(12) PATENTTIJULKAISU PATENTSKRIFT (10) FI B. (51) Kv.lk.6 - Int.k1.6. (21) Patenttihakemus - Patentansökning

Transkriptio

1 F1000B (12) PATENTTIJULKAISU PATENTSKRIFT (10) FI B (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats SUOMI-FINLAND (FI) Patentti- ja rekisterihallitus Patent- och registerstyrelsen (51) Kv.lk.6 - Int.k1.6 C 07K 14/115, C 12N 15/4 A 61K 39/155, C 12N 7/005, 15/63, (21) Patenttihakemus - Patentansökning (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag (24) Alkupäivä - Löpdag (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig (86) Kv. hakemus - Int. ansökan PCT/US88/03784 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet US P (73) Haltija - Innehavare 1. Pharmacia & Upjohn Company, 301 Henrietta Street, Kalamazoo, MI 49001, USA, (US) (72) Keksijä - Uppfinnare 1. Wathen, Michael, 3183 St. Anthony Drive, Portage, MI 49002, USA, (US) (74) Asiamies - Ombud: Berggren Oy Ab, Jaakonkatu 3 A, Helsinki (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Ilmentåmisjärjestelmä ihmisen respiratory syncytial -viruksen glykoproteiinien immunogeenisia fragmentteja sisältäviä kimeerisiå glykoproteiineja varten Expressionssystem för kimeriska glykoproteiner innehållande immunogeniska fragment av glykoproteiner av människans respiratory syncytial -virus (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer WO A 87/04185 (C 12N 15/00), WPJ abst. nro , Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol pp , Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol pp (57) Tiivistelmä - Sammandrag Tämä keksintö käsittää DNA-koostumuksia, jotka Denna uppfinning avser DNA-kompositioner, som koodaavat uusia kimeerisiä glykoproteiineja, kodar nya kimeriska glykoproteiner användbara jotka ovat käyttökelpoisia viruskohtaisten för producering av virus specifika immunsvar immuunivasteiden valmistamiseen ihmisen respi- mot människans respiratory syncytial -virus. ratory syncytial -virusta vastaan. DNA-koos- DNA-kompositionerna innefattar strukturgener, tumuksiin kuuluvat glykoproteiineja koodaavat som kodar glykoproteiner, och expressions- och rakennegeenit ja rakennegeenejä sisältävät replikationsplasmider, som innehåller strukilmentämis- ja lisääntymisplasmidit. Näillä turgener. Värdceller transformerade med dessa DNA-koostumuksilla transformoidut isäntäsolut, DNA-kompositioner, vaccin framställda från glykoproteiineista valmistetut rokotteet ja glykoproteiner och förfarande för skyddning menetelmät ihmisten suojaamiseksi mainituilla av människor genom vaccinering med nämnda vacrokotteilla rokottamalla ovat myös osa tätä cin, är också en del av denna uppfinning. keksintöä.

2 Ilmentämisjärjestelmä ihmisen respiratory syncytial -viruk- 5 sen glykoproteiinien immunogeenisia fragmentteja sisältäviä kimeerisiä glykoproteiineja varten Tämä keksintö käsittää DNA-koostumukset, jotka koodaavat uu- 10 sia kimeerisiä glykoproteiineja, jotka ovat käyttökelpoisia virusspesifisten immuunivasteiden valmistamiseksi ihmisen respiratory syncytial -virusta, HRSV:a, vastaan. Näihin DNAkoostumuksiin kuuluvat glykoproteiineja koodaavat rakennegeenit ja rakennegeenejä sisältävät ilmentämis- ja lisäänty- 15 misplasmidit. HRSV löydettiin v ja se esiintyy maailmanlaajuisesti. Se aiheuttaa erityisesti pikkulasten ja nuorten lasten ylempien ja alempien hengitysteiden sairauksia. Noin 30 %:11a 20 sairaalahoitoon tulleista nuorista lapsista, joilla ilmenee äkillisiä hengitystiesairauksia, on respiratory syncytial -virusinfektio. Vanhemmilla lapsilla ja aikuisilla sairaus on lievempi. Pikkulapsilla tämä vakava sairaus vaatii usein sairaalahoitoa. 25 Respiratory syncytial -virusinfektioita tavataan hengitysteiden kaikissa osissa, niihin liittyy usein kuume, yskä, nuha ja heikotus ja ne diagnostisoidaan kliinisesti keuhkoputken tulehdukseksi, pienen keuhkoputken tulehdukseksi, 30 keuhkokuumeeksi, kuristustaudiksi tai virusinfektioksi. Vanhemmilla lapsilla ja aikuisilla virus rajoittuu yleensä niin, että se lisääntyy vain ylemmissä hengitysteissä. Pikkulapsilla sairaus voi olla vakavampi, kun virus leviää keuhkoihin. Keuhkovaurio voi olla pysyvä. 35

3 2 Respiratory syncytial -viruksen primääri-infektio tapahtuu varhaislapsuudessa, usein ennen 4. ikävuotta. Lapsilla tämän viruksen aiheuttama sairaus pyrkii esiintymään ainakin kerran vuodessa melko terävinä, useita kuu- 5 kausia kestävinä äkillisinä puhkeamisina. Epidemiat rajoittuvat selvästi ja niiden kesto on yleensä noin 3-5 kuukautta. Perhetutkimuksissa on havaittu, että ensimmäisiä kouluvuosiaan käyvät lapset tuovat kotiin viruksen, joka infektoi nuorempia perheenjäseniä muita per- 10 heenjäseniä vakavammin. Infektion kliiniset seuraukset ovat vakavampia, kun infektio kohtaa ensimmäisen kerran ja ne käyvät lievemmiksi vanhemmilla henkilöillä, jotka ovat immunologisesti kokeneita. 15 Respiratory syncytial -viruksen sekundäärivaikutukset voivat vaihdella havaitsemattomasta infektiosta vakavaan keuhkokuumeeseen ja kuolemaan. Useimmat oireet ovat seurausta hengitysteiden tulehtumisesta. Täydellinen parantuminen tapahtuu useimmissa tapauksissa yhdestä kolmeen 20 viikon aikana ja tähän liittyy vasta-aineen tuotto, joka näyttää kestävän koko eliniän. Yhdysvalloissa noin 30 %: lla yksivuotiaista ja 95 %:11a viisivuotiaista lapsista on kiertävä respiratory syncytial -virusvasta-aine. Myöhemmät infektiot vasta-aineen omaavilla vanhemmilla pik- 25 kulapsilla, lapsilla ja aikuisilla ovat enimmiltään lieviä, nuhan muodossa esiintyviä ylempien hengitysteiden sairauksia. Vaikka viruksen pienet saaliit soluviljelmistä ovat estä- 30 neet HRSV-tutkimusta, virus on tarkoin tutkittu. HRSV on paramyksovirus, joka sisältää yhden RNA:sta muodostuvan negatiivisen nauhan, josta tapahtuu transkriptio 10:een pääasiallisesti monokistroniseen lähetti-rna-molekyyliin. Lähetti-RNA-molekyylit on eristetty ja niitä on käytetty 35 translaatioon in vitro. Tuotteet on luonnehdittu geelielektroforeesilla, peptidikartoituksella ja immunosaostuksella samanlaisiksi kuin ne rakenneproteiinit, jotka on eristetty virioneista. Rakenneproteiineihin kuuluvat nukleokapsidin runsain proteiini (N; mp. noin 42000),

