(12) PATENTTIJULKAISU PATENTSKRIFT (10) FI 106844 B. (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats 30.04.2001. (51) Kv.Ik.7 - Intk1.7

11111111111111i111111 100 11(311111111,111i1111111111i 1111111 (12) PATENTTIJULKAISU PATENTSKRIFT (10) FI 106844 B (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats 30.04.2001 SUOMI - FINLAND (FI) (51) Kv.Ik.7 - Intk1.7 A61K 39/095, 39/395, C12N 15/31, CO7K 2/00 GO1 N 33/569, 33/577 (21) Patenttihakemus - Patentansökning 940681 PATENTTI- JA REKISTERIHALLITUS PATENT- OCH REGISTERSTYRELSEN (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag 14.02.1994 (24) Alkupäivä - Löpdag 14.08.1992 (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig 07.04.1994 (86) Kv. hakemus - Int. ansökan PCT/US92/06869 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet 15.08.1991 US 745591 P (73) Haltija - Innehavare 1 Board of Regents, the University of Texas System, 201 West Seventh Street, Austin, TX 78701, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) (72) Keksijä - Uppfinnare 1 Hansen,Eric J., 2404 Chamberlain, Piano, TX 75023, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) 2 Helminen,Merja, 6031 Pineland #1116, Dallas, TX 75231, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) 3 Maciver,lsobel, 6721 Larmanda, Suite 254, Dallas, TX 75231, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) (74) Asiamies - Ombud: Kolster Oy Ab Iso Roobertinkatu 23, 00120 Helsinki (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Menetelmä Moraxella catarrhalisin antigeeneihin liittyvien koostumusten ja vasta-aineiden valmistamiseksi sekä DNAsegmentti, yhdisteimävektori ja yhdistelmäisäntäsolu Förfaranden för framställning av kompositioner och antikroppar som hänför sig till antigener av Moraxella catarrhalis och DNA-segment, rekombinant vektor och rekombinant värdcell (83) Mikro-organismitalletus - Deposition av mikroorganism: 69043 ATCC 75285 ATCC 75286 ATCC HB11091 ATCC HB11092 ATCC HB11093 ATCC (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer (57) Tiivistelmä - Sammandrag Patenttiselitys liittyy valittuihin antigeenisiin proteiineihin, jotka on saatu Moraxellacatarrhaliksenulkomembraaneista ja joilla on havaittu olevan useita erilaisia käyttökelpoisia ominaisuuksia. Näille proto.ineille, joista käytetään nimitystä OMP:t (ulkomembraaniproteiinit, 'outer membrane proteins') on tunnusomaista se, että niiden suhteelliset moolimassat ovat noin 30 kd, 80 kd ja noin 200-700 kd. Tässä keksinnössä esitetyt tutkimukset osoittavat, että näitä proteiineja vastaan suunnatut monoklonaaliset vasta-aineet antavat suojan Moraxella catarrhalis -organismia vastaan eläinmallitutkimuksissa, mikä on osoituksena siitä, että nämä vasta-aineet ovat mandollisesti käyttökelpoisia synnyttämään passiivisen immuniteetin, sekä siitä, että nämä OMP:t tai niiden variantit ovat mandollisesti käyttökelpoisia rokotteiden valmistuksessa. Keksinnössä on myös kuvattu näitä OMP-molekyylejä koodaavia DNA-segmenttejä, menetelmiä antigeenien tai varianttien valmistamiseksi yhdistelmä-dna-menetelmiä käyttäen sekä diagnostisia menetelmiä ja sovellutusmuotoja.

106844 Förevarande uppfinning avser valda antigeniska proteiner, erhållna från yttre membran 1 Moraxella catarrhalis, vilka befunnits ha ett flertal användbara egenskaper. Dessa proteiner, benämnda OMP ("Outer Membrane Proteins"), karakteriseras av molekylvikter av ca 30 kd, 80 kd och mellan ca 200 och 700 kd, respektive. Studier, framförda i denna uppfinning, utvisar att monoklonala antikroppar, riktade mot dessa proteiner, ger en skyddande effekt mot infektion, förorsakad av Moraxella catarrhalisorganismer i djurmodeller, vilket visar den potentiella användbarheten av sådana antikroppar vid förlänande av passiv immunitet ävensom den potentiella användbarheten av dessa OMP, eller varianter av dem, vid framställningen av vacciner. Uppfinningen avser även DNA-segment, vilka kodar för dessa OMP, förfaranden för framställningen av antigener, eller varianter, genom användning av rekombinant DNA-teknik, ävensom diagnostiska förfaranden och tillämpningar.

1 106844 Menetelmiä Moraxella catarrhalisin antigeeneihin liittyvien koostumusten ja vasta-aineiden valmistamiseksi sekä DNAsegmentti, yhdistelmävektori ja yhdistelmäisäntäsolu 5 Keksinnön tausta Keksinnön ala Keksintö liittyy yleisesti Moraxella catarrhaliksen moniin erilaisiin ulkomembraaniproteiineihin (OMP:t). Tietyissä nimenomaisissa kohteissaan tämä keksintö koskee 10 menetelmää antigeenien valmistamiseksi, jotka antigeenit ovat SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla määritettyjen moolimassojensa perusteella ovat tunnistettavissa 30 kd:n ja 80 kd:n suuruisiksi antigeeneiksi sekä menetelmää kolmannen antigeenin valmistamiseksi, jota antigeeniä ni- 15 mitetään "suurimoolimassaiseksi proteiiniantigeeniksi" eli "HMWP-antigeeniksi, jonka moolimassa on alueella 200-700 kd. Tarkemmin tämä keksintö koskee menetelmää antigeenikoostumuksen valmistamiseksi, joka käsittää puhdistetun proteiini- tai peptidiantigeenin, joka sisältää Moraxella 20 catarrhaliksen 30 kd:n, 80 kd:n tai HMWP-OMP:n kanssa immunologisesti ristireagoivan epitoopin. Tämä keksintö koskee muissa kohteissaan näitä antigeeneja koodaavia yhdistelmä-dna-klooneja, näistä antigee-. neista peräisin olevia antigeenifragmentteja, niitä vastaa- 25 via molekyylejä sekä näiden molekyylityyppien kanssa reagoivia vasta-aineita. Tämä keksintö koskee myös DNAsegmenttiä, yhdistelmävektoria, yhdistelmäisäntäsolua sekä menetelmää vasta-aineen valmistamiseksi. Tämä keksintö koskee lisäksi menetelmiä Moraxella catarrhalis -antigee- 30 vien ja -vasta-aineiden havaitsemiseksi. Tekniikan taso Moraxella catarrhaliksen (joka on aiemmin tunnettu nimityksillä Branhamella catarrhalis tai Neisseria catarrhalis) arveltiin aikaisemmin olevan ylempien hengitysteiden 35 vaaraton saprofyytti. Viimeksi kuluneen vuosikymmenen aikana on kuitenkin tultu siihen johtopäätökseen, että tämä or-

2 106844 ganismi on ihmisen merkittävä patogeeni. Itse asiassa tämän gramnegatiivisen diplokokin on viimeaikaisissa tutkimuksissa osoitettu pitävästi olevan useiden infektioiden aiheuttaja ihmisellä [Murphy, (1989)]. Moraxella catarrhalis on 5 esimerkiksi tärkein välikorvantulehduksen, äkillisen poskiontelotulehduksen sekä alempien hengitysteiden yleisinfektioiden aiheuttaja [näitä kysymyksiä on käsitelty esimerkiksi julkaisussa Murphy, et al., (1989)]. Tutