan tai suojaamaan organismin 5 antigeenin aiheuttamia sairaustiloja tai tauteja vastaan. Tämän keksinnön mukaisesti tapahtuva ilmentäminen flagelliinin yhdistelmäfuusioproteiinina tarjoaa menetelmän minkä tahansa epitoopin esittämisen immunologiselle järjestelmälle immunogeenisessä muodossa immuunivasteiden stimu- 10 loimiseksi (joihin kuuluvat humoraalinen, limakalvojen ja /tai soluvälitteinen immuunivaste). Erityisessä sovellutusmuodossa voivat elävän rokotteen muodossa olevat heikennetyt elimistöön tunkeutumiskykyiset bakteerit ilmentää tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja yhdistelmäflagel- 15 liinigeenejä. Toisessa erityisessä sovellutusmuodossa voidaan flagelliinin yhdistelmäfuusioproteiineja formuloida käytettäväksi alayksikkörokotteina. Esimerkeissä yksityiskohtaisesti kuvatuissa tämän keksinnön mukaisissa erityisissä sovellutusmuodoissa il- 20 mennetään malarian sirkumsporotsoiittiantigeenien, koleratoksiinin B-alayksikön, hepatiitti-b:n pinta-antigeenin ja pinta-antigeenin esimuodon, rotaviruksen VP7-polypeptidiantigeenien, HIV:n vaippaglykoproteiinin ja Streptococcus pyogeneksen M-proteiinin epitooppeja flagelliinin yh- 25 distelmäfuusioproteiineissa, joista rakentuu toiminnallisia flagelloja ja jotka aiheuttavat heterologista epitooppia vastaan kohdistuvan immuunivasteen isäntänä olevassa selkärankaisyksilössä. Tässä kuvattu menetelmä voidaan yksinomaan kuvaa- 30 mistarkoituksissa jakaa seuraaviin yleisiin vaiheisiin: a. flagelliinigeenin eristäminen b. immunogeenisia epitooppeja koodaavien jaksojen eristäminen yhdistelmäflagelliineina tapahtuvaa ilmentämistä varten 35 c. yhdistelmäflagelliinigeenien konstruktio

20 d. ilmentäminen bakteeri-isännissä e. yhdistelmäflagelliin(e)ina ilmennetyn(tyjen) heterologis(te)n epitoopin(pien) immunologisen tehon määrittäminen 5 f. rokotteen formulaatio Tässä kuvataan lisäksi immuunivasteen aiheuttamismenetelmä (johon kuuluvat humoraalinen, limakalvojen ja/tai soluvälitteinen immuunivaste) antamalla selkärankaisisännälle fysiologisesti hyväksyttävässä kantaja-ai- 10 neessa olevaa bakteeria, joka on transfektoitu siten, että se ilmentää mainittua flagelliinin yhdistelmäfuusioproteiinia. Bakteeri on edullisesti elävä ja infektiokykyinen mutta ei voi aiheuttaa merkittävää tautia selkärankaisisännässä. Vaihtoehtoisesti voidaan isäntään antaa 15 pelkkää flagellan yhdistelmäfuusioproteiinia immuunivasteen aiheuttamiseksi. Sienten vastaisia aineita voidaan käyttää sienisairauksien ehkäisyyn ja näihin kuuluvat taulukossa 1 esitetyt sienet, esitettyihin kuitenkaan rajoittumatta. [Braude 20 et al., (1986), Infectious Diseases and Medical Microbiology, Feigin et al., (1987), Textbook of Pediatric Infectious Diseases 35, Mandell et al., (1985), Principles and Practice of Infectious Diseases, Osa F.]. Muihin rokotteiden käyttösovellutuksiin kuuluvat sellaisten hormoneja 25 vastaan suunnattujen vasteiden aiheuttaminen kuten raskauden ehkäisyn tehostaminen, elimistön tarvitsemien ravintoaineiden muuntokyvyn parantaminen ja hormonitasapainohäiriöt. Muihin käyttömuotoihin kuuluvat syövän hoito ja sen ennakolta ehkäisy, allergiaa vastaan suunnattu hoito ja 30 immunologisia sairauksia ennakolta ehkäisevien ja immunoterapeuttisten aineiden tuotanto. Flagelliinigeenin eristys Heterologisen epitoopin sisältävää flagelliinin fuusioproteiinia koodaavan yhdistelmägeenin konstruoimi- 35 seksi voidaan käyttää mitä tahansa flagelliinin rakenne-

21 geeniä. Näihin flagelliinigeeneihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, Salmonellan H1- ja H2-geenit, Bacillus subtiliksen ja Pseudomonas aeruginosan H- ja E. colin hag-geeni. 5 Useat flagelliinigeenit on kloonattu ja sekvenssoitu [ks. esim. Kuwajima, G., et al. (1986) J. Bact. 168, 1-479, Wei, L.-N. ja Joys, T. M., (1985) J. Mol Biol. 186, ja Gill, P. R. ja Agabian, N., (1983) J. Biol. Chem. 258, , jotka on liitetty tähän viit- 10 tauksella]. Jos kloonattu flagelliinigeeni ei ole saatavissa valmiina, se voidaan kloonata tunnetuilla vakiomenetelmillä [ks. esim. Maniatis, T., et al., (1982) Molecular Cloninq, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 15 Cold Spring Harbor, New York], käyttäen mitä tahansa flagellan sisältävää bakteerisolua, joka muodostaa molekulaariseen kloonaukseen tarvittavan potentiaalisen nukleiinihappolähteen. Näihin bakteereihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, Escherichia, Salmonella, Pro- 20 teus, Pseudomonas, Bacillus, Campylobacter, Vibrio, Treponema, Legionella, Clostridia ja Caulobacter. Kloonatun geenin nukleotidijakson analyysi voidaan suorittaa useilla tunnetuilla menetelmillä esim.[maxamin ja Gilbertin (1980) Meth. Enzymol. 65, ] menetelmällä, Sangerin di- 25 deoksimenetelmällä [Sanger, F., et al., (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463] tai automaattista DNA-sekvenointilaitetta käyttäen (esim. Applied Biosystems, Foster City, CA). Immunogeenisia epitooppeja koodaavien jaksojen 30 eristys niiden ilmentämiseksi yhdistelmäflagel- liineina Mikä tahansa DNA-jakso, joka koodaa heterologisen organismin epitooppia, joka flagelliinifuusioproteiinina ilmennettynä tuottaa suojaavan immuniteetin tätä organis- 35 mia vastaan tai antigeenin aiheuttamaa sairaustilaa tai

22 tautia vastaan, voidaan eristää tässä kuvatuissa rokoteformulaatioissa käytettäväksi. Edullisessa sovellutusmuodossa tämä organismi on patogeeninen mikro-organismi. Tämä heterologinen epitooppi voi esimerkiksi esiintyä baktee- 5 reissa, loisissa, viruksissa tai sienissä, jotka ovat taudinaiheuttajia. Lisäksi voidaan käyttää allergeenien ja syöpäsolujen epitooppeja. Näihin bakteereihin, loisiin, viruksiin tai sieniin kuuluvat taulukossa 1 luetellut organismit, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta. 10 Taulukko 1 15 Heterologiset organismit, joista DNA voidaan eristää flagelliinifuusioproteiinien konstruoimiseksi Loiset: Plasmodium spp. Eimeria spp. Schistosoma spp. 20 Trypanosoma spp. Babesia spp. Leishmania spp. Cryptosporidia spp. Toxoplasma spp. 25 Pneumocystis spp. Bakteerit: Vibrio cholerae Streptococcus pyogenes Neisseria menigitidis 30 Neisseria gonorrhoeae Corynebacteria diphtheriae Clostridium tetani Branhamella catarrhalis Bordetella pertussis 35 Haemophilus spp. (esim. influenzae)

23 Chlamydia spp. Enterotoksigeeninen Escherichia coli Virukset Ihmisen immuunipuutostautivirus, tyyppi I 5 Ihmisen immuunipuutostautivirus, tyyppi II Apinan immuunipuutostautivirus Ihmisen T-lymfosyyttivirus, tyyppi I, II ja III Respiratory syncytial -virus Hepatiitti-A -virus 10 Hepatiitti-B -virus Hepatiitti-C -virus Ei-A, ei-b-hepatiitti -virus Herpes simplex -virus, tyyppi I Herpes simplex -virus, tyyppi II 15 Sytomegalovirus Influenssavirus Parainfluenssavirus Poliovirus Rotavirus 20 Coronavirus Vihurirokkkovirus Tuhkarokkovirus Sikotautivirus Vesirokkovirus 25 Epstein Barr -virus Adnovirus Papilloomavirus Keltakuumevirus Sienet 30 Candida spp. (varsinkin albicans) Cryptococcus spp. (varsinkin neoformans) Blastomyces spp. (dermatitidis) Histoplasma spp. (varsinkin capsulatum) Coccidroides spp. (varsinkin immitis) 35 Paracoccidroides spp. (varsinkin brasiliensis) Aspergillus spp.