4 3 nukleokapsidin fosfoproteiini (P; mp. noin 34000), nukleokapsidin suuri proteiini (L; mp. noin ) ja vaipan matriisiproteiini (M; mp. noin 26000), matriisin glykoproteiini (noin 22000) ja kaksi vaipan glykoproteiinia, 5 fuusioglykoproteiini (F;, mp. noin ) ja toinen, vähämetioniininen glykoproteiini (G; mp. noin ). Lisäksi infektoituneissa soluissa tiedetään esiintyvän viruksen koodaama, noin 9500 daltonin proteiini ja muita pieniä proteiineja, Collins et al., 10 (1984), Identification of a tenth mrna of HRSV and assignment of polypeptides to the 10 viral genes, J. of Virol. 49, , ja tässä siteeratut viitteet. HSRV:n molekyylibiologiaa kuvaaviin muihin tutkimuksiin kuuluvat: (1) Collins et al., (1984), Nucleotide sequen- 15 ce of the gene encoding the fusion (F) glycoprotein of human respiratory syncytial virus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, , joka kuvaa F-glykoproteiinia vastaavan geenijakson; (2) Collins et al., (1985), The 1A Protein Gene of Human Respiratory Syncytial Virus: 20 Nucleotide Sequence of the mrna and a Related Polycistronic Transcript, Virology 141, , joka kuvaa 1Aproteiinia vastaavan geenijakson; (3) Collins et al., (1985), The Envelope-Associated 22K Protein of Human Respiratory Syncytial Virus: Nucleotide sequence of the mrna 25 and a Related Polytranscript, J. of Virol. 54(1) 65-71, joka kuvaa 22K proteiinia vastaavan geenijakson; (4) Wertz et al., (1985) Nucleotide sequence of the G protein gene of human respiratory syncytial virus reveals an unusual type of viral membrane protein, Proc. Natl. Acad. 30 Sci. USA, 82, , joka kuvaa G-glykoproteiinia vastaavan geenijakson; ja (5) Collins et al., (1985), Correct Sequence for the Major Nucleocapsid Protein mrna of Human Respiratory Syncytial Virus, Virology 146, 69-77, joka kuvaa w-proteiinia vastaavan geenijakson. 35 HRSV:n F- ja G-glykoproteiineilla on samanlaiset vastineet muissa paramyksoviruksissa. Muilla paramyksoviruksilla on HRSV:n tavoin F-glykoproteiini, joka liittyy solukalvoihin kohdistuvaan fuusioon, Choppin, P.W. ja A.

5 4 Scheid (1980) Rev. Infect. Dis. 2, 40-61; Merz et al., (1980) J. Exp. Med. 151, Aktiivinen paramyksoviruksen F-proteiini käsittää kaksi disulfidisidoksen kytkemää alayksikköä F 1 ja F 2, jotka syntyvät inaktiivi- 5 sesta esiasteesta (F 0 ) solujen proteaasien suorittamalla spesifisellä sisäisellä pilkkoutumisella, Scheid ja Choppin, (1977) Virol. 80, Useimpien paramyksovirusten toista runsaana esiintyvää glykoproteiinia nimitetään HN-proteiiniksi ja se liittyy näiden virusten hemag- 10 glutiniini- ja neuraminidaasiaktiivisuuksiin. Vaikka HRSV:n G-proteiinilla ei ole näitä entsymaattisia aktiivisuuksia, sekä G- että HN-glykoproteiinit liittyvät viruksen kiinnittymiseen soluihin. Nämä glykoproteiinit ovat myös rakenteellisesti samankaltaisia siten, että 15 niiden aminoterminaalisessa päässä on epätavallinen hydrofobinen signaali/ankkuroitumisalue, Wertz et al., (1985) PNAS 82, ; Elango et al., (1986) J. Virol. 57, HRSV:a vastaan ei ole saatavilla tehokkaita rokotteita. On tehty monia yrityksiä tehokkaan rokotteen aikaansaamiseksi HRSV:a vastaan. Friedewald et al., (1968) Journal of the American Medical Association 204, kuvaavat respiratory syncytial -viruksen lisäämistä naudan al- 25 kion munuaiskudosviljelmässä. Viruksen, jota oli kasvatettu 34 C:n tai 28 C:n lämpötilassa, infektiivisyys tai virulenssi eivät vähentyneet. HRSV:a, jota oli kasvatettu 26 C:ssa, ei voitu harkita aikuisten infektion estämiseen, koska viruksella oli rajoitettu infektiivi- 30 syys ja se oli heikosti immunogeeninen, vaikka siihen liittyvä infektiivisyys aikuisia kohtaan oli alentunut. Kim et al., (1971) Pediatrics 48, , kuvaa sen, että 26 C:ssa kasvatetusta viruksesta valmistettu inak- 35 tivoitu respiratory syncytial -virusrokote herätti seerumin vasta-aineiden kehittymisen korkealle tasolle pikkulapsissa ja lapsissa, jotka olivat iältään 6 kk - 13 v. mutta se ei estänyt infektiota.

6 5 Julkaisu McIntosh et al., (1974) Pediatric Research 8, käsittelee kahta kokeellista elävää respiratory syncytial -virusrokotetta, joista yksi oli valmistettu 26 5 C:ssa kasvatetusta viruksesta ja toinen oli valmistettu lämpötilaherkästä mutantista, joka kasvoi hyvin 32 C:ssa eikä ollenkaan 37 C:ssa tai tätä korkeammassa lämpötilassa. Ensimmäinen rokote oli epätyydyttävä, koska se ei suojannut infektiota vastaan, kun rokotuksen ja altistuk- 10 sen väli oli pidempi kuin neljä kuukautta. Toinen rokote oli epätyydyttävä, koska siitä joissakin rokotteissa nähtävästi katosi lämpötilaherkkyys. Craighead, (1975) Journal of Infectious Diseases 131, , käsittelevät v suoritettuja kokeita, joissa useat tutkijaryhmät testasivat pikkulapsiin ja nuoriin lapsiin formaldehydikäsiteltyä ja alunalla saostettua virusta, joka oli kasvatettu kudosviljelmässä. Altistet- taessa myöhemmin villityypin virukselle rokotteen saa- 20 neissa yksilöissä esiintyi hengitysteiden taudinkulku terävöityneenä. Craighead tekee sen johtopäätöksen, että formaldehydikäsitellyllä viruksella suoritettu immuni-. sointi lisäsi taudin vakavuutta Wright et al., (1976) Journal of Pediatrics 88, , kuvaa lämpötilaherkän, elävän ja heikennetyn respiratory syncytial -virusrokotteen arviointia pikkulapsissa. Kun tämä rokote sellaisella annostasolla annosteltuna, että se infektoi kaikki seronegatiiviset pikkulap- 30 set, aiheutti lievän ylempien hengitysteiden sairauden, annoksen alentamisella ei päästy hyväksyttävään infektoitumistasoon. Virus oli myös geneettisesti pysymätön, koska oli todistetta lämpötilaherkkyyden katoamisesta yhdessä rokotteessa. Ei esiintynyt todisteita luonnolli- 35 sen sairauden voimistumisesta tämän rokotteen kyseessäollessa, ja rokotetuilla esiintyi uusia infektioita. US-patentit n:o ja kuvaavat menetel- män virioneiden heikentämiseksi jatkoviljelyllä ihmisen

7 6 diploidien keuhkofibroblastien kautta ja US-patentti n:o kuvaa menetelmän immunogeenisesti aktiivisten HRSV-proteiinien tuottamiseksi virukselle herkkien soluviljelmässä kasvatettujen solujen pintaan. Näitä soluja anne- 5 taan ruiskeina isäntäån immuunivasteen aikaansaamiseksi. Yhdistelmä-DNA-tekniikkaan perustuvan vacciniavirus-ilmentämisjärjestelmän tiedetään ilmentåvän HRSV:n G- ja F-glyko- proteiineja erillisinä, Bally Pt al, (1986), Expression of 10 the Major Glycoprotein G of Human Respiratory Syncytial Virus from Recombinant Vaccinia Virus Vectors, P.N.A.S., USA, 83, ja Olmsted et al., (1986) Expression of the F Glycoprotein Respiratory Syncytial Virus by a Recombinant Vaccinia Virus: Comparison of the Individual Contribu- 15 tions of the F and G Glycoproteins to Host Immunity P.N.A.S., USA, 83, Näiden kanden glykoproteiinin osoitettiin myös synnyttävän immunosuojauksen nisäkkäissä annettaessa elävää HRSV-virusta, Stott Pt a1, (1986), Human Respiratory Syncytial Virus Glycoprotein G Expressed 20 from Recombinant Vaccinia Virus Vector protects Mice Against Live-Virus Challenge, Journal of Virology 67, ; Walsh pt al., (1987) Immunization with Glycoprotein subunits of Respiratory Syncytial Virus to Protect Cotton Rats Against Viral Infection, Journal of Infectious Diseases ; Wertz pt al, (1987), Expression of the Fusion. Protein of Human Respiratory Syncytial Virus From Recombi- nant Vaccinia Virus Vectors and Protection of Vaccinated Mice, Journal of Virology, ; Elango Pt al, (1986) Resistance to Human Respiratory Syncytial Virus (RSV) Infec- 30 tion Induced by Immunization of Cotton Rats with a Recombi- nant Vaccinia Virus Expressing the RSV G Glycoprotein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Tämä keksintö koskee ilmentämisjärjestelmää käsittäen DNA- 35 jakson, joka kykenee ilmentämäån polypeptidiä, joka käsittää

