! (

Transkriptio

1 ! ( (12) PATENTTIJULKAISU PATENTSKRIFT (10) FI B (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats SUOMI-FINLAND (FI) (51) Kv.lk.6 - Int.k1.6 C 07K 14/22, C 12N 15/31, A 61K 39/095 (21) Patenttihakemus - Patentansökning (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag (24) Alkupäivä - Löpdag Patentti- ja rekisterihallitus Patent- och registerstyreisen (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet CU 145/90 P (73) Haltija - Innehavare 1. Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia, 31 Street, 156 & 190, Cubanacan, Playa, Havana, Cuba, (CU) (72) Keksijä - Uppfinnare 1. Silva Rodriguez, Ricardo, Calle 15 #4209, entre 42 y 44, Playa, Ciudad de la Habana, Cuba, (CU) 2. Houssein Sosa, Manuel Selman, Paseo #126, entre Sta y Calzada, Vedado, Ciudad de la Habana, Cuba, (CU) 3. Guillån Nieto, Gerardo, Linea #6, Apto 4, entre N y 0, Vedado, Ciudad de la Habana, Cuba, (CU) 4. Herrera Martinez, Luis Saturnino, Calle 96, entre 3a y 3aA, Playa, Ciudad de la Habana, Cuba, (CU) 5. Fernändez Maso, Julio Raul, Calle 26 #873 1/2, Apto 3, entre Conill y 45, Nuevo Vedado, Ciudad de la Habana, Cuba, (CU) 6. Novoa P6rez, Lidia In6s, Calle 184 #3112, entre 31 y 33, Apto 49, Playa, Ciudad de la Habana, Cuba, (CU) 7. Morales Grillo, Juan, Compostela #653, Apto 1, entre Luz y Acosta, Habana Vieja, Ciudad de la Habana, Cuba, (CU) 8. Morera Cordova, Vivian, Calle 184 #3112, entre 31 y 33, Apto 39, Playa, Ciudad de la Habana, Cuba, (CU) 9. Gonzålez Blanco, Sonia, Calle 184 #3112, entre 31 y 33, Apto 42, Playa, Ciudad de la Habana, Cuba, (CU) 10. Tamargo Santos, Beatriz, Calle 202 #29302, entre 293 y 295, Reparto Calixto Sänchez, Boyeros, Ciudad de la Habana, Cuba, (CU) 11. del Valle Rosales, Jesus Augusto, D'Strampes #351, entre San Mariano y Vista Alegre, La Vibora, Ciudad de la Habana, Cuba, (CU) 12. Caballero Men6ndez, Evelin, Calle 7 #214, entre 2 y 4, Cayo de la Rosa, Hauta, Ciudad de la Habana, Cuba, (CU) 13. Alvarez Acosta, Anabel, Calle 184 #3112, entre 31 y 33, Apto 1, Playa, Ciudad de la Habana, Cuba, (CU) 14. Gouzeau Rodriguez, Edelgis, Calle 184 #3112, entre 31 y 33, Apto 20, Playa, Ciudad de la Habana, Cuba, (CU) 15. Gruz Leon, Silian, Ave 47 #11812, entre 118 y 120, Marianao, Ciudad de la Habana, Cuba, (CU) 16. Musacchio Lasa, Alexis, Calle 128 #7117, entre 71 y 73, Mariel, Ciudad de la Habana, Cuba, (CU) (74) Asiamies - Ombud: Tampereen Patenttitoimiato Oy, Hermiankatu 6, Tampere (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Neisseria meninqitidisin ulkokalvon proteiinia koodaava nukleotidisekvenssi Nukleotidsekvens som kodar för protein av den yttre membranen av Neisseria meningitidis (83) Mikro-organismitalletus - Deposition av mikroorganism: CBS (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer EP A (A 61K 39/095), US A (A 61K 39/40), WO A 90/06696 (A 61K 39/095) (57) Tiivistelmä - Sammandrag Keksintö liittyy menetelmään N. meningitidisin ulkokalvolla olevaa n daltonin molekyylipainoista proteiinia koodaavan nukleotidisekvenssin eristämiseksi sekä siitä saatuun rekombinoituun DNA:han, jota

2 käytetään isäntänä toimivan mikro-organis - min muunnokseen. Keksinnön teknisenä tavoitteena on tunnistaa nukleotidisekvenssi, joka koodaa hyvin säilyvää ja useimmille patogeenisille Neisseria-kannoille yhteistä proteiinia, sekä tuottaa tätä proteiinia hyvin puhdasasteisena ja kaupallisesti hyödynnettäviä määriä käyttäen rekombinaatiomenetelmää, jotta sitä voidaan käyttää diagnosointimenetelmissä ja laajan immuunisuojan tarjoavissa rokotevalmisteissa. Uppfinningen avser en metod för isolering av en nukleotidsekvens som kodar för ett protein med molekylvikten av ca dalton på den yttre membranen av N. meningitidis samt därav erhällen rekombinerad DNA som används för transformering av en som värd fungerande mikro-organism. Det tekniska målet av uppfinningen är att identifiera en nukleotidsekvens som kodar för ett välbehållet och för de flesta patogeniska Neisseria-stammen gemensamt protein, samt att producera detta protein i mycket stor renhetsgrad och i kommerciellt användbara mängder genom användning av en rekombinationsmetod, så att det kan utnyttjas i diagnoseringsförfaranden och vaccinpreparat som erbjuder ett vidsträckt immunskydd. Sali Emil! Ewa] M6 T M6 11,,d 1H

3 1 Neisseria meningitidisin ulkokalvon proteiinia koodaava nukleotidisekvenssi 5 Esillä oleva keksintö kuuluu geenimanipulaation ja bioteknologian aihepiiriin. Erityisemmin keksintö liittyy patogeenisesta bakteerista Neisseria meningitidis saatavaan nukleotidisekvenssiin, joka koodaa mainitun bakteerin ulkokalvon proteiinia. Mainittu 10 proteiini kloonautuu ja ilmentyy Escherichia coliisännässä. Tämän proteiinin ominaisuudet sekä sen kyky tuottaa immunologisesti aktiivisia vasta-aineita (bakterisidiset vasta-aineet) luonnollisessa isännässään mandollistavat sen käytön rokotevalmisteissa 15 tämän mikro-organismin patogeenisia lajeja vastaan. Gram-negatiivinen bakteeri N. meningitidis on syynä joka kolmanteen bakteerin aiheuttamaan aivokalvontulehdustapaukseen maailmassa. Sen kuvasi ensimmäisen 20 kerran Anton Weichselbaum v (I. DeVoe, 1982, Microbiol. Revs. 46: ), ja ihminen on sen toistaiseksi ainoa luonnollinen isäntä. Tämän vuosisadan ensimmäisellä puoliskolla löydettiin 25 joitakin olennaisia seikkoja, jotka liittyvät tämän mikro-organismin metaboliaan ja serologiseen erottamiseen. Ensimmäiset epäonnistuneet yritykset rokotevalmisteiden saamiseksi perustuivat sen suojakalvon polysakkaridiin (E. Kabat et al., 1945, J. Exp. Med : ). Tämän suojakalvon polysakkaridin kemiallisen koostumuksen perusteella bakteeri N. meningitidis luokitellaan serologisiin ryhmiin A, B, C, 29-E, H, I, K, L, W-135, X, Y tai Z, ja suurin prosentuaalinen määrä tautitapauksista on A-, C-, Y-, W-135- ja B- 35 ryhmien aiheuttamia. Suojakalvottomat kannat eivät liity hyökkäävään tautiin.