24 Toisessa sovellutusmuodossa voidaan nematodin antigeenin epitooppi ilmentää fuusioproteiinina antamaan suojaa näiden matojen aiheuttamia tauteja vastaan. Potentiaalisesti käyttökelpoiset antigeenit rokote- 5 formulaatoita varten voidaan tunnistaa useilla eri arviointiperusteilla, kuten antigeenin liittyminen patogeenin infektiokyvyn neutralointiin [Norrby, E., (1985) Yhteenveto teoksessa Vaccines 85, Lerner, R. A., R.M. Chanock ja F. Brown (toim.), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold 10 Spring Harbor, New York, pp ], sen tyyppi- tai ryhmäspesifisyys, potilaan antiseerumin tai immuunijärjestelmän solujen kyky tunnistaa kyseinen antigeeni ja/tai antigeeniä vastaan spesifisten antiseerumien tai immuunijärjestelmän solujen suojaavien vaikutusten osoittaminen. 15 Lisäksi antigeenin koodaamassa epitoopissa tulisi lisäksi saman patogeenin eri isolaatioissa esiintyä edullisesti vähäistä ajan mittaan ilmenevää antigeenivaihtelua tai tämän tulisi puuttua täysin. Edullisessa sovellutusmuodossa heterologinen jakso 20 koodaa patogeenin immunogeenisesti tehokasta määräävää epitooppia. Lisäksi molekyylit, jotka ovat hapteeneja (ts. antigeenisia mutta eivät immunogeenisia) voidaan myös ilmentää yhdistelmäflagelliinina, koska flagelliini voi toimia kantajamolekyylinä, jonka läsnäolo tekee hapteenin 25 immunogeeniseksi. Yhdistelmäflagelliineilla, jotka sisältävät vasta-aineen kanssa reaktiokykyisiä epitooppeja mutta jotka eivät kykene aiheuttamaan immuunivasteita, on kuitenkin potentiaalista käyttöä immuunimäärityksissä. Peptidit tai proteiinit, joiden tiedetään sisältä- 30 vän antigeenisia determinantteja, voidaan liittää yhdistelmäflagelliineihin. Jos jotkin tietyt antigeenit ovat tuntemattomia, on suoritettava immunologisesti reagoivien jaksojen tunnistus ja luonnehtiminen. Yksi tapa tämän suorittamiseksi on käyttää monoklonaalisia vasta-aineita, 35 jotka on muodostettu patogeenin pinta- tai muita molekyy-