8 7 5 signaalijakson ja ainakin yhden immunogeenisen osan ihmisen respiratory syncytial -viruksen molemmista glykoproteiineista F ja G. Tämän proteiinin valmistaminen yhdistelmä- DNA-tekniikan keinoin on myös osa tätä keksintöä. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa. Tässä kuvauksessa käytetään seuraavassa määriteltyjä käsit- 10 teitä. Ilmaisu "soluviljelmå" viittaa monisoluisesta kasvista tai eläimestä peräisin olevien solujen kasvattamiseen tarkoitettuun ympäristöön, jossa solut voivat pysyä elinky- kyisinä alkuperäisen kasvin tai eläimen ulkopuolella. Käsite "jäljempi" identifioi jaksot, jotka jatkuvat ilmentämissuun- 15 taan kauempana; esimerkiksi koodaava alue on myöhempänä aloituskoodisanan suhteen. Käsitteeseen "mikro-organismi" kuuluvat sekä yksisoluiset esitumalliset että aitotumaiset organismit, kuten bakteerit, aktinomykeetit ja hiivat. Käsi- te "operoni" on täydellinen geenien ilmestymisen ja säätelyn 20 yksikkö, joka sisältää rakennegeenit, säätelygeenit ja DNA:ssa olevat, säätelygeenien tuotteiden tunnistamat kontrolloivat elementit. Käsite "plasmidi" tarkoittaa itsenäistä, itsenäisesti kandentuvaa kromosomin ulkopuolista rengasmaista DNA:ta ja se kattaa sekä ilmentämistyypit että sel- 25 laiset tyypit, joita ei ilmennetä. Kun yhdistelmä-dnatekniikalla valmistetun mikro-organismin tai soluviljelmän kuvataan olevan isäntänä ilmentämisplasmidille, ilmaisuun "ilmentämisplasmidi" kuuluvat sekä kromosomin ulkopuolinen rengasmainen DNA että se DNA, joka on liittynyt isännän kro- 30 mosom(e)i(h)in. Kun plasmidi säilyy isäntäsolussaan, se kahdentuu stabiilisti solujen toimesta mitoosin aikana joko it- senäisenä rakenteena tai isännän genomiin liittyneenä osana. Käsite "promoottori" on DNA-alue, joka osallistuu RNA-polymeraasin sitomiseen transkription aloittamiseksi. Ilmaisu

9 8 "DNA-jakso" viittaa yksi- tai kaksinauhaiseen DNA-molekyyliin, joka käsittää nukleotidiemäkset adenosiini, tymidiini, sytosiini ja guanosiini. Ilmaisu "oleellisen puhdas" viittaa proteiinikoostumukseen, joka ei sisällä mitään muuta para- 5 myksovirusproteiinia kuin haluttua yhdistelmä-dna-tekniikalla valmistettua kimeeristä glykoproteiinia. Vaikka oleellisen puhtaat proteiinit voivat olla kontaminoituneita pienillä määrillä solun ainesosia, proteiinissa ei esiinny kandentuvien paramyksovirusten tuottamia kontaminoivia viruksen 10 rakenneproteiineihin kuulumattomia proteiineja. Ilmaisu "sopiva isäntä" viittaa soluviljelmään tai mikro-organismiin, joka on yhteensopiva yhdistelmäplasmidin kanssa ja sallii plasmidin kandentumisen, liittymisen genomiinsa tai tämän ilmentämisen. Ilmaisu "edeltävä" identifioi jaksot, 15 jotka jatkuvat ilmentymisen suunnan suhteen päinvastaiseen suuntaan, esimerkiksi bakteerien promoottori on transkriptioyksikköä edeltävä ja aloituskoodisana on koodaavaa aluetta edeltävä. 20 Tämä keksintö sisältää sarjan molekyyligeneettisiä käsittelyjä, jotka voidaan suorittaa monilla eri tunnetuilla tavoilla. Pääkohdittain nämä käsittelyt ovat proteiinin cdna:n käsille saaminen, cdna:n kloonaus ja kandentuminen F. colls- sa ja halutun cdna:n ilmentåminen sopivassa isännässå. Seu- 25 raavissa kuvauksissa esitetään yksityiskohtaisesti eri menetelmät, jotka ovat käytettävissä proteiinien ilmentämiseen ja näitä seuraavat yksityiskohtaiset esimerkit edullisista menetelmistä. Tätä nimenomaista polypeptidiä, FG-glykoproteiinia vastaava spesifinen jakso ja emästen numeroinnissa 30 käytetyt asemat on esitetty kaaviossa 9. Tässä keksinnössä tarvittavat nimistö ja yleiset laboratoriomenetelmät ovat teoksessa Maniatis Pr al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, (Maniatis).

10 9 Kaikki E. coli -kannat kasvatetaan Luria -lihaliemessä (LB) glukoosin kanssa, Difcon Antibiotic Medium #2:ssa ja M9-kasvatusliuoksessa, joka on täydennetty glukoosilla ja happohydrolysoiduilla kaseiiniaminohapoilla. Antibioo- 5 teille vastustuskykyisten kantojen elatus tapahtui niissä 10 lääkeainepitoisuuksissa, jotka on kuvattu Maniatisin teoksessa. Transformaatiot suoritettiin menetelmällä, joka on kuvattu julkaisussa Rowekamp ja Firtel, (1980) Dev. Biol. 79, Kaikkia entsyymejä käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Transformantit analysoitiin pesäkehybridisaatiolla julkaisussa Grunstein ja Vallis, Methods in Enzymology 68, kuvatulla tavalla. 15 Hybridisaation jälkeen koettimet poistettiin ja otettiin talteen ja suodattimet pestiin liuoksella, joka sisälsi 0,1 % SDS ja 0,2 x SSC, yhteensä 3 tunnin ajan vaihtaen 400 ml erät viidesti. Suodattimet kuivattiin täysin, 20 kiinnitettiin ja niille tehtiin autoradiografia käyttäen Kodak X-OMAT AR filmiä ja Dupont Cronex Lightnening Plus vahvistusverkkoja 16 tunnin ajan -70 C:ssa. Plasmidien sekvenssointia varten valmistettiin puhdistet- 25 tu plasmidi-dna Maniatisin teoksessa esitetyn kuvauksen mukaan. Pääteleimatut DNA-fragmentit valmistettiin ja analysoitiin Maxamin ja Gilbertin kemiallisilla sekvenssointimenetelmillä käyttäen julkaisussa Collins ja Wertz 30 (1985) J. Virol. 54, kuvattuja muunnoksia. Nukleotidien koko on ilmoitettu joko kiloemäksinä (ke.) tai emäspareina (ep.). Nämä ovat agaroosigeelielektroforeesista saatuja arvioita. 35 Ensimmäinen vaihe proteiinin ilmentymisen aikaansaamiseksi on saada proteiinia koodaava DNA-jakso cdna-klooneista. Tämä jakso kloonataan sitten ilmentämisplasmidiin, joka kykenee ohjaamaan geenin transkriptiota ja joka sallii transkriptiotuotteen toimimisen tehokkaasti