4 2 Näiden polysakkaridien erilaisia puhdistusmenetelmiä käytettäessä (E. Gotschlich et al., 1969, J. Exp. Med. 129: ) neljä ensimmäistä polysakkaridia (PS) osoittautuivat hyviksi immunogeeneiksi ja bak- 5 teereja tappavien vasta-aineiden tuottajiksi ihmisellä (E. Gotschlich et al., 1969, J. Exp. Med. 129: ). Tällaisten vasta-aineiden läsnäolo on aiemmin korreloinut kääntäen infektion esiintymisalttiuden kanssa (J. Goldschneider et al., 1969, J. Exp. Med : ). Nykyään yhden-, kanden- tai kolmenarvoisia rokotteita on tutkittu laajalti serotyyppien A, C ja W-135 osalta (I. Ambrosch et al., 1983, Bulletin of the WHO 61: ; I. Vodopija et al., 1983, Infect. Immunol. 42: ; M. Cadoz et al., , Vaccine 3: ; H. Peltola et al., 1985, Pediatrics 76: 91-96). Nämä rokotteet on laillistettu käyttöön ihmisellä eri maissa (Centers for Disease Control, 1985, Morbid. 20 Mortal. Weekly Report 34: ) ja joitakin niistä on saatavissa kaupallisesti eri yrityksiltä ja valmistajalta (mm. Connaught Laboratories, USA; Smith Kline- RIT, Belgia; Institute Merieux, Ranska; Behringwerke Aktiengesellschaft, Saksa; Instituto Sieroterapico e 25 Vaccino genea Toscano "Sclavo", Italia; Swiss Serum and Vaccine Institute, Bern, Sveitsi). Tavanomainen rokote N. meningitidis seroryhmä C:tä vastaan ei kuitenkaan tuota riittäviä määriä bak- 30 teereita tappavia vasta-aineita alle 2-vuotiailla lapsilla, jotka ovat tämän taudin pääasialliset uhrit. On osoitettu, että erityisten N. meningitidis -vastaaineiden määrä alle nelivuotiailla lapsilla kolme vuotta rokottamisen jälkeen on samanlainen rokotetuilla 35 ja rokottamattomilla lapsilla (H. Käyhty et al., 1980, J. Infect. Dis. 142: ). Myöskään muistivastetta ei todettu N. meningitidisiä vastaan nuorilla

5 3 aikuisilla 8 vuotta rokottamisen jälkeen (N. Rautonen et al., 1986, J. Immunol. 137: ). N. meningitidis seroryhmä B:tä vastaava polysakkaridi 5 on heikosti immunogeeninen (E. Gotschlich et al., 1969, J. Exp. Med. 129: ) ja saa aikaan heikon vasteen, jossa IgM on heikosti spesifinen (W. Zollinger et al., 1979, J. Clin. Invest. 63: ). Tähän ongelmaan liittyy erilaisia teorioita, 10 kuten B-polysakkaridin ja sikiön aivorakenteiden ristikkäisreaktiivisuus, vasta-ainerakenteiden muuttuminen liuoksessa ja neuroaminidaasiherkkyys (C. Moreno et al., 1985, Infect. Immunol. 47: ). Viime aikoina on luotu PS-B:n kemiallinen muunnos, 15 joka sai isännässä aikaan vasteen (H. Jennings et al., 1988, US-patentti ; F. Ashton et al., 1989, Microb. Pathogen. 6: ), mutta tämän rokotteen turvallisuutta ihmisellä ei ole osoitettu. 20 Koska tehokas N. meningitidis B:n rokote puuttuu ja koska endeemisen tulehduksen riski on vähäinen ja rajoittuu pääasiassa lapsiin, rutiini-immunisaatiota polysakkarideilla ei suositella (C. Frasch, 1989, Clin. Microbiol. Revs. 2: S134-S138) muutoin kuin 25 epidemiatapauksessa. Koska toisen maailmansodan jälkeen sairaus oli useimmissa tapauksissa N. meningitidis B:n aiheuttama, rokotteet seroryhmä B:tä vastaan muodostuivat erityisen 30 tärkeiksi. Muita N. meningitidisin ulkokalvon osia ovat fosfo- lipidit, lipopolysakkaridit (LPS tai endotoksiinit), pili-proteiinit ym. N. meningitidisillä on kuvattu eri 35 LPS-immunotyyppejä (W. Zollinger ja R. Mandrell, 1977, Infect. Immun. 18: ; C.M. Tsai et al, 1983, J. Bacteriol. 155: ), ja immunogeenisyyttä mitattiin käyttäen ei-toksisia johdannaisia (H.

6 4 Jennings et al., 1984, Infect. Immun. 43: ), mutta niiden vaihtelevuus (H. Schneider et al., 1984, Infect. Immun. 45: ) ja pyrogeenisuus (milloin se on konjugoituneena lipidi A:han) ovat tällä hetkellä 5 rajoittavia tekijöitä. Pili, rakenteet, joita tarvitaan solujen kiinnit- tymiseksi nenän ja nielun limakalvolle (D. Stephens et al., 1983, J. Infect. Dis. 148: ) ovat 10 antigeenisesti erilaisia eri kannoissa (J. Greenblatt et al., 1988, Infect. Immun. 56: ), joilla on joitakin yhteisiä epitooppeja (D. Stephens et al., 1988, J. Infect. Dis. 158: ). Tällä hetkellä on joitakin epäilyksiä sen suhteen, kuinka tehokas 15 näihin rakenteisiin perustuva rokote on. Kuitenkin joitakin tämäntyyppisiä rokotteita on saatu käyttöön 20 ilman tunnettuja tuloksia, jotka liittyvät niiden käyttöön ihmisellä (C. Brinton, 1988, US-patentti ). Viime aikoina huomio on kiinnittynyt muihin tämän bakteerin ulkokalvon proteiineihin. Näitä proteiinikomplekseja on useita immunologisia tyyppejä. 25 N. meningitidis -kannat jaetaan serotyyppeihin enemmistönä olevan proteiinin P1/P2 spesifisten epitooppien 30 läsnäolon mukaan ja alatyyppeihin P1-proteiinin muiden epitooppien mukaan (C. Frasch et al., 1985, Rev. Infect. Dis. 7: ). On olemassa useita julkaistuja artikkeleita ja patenttihakemuksia, jotka koskevat näiden proteiinien yhdistelmiin perustuvia rokotteita, joista on etukäteen selektiivisesti poistettu endotoksiinit käyttäen 35 biologisesti soveltuvia puhdistusaineita. Näiden yhdistelmien immunogeenisyys on osoitettu eläimillä ja ihmisellä (W. Zollinger et al., 1979, J. Clin. Invest. 63: ; C. Frasch ja M. Peppler, 1982,

7 5 Infect. Immun. 37: ; E. Beuvery et al., 1983, Infect. Immun. 40: ; E. Rosenqvist et al., 1983, NIPH Annals 6: ; L. Wang ja C. Frasch, 1984, Infect. Immun. 46: ; C. Moreno et al, , Infect. Immun. 47: ; E. Wedege ja L. Froholm, 1986, Infect. Immun. 51: ; C. Frasch et al., 1988, J. Infect. Dis. 158: ; M. Lifely ja Z. Wang, 1988, Infect. Immun. 56: ; J. Poolman et al., 1988, teoksessa J. Poolman et al. (toim.), 10 Gonococci and Meningococci, KluwerAcademicPublishers, Dordrecht, The Netherlands, ss ; E. Rosenqvist et al., 1988, J. Clin. Microbiol. 26: ) sisältäen tulokset laajoista kenttäkokeiluista esimerkiksi Kapkaupungissa, Etelä-Afrikassa v (C. 15 Frasch, 1985, Eur. J. Clin. Microbiol. 4: ); Iquiquessa, Chilessä v (W. Zollinger, 1988, Proceedings of the Sixth International Pathogenic Neisseria Conference. Callaway Gardens Conference Center) ja Kuubassa 1986 ja 1988 (G. Sierra, 1988, 20 Proceedings of the Sixth International Pathogenic Neisseria Conference. Callaway Gardens Conference Center). Kuitenkin viimemainittua tapausta lukuunottamatta näillä valmisteilla aikaansaadut bakteereita tappavat vasta-aineet rajoittuivat saman tai lähek- 25 käisen serotyypin kantaan. Yhteen näistä rokotteista viitataan US-patentissa , joka rajoittuu yhteen aivokalvontulehdusta aiheuttavaan Neisseria-tyyppiin (serotyyppi 2), jolla 30 on suuri esiintymistiheys, mutta potilaista on eristetty myös muita suuren esiintymistiheyden omaavia serotyyppejä kuten serotyyppejä 4 (Kuuba vv , H. Abdillahi et al., 1988, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 7: ; Suomi vv , 35 H. Käyhty et al., 1989, Scand. J. Infect. Dis. 21: ); 8 (Australia vv , F. Ashton et al., 1984, Can. J. Med. Biol. 30: ) ja 15 (Norja vv , L. Froholm et al., 1985, Pro-