25 lejä vastaan. Peptidijaksoja, joita vasta-aineet kykenevät tunnistamaan, kutsutaan epitoopeiksi. Vaihtoehtoisesti voidaan kantajamolekyyleihin liitetyistä pienistä peptideistä testata niiden kyky aikaansaada sellaisten mono- 5 klonaalisten vasta-aineiden muodostuminen, jotka sitoutuvat peptidiä vastaaviin kohtiin täysimittaisessa proteiinissa [ks. esim. Wilson, I.A., et al., (1984), Cell 37, 767]. Tämän keksinnön piiriin kuuluvat myös muut tällä alalla tunnetut keinot, joita voidaan käyttää antigeenis- 10 ten determinanttien tunnistamiseen ja luonnehtimiseen. Yhdessä erityisessä sovellutusmuodossa voidaan tämän keksinnön mukaista käyttöä varten eristää mikä tahansa DNA-jakso, joka koodaa Plasmodiumin epitooppia, joka flagelliinin fuusioproteiinina ilmentyessään on immunogeeni- 15 nen selkärankaisisännässä. DNA-lähteiksi soveltuviin Plasmodium-lajeihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, ihmisen malariaparasiitit P. falciparum, P. malariae, P. ovale, P. vivax ja eläinten malariaparasiitit P. berghei, p. yoelii, P. knowlesi ja P. cynomolgi. Anti- 20 geenit tai niiden fragmentit, joita voidaan ilmentää flagelliinin fuusioproteiineina, ovat antigeenejä, joita malariaparasiitti ilmentää missä tahansa elinkiertonsa vaiheessa, kuten sporotsoiittivaiheessa, eksoerytsosyyttivaiheessa (kehittyminen maksan parenkyymisoluissa), aseksuaa- 25 lisessa erytrosyyttivaiheessa tai seksuaalisissa vaiheissa (ts. gameetti-, tsygootti- tai ookineettisessä vaiheessa). Yhdessä erityisessä sovellutusmuodossa ilmennettävä heterologinen epitooppi on Plasmodium-lajin sirkumsporotsoiitti (CS) -proteiini (ks. esim. 1). Analogisia CS-proteiine- 30 ja on tunnistettu kaikkien testattujen Plasmodium-lajien sporotsoiittien pinnoilla. Heikennetyissä Salmonella-lajeissailmennettyjäsirkumsporotsoiittiproteiiniantigeenejä voidaan käyttää elävinä rokotteina, jotka on suunnattu sporotsoiitteja vastaan, jotka ovat naaraspuolisen Anophe- 35 les-moskiiton välityksellä siirtyvän malariaparasiitin

26 elimistöön tunkeutuva muoto. Mitä tahansa sellaisella CSproteiinin alueella olevaa epitooppia, joka on tärkeä suojaavan humoraalisen tai soluvälitteisen immuunivasteen induktiossa, voidaan käyttää tässä esitetyissä rokotefor- 5 mulaatioissa. [Ks. esim. Dame, J.B., et al., (1984) Science 225, 593, Arnot, D.D., et al., (1985) Science 230, 815, Weber et al., (1987) Exp. Parasitol. 63, 295, Enea, V., et al., (1984) Science 225, 628, Enea, V., et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7520, Godson, G.N. et 10 al., (1983) Nature 305, 29 ja McCutchan, T.F., et al., (1985) Science 230, 1381, jotka viitteet on liitetty tähän hakemukseen viittauksena]. Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut yhdistelmäbakteerit voivat esimerkiksi yhdessä sovellutusmuodossa ilmentää peptidiä asn-ala-asn-pro, joka 15 edustaa P. falciparumin immunodominanttia toistuvaa CSepitooppia. Toisessa sovellutusmuodossa voidaan ilmentää peptidiä asp-pro-ala-pro-pro-asn-ala-asn, joka edustaa P. berghein CS-proteiinin immunodominanttia toistuvaa epitooppia. Vielä yhdessä erityisessä sovellutusmuodossa voi- 20 daan ilmentää P. falciparumin CS-proteiinin Th2R-epitooppia [Good, M.F., et al., (1987) Science 235, 1059] flagelliinin yhdistelmäproteiinina rokoteformulaatoissa. Vielä yhdessä sovellutusmuodossa flagelliinin yhdistelmäfuusioproteiinina ilmennettävä heterologinen epitooppi 25 käsittää koleratoksiinin B-alayksikön peptidin. Julkaisussa Jacob et al. kuvataan sopivia peptidejä. Kuten julkaisussa [Jacob et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 7611] kuvataan, on syntetisoituja peptidejä, jotka vastaavat koleratoksiinin B-alayksikön useita aluei- 30 ta ja nämä on liitetty immunogeeniseen kantaja-aineeseen yritettäessä määrittää ne epitoopit, jotka aiheuttavat neutraloivien vasta-aineiden syntymisen. Kun näitä konjugaatteja käytettiin synnyttämään vasta-aineita kaniineissa, osoitettiin niistä yhden, aminohappoja vastaa- 35 van (peptidin CTP3) aiheuttavan sellaisten vasta-aineiden

27 muodostumisen, jotka tunnistivat natiivin toksiinin ja neutraloivat kokonaisen toksiinin sekä biokemiallisen (adenylaattisyklaasin aktivaatio) ja biologisen (nesteen eristys suolesta) vaikutuksen. [Jacob, C.O. et al., (1984) 5 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7893]. Muihin epitooppeihin, joita voidaan ilmentää flagelliinin fuusioproteiineina, kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, seuraavat epitoopit: respiratory syncytial viruksen (RSV) G-proteiinin epitoopit [Collins 10 et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7683], poliovirus I:n VP1:ssä olevat neutraloivat epitoopit [Emini, E., et al., (1983) Nature 304, 699], HIV I:n vaipan glykoproteiineissa olevat neutraloivat epitoopit [Putney, S.D., et al., (1986) Science 234, ], Hepa- 15 tiitti - B:n pinta-antigeenissa olevat epitoopit [Itoh, Y., et al., (1986) Nature 308, 19, Neurath., A.R., et al., (1986) Vaccine 4, 34], difteriatoksiinin epitoopit [Audibert, F., et al., (1981) Nature 289, 543], streptococcuksen 24M-epitooppi [Beachey, E.H., (1985) Adv. Exp. 20 Med. Biol. 185, 193], ja gonokokkien piliinissä olevat epitoopit [Rothbard, J.B. ja Schoolnik, G.K., (1985) Adv. Exp. Med. Biol. 185, 247]. Tässä kuvatuissa rokoteformulaatioissa käytettävät flagelliinin fuusioproteiinit voivat myös käsittää hetero- 25 logisen organismin epitoopin, joka sitten kun fuusioproteiini on viety selkärankaisisäntään, aiheuttaa immuunivasteen, joka antaa suojan epitooppia sisältävän antigeenin aiheuttamaa sairaustilaa tai tautia vastaan. Esimerkiksi tässä tämän keksinnön mukaisessa sovellutusmuo- 30 dossa voidaan käyttää flagelliinin fuusioproteiineja, jotka koodaavat käärmeen myrkyn, mehiläisen myrkyn, hormonin, sperman, (ehkäisyä varten), allergiaa aiheuttavan antigeenin tai minkä tahansa muun antigeenin epitooppia, jota vastaan immuunivasteen halutaan syntyvän. Yhdessä erityi- 35 sessä sovellutusmuodossa voidaan ilmentää rasvasolujen

28 kalvossa olevan antigeenin epitooppia flagelliinin yhdistelmäproteiinina sellaisen rokotteen formuloimiseksi, joka vähentää ravintona käytettävien eläinten rasvapitoisuutta. Toisessa sovellutusmuodossa voidaan flagelliinin yhdistel- 5 mäfuusioproteiinina ilmentää tuumorispesifistä antigeenia suojaavan immuunivasteen synnyttämiseksi syöpää vastaan. Vielä yhdessä sovellutusmuodossa voidaan bakteerin enterotoksiinin epitooppia myös ilmentää flagelliinifuusioproteiinina. Useiden bakteerien enterotoksiinien nukleotidijak- 10 sot ja niistä johdetut aminohappojaksot on määritetty [Mekalanos, J.J., et al., (1983 Nature 306, 551, Leong, J., et al., (1985) Infect. Immun. 48, 73]. Toisessa tämän keksinnön mukaisessa sovellutusmuodossa useita B-solujen epitooppeja sisältäviä laajoja pro- 15 teiinialueita koodaavia DNA-jaksoja (ts. kiertävien vastaaineiden välittämän immuunivasteen induktioon kykeneviä epitooppeja) voidaan liittää flagelliinigeeniin ilmennettäväksi flagelliinin fuusioproteiineina. Luontaisia T-auttajasoluepitooppeja sekä vasta-aineita synnyttäviä epi- 20 tooppeja käyttämällä voidaan siten suorittaa esikäsittely, josta seuraa immuunivasteen nopea kohoaminen potilaan joutuessa kosketuksiin patogeenisen heterologisen organismin kanssa. Tämän keksinnön mukaisesti valmistettuna yhdistel- 25 mäflagelliinina ilmennettävää heterologista epitooppia koodaavat geenijaksot voidaan eristää tunnetuilla menetelmillä ja näihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, puhdistus mikro-organismin genomin DNA:sta, mikro-organismin RNA:sta tapahtuva cdna:n systeesi, yhdistel- 30 mä - DNA -menetelmät (Maniatis, T., et al., (1982) Molecular Cloninq, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) tai kemiallinen syntee- si.