11 10 translaatiossa. Proteiinia koodaavan cdna:n saaminen kirjastomenetelmällä on kuvattu yleisesti Maniatisin teoksessa ja täsmällisesti julkaisussa Collins ja Wertz, (1983), cdna Cloning and Transcriptional Mapping of Nine 5 Polyadenylated RNA:s Encoded by the Genome of HRSV, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, ja tähän yhteyteen kuuluvissa dokumenteissa Elango et al., (1986) Resistance to Human Respiratory Syncytial Virus (RSV) Infection Induced by Immunization of Cotton Rats with a Recombinant 10 Vaccinia Virus Rxpressing the RSV G Glycoprotein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ja Olmstead et al., (19-86) Expression of the F Glycoprotein Respiratory Syncytial Virus by a Recombinant Vaccinia Virus: Comparison of the Individual Contributions of the F and G Glycoproteins 15 to Host Immunity, P.N.A.S., USA, 83, :.. Kloonit valmistetaan liittämällä cdna PstI-pilkottuun pbr322:een, johon on entsymaattisesti liitetty dgtp-homo- polymeeriulokkeet pilkkoutumiskohdan 3'-päihin. dctp- 20 homopolymeeriulokkeet liitetään entsymaattisesti cdnamolekyylien 3'-päihin Maniatisin teoksessa kuvattujen menetelmien mukaan. Ihanteellisessa tapauksessa olisi lisättävä dctp- tai dgtp-ryhmää korkeinta kloonaustehokkuutta varten. cdna:n ja piasmidien annetaan 25 liittyä toisiinsa ja suoritetaan transformaatio E. coliin. Täysimittaisen cdna:n sisältävät kloonit havaitaan koettimilla, jotka ovat leimattua virus-dna:a tai geenijaksojen osia vastaan komplementaarisia oligonukleotidejä, jonka jälkeen suoritetaan restriktioentsyymiana- 30 lyysi ja DNA-sekvenssointi. Oligonukleotidit on syntetisoitu kemiallisesti kiinteän faasin fosforiamidiittitriesterimenetelmän mukaan, jonka ensimmäisenä kuvasi Beaucage ja Caruthers, (1981) Tetra- 35 hedron Letters 22(20), , käyttäen automaattista syntetoijaa kuten julkaisussa Needham-VanDevanter et al., (1984) Nucleic Acid Res. 12, Oligonukleotidien puhdistukseen käytetään joko natiivia akryyliamidigeelielektroforeesia tai anioninvaihto-hplc:a kuten

12 11 julkaisussa Pearson ja Regnier, (1983), J. Chrom. 255, on kuvattu. Synteettisten oligonukleotidien emäsjärjestys voidaan 5 varmentaa käyttäen kemiallista pilkkomismenetelmää, joka on kuvattu julkaisussa Maxam ja Gilbert (1980) Methods in Enzymology (Grossman ja Moldave, toim., Academic Press, New York) 65, Jotta kloonatun geenin ilmentäminen saataisiin tapahtumaan korkealla tasolla esitumaisessa järjestelmässä, on oleellista konstruoida ilmentämisvektorit, jotka vähimmillään sisältävät vahvan promoottorin mrna:n transkription ohjaamiseksi, ribosomien sitoutumiskohdan translaa- 15 tion aloitusta varten ja transkription lopetuskohdan. Esimerkkejä tähän tarkoitukseen soveltuvista säätelyalueista ovat E. colin tryptofaanin biosynteettisen tien promoottori- ja operaattorialueet, kuten julkaisussa Yanofsky, Keller ja Horn, (1984) J. Bacteriol. 158, on kuvattu ja faagi lambdan vasemmalle suuntautuva promoottori (P L ), kuten julkaisussa Herskowitz ja Hagen, (1980) Ann. Rev. Genet. 14, on kuvattu. E. colissa tuotetut proteiinit eivät laskostu oikein kys- 25 teiiniryhmien esiintymisen ja sopivien translaationjälkeisten modifikaatioiden puuttumisen vuoksi. Puhdistettaessa ilmennettyjä proteiineja E. colista nämä on ensin denaturoitava ja sitten renaturoitava. Tämä voidaan saada aikaan liuottamalla E. colissa tuotetut proteiinit 30 guanidiini-hc1:iin ja pelkistämällä kaikki kysteiiniryhmät (3-merkaptoetanolilla. Proteiini renaturoidaan sitten joko hitaasti dialysoimalla tai geelisuodatuksella USpatentin n:o mukaan. 35 Proteiinien havaitseminen tapahtuu sinänsä tunnetuilla menetelmillä, kuten radioimmunomäärityksellä, tai Western-blottausmenetelmällä tai immunosaostuksella. E.

13 12 colista suoritettava puhdistus voidaan suorittaa US-patentissa n:o kuvatuilla menetelmillä. Heterologisten proteiinien ilmentäminen hiivassa on tun- 5 nettua ja kuvattu perusteellisesti. Teos Methods in Yeast Genetics, Sherman et al., (1982) Cold Spring Harbor Laboratory, on tunnustusta saanut teos, joka kuvaa useita eri menetelmiä proteiinien tuottamiseksi hiivoissa. 10 Jotta geenin ilmentäminen saataisiin tapahtumaan korkealla tasolla hiivassa, on oleellista liittää geeni vahvaan promoottorijärjestelmään, kuten esitumaisten tapauksessa, ja saattaa käyttöön hiivageenistä peräisin olevat tehokkaat transkription lopetus/polyadenylaatiojaksot. 15 Esimerkkeihin käyttökelpoisista promoottoreista kuuluu Ga11,10, Johnston ja Davis, (1984) Mol. and Cell. Biol. 4, , ADH2, Russel et al., (1983) J. Biol. Chem. 258, , PHO5, (1982) EMBO J. 6, ja MFal. Monikopioinen plasmidi, jossa on valikoiva 20 markkeri kuten Lue-2, URA-3, Trp-1 tai His-3, on myös.:, toivottava. MFal -promoottori on edullinen. MFal pro-...:.... moottori on konstitutiivinen a-mating -tyyppisessä isän- I nässä, mutta se on toiminnallisesti poiskytkettynä dip-.. loideissa tai a-mating -tyyppisissä soluissa. Sitä voi daan säädellä kuitenkin lämpötilan kohottamisella tai... laskemisella isäntäsoluissa, joissa on lämpöherkkä mutaa-.... tio yhdessä SIR-lokuksista. Tällaisen mutaation vaikutus 35 C:ssa a-tyypin soluun on laukaista normaalisti toi- minnasta poiskytketyn a-mating -tyyppiä koodaavan geenin 30 toiminta. Poiskytketyn a-mating -tyypin geenin ilmenty-. minen puolestaan kytkee MFal-promoottorin pois toiminnas-. ta. Kasvatuslämpötilan alentaminen 27 C:een kääntää koko tapahtumasarjan päinvastaiseksi, so., tämä kytkee a- mating -tyypin pois toiminnasta ja kytkee MFal:n toimin- 35 taan, Herskowitz ja Oshima (1982), The Molecular Biology.. of the Yeast Saccharomyces, Strathern, Jones ja Broach... (toim.), Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, N.Y.,

14 13 Polyadenylaatiojaksot ovat saatavissa minkä tahansa tehokkaasti ilmentyvän geenin 3 1 -terminaalisen pään jaksoista kuten ADH1, MFal, tai TPI, Albert ja Kawasaki, (1982) J. of Mol. and Appl. Genet. 1, Vektoreina voidaan käyttää joukkoa hiivan ilmentämisplasmideja, kuten YEp6, YEp13 ja YEp24. Kiinnostuksen kohteena oleva geeni voidaan liittää mihin tahansa yllä mainituista promoottoreista ja sitten liittää ligaasilla 10 näihin plasmideihin useissa eri hiivaisäntäsoluissa tapahtuvaa ilmentämistä varten. Nämä plasmidit on kuvattu täydellisesti kirjallisuudessa, Botstein et al., (1979) Gene 8, 17-24; Broach et al., (1979) Gene 8, Hiivasolujen transformointiin on käytössä kaksi menetelmää. Toisessa tapauksessa hiivasolut muunnetaan protoplasteiksi tsymolyaasia, lytikaasia tai giusulaasia käyttäen, jonka jälkeen lisätään DNA ja polyetyleeniglykoli (PEG). PEG-käsitellyt protoplastit regeneroidaan sitten 20 3-%:sella agar -alustalla valikoivissa olosuhteissa. Tämän menetelmän yksityiskohdat ovat julkaisuissa Beggs, (1978) Nature (London) 275, ja Hinnen et al., (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, Toiseen menetelmään ei liity soluseinän poistoa. Tämän si- 25 jasta solut käsitellään litiumkloridilla tai asetaatilla ja PEG:lla ja viedään valikoiville maljoille, Ito et al., (1983) J. Bact. 153, cdna voidaan liittää ligaasilla useisiin eri ilmentämis vektoreihin käytettäväksi isäntäsoluviljelmien transformaatiossa. Kaikki vektorit sisältävät geenijaksot niiden proteiinien transkription ja translaation aloittamiseksi, jotka ovat yhteensopivia transformoitavan isäntäsolun suhteen. Vektorit sisältävät lisäksi edullisesti markkerin, kuten dihydrofolaattireduktaasin tai metallotioneiinin, joka tarjoaa fenotyyppisen ominaisuuden transformoitujen isän-

15 14 täsolujen valikoimiseksi. Lisääntyvä vektori voi lisäksi sisältää replikonin. Proteiinien tuottamiseen käyttökelpoisista soluviljelmis- 5 tä ovat kuvaavina esimerkkeinä hyönteisistä tai nisäkkäistä peräisin olevat solut. Nisäkässolujärjestelmät ovat usein yhden solukerroksen muodossa esiintyviä, vaikka nisäkässolususpensioitakin voidaan myös käyttää. Kuvaaviin esimerkkeihin nisäkässolulinjoista kuuluvat VERO- 10 ja HeLa-solut, kiinanhamsterin munasarja (CHO) -solulinjat, WI38-, BHK-, COS-7- tai MDCK-solulinjat. Kuten edellisestä esityksestä ilmenee, isäntäsolun transformaatioon käytettävä vektori sisältää edullisesti gee- 15 nijaksot proteiinin geenijakson transkription ja translaation aloittamiseksi. Näitä jaksoja nimitetään ilmentymisen säätelyjaksoiksi. Kun isäntäsolu on peräisin nisäkkäistä tai hyönteisistä, kuvaavia esimerkkejä käyttökelpoisista ilmentymisen säätelyjaksoista saadaan SV promoottorista, Science 222, (1983) , CMV I.E.-promoottorista, Proc. Natl. Acad. Sci. 81, (1984) , metallotioneiinipromoottorista, Nature 296, (1982) tai bakuloviruksen polyhedriinipromoottorista (hyönteissoluja) Virol. 131, (1983) Ilmentymisen säätelyjaksot sisältävä plasmidi tai lisääntyvä tai kromosomiin integroituva DNA-materiaali aukaistaan restriktioentsyymeillä ja sovitetaan tarvittavan tai halutun kokoiseksi ja liitetään ligaasilla proteiineja koodaavaan cdna:han sinänsä hyvin tunnetuilla keinoilla. 30 Kuten hiivojen suhteen oli laita, myös korkeammista eläimistä peräisin olevia isäntäsoluja käytettäessä on vektoriin tarpeen liittää tunnetuista nisäkäsgeeneistä peräisin olevat polyadenylaatio- tai transkription lopetusjak- 35 sot. Esimerkkinä lopetusjaksosta on naudan kasvuhormonin geenin polyadenylaatiojakso. Isäntäsolussa tapahtuvan lisääntymisen säätelemiseksi voidaan lisäksi vektoriin liittää geenijaksoja, kuten

16 15 naudan papilloomavirus -tyypin vektoreissa esiintyviä jaksoja, Saveria-Campo, (1985) Bovine papillomavirus DNA: a eukaryotic cloning vector, sivut teoksessa Glover (toim.) DNA Cloning vol. II --A practical appro- 5 ach, IRL Press Arlington, Virginia. Edullinen ilmentämisvektori, joka on käyttökelpoinen pro- teiinien ilmentämiseen kiinanhamsterin munasarja (CHO) - soluissa, on sukkulavektori psvcow7, joka lisääntyy sekä 10 CHO- että E. coli -soluissa käyttäen markkereina ampisilliiniresistenssigeeniä E. coli -soluissa ja dihydrofolaattireduktaasigeeniä CHO-soluissa. Plasmidi psvcow7 tarjoaa käyttöön naudan kasvuhormonista peräisin olevan polyadenylaatiojakson, jota tarvitaan CHO-soluissa tapah- 15 tuvaan ilmentämiseen. Plasmidi psvcow7 aukaistaan ja tähän liitetään virus -promoottori ja cdna:t Edullinen ilmentämisvektori, joka on käyttökelpoinen yhdistelmäbakuloviruksen muodostamiseksi hyönteissoluissa 20 tapahtuvaa proteiinien ilmentämistä varten on pac373, Smith et al., (1983) Mol. Cell. Biol. 3, Plasmidi lisääntyy E. coli -soluissa ampisilliiniresistenssiä käyttäen ja tarjoaa käyttöön aitotumaisten solujen promoottorin ja polyadenylaatiosignaalit bakulovi- 25 ruksen polyhedriinigeenistä geenien ilmentämistä varten. Plasmidi pac373 aukaistaan ja cdna liitetään promoottorin viereen. Tämä uusi plasmidi transfektoidaan rinnan bakuloviruksen (Autograpa californican tuman polyhedroosivirus) DNA:n kanssa hyönteissoluihin kalsiumfosfaattisaos- 30 tuksella. Yhdistelmäbakulovirus, jossa plasmidin pac373 cdna:a sisältävä polyhedriinigeeni on korvannut siinä normaalisti sijaitsevan viruksen polyhedriinigeenin homologisella rekombinaatiolla, havaitaan täpläblottaushybridisaatiolla käyttäen 32P-leimattua cdna:a koettimena, 35 Summers and Smith, (1986) A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas A & M University, College Station, TX, Yhdistelmäbakuloviruksella infektoidut solut voidaan myös erottaa

17 16 muista näiden okkluusionegatiivisen morfologian perusteella, koska cdna:n liittäminen polyhedriinigeeniin estää tämän okkluusion muodostavan proteiinin synteesin. 5 Edullinen naudan papilloomaviruksen (BPV) yhteydessä käytetty ilmentämisvektori proteiinien ilmentämiseen on ptf- W9. Plasmidi ptwf9 talletettiin Budapestin sopimuksen mukaisesti. Plasmidi ptwf9 kasvatetaan E. coli -isännässä ja se on talletettu laitokseen Northern Regional Re- 10 search Center, Peoria, Illinois, USA 17. marraskuuta 1986 ja se on merkitty tunnusnumerolla NRRL B ) Plasmidi lisääntyy E. colissa käyttäen hyväksi ampisilliiniresistenssiä ja siinä on tarjolla käytettäväksi hiiren metallotioneiinin promoottori ja SV40:n polyadenylaatiosig- 15 naali geenien ilmentämistä varten. Plasmidi ptwf9 aukaistaan ja cdna liitetään promoottorin viereen. Tämä uusi plasmidi aukaistaan BPV:n liittämiseksi. Yhdistelmäplasmidi transfektoidaan eläinsoluihin kalsiumfosfaattisaostuksella ja transformoituja soluja sisältävät fo- 20 kukset valikoidaan. Isäntäsolut ovat kompetentteja tai ne tehdään kompetenteiksi transfektioon useilla eri tavoilla. DNA:n viemiseksi eläinsoluihin on useita erilaisia tunnettuja keino- 25 ja. Näihin kuuluu: kalsiumfosfaattisaostus, vastaanottajasolujen fuusio DNA:a sisältävien bakteeriprotoplastien kanssa, vastaanottajasolujen käsittely DNA:a sisältävillä liposomeilla ja DNA:n suora mikroinjektio soluihin. Transfektoidut solut viljellään sinänsä hyvin tunnetuilla 30 tavoilla, Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, (1977) Kuchler, Dowden, Hutchison and Ross, Inc.. Yhdessä edellä olevista aitotumaisista ilmentämisjärjestelmistä ilmennetyt yhdistelmäglykoproteiinit eristetään solususpensioista, jotka on aikaansaatu hajottamalla isä- 35 ntäsolujärjestelmä tunnetuilla mekaanisilla tai entsymaattisilla keinoilla. Proteiinit, jotka on suunniteltu erittymään soluista eristetään kasvatusliuoksista soluja hajottamatta. Glykoproteiinien puhdistusta varten on avuksi viedä sytoplasmafraktio ensin linssipavun lektii-

18 17 nipylvääseen, joka sitoo spesifisesti glykoproteiineja. Eluoituneet glykoproteiinit viedään sitten vasta-ainetta sisältävään affiniteettipylvääseen. 5 Tyypillinen glykoproteiini voidaan jakaa kolmeen alueeseen. Aminoterminaalisessa päässä on hydrofobinen alue, jota kutsutaan signaalijaksoksi. Tämä aminohappojakso on merkkinä glykoproteiinin kuljettamiseksi solukalvoon. Kuljetuksen jälkeen signaalijakso pilkkoutuu pois. Sig- 10 naalijaksoa jäljempänä on valmiin glykoproteiinin solunulkoinen osa. Tämä on glykoproteiinin immunogeeninen osa, koska se on vasta-aineiden tavoitettavissa. Giykoproteiinin karboksiterminaalisessa päässä on hydrofobinen ankkuroitumisalue, joka aiheuttaa sen, että glykoproteii- 15 ni pysyy solukalvossa. HRSV:n F-proteiini on tyypillinen glykoproteiini siinä mielessä, että se sisältää aminoterminaalisen signaalijakson ja karboksiterminaalisen ankkuroitumisjakson, Collins et al., (1984) PNAS 81, HRSV:n G-glykoproteiini on kuitenkin epätavalli- 20 nen, koska sen aminoterminaalinen pää toimii sekä signaali- että ankkuroitumisalueena, Wertz et al., (1985) PNAS 82, Glykoproteiini voidaan suunnitella eritettäväksi soluista 25 ympäröivään kasvatusliuokseen. Tämä suoritetaan siten, että aiheutetaan glykoproteiinin ennenaikainen lopetus ennen ankkurointialueen transkriptiota, Lasky, (1984) 35 Biotechnology 2, Ennenaikainen lopetus voidaan suorittaa liittämällä universaali translaation lope- 30 tusoligonukleotidi sopivaan kohtaan geenin DNA:ssa. Näitä oligonukleotidejä on saatavilla kaupallisesti. Ennenaikainen lopetus voidaan myös suorittaa lukuvaiheistusta muuttamalla ja muodostamalla näin translaation lopetuskoodisana. Myöhempänä kuvattava kimeerinen glykoproteiini koostuu HRSV-F:n signaali- ja solunulkoisesta osasta, jotka on liitetty HRSV-G:n solunulkoiseen osaan, ja tätä nimitetään FG:ksi. Suurin osa glykoproteiini G:n solunulkoi-

19 .:. 18 sesta osasta sisältyy koodaavaan alueeseen, joka on restriktioentsyymien DdeI (nukleotidiasema 302) ja FoKI (nukleotidiasema 850) katkaisukohtien rajoittama. Tämä jakso ei koodaa glykoproteiinin signaali/ankkuroitumisaluetta. 5 Suurin osa glykoproteiini F:n solunulkoista osaa sisältyy koodaavalle alueelle, joka on ennen NsiI-restriktioentsyymien katkaisukohtaa. Tämä jakso koodaa signaalialuetta ja suurinta osaa antigeenisesta alueesta, mutta ei glykoproteiinin ankkuroitumisaluetta. 4 : 10 G-glykoproteiinin liittämiseksi F-glykoproteiiniin pilkottiin HRSV-gpG:n sisältävä plasmidi G-16 DdeI- ja Fo- KI-entsyymeillä ja päät tasoitettiin Klenow -polymeraasilla. Kooltaan 550 ep.:n suuruinen osa eristettiin sit- 15 ten agaroosigeelielektroforeesilla. HRSV-gpF-geenin sisältävä plasmidi pgpg-4 pilkottiin NsiI:lla. Päät tasoitettiin T4-DNA-polymeraasilla ja defosforyloitiin bakteeriperäisellä alkaalisella fosfataasilla. G-16:sta saatu 550 ep.:n osa liitettiin sitten ligaasilla pgpf-4-plasmi- 20 diin ja transformoitiin E. coli HB101-kantaan. Näistä klooneista yhden, pgpfg-1:n, joka oli eristetty transformaatiosta, varmennettiin sisältävän oikeat liitoskohdat Maxam-Gilbert -sekvenssoinnilla. 25 Edellä kuvattu FG-geeni on suunniteltu ilmentämään kimeeristä glykoproteiinia, joka kuljetettaisiin solun pintaan ja eritettäisiin kasvatusliuokseen, kun se on sijoitettu oikein aitotumaisten ilmentämisvektoriin. 30 Edellä kuvatut restriktioentsyymikohdat valittiin, koska niillä ilmentyy suuri osa F- ja G-glykoproteiinien asiaankuuluvista alueista. Voitaisiin kuitenkin ilmentää glykoproteiinien muita osia valitsemalla muita restriktioentsyymien katkaisukohtia proteiineja F ja G koodaavi- 35 en jaksojen alueilla näiden geenien fuusioimiseksi. Esimerkiksi restriktioentsyymejä AluI, HincII, tai HinfI voitaisiin käyttää katkaisuun gpg-geenin 5'-päässä. Restriktioentsyymejä HpHI, MboII, tai XhoII voitaisiin käyttää katkaisuun gpg-geenin 3'-päässä. Entsyymejä voitai-

20 19 siin käyttää minä tahansa molemmista ryhmistä saatuna kanden entsyymin yhdistelmänä immunogeenisten proteiiniosien muodostamiseksi. Geeniä gpf varten voitaisiin NsiI:n tilalla käyttää restriktioentsyymejä HinfII, Hinc- 5 II, AvaII, SspI tai HphI. Kytkeviä oligonukleotidejä voitaisiin lisätä lukuvaiheistuksen korjaamiseksi liitoskohdissa. Kaksi oligonukleotidiä, jotka korjaisivat kaksi mandollista lukuvaiheistuksen siirtymää, ovat SalIkytkijät 10 GGTCGACC ja CGGTCGACCG CCAGCTGG GCCAGCTGGC jotka ovat kaupallisesti saatavilla. Myös silloin, kun ankkuroitumisalueen halutaan sijoittuvan glykoproteiiniin, lisätään kytkijäoligonukleotidi toiseen liitoskoh- 15 taan gpf:n ankkuroitumisalueen synteesin mandollistamiseksi. Muita vaihtoehtoisia strategioita voitaisiin suunnitella FG-fuusioproteiinin ilmentämistä varten liittämällä tai poistamalla useita eri jaksoja. Proteiinia koskeva pääasiallisin ehto on signaalijakson ja näiden 20 kanden glykoproteiinin immunologisesti tärkeiden alueiden säilyminen. FC-geenin liittäminen CHO-, BPV- tai bakulovirus -ilmentämisvektoreihin on jo kuvattu. 25 Kimeerinen FG-glykoproteiini tuo etuja yksittäisten glykoproteiinien ilmentämiseen verrattuna. Koska FG on yksi proteiini, sen puhdistaminen vaatii vain puolet siitä työstä ja reagensseista, joka vaaditaan erillisten F- ja 30 G-glykoproteiinien tapauksessa. Kimeerinen FG-glykoproteiini erittyy myös kasvatusliuokseen puhdistamisen helpottamiseksi. F-glykoproteiini voidaan muokata erittyväksi glykoproteiiniksi katkaisemalla se ennen ankkurointialueen jaksoja. HRSV-G-glykoproteiini sisältää kuiten- 35 kin signaali/ankkurointialueen aminoterminaalisessa päässään. Tämän glykoproteiinin katkaisu ei siksi synnytä erittyvää muotoa. Signaali/ankkurointialue voitaisiin korvata vieraan glykoproteiinin signaalialueella, mutta

21 20 tämä toisi vieraita proteiinijaksoja mandolliseen rokotteeseen.... HRSV:n F- ja G-glykoproteiinit on ilmennetty vacciniavi- 5 rus -ilmentämisjärjestelmiä käyttäen ja näitä yhdistelmäviruksia on käytetty rokotteina puuvillarottien suojaamiseen HRSV-infektiota vastaan, Olmsted et al., (1986) P.N.A.S., USA, 83, F-glykoproteiinia ilmentävä vacciniavirus oli merkittävästi immunogeenisempi ja 10 tarjosi paremman suojan kuin G-glykoproteiinia ilmentävä vacciniavirus, Olmsted, yllä). Molemmilla viruksilla suoritetulla rokotuksella ei näyttänyt olevan summautuvaa vaikutusta pelkästään F:llä suoritettuun rokotukseen nähden. Sensijaan eritetty FG-glykoproteiini näyttää ole- 15 van immunogeenisempi ja antavan paremman suojan kuin F- glykoproteiinin eritetty muoto. Puuvillarottien rokotus FG-proteiinilla tuottaa suuremman prosenttiosuuden neutralisoivaa vasta-ainetta määritettynä ELISA:n ja neutralisaation välisestä suhteesta. 20 Suunniteltiin koe FG:n ja katkaistun F:n (Ft) immunogeenisyyden vertaamiseksi. Koska yhdistelmäglykoproteiineja ei voitu havaita ConA:lla (glykoproteiineja sitova lektiini) puhdistetuista uutteista värjäämällä SDS-PAGE-gee- 25 leissä elektroforesoidut proteiinit Coomassiesinellä (luultavasti vähemmän kuin 1 % proteiinista), käytettiin epäsuoraa menetelmää glykoproteiinien ekvivalenttisten määrien määrittämiseksi. 35 S-Metioniinilla leimattua proteiinia, joka oli elektroforesoitu SDS-PAGE-geelissä, 30 sisältävien autoradiogrammien densitometrikäyriä käytettiin FG:n ja FT:n suhteellisen määrän määrittämiseen näytteissä (FG ja Tt sisältävät yhtä suuret metioniinimäärät). Nämä samat näytteet analysoitiin ELISA:lla ja määritykset osoittivat sen, että tekemässämme ELISA-mää- 35 rityksessä ekvivalenttiset FG-määrät reagoivat kolme kertaa paremmin kuin Ft. FG:n tai Ft:n määrä rokotuksiin valmistetuissa näytteissä määritettiin sitten ELISA:lla ja tasoitettiin tämän suhteen mukaan. Tutkimuksessa ole-

22 21 vat ryhmät olivat FG, Ft (suuri annos), Ft (pieni annos) ja gp50 (negatiivinen kontrolli). Puuvillarotat rokotettiin kolmesti Freundin adjuvantissa, 500 µg proteiinia annosta kohti. Spesifisen glykoproteiinin määrä FG-ryhmässä on ekvi- 5 valenttinen Ft:n pienen annoksen suhteen. Suuriannoksinen Ft-ryhmä sai kolme kertaa enemmän spesifistä glykoproteiinia. Seuraavassa esitetään yhteenveto tämän tutkimuksen tuloksista. 10 RYHMÄ 15 FG Ft suuri Ft pieni gp50 Keuhko- ELISA- NEUTR.- tiitteri tiitteri tiitteri ELISA/ (pfu/gm (50 % lop- (50 % lop- NEUTR.- keuhkoa) pupiste) pupiste) suhde < ,53 2,0 x ,91 6,1 x ,85 2,7 x 10 5 < ET 20 Tämä tutkimus osoittaa kimeerisen FG-glykoproteiinin tehok- kuuden käytettäessä FG:n raakapreparaatteja Freundin adju- vantissa. Jotta voitaisiin osoittaa FG:n tehokkuus aiheut-.:. tamaan korkeita neutraloivien vasta-aineiden tiittereitä ja. suojaamaan puuvillarottia annettua RSV:a vastaan, suoritet- 25 tiin tutkimus käyttäen FG:n puhdistetumpia valmisteita, joi- den antamiseen käytetty valmistusohje sisälsi ihmisille tar-. koitettuun käyttöön hyväksyttävää adjuvanttia (alunaa). FG puhdistettiin homogeenisuudeltaan 50-%:seksi linssipavun. lektiinikromatografialla ja tätä seuranneella monoklonaalis- 30 ta vasta-ainetta käyttävällä affiniteettikromatografialla.. Puuvillarotat rokotettiin kandesti näillä glykoproteiineil- la, jotka oli adsorboitu alunaan (2,5 mg alunaa/annos). Yksi... rottien ryhmä rokotettiin elävällä RSV:lla nenään positii-. viseksi kontrolliksi. Yksi rottien ryhmä rokotettiin aluna-. 35 adjuvantilla negatiiviseksi kontrolliksi. Kustakin ryhmästä. olevilta rotilta tutkittiin seerumin ja neutraloivat vasta- aineet. Rotille annettiin RSV:a ja virusmääritys suoritettiin keuhkoista.

23 Ryhmä 25 gg FG + aluna 5 5 gg FG + aluna 1 gg FG + aluna 25 gg FG + CFA 25 gg FT + aluna 5 gg FT + aluna 10 Alunakontrolli RSV (nenään annettu) Seerumin vasta-aineet Neutraloivat vasta-aineet Infektoituneiden lukumäärä Infektoituneiden rottien keuhkotiitterin keskiarvo /7 0/ /7 3,5 x /7 1 x /7 3,0 x /7 6,7 x 10 2 < /7 9,7 x /7 50

24 23 Kaavioissa 1-6 käytettyjen plasmidien ja fragmenttien esitystapojen on tarkoitus merkitä samaa kuin plasmidien ja niiden fragmenttien tavanomaisten rengasesitysten. 5 Rengasesityksistä poiketen edustaa yhtenäisenä viivana kaavioihin tehty esitys sekä rengasmaista että suoraa kaksinauhaista DNA:a, jossa transkription aloitus tapahtuu vasemmalta oikealle (5' - 3'). Asteriskit (*) edustavat plasmidien rengasmuodon täydentävää nukleotidien 10 liittymistä toisiinsa. Fragmenteissa ei ole asteriskimerkkejä, koska ne ovat kaksinauhaisen DNA:n lineaarisia osia. Endonukleaasien restriktiokohdat on merkitty viivan yläpuolelle. Geenimarkkerit esitetään viivan alapuolella. Plasmideja tai fragmentteja edustavien kaavioiden 15 alaosassa esiintyviä palkkeja käytetään osoittamaan emäsparien lukumäärää kanden pisteen välillä DNA:ssa. Markkerien välinen suhteellinen etäisyys ei osoita todellista etäisyyttä vaan sen tarkoituksena on vain osoittaa niiden suhteellinen etäisyys kuvatussa DNA-jaksossa. 20 Esimerkit...: Esimerkki 1 G-C-jatkeiden poisto F-glykoproteiinigeenistä..... F-glykoproteiinin maksimaalisen ilmentämisen aikaansaamiseksi täytyy G-C-nukleotidit, joita käytetään cdna:n liittämiseksi pbr322-plasmidiin, poistaa cdna:n 5'-päästä 30 (suhteessa alkuperäiseen mrna:han). Jotta gpfg-cdna:n liittäminen edulliseen CHO-solujen yhteydessä käytettävään ilmentämisvektoriin psvcow7 (kuvattu jäljempänä) olisi vaivatonta, on tarpeen tuoda BamHI-katkaisukohta proteiinia koodaavaa jaksoa edeltävään asemaan. Tämän 35 aikaansaamiseksi liitetään F-glykoproteiinin cdna puc12- plasmidiin (PL Pharmacia Labs, Piscataway, NJ). Menetelmät koko F-glykoproteiinijakson sisältävän cdna-kloonin F5-25 syntetisoimiseksi on kuvattu. Collins et al., (1984), Nucleotide sequence of the gene encoding the fu-

25 24 sion (F) glycoprotein of human respiratory syncytial virus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, A. pgpf2:n konstruktio - kaavio 1 F-glykoproteiinin cdna on PstI-katkaisukohtien välissä (kaavio 1), mutta esiintyy myös sisäisiä PstI-katkaisukohtia. Tämän vuoksi plasmidi pf5-25 pilkotaan osittain 10 PstI:lla ja fragmentti 1 (1,9 ke.) eristetään geelistä. Fragmentti 1 liitetään ligaasilla plasmidiin puc12 (Bethesda Res. Labs., Rockville, MD.), joka oli pilkottu PstI:lla. Valikoidaan plasmidi, jossa gpf-geenin 5'-pää on puc12:ssa olevan XbaI-katkaisukohdan vieressä, ja täl- 15 le annetaan merkintä pgpf2 (4,6 ke.). Tämä orientaatio varmennetaan katkaisemalla NsiI:lla ja HindIII:11a, josta on tuloksena noin 400 ep.:n fragmentti. 20 B. pgpf3:n ja pgpf4:n konstruktio - Kaavio 2 G-C-nukleotidien poistamiseksi cdna:n 5'-päästä, avataan pgpf2 XbaI:lla ja päät käsitellään bakteeriperäisellä alkaalisella fosfataasilla fragmentti 3:n saamiseksi. 25 Fragmentti 3 pilkotaan sitten Sali:11a, joka leikkaa pois lyhyen, XbaI:n ja PstI:n välisen jakson, ja käsitellään sitten Klenow -entsyymillä päiden tasoittamiseksi. Klenow -entsyymikäsittelyn jälkeen fragmentti 3 pilkotaan Lambda -eksonukleaasilla, joka tarvitsee 5'-fosfaatin ja 30 jättää vapaan 3'-pään. gpf:a edeltävän pään 5'-fosfaatin poiston vuoksi eksonukleaasi pilkkoo jäljempänä olevasta päästä lähtien gpf:a kohti. Eksonukleaasin annetaan vaikuttaa riittävän pitkän ajan nukleotidien poistamiseksi alueelta, joka ulottuu G/C-päätejaksoalueen yli johtojak- 35 son sisään. Hybridisoidaan ensimmäiset 15 johtojakson emästä sisältävä synteettinen jakso fragmenttiin 3 ja puuttuvat emäkset täytetään Klenow -entsyymillä ja päät yhdistetään T4-ligaasin katalysoimalla ligaasireaktiolla,