8 6 ceedings of the Fourth International Symposium on Pathogenic Neisseria. American Society for Microbiology; Chile vv , S. Ruiz et al., 1988, Proceedings of the Sixth International Pathogenic 5 Neisseria Conference. Callaway Gardens Conference Center) sekä määrittelemättömän serotyypin kantoja (F. Ashton et al., 1980, Can. J. Microbiol. 26: ; Australia vv , F. Ashton et al., 1984, Can. J. Med. Biol. 30: ; Suomi vv , H. Käyhty et al., 1989, Scan. J. Infect. Dis. 21: ). Kuubalainen rokote, jonka Centro National de Biopreparados sai aikaan v (Eurooppa-patentti ), 15 on osoittautunut hyvin tehokkaaksi. Se perustuu antigeeniryhmään, jolla on korkea molekyylipaino. Sillä on laaja ristikkäisreaktiivisuusalue muiden kantojen kanssa, ja se tuottaa ja ylläpitää bakteereja 20 tappavia vasta-aineita rokotetussa isännässä. Ne menetelmät, joita käytetään tämäntyyppisen rokotteen saamiseksi, alkavat kuitenkin sellaisen mikro-organismin lisäämisellä sopivassa viljelmässä, joka on hyvin patogeeninen, mihin liittyy bakteerin suoranaisen 25 käsittelyn biologinen riski. Edelleen tämäntyyppinen valmiste sisältää lipopolysakkarideja, kontaminoivaa ainetta, joka tosin saattaa lisätä tuotteen tehokkuutta mutta osoittaa samalla epätoivottuja sivuvaikutuksia voimakkaan pyrogeenisuutensa vuoksi. Lisäksi sen 30 vähäisempien, osan valmistetta muodostavien antigeenikomponenttien muuntelua ei voida valvoa eri erissä, mikä vaikeuttaa reaktogeenisyyteen ja immunogeenisyyteen liittyvien tärkeiden parametrien seurantaa. 35 Tästä syystä on yhä kiinnostavampaa tunnistaa ne nukleotidisekvenssit, jotka koodaavat hyvin säilyviä proteiineja kaikissa kannoissa ja etenkin tunnistaa niiden bakteereja tappavien vasta-aineiden aiheut-

9 7 tajaproteiinit, jotka esiintyvät useimmissa patogeenisissa Neisseria-bakteereissa laajan suojan tarjoavien rokotevalmisteiden aikaansaamiseksi. 5 On olemassa erilaisia, suuren molekyylipainon omaavia proteiineja, joita esiintyy pieniä määriä N. meningitidisin ulkokalvolla, kun tätä mikro-organismia kasvatetaan tavanomaisessa viljelyalustassa, mutta jotka saavat aikaan voimakkaan vasteen yksilöissä, 10 joissa ne vaikuttavat (J. Black et al., 1986, Infect. Immun. 54: ; L. Aoun et al., 1988, Ann. Inst. Pasteur/ Microbiol. 139: ) ja/tai lisäävät vastettaan erityisissä viljelyolosuhteissa (J. van Putten et al. 1987, Antoine van Leeuwenhoek 53: ; A. Schryvers ja L. Morris, 1988, Molecular Microbiol. 2: ja Infect. Immun. 56: ). Jotkin näistä proteiineista ovat hyvin säilyviä eri kannoissa, erityisesti ne jotka liittyvät mikroorganismin raudansaantiin, niin että ne ovat muodos- 20 tuneet kiinnostaviksi rokote-ehdokkaiksi (L. Mocca et al., 1988, Proceedings of the Sixth International 25 Pathogenic Neisseria Conference. Callaway Gardens Conference Center; C. Frasch, 1989, Clin. Microbiol. Revs. 2; S134-S138). Puhtaiden, mikro-organismista tai näille lähekkäisten lajien kannoista saatavien proteiinien lisäksi (esim. 37 kd-proteiini, T. Mietzner ja S. Morse, 1987, USpatentti ) on kloonattu ja ilmennetty useita 30 lähekkäisiä geenejä. Näitä proteiineja ovat seuraavat: 35 proteaasi IgAl proteiini P1 proteiini P5a (J. Koomey ja S. Falkow, 1984, Infect. Immun. 43: ); (A. Barlow et al, 1987, Infect. Immun. 55: , ja 1989, Molec. Microbiol. 3: ); (T. Kawula et al., 1988, Infect. Immun. 56: );

10 proteiini P5c proteiini P4 proteiini P2 (T. Olyhoek ja M. Achtman, 1988, Proceedings of the Sixth International Pathogenic N. Conference. Callaway Gardens Conference Center); (K. Klugman et al., 1989, Infect. Immun. 57: ); (K. Murakami et al., 1989, Infect. Immun. 57: ); ja N. gonorrhoeaesta, jotka koodaavat proteiineja, joilla on ristikkäisreaktiivisuutta niiden N. meningitidisin vastaavien proteiinien kanssa: 15 antigeeni H.8 (W. Black ja J.G. Cannon, 1985, Infect. Immun. 47: ); makromolekyylikompleksi (W. Tsai ja C. Wilde, 1988, Proceedings of the Sixth International Pathogenic Neisseria 20 Conference. Callaway Gardens Conference Center); 37 kda -proteiini, jonka muodostuminen estyy raudan läsnäollessa (S. Berish et al., 1988, Proceedings of the Sixth International 25 Pathogenic Neisseria Conference. Callaway Gardens Conference Center). Näiden proteiinien käyttöä aktiivisena rokotevalmis- 30 teena ei ole raportoitu tai niitä vastaan aikaansaatujen vasta-aineiden bakteerien tuhoamiskyky on testeissä ollut negatiivinen, kuten hiiren monokloonisten H.8-vasta-aineiden ollessa kyseessä (J. Woods et al., 1987, Infect. Immun. 55: ). 35 Tällä hetkellä N. meningitidisin ulkokalvolla sijaitseva P1-proteiini on parhaiten tunnettuja ja tutkituimpia antigeeneja. Tällä proteiinilla ei ole eri

11 9 muunnoksia samassa kannassa. Neisseriassa on kuitenkin yli 17 Pl-proteiinin tyyppiä, joilla on eroja kolmella eri alueella, mihin perustuu Neisserian luokittelu eri alatyyppeihin. Tämä proteiini on ihmisillä hyvin 5 immunogeeninen (W.D. Zollinger ja R.E. Mandrell, 1983, Med. Trop. 43: ) ja herättää esiin suojaavia vasta-aineita (E. Wedege ja L.O. Froholm, 1986, Infect. Immun. 51: ; K. Saukkonen et al., 1987, Microb. Pathogen. 3: ), joiden 10 vuoksi se on erityisen tärkeä rokotevalmisteissa. Joitakin P1-proteiinin alatyyppejä on kloonattu E. colissa, alkaen genomitiedostoista (A.K. Barlow et al., 1989, Molec. Microb. 3: ) tai käyttäen 15 PCR-tekniikkaa (S. Butcher et al., VIIth International Congress of Neisseria, R.C. Seid, patenttihakemus WO 90/06696; Brian McGuinness et al., 1990, J. Exp. Med. 171: ; M.C.J. Maiden et al., VIIth International Conference of Neisseria, Berliini, , ja 1991, Molec. Microb. 3: 727; J. Suker et al., VIIth International Conference of Neisseria, Berliini, ). Tähän mennessä ei kuitenkaan ole löydetty geneettistä rakennetta, joka voisi tuottaa tätä proteiinia suurilla ilmenemisasteilla. On rapor- 25 toitu ainoastaan alhaisia ilmenemisasteita (D.A. White et al., 1990, Molec. Microb. 4: ) tai sen ilmenemistä Bacillus subtilisissä sulautuneena E. colin ulkokalvon A-proteiiniin (omp A) (E. Wahlström et al., VIIth International Congress of Neisseria, 30 Berliini, ). Voidaan vakuuttaa, 'että tähän mennessä ei ole eristetty yhtään antigeenia, joka olisi yhteinen N. meningitidisin kaikille tyypeille ja seroryhmille ja voisi 35 tuottaa bakteereja tappavia vasta-aineita. Tästä syystä tällainen antigeeni, immunologisesti kiinnostaviin muihin proteiineihin tai polysakkarideihin

12 10 konjugoituneena tai fuusioituneena, olisi tärkeä kandenarvoisten rokotevalmisteiden ehdokas. Tämä keksintö liittyy nukleotidisekvenssiin, joka 5 koodaa noin 64 kilodaltonin molekyylipainoista proteiinia. Tämä sekvenssi on löydetty kaikista testatuista N. meningitidisin serotyypeistä ja seroryhmistä varmennettuna aminohappohybridisaatiolla sekä Western blotting-, Dot-blot- ja ELISA-määrityksillä. 10 Tämän keksinnön tekninen tavoite on tunnistaa se nukleotidisekvenssi, joka koodaa hyvin säilyvää proteiinia ja on yhteinen suurimmalle osalle Neisserian patogeenisistä kannoista (nimitys P64k), jotta prote- 15 iinia saataisiin rekombinoimalla korkean puhtausasteen omaavana ja kaupallisesti hyödynnettävinä määrinä niin, että sitä voidaan käyttää diagnosointimenetelmissä. 20 Geneettisen informaation (DNA ja RNA) tasolla keksintö tarjoaa rekombinoidun polynukleotidin, joka käsittää Neisseria meningitidisin P64k-proteiinia koodaavan nukleotidisekvenssin, jolloin mainitussa P64k-prote- 25 iinissa on olennaiena osana aminohapposekvenssi, joka on esitetty sekvenssilistassa SEQ ID NO:1. Rekombinoitu polynukleotidi voi edelleen käsittää kloonaavan tai ilmentävän vektorin nukleotidisekvenssin. 30 Keksintö tarjoaa lisäksi muunnetun mikro-organismin, joka sisältää edellä määritellyn rekombinoidun polynukleotidin, edullisesti muunnetun mikro-organismin, joka pystyy ilmentämään N. meningitidisin P64k-proteiinia. Keksinnön erityisen edullisessa suoritusmuodossa 35 muunnettu mikro-organismi on Escherichia coli-kanta, kuten E. coli HB101-kanta, joka on muunnettu ilmenemisvektorilla, joka sisältää N. meningitidisin P64k-

13 11 proteiinia koodaavan nukleotidisekvenssin, esimerkiksi ilmenemisvektorilla pm-6. Keksintö tarjoaa myös rekombinoidun proteiiniaineen, 5 joka käsittää ainakin osaksi N. meningitidisin P64kproteiinin aminohapposekvenssiä vastaavan aminohapposekvenssin, jolloin mainitussa P64k-proteiinissa on olennaisesti listassa SEQ ID NO:1 esitetty aminohapposekvenssi. Mainittu rekombinoitu proteiiniaine voi 10 koostua olennaisesti P64k-proteiinista tai olla fuusioproteiini tai proteiini/polysakkaridi-konjugaatti, joka käsittää N. meningitidisin P64k-proteiinin aminohapposekvenssin. 15 Keksintö tarjoaa lisäksi menetelmän Neisseria meningitidisin P64k-proteiinin tai P64k-proteiinin käsittävän fuusioproteiinin valmistamiseksi, jolloin mainittu P64k-proteiini sisältää olennaisesti aminohapposekvenssin, joka on esitetty listassa SEQ ID NO:1; 20 prosessi käsittää vaiheet, joissa mikro-organismi muunnetaan mainittua P64k-proteiinia tai mainittua fuusioproteiinia koodaavan nukleotidisekvenssin sisältävän ilmenemisvektorin avulla; muunnettuamikroorganismia viljellään mainitun P64k-proteiinin tai 25 mainitun fuusioproteiinin ilmentymän aikaansaami- seksi; ja mainittu ilmenemistuote eristetään.

14 12 Yksi tämän keksinnön uusi näkökohta on N. meningitidis B:4:P1.15-kannasta eristetty geeni, joka nimettiin M-6:ksi ja jonka pääominaisuutena on sen pysyvyys E. coli-vektoreissa. Tällä geenillä ei ole isännässä 5 haitallisia sivuvaikutuksia, jolloin voidaan saada yli 25 %:n kokonaisproteiinimääriä (P64k:n suhde isäntäkannan kokonaisproteiiniin). Toisaalta Southernja Western-blot -hybridisaatioilla on todettu (E.- Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98: ja W. Bur- 10 nette, 1981, Anal. Biochem. 12: ), että P64kproteiinia esiintyy kaikissa seuraavissa tutkituissa N. meningitidis -kannoissa: N. meningitidis A 15 N. meningitidis B:1 N. meningitidis B:2 N. meningitidis B:4 N. meningitidis B:5 N. meningitidis B:8 20 N. meningitidis B:9 N. meningitidis B:11 N. meningitidis B:15 N. meningitidis B:4:P1.15 N. meningitidis C 25 N. meningitidis B:15:P N. meningitidis B:15:P1.16 (H 44/76) N. meningitidis B:NT (121/85) N. meningitidis B:NT (71/86) N. meningitidis B:NT (210/86) sekä myös lajeissa N. mucosa, N. subflava ja N. gonorrhoeae. Proteiinia ei esiinny lajeissa N. cinerea, N. lac- 35 tamica, N. sicca ja N. flavescens, mutta nämä eivät ole kiinnostuksen kohteina, koska ne eivät ole patogeenisiä.

15 13 Noin 64 kda:n molekyylipainon omaava proteiini voidaan paikallistaa elektronimikroskoopilla N. meningitidisin ulkokalvolta. Tämä antigeeni on tällöin näkyvissä oleva antigeeni.proteiini tunnistettiin Western blot- 5 immunoidentifikaatiokokeilla käyttäen seerumia, joka saatiin toipilailta sekä yksilöiltä, jotka oli rokotettu tavanomaisella kuubalaisella rokotteella Va-Mengoc- BC (Centro Nacional de Biopreparados, Havanna, Kuuba). 10 Tämän keksinnön yksi tärkeä kohde on nukleotidisekvenssi, joka koodaa M-6-geeniä (SEQ ID NO:1 sekvenssilistassa), jonka tuote P64k-proteiini on. Tämä geeni johdettiin Kuubassa eristetyn B385-kannan genomista (N. meningitidis B:4:Pl. 15) konstruoimalla geenitiedos- 15 to EMBL 3 -faagilla. M-6-geenin sisältävä rekombinoitu DNA muodostaa tämän keksinnön toisen kohteen, johon kuuluu lambda-faagi, pm-3-plasmidi ja pm-6-ilmenemisvektori bakteereissa 20 ilmentämistä varten. Solunsisäistä ilmenemistä E. colissa varten M-6-geeni kloonattiin erityisesti tryptofaanipromoottorin avulla käyttäen sen omaa transkription lopetussignaalia ja 25 M-6-geenin ja NcoI-kloonauskohdan välistä yhdysosaa, joka lisää 5'-päähän seuraavan nukleotidisekvenssin: ATG CTA GAT AAA AGA (SEQ ID NO:2) 30 Plasmidiin pm-6 lisätyn M-6-geenin koodaaman P64k- proteiinin N-pää, joka liittää alkuperäisen proteiinin N-päähän 5 aminohappoa, vastaa sekvenssiä:

16 14 MLDKRMALVELKVPDIGGHENVDII (SEQ ID NO:3) 5 Tämän keksinnön kohteena ovat lisäksi ne mikroorganismit, jotka syntyvät E. coli HB 101 -kannan muunnoksessa pm-6-vektorin kanssa ja joille on tunnusomaista P64k-proteiinin suuri ilmenemisaste, hyvä elinkelpoisuus ja suuri pysyvyys E. colin muunnetulle kloonille annettiin nimitys HBM64 (Kuva 2), ja siinä esiintyy P64k-proteiinin yli 25 %:n ilmenemisaste suhteessa solun kokonaisproteiinimäärään (Kuva 6). ESIMERKKEJÄ: Näiden esimerkkien tarkoituksena on kuvata keksintöä mutta ei rajoittaa tämän keksinnön aihepiiriä. 20 ESIMERKKI 1: Genomi-DNA:n eristämiseksi N. meningitidis B:4:P1.15- kannastasolujakasvatettiinmueller-hinton-väliaineessa (OXOID, Lontoo). 100 ml:n viljelmän biomassa 25 sekoitettiin 8 ml:aan Tris-puskuria (hydroksimetyyliaminometaania), 100 mm, EDTA (etyleenidiamiinitetra-

17 15 etikkahappoa) 1 mm, ph 8. Solut käsiteltiin ensin lysotsyymillä (10 mg/ml), sitten 200 m1:11a itsepilkkovalla pronaasilla (20 mg/ml) ja 1,1 ml:11a 10-prosenttista natriumdodekyylisulfaattia (SDS). Seosta in- 5 kuboitiin 37 C:ssa 1 tunnin ajan, sitten se käsiteltiin fenolikloroformilla (v/v), ja fenolijäämät poistettiin käyttämällä 2-butanolia. Lopuksi DNA erotettiin absoluuttisella etanolilla ja RNA poistettiin A- ribonukleaasilla (Sigma, Lontoo). 10 Noin 60 kb:n DNA pilkottiin osittain Sau 3A-entsyymillä, millä saatiin noin 15 kb:n osien populaatio. Tämä enin osa eristettiin ja puhdistettiin erottamalla agaroosigeelissä (T. Maniatis et al., 1982, Molecular 15 Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab.: Cold Spring Harbor, New York). Geenitiedoston rakentamiseksi seurattiin olennaisesti Maniatisin kuvaamaa prosessia (T. Maniatis et al., , Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab.: Cold Spring Harbor, New York). Neljä i.tg puhdistettua DNA:ta sidottiin 8 mg:11abamhi:n avulla pilkottua EMBL-3:a. Sidontatuote pakattiin ja lopuksi faagit asetettiin levyillä E. coli C66P2-25 kannan yhteyteen. Tiedosto lajiteltiin immunoidentifikaatiolla (R. Young ja R. Davis, 1983, PNAS USA 80: ) käyttäen kaniinin seerumia, joka oli saatu N. meningitidis 30 B:4:P1.15-kannan ulkokalvoon kuuluvia proteiineja vastaan. Kloonit analysoitiin Western-blot-menetelmällä (Burnette, 1981), ja niistä löydettiin n.70 kda:n molekyylipainoisen P64k-proteiinin ilmentymä. Näin syntynyt rekombinoiva fagi nimettiin 31:ksi. Western- 35 blot-määritys tehtiin myös käyttämällä meningococcemiatoipilaista saatua seerumisekoitusta, jossa ei ole E. colin vasta-aineita, jolloin saatiin sama tulos kuin käyttämällä hyperimmunisoitua kaniinin seerumia.

18 16 5 Tämä koe toistettiin käyttämällä useilta terveiltä yksilöiltä saatua seerumia, ja saatu signaali oli rekombinoitua P64k-proteiinia vastaan negatiivinen. ESIMERKKI 2: Alakloonaamiseksi bakteereissa tiedostosta eristettyä faagia vastaava 17 kb:n lisäys kloonattiin puc18- plasmidissa, kun se oli erotettu faagin säikeistä 10 SalI-entsyymiä käyttäen. Tämän tuloksena syntyi pm1- rakenne (Kuva 2), jolle tehtiin restriktioanalyysi (Kuva 3). Noin 6 kb:n Sali-HindIII-osa kloonattiin uudelleen 15 puc18-plasmidissa ja saatiin pm-2-rakenne (Kuva 2). P64k-proteiinin geenikoodin paikallistamiseksi tehtiin poistoja entsyymien Clal, EcoRI ja HincII avulla. M- 6-geenin täydellinen osa paikannettiin lopuksi pm-3- rakennetta vastaavaksi EcoRI-HindIII-lisäykseksi 20 (Kuva 2). Kaikissa rakenteissa geenin esiintyminen vahvistettiin tunnistamalla proteiini pesäkeimmunoidentifikaation ja Western-blot-menetelmän avulla käyttäen hyperim- 25 munisoitua kaniinin seerumia. 30 Lisäyksen sekvenssi pm-3:ssa määritettiin Sangerin menetelmällä (F. Sanger et al., 1977, PNAS USA 74: ). Saadusta sekvenssistä pääteltiin geenin koodaaman proteiinin likimääräinen molekyylipaino. Rakenteen aikaansaamiseksi P64k-proteiinin korkeaa 35 ilmenemisastetta varten pm-3-plasmidi (Kuva 2) linearisoitiin EcoRI-entsyymin kanssa ja geenille tehtiin peräkkäisiä suppressioita, jolloin näyte inkuboitiin ExoIII- ja Sl-nukleaasien kanssa.

19 17 Näin syntyneet osat erotettiin muusta puc18-vektorista leikkaamalla HindIII-restriktioentsyymin avulla ja kloonattiin stabilisoivaan osaan fuusioituneena 5 (Eurooppalainen patenttihakemus EP-A ) käyttäen Xba-blunt-adapteria stabiloivan geenin XbaIkohdan säilyttämiseksi: 10 5' C T A G A T A A A A G A 3' (SEQ ID NO:4) 3 T A T T T T C T 5' (SEQ ID NO:5) Rakenteet, joissa fuusioitunut osa oli yhtenevä lukukehyksen kanssa, valittiin immunoidentifikaatiolla 15 käyttäen hyperimmuunia kaniinin seerumia. Lisäyssekvenssit määriteltiin käyttäen Sangerin menetelmää (F. Sanger et al., 1977, PNAS USA 74: ). Saaduista sekvensseistä pääteltiin tämän 20 geenin koodaaman proteiinin likimääräinen molekyylipaino. Proteiinien välinen fuusioalue paikannettiin geenisekvensseissä. Kloonissa pilm-25 (Fig. 4) tiedostosta 25 eristetyn DNA-lisäyksen sekvenssin ennaltamääräämän geenin ATG oli yhtenevä fuusiokohdan kanssa.. Stabiloivaa peptidiä koodaavaa sekvenssiä vastaava NcoI-XbaI-osa poistettiin pilm-25:stä, jolloin saatiin 30 tryptofaanipromootterin välityksellä ilmenevä eifuusioitunut proteiini ja sen alkuperäinen terminaattori oli N. meningitidis B:4:P1.15:stä pm-6-rakenteen mukaan (Kuva 1). 35 pm-6-plasmidi muunnettiin eri E. coli -kannoissa kuten kannoissa W3110, JA-221, HB-101, LE-392 ja MC-1061, ja P64k:n ilmenemistä verrattiin. Parhaat tulokset saatiin kannoissa W3110, JA-221 ja HB-101.

20 18 Nämä kannat valittiin laajemman fermentaation kohteeksi, ja näin saatiin jopa 25 %:n ilmenemisasteita solun kokonaisproteiinimäärissä. 5 ESIMERKKI 3: Kloonatun geenin oikean ilmenemisen varmistamiseksi kokonaisen proteiinin N-pään aluetta käsiteltiin Edmanin degradaatiomenetelmällä (P. Edman, 1950, Acta 10 Chem. Scand. 4: ). Tällä menetelmällä kuvataan tämän alueen sekvenssiä (primäärirakennetta) molekyylissä. P64k-proteiinista poistettiin suola geelifiltraatiok- 15 romatografian avulla (PD-10, Pharmacia), sitä liuotettiin veteen ja tarkasteltiin 280 nm:ssä. Proteiiniosa konsentroitiin 0,5 nm/g1:ksi. Yksi ml tätä liuosta 20 asetettiin polyvinylideenifluoridisuodattimelle (PVDF; Millipore), joka oli sitä ennen aktivoitu metanolilla. Edmanin degradaatio suoritettiin käyttäen Knauerin automaattista jaksotinta, malli 810, joka oli yhdistetty HPLC-järjestelmään (High Performance Liquid Chromatography), jotta voitaisiin löytää aminohappojen 25 fenyylitiohydantoiinijohdannaiset (PTH-aminohapot). Sekvenssoinnissa noudatettiin laitteen valmistajan suosittelemaa standardimenetelmää. PTH-aminohappojen erottaminen suoritettiin vastakkaisfaasipylväässä 35 (reverse phase column) C-18 (5 mm), 250 mm x 2 mm 30 (Merck), liuotettuna asetonitriiligradienttiin (Bpuskuri) natriumasetaatissa (A-puskuri), joka valmistettiin valmistajan ohjeiden mukaan, 200 ml/min virtauksena ja 42 C:ssa. PTH-aminohapot havaittiin 269 nm:ssä. Tietojenkäsittely ja tallennus tehtiin Shimadzu CR- 6a-mallin automaattisella integroijalla käyttäen kanden peräkkäisen kromatogrammin vähentävää tietojen-

21 19 käsittelyohjelmaa Edmanin degradaatiosyklien arvioimiseksi. Sekvenssi-identifikaatio saadaan vastaavan analysoidun syklin kromatografisen arvioinnin avulla ja vahvistetaan vähentämällä saadullakromatogrammilla, 5 jolloin voidaan määrittää 25 jäännöstä. ESIMERKKI 4: Sen osoittamiseksi, että kuubalaisella Va-Mengoc-BC- 10 valmisteella (Centro Nacional de Biopreparados, Havanna, Kuuba) rokotettujen yksilöiden seerumi tunnistaa P64k-proteiinin, tehtiin Western-blotmääritys 12 aikuiselta (jotka oli rokotettu kandella annoksella kuubalaista rokotetta) saadun seerumin 15 sekoituksella, joka oli laimennettu rasvatonta maitoa sisältävällä liuoksella (Oxoid, Lontoo). Koe sisälsi: 20 rekombinoitua P64k-proteiinia, joka oli puhdistettu pm-6-plasmidilla muunnetusta E. coli HB-101:stä; muuntamattoman E. coli HB-101:n ultraäänellä saatujen hajonneiden solujen supernatanttia; reaktio havaittiin proteiinin A-kolloidisen kultakon- 25 jugaatin avulla. Voitiin osoittaa, että P64k-proteiini tunnistetaan seerumisekoituksesta. 30 ESIMERKKI 5: Bakteerientuhoamiskoe B385:tä vastaan (B.4:P1.15) tehtiin Larrickin ym. kuvaaman menetelmän mukaan (Scand. J. Immunol. 32, 1990, ) eri muunnoksin. 35 Tämän tavoitteen perusteella tehtiin seos seuraavista: a) erityisolosuhteissa viljeltyjen bakteerien suspensio (1-5 bakteeripesäkkeitä muodostavaa yksikköä/1), b) Gey'n balansoitu suolaliuos,