26 jotta saadaan pgpf3:n (4,6 ke.), joka sitten transformoidaan E. coliin ja jonka nukleotidijärjestys varmistetaan. 25 G-C-nukleotidien poistamiseksi cdna:n 3'-päästä avataan 5 pgpf3 HindIII:lla ja käsitellään eksonukleaasilla Bal 31 riittävän pitkän aikaa, jotta pilkkoutuminen jatkuisi G- C-nukleotidien yli. Päät tasoitetaan Klenow -entsyymillä ja cdna-klooni vapautetaan vektorista pilkkomalla BamHI: lla. cdna-fragmentti eristetään geelistä ja liitetään 10 ligaasilla puc12-plasmidiin, joka on pilkottu BamHI:lla ja HincII:lla (HincII on yhteensopiva tasoitettujen päiden yhteydessä) pgpf:n saamiseksi. Plasmidi transformoidaan E. coliin ja sopiva klooni, joka oli pilkottu riittävästi Ba131:11a, tunnistetaan määrittämällä tämän nuk- 15 leotidijärjestys. Vaihtoehtoisesti voidaan G-C-nukleotidit poistaa restriktioentsyymillä, jolla on ainoastaan kerran esiintyvä, G-C-nukleotideja edeltävä katkaisukohta. gpf:n tapauksessa tämä entsyymi olisi HaeIII. Koska HaeIII katkaisee F-geenin normaalin translaation lopetus- 20 signaalia edeltävästä kohdasta, olisi yleisvaikutteinen translaation lopetusoligonukleotidi (New England Biolabs) liitettävä ligaasilla F-cDNA:han HaeIII:lla suoritetun pilkkomisen jälkeen. DNA pilkottaisiin sitten BamHI:lla ja käsiteltäisiin edellä kuvatulla tavalla, jota nouda- 25 tettiin pgf-4:a muodostettaessa. Esimerkki 2 HRSV:n kimeerisen FG-glykoproteiinin konstruktio - kaavio 3 30 A. HRSV-G-glykoproteiinigeenin valmistus Klooni G2B-16, joka sisältää koko HRSV-G-glykoproteiinia koodaavan alueen on kuvattu (Wertz et al., (1985) Nucleo- 35 tide sequence of the G protein gene of human respiratory syncytial virus reveals an unusual type of viral membrane protein, PNAS 82, ). G-glykoproteiinin cdna:n sisältävä klooni G2B-16 pilkotaan DdeI:lla ja FoKI:lla ja päät tasoitetaan E. colin DNA-polymeraasilla (Klenow -

27 26 5 fragmentti). DNA:lle suoritetaan elektroforeesi 1,5- %:sessa agaroosigeelissä. Asianmukaisen G-geenin alueen sisältävä 550 ep.:n kokoinen fragmentti (fragmentti 4) irroitetaan geelistä ja DNA puhdistetaan agaroosista. B. G-cDNA-fragmentin liittäminen HRSV-F-glykoproteiinigeeniin 10 Plasmidi pgpf4 (kaavio 2) pilkotaan NsiI:lla. Päät tasoitetaan T4-DNA-polymeraasilla ja defosforyloidaan bakteeriperäisellä alkaalisella fosfataasilla. G-cDNA:n 550 ep.:n fragmentti liitetään ligaasilla plasmidiin pgpf4, jotta saatiin kimeerinen FG-geeni (pgpfg-1). Plasmidi 15 transformoidaan E. coli HB101-kantaan. Kloonit eristetään ja niistä valitaan F-geenissä oleva oikein orientoitunut G-cDNA pilkkomalla Hinfl:lla, josta muodostuu 875 ep.:n ja 186 ep.:n liitosfragmentit. G-fragmentin väärästä orientaatiosta muodostuu 650 ep.:n ja 400 ep.:n 20 liitosfragmentit Hinfl:lla pilkottaessa. Oikean orientaation käsittävän kloonin liitosalueet varmistetaan sitten Maxam-Gilbert -sekvenssoinnilla. Edellä olevassa esimerkissä on muodostettu kimeeristä 25 glykoproteiinia koodaava geeni, joka sisältää G-glykoproteiinin immunogeeniseen alueeseen liitetyn F-glykoproteiinin signaali- ja immunogeenisen alueen. Koska toinen liitos (G - F) aiheuttaa lukuvaiheistuksen siirron ja translaation lopetuksen, glykoproteiinissa ei esiinny 30 ankkuroitumisaluetta. 35 Esimerkki 3 DNA-oligonukleotidikytkijöiden käyttö HRSV:n kimeerisen FG-glykoproteiinin lukuvaiheistuksen säätämiseksi - kaavio 4 Jos käytetään muita kuin esimerkissä 2 esitettyjä rest- riktioentsyymejä F- ja G-geenien liittämiseksi voi syntyä lukuvaiheistuksen siirtymä F:n ja G:n ensimmäisessä lii-

28 27 5 toksessa, joka johtaa glykoproteiinin varhaiseen translaation lopetukseen. Tämä voidaan välttää käyttämällä oligonukleotidikytkijöitä, jotka palauttavat oikean lukuvaiheistuksen. A. HRSV:n G-glykoproteiinigeenin valmistus G-glykoproteiinin cdna:n sisältävä klooniplasmidi G2B pilkotaan HphI:lla ja päät tasoitetaan T4-DNA-polymeraasilla. SalI-kytkijä CGGTCGACCG GCCAGCTGGC (New England Biolabs) kytketään ligaasilla DNA:N päihin. 15 DNA pilkotaan SalI:lla ja tälle tehdään elektroforeesi 1,5-%:sessa agaroosigeelissä. Asianmukaisen G-geenin alueen sisältävä 410 ep.:n kokoinen fragmentti (fragmentti 5) irroitetaan geelistä ja DNA puhdistetaan agaroosista. 20 B. G-cDNA-fragmentin liittäminen HRSV-F-glykoproteiinigeeniin 25 Plasmidi pgpf4 pilkotaan NsiI:lla ja päät tasoitetaan T4- DNA-polymeraasilla. SalI-kytkijä liitetään ligaasilla pgpf4-dna:n päihin. DNA pilkotaan SalI:lla ja tälle tehdään elektroforeesi 1-%:sessa agaroosigeelissä. 4,4 kep.:n kokoinen fragmentti irroitetaan geelistä ja DNA 30 puhdistetaan agaroosista. 4,4 kep.:n pgpf4-dna-fragmentti ja 410 ep.:n G-fragmentti liitetään ligaasilla yhteen, josta muodostuu pgpfg-2, ja transformoidaan E. coli HB101-kantaan. Eristetään kloonit ja valitaan sellainen, jolla F-geenissä on oikein orientoitunut G-cDNA pilkko- 35 maila Hinfl:lla, joka muodostaa 768 ep.:n ja 220 ep.:n liitosfragmentit. G-fragmentin väärä orientaatio tuottaa 555 ep.:n ja 430 ep.:n liitosfragmentit Hinfl:lla pilkottaessa. Tämän kloonin liitosalueet varmistetaan sitten oikeiksi Maxam-Gilbert -sekvenssoinnilla.