22 20 c) kaniinin seerumia (3-4 viikkoa) täydennyslähteenä ja d) seerumiseos hiiriltä, jotka oli rokotettu alumiinihydroksidigeelissä olevaa P64k-proteiinia vastaan, 5 joka seerumi oli inaktivoitu 56 C:ssa 30 minuutin ajan. Hiirien rokottaminen suoritettiin 3 x 20 gg annoksen rokotuskaavion mukaisesti. Edellämainitussa seoksessa käytetyt suhteet olivat 1:2:1:1 kokonaistilavuuden ollessa 125 gl. Seosta inkuboitiin 37 C:ssa 10 1 tunnin ajan ja asetettiin levylle tuoreessa Mueller- Hinton-agarissa (Oxoid, Lontoo), jota oli täydennetty 5-prosenttisella vasikanseerumilla (CubaVet, Havanna). Eloonjääneet pesäkkeet laskettiin 18 tunnin kuluttua levyjen inkuboimisesta 5 % CO 2 -ilmastossa ja 37 C:n 15 lämmössä. Bakteereja tappavana määränä pidettiin seerumiliuoksen maksimilaimennosta, joka tarvitaan bakteerien kasvun 50-prosenttiseen estämiseen suhteessa samaan seokseen 20 ilman testiseerumia. Havaittiin, että 1:20 seerumilaimennoksessa säilyy vielä bakteereja tappava toimintakyky. Negatiivisina vertailuliuoksina (ei bakteereja tappavina 1: 2-laimennoksina) käytettiin alumiinihydroksidigeelillä rokotettujen hiirien seerumisekoitusta 25 ja kuubalaisella rekombinoidulla hepatiitti-b-rokotteella rokotettujen hiirien seerumisekoitusta. Bakteereja tappava vaikutus oli anti-p64k-vasta-ainespesifinen. 30 ESIMERKKI 6: N. meningitidisin eri kantoja vastaan tehtiin bakteerintuhoamiskoe, jossa käytettiin: Ammoniumsulfaattisaostumaa supernatantista, joka saatiin hybridomasolujen viljelmästä, jotka erittävät P64k-spesifejä monokloonisia vasta-aineita (anti- P64k)/Analysoitava näyte.

23 21 2. Ammoniumsulfaattisaostumaa supernatantista, joka saatiin hybridomasoluista, jotka erittävät N. meningitidis B385-kannassa esiintyvää P1.15-proteiinia 5 vastaan spesifejä monokloonisia vasta-aineita (anti- P1.15)/ Systeemin positiivinen vertailuaine. Testatut maksimilaimennokset olivat aina 1:16. Ne 10 testatut maksimilaimennokset, joilla oli esimerkin 5 mukainen bakteereja tappava vaikutus, on lueteltu alla: Kanta anti-p64k anti-p1.15 B385 1:16 1:16 15 B:4:P1.15 1:16 1:16 B:14:P1.7 1:16 B:NT:NT 1:16 B:15:P1.15 1:8 B:15:P1.16 1:8 20 B:13 1:8 C 1:16 A 1:16 Kuten taulukosta nähdään, anti-p64k monokloonisilla 25 vasta-aineilla on merkitsevät bakteereja tappavat tiitteriarvot bakteerien eri seroryhmiä (A, B, C), serotyyppejä (4, 14, 13, 15 ja NT) ja alatyyppejä (7, 15, 16 ja NT) vastaan. 30 ESIMERKKI 7: Fuusioproteiini M-14 (P64k ja P1.15) Proteiiniin P64k fuusioituneen P1.15-proteiinin 35 (N. meningitidis B:4:P1.15:n ulkokalvon proteiinin) eri epitoopit sisältävän suuren ilmenemisasteen geenirakenteen löytämiseksi kloonattiin P1.15-proteiiniakoodaava geeni käyttäen polymeraasiketjureaktiota

24 22 (Polymerase Chain Reaction, PCR). Seuraava P1.15:n eri immunodeterminantit sisältävä alue: 5 10 L Q L T E P P S K S Q P Q V K V T K A K S R I R T K I S D F G S FIGFKGSEDLGEGLKAVWQLEQDVSVAGGG ATQWGNRESFVGLAGEFGTLRAGRVANQFDD ASQAIDPWDSNNDVASQLGIFKRHDDMPVSV RYDSPDFSGFSGSVQFVPIQNSKSAYTPAYH Y T R Q N N A D V F V P A V V G K P G S D V Y V A G L N Y K N G GFAGSYAFKYARHANVGRNAFELFLLGSTS D E A (SEQ ID NO:6) lisättiin M-6-geenin Miul-kohtaan, joka koodaa P64k:ta, kun se oli ensin tylpistetty DNA-polymeraasi I:n klenow-osan avulla. Geenien P1.15 ja M-6 15 fuusiokohdat ovat: GDALQL (SEQ ID NO:7) Gly Asp Ala Leu Gln Leu 20 5'- GGC GAC GCG CTG CAG TTGA -3' (SEQ ID NO:8) M-6 P1.15 EANAYE (SEQ ID NO:9) 25 Glu Ala Asn*Ala Tyr Glu 5'- GAA GCC AAC GCG TAC GAA -3' P1.15 M-6 (SEQ ID NO:10) *: N ei kuulu mihinkään fuusioproteiiniin ja se syntyi 30 geenin rakennuksen yhteydessä. Syntynyt fuusioproteiini (M-14) ilmeni E. colissa käyttäen plasmidivektoria tryptofaanipromootterilla yli 10 %:n määrinä solun kokonaisproteiinista. 35 Western-blot-määrityksessä bakteereja tappavat monoklooniset vasta-aineet sekä anti-p1.15- ja P64k-polyklooniset vasta-aineet tunnistivat proteiinin.

25 23 ESIMERKKI 8: Polysakkaridi/P64k-konjugaatti. 5 Proteiini P64k konjugoitiin Haemophilus influenzaesta saadun polysakkaridin kanssa käyttäen pelkistävää aminointimenetelmää. Haemophilus influenzae -polysakkaridi (Polyribosyyliribitolifosfaatti, PRP) puhdistettiin Fraschin kuvaamalla kylmäfenolimenetelmällä 10 (teoksessa Bacterial Vaccines, 1990, Alan R. Liss, Inc., s ). PRP:n lopullinen proteiini- tai nukleiinihappokontaminaatio oli alle 1 %. Tämä polysakkaridi pilkottiin käyttäen Parikhin ym. menetelmää (1974, Methods in Enzymol. 34B: ), jossa natrium- 15 perjodaatissa olevaa PRP:tä (painosuhde 1:5) liuotettiin 0,1 M natriumasetaattiin (ph 4,5). Inkubointi tehtiin pimeässä 30 minuutin ajan sekoittaen. Perjodaattijäämä poistettiin lisäämällä ribitolia. Hyvin alhaisen molekyylipainon omaavat yhdisteet poistettiin 20 dialyysillä (Medicell International Ltd. Membrane, Lontoo). Syntyneessä oligosakkaridissa oli vapaita aldehydiryhmiä, jotka voivat reagoida primääristen amiinien (esim. proteiinien lysiinijäämien) kanssa. Konjugaatti muodostetaan sekoittamalla proteiinia ja. 25 polysakkaridia 1:1 painosuhteessa, lisäämällä natriumsyanoborohydridiä ja inkuboimalla seosta ensin 48 tuntia 4 C:ssa ja sitten 24 tuntia 37 C:ssa. Korkean molekyylipainon omaava yhdiste, joka sisältää syntynyttä konjugaattia ja proteiini/polysakkaridia suhteessa 30 1 : 2,3, voidaan erottaa ei-reaktiivisista kontaminanteista HPLC:n avulla. ESIMERKKI 9: 35 Euroopan molekyylibiologian laboratorion (EMBL) tietokannan selaamiseksi luotiin tietokoneohjelma,

26 24 joka myös havaitsee P64k:n ja muiden proteiinien samankaltaisuuden. Haun tuloksena havaittiin, että P64k-sekvenssin yhden osan ja N. gonorrhoeae -sekvenssien osien välillä oli samankaltaisuutta. Tämä 5 sekvenssi todettiin sekä N. gonorrhoeae:lle että N. meningitidisille tunnusomaiseksi (F.F. Correia, S. Inouye ja M. Inouye, 1988, J. Biol. Chem. 263, No. 25, ). 10 Toinen alue, jossa ilmeni paljon samankaltaisuutta, löydettiin kandesta E. coli K12:sta saatavan pyruvaattidehydrogenaasikompleksin proteiinista: a) E. colin asetyylitransferaasi ja N. meningitidisin 15 ulkokalvon P64k-proteiini. Samankaltaisuutta esiintyy 100 aminohapon muodostaman segmentin, jotka toistuvat asetyylitransferaasin aminohapposekvenssin alussa ("Lipoyl Domain", johon 20 kuuluu "Lipoyl Binding Site" [P.E. Stephens et al., 1983, Eur. J. Biochem. 133: ]) ja P64k:n 111 ensimmäisen aminohapon kohdalla olevan alueen välillä: 25 ',-IALVELKVPDIGGHENVDIIAVEVNVGDTIAV _ ****** _ * * * *** _* VKEVNVPDIGG DEVEVTEVMVKVGDKVAA (SEQ ID NO:11) (SEQ ID NO:12) DDTLITLETDKATMDVPAEVAGVVKEVKVKVG ***_* *** *_*** ******_** ** (SEQ ID NO:11) (jatk ) EQSLITVEGDKASMEVPAPFAGVVKELKVNVG (SEQ ID NO:12)(j-atk) 30 DKISEGGLIVVVEAEGT--AAAPKAESAA--A **- * **-- * ** **** ** * (SEQ ID NO:11) (jatk ) DKVKTGSLIMIFEVEGAAPAAAPAKQEAAAPA (SEQ ID NO:12) (jatk ) 35 PRKKPLKCRWVPQAAQFGG * * * * PAAKAEAPAAAPAAKAEGK (SEQ ID NO:11) (jatk (SEQ ID NO:12) (jatk missä (*) viittaa samojen aminohappojen kohtiin ja (-) viittaa säilyvien aminohappomuutosten kohtiin.

27 25 b) E. colin lipoamididehydrogenaasi ja N. meninaitidisin ulkokalvon P64k-proteiini. Samankaltaisuutta esiintyy E. colin lipoamididehydro- 5 genaasin (proteiinin, jossa on 473 aminohappoa, P.E. Stephens et al., 1983, Eur. J. Biochem. 133: ) ja P64k-proteiinin välillä, tarkemmin segmentissä, joka edustaa lähes koko proteiinia, lukuunottamatta asetyylitransferaasin "lipoyl domain" -alueen 10 kanssa samankaltaista osaa.

28 SADAEYDVVVIGGGPGGYSAAFAAADEGLKVA * _*****_**_****** ** ** STEIKTQVVVLGAGPAGYSAAFRCADLGLETV 2 IVERYKTLGGVCLNVGCIPSKALLHNAAVIDE *****_******************* * **_* IVERYNTLGGVCLNVGCIPSKALLHVAKVIEE VRHLAANGIKYPEPALDIDMLRAYKDGVVSRL ** ** _ ** *** * *_ * * AKALAEHGIVFGEPKTDIDKI TWKEKVINQL (SEQ ID NO:13) (SEQ ID NO:14) (SEQ ID NO:13)(jatk) (SEQ ID No:14)(jatk) (SEQ ID NO:13) (jatk) (SEQ ID NO:14) (jatk) 15 TG FGRYGEKRKVDVIQGDGQFLDPHHLEVSL ** ***_* * *_* ***_ TGGLAGMAKGRKVKVVNGLGKFTGANTLEVEG (SEQ ID NO:13) (jatk ) (SEQ ID NO:14) (jatk) 20 * ENG TAGDAYEQAAPTGEKKIVAFKNCIIAAGSRVT *----*-* ******* KTVINFDNAIIAAGSRPI (SEQ ID NO:13) (jatk) (SEQ ID NO:14)(jatk) KLPFIP EDPRIIDSSGALALKEVPGKLLIIG _***** ***** ** **_***** ** * (SEQ ID NO:13) (iatk ) 25 QLPFIPHEDPRIWDSTDALELKEVPERLLVMG (SEQ ID NO:14) (jatk ) 30 GGIIGLEMGTVYSTLGSRLDVVEMMDGLMQGA ************ _*** *****_* * (SEQ ID NO:13) (jatk) GGIIGLEMGTVYHALGSQIDVVEMFDQVIPAA (SEQ ID NO:14) (jatk ) DRDLVKVWQKQNEYRFDNIMVNTKTVAVEPKE *_*_***_ * * * _** ***_** (SEQ ID NO:13) (jatk) DKDIVKVFTKRISKKFN LMLETKVTAVEAKE (SEQ ID NO:14) (jatk ) 35 DGVYVTFEGANPPKEPQRYDAVLVAAGRAPNG **_***_** * *********** **_*** (SEQ ID NO:13) (jatk ) DGIYVTMEGKKAPAEPQRYDAVLVAIGRVPNG (SEQ ID NO:14) (jatk ) KLISAEKAGVAVTDRGFIEVDKQMRTNVPHIY 40 * *_****_*_***** ****_*******_ KNLDAGKAGVEVDDRGFIRVDKQLRTNVPHIF (SEQ ID NO:13) (jatk) (SEQ ID NO:11),jatk)

29 - 27 AIGDIVGQPMLAHKAVHEGHVAAENCAGTKAY **************_********* **_* * AIGDIVGQPMLAHKGVHEGHVAAEVIAGKKHY (SEQ ID NO:13) (jatk ) (SEQ ID NO:19)(j Io FDAAVIPGVAYTSPEVAWVGETELSAKRPAGK **_ *** ***_******* ** _** - _ (SEQ ID NO:13) (jatk ) FDPKVIPSIAYTEPEVAWVGLTEKEAKEKGIS (SEQ ID NO:19) (jatk ) ITKANFPWAASGRAIANGCDKPFTKLIFDAET 10 *- ******** ***--*-- -***** * *_ YETATFPWAASGRAIASDCADGMTKLIFDKES (SEQ ID NO:13) (jatk (SEQ ID NO:19) (jatk) GRIIGGGIVGPNGGDMIAKSALPSKLGCDAAD *_***_***_*** ****_* (SEQ ID NO:13) (jatk 15 HRVIGGAIVGTNGGELLGEIGLAIEMGCDAED (SEQ ID NO:14) (,jatk ) VGKTIHPRPTLGESIGMAAEVALGTCTDLPPQ *** *** **_*_**** *_ **** (SEQ ID NO: 13) (jatk ) 20 IALTIHAHPTLHESVGLAAEVFEGSITDLPNP (SEQ ID NO:19) (jatk ) 25 --KKK * * * KAKKK MEN1pd (SEQ ID NO: 13) (jatk ) EClpd (SEQ ID NO:14)(jatk) Missä: : adeniinin sitoutumiskohta (FAD) 1-2-1: redoksiaktiivinen disulfidialue 1-3-1: aktiivinen histidiinikohta 35 Kannan tallennukset: E. coli HB-101 klooni, joka sisältää pm-3-plasmidin (puc18-plasmidin, joka sisältää 4,1 kb DNA-osan Neisseria meningitidis -kannasta B:4:P1.15 kloonattuna

30 28 EcoRI- ja HindIII-restriktiokohtien väliin), tallennettiin Centraalbureau voor Schimmelcultures'iin (CBS), Baarn, Alankomaat, ja se sai talletusnumeron CBS

31 29 SEKVENSSILISTA 5 SEQ ID NO:1 SEKVENSSITYYPPI: Nukleotidi ja sitä vastaava aminohappo SEKVENSSIN PITUUS: 1830 bp SÄIKEISYYS: yksisäikeinen TOPOLOGIA: lineaarinen 10 MOLEKYYLITYYPPI: genominen DNA ALKUPERÄINEN LÄHDEORGANISMI: N. meningitidis ryhmä B VÄLITÖN KOKEEN LÄHDE: Kuubassa eristetty kanta B:4:P1.15 PIIRTEET: bp valmista proteiinia 15, OMINAISUUDET: N. meningitidisin ulkokalvon P64kproteiinia koodaava geeni ATG CTA GAT AAA AGA ATG GCT TTA GTT GAA TTG AAA GTG CCC 42 Met Leu Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Pro GAC ATT GGC GGA CAC GAA AAT GTA GAT ATT ATC GCG GTT GAA 84 Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala Val Glu GTA AAC GTG GGC GAC ACT ATT GCT GTG GAC GAT ACC CTG ATT 126 Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Vai Asp Asp Thr Leu Ile ACT TTG GAA ACC GAT AAA GCG ACT ATG GAC GTA CCT GCT GAA 168 Thr Leu Glu Thr Asp Lys Ala Thr Met Asp Val Pro Ala Glu GTT GCA GGC GTA GTC AAA GAA GTT AAA GTT AAA GTC GGC GAC 210 Val Ala Gly Val Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp AAA ATC TCT GAA GGT GGT TTG ATT GTC GTC GTT GAA GCT GAA 252 Lys Ile Ser Glu Gly Gly Leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu GGC ACG GCA GCC GCT CCT AAA GCC GAA TCG GCT GCC GCC CCG 294 Gly Thr Ala Ala Ala Pro Lys Ala Glu Ser Ala Ala Ala Pro

32 30 CGC AAG AAG CCC CTA AAC GTG CCG CTC CCT GCT CCG CAA GCC 336 Arg Lys Lys Pro Leu Asn Val Pro Leu Pro Ala Pro Gln Ala GCG CAA TTC GGC GGT TCT GCC GAT GCC GAG TAC GAT GTG GTC 378 Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu Tyr Asp Val Val GTA TTG GGT GGC GGT CCC GGC GGT TAC TCC GCT GCA TTT GCC 420 Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Ala GCT GCC GAT GAA GGC TTG AAA GTC GCC ATC GTC GAA CGT TAC 462 Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg Tyr AAA ACT TTG GGC GGC GTT TGC CTG AAC GTC GGC TGT ATC CCT 504 Lys Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro TCC AAA GCC TTG TTG CAC AAT GCC GCC GTT ATC GAC GAA GTG 546 Ser Lys Ala Leu Leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val CGC CAC TTG GCT GCC AAC GGT ATC AAA TAC CCC GAG CCG GAA 588 Arg His Leu Ala Ala Asn Gly Ile Lys Tyr Pro Glu Pro Glu CTC GAC ATC GAT ATG CTT CGC GCC TAC AAA GAC GGC GTA GTT 630 Leu Asp Ile Asp Met Leu Arg Ala Tyr Lys Asp Gly Val Vai TCC CGC CTC ACG GGC GGT TTG GCA GGT ATG GCG AAA AGC CGT 672 Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met Ala Lys Ser Arg AAA GTG GAC GTT ATC CAA GGC GAC GGG CAA TTC TTA GAT CCG 714 Lys Val Asp Val Ile Gln Gly Asp Gly Gln Phe Leu Asp Pro CAC CAC TTG GAA GTG TCG CTG ACT GCC GGC GAC GCG TAC GAA 756 His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala Tyr Glu CAG GCA GCC CCT ACC GGC GAG AAA AAA ATC GTT GCC TTC AAA 798 Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys Ile Val Ala Phe Lys AAC TGT ATC ATT GCA GCA GGC AGC CGC GTA ACC AAA CTG CCT 840 Asn Cys Ile Ile Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro

33 31 TTC ATT CCT GAA GAT CCG CGC ATC ATC GAT TCC AGC GGC GCA 882 Phe Ile Pro Glu Asp Pro Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gly Ala TTG GCT CTG AAA GAA GTA CCG GGC AAA CTG CTG ATT ATC GGC 924 Leu Ala Leu Lys Glu Val Pro Gly Lys Leu Leu Ile Ile Gly GGC GGC ATT ATC GGC CTC GAG ATG GGT ACG GTT TAC AGC ACG 966 Gly Gly Ile Ile Gly Leu Glu Met Gly Thr Val Tyr Ser Thr CTG GGT TCG CGT TTG GAT GTG GTT GAA ATG ATG GAC GGC CTG 1008 Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val Glu Met Met Asp Gly Leu ATG CAA GGC GCA GAC CGC GAT TTG GTA AAA GTA TGG CAA AAA 1050 Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys Val Trp Gln Lys CAA AAC GAA TAC CGT TTT GAC AAC ATT ATG GTC AAC ACC AAA 1092 Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn Ile Met Val Asn Thr Lys ACC GTT GCA GTT GAG CCG AAA GAA GAC GGC GTT TAC GTT ACC 1134 Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr TTT GAA GGC GCG AAC GCC CCT AAA GAG CCG CAA CGC TAC GAT 1176 Phe Glu Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp GCC GTA TTG GTT GCC GCC GGC CGC GCG CCC AAC GGC AAA CTC 1218 Ala Val Leu Val Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu ATC AGC GCG GAA AAA GCA GGC GTT GCC GTA ACC GAT CGC GGC 1260 Ile Ser Ala Glu Lys Ala Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly TTC ATC GAA GTG GAC AAA CAA ATG CGT ACC AAT GTG CCG CAC 1302 Phe Ile Glu Val Asp Lys Gln Met Arg Thr Asn Val Pro His ATC TAC GCC ATC GGC GAC ATC GTC GGT CAG CCG ATG TTG GCG 1344 Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile Val Gly Gln Pro Met Leu Ala CAC AAA GCC GTT CAC GAA GGC CAC GTT GCC GCC GAA AAC TGC 1386 His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu Asn Cys

34 32 GCC GGC AAC AAA GCC TAC TTC GAC GCA CGG GTG ATT CCG GGC 1428 Ala Gly Asn Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val Ile Pro Gly GTT GCC TAC ACT TCC CCC GAA GTG GCG TGG GTG GGC GAA ACC 1470 Val Ala Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr GAA CTG TCC GCC AAA GCC TCC GCG CGC AAA ATC ACC AAA GCC 1512 Glu Leu Ser Ala Lys Ala Ser Ala Arg Lys Ile Thr Lys Ala AAC TTC CCG TGG GCG GCT TCC GGC CGT GCG ATT GCC AAC GGT 1554 Asn Phe Pro Trp Ala Ala Ser Gly Arg Ala Ile Ala Asn Gly TGC GAC AAG CCG TTT ACC AAG CTG ATT TTT GAT GCC GAA ACC 1596 Cys Asp Lys Pro Phe Thr Lys Leu Ile Phe Asp Ala Glu Thr GGC CGC ATC ATC GGC GGC GGC ATT GTC GGT CCG AAC GGT GGC 1638 Glv Arg Ile Ile Gly Gly Gly Ile Val Gly Pro Asn Gly Gly GAT ATG ATC GCG AAG TCT GCC TTG CCA TCG AAA TGG GCT GCG 1680 Asp Met Ile Ala Lys Ser Ala Leu Pro Ser Lys Trp Ala Ala ACA CGT GCA GAC ATC GGC AAA ACC ATC CAC CCG CGC CCG ACC 1722 Thr Arg Ala Asp Ile Gly Lys Thr Ile His Pro Arg Pro Thr TTG GGC GAA TCC ATC GGT ATG GCG GCG GAA GTG GCA TTG GGT 1764 Leu Gly Glu Ser Ile Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu Gly ACT TGT ACC GAC CTG CCT CCG CAA AAG AAA AAA TAA 1800 Thr Cys Thr Asp Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys * ATCC GACTGAATAA ACAGCCGATA AGGT TTATTT GA 1836

35 33 5 SEQ ID NO:2 SEKVENSSITYYPPI: Nukleotidi SEKVENSSIN PITUUS: 15 emästä ATGCTAGATA AAAGA 15 SEQ ID NO:3 10 SEKVENSSITYYPPI: Aminohappo SEKVENSSIN PITUUS: 25 aminohappoa MOLEKYYLITYYPPI: N. meninqitidisin ulkokalvon P64kproteiinin N-pään sekvenssi 15 Met Leu Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile SEQ ID NO:4 SEKVENSSITYYPPI: Nukleotidi SEKVENSSIN PITUUS: 12 emästä CTAGATAAAA GA 12 SEQ ID NO:5 30 SEKVENSSITYYPPI: Nukleotidi SEKVENSSIN PITUUS: 8 emästä TCTTTTAT 8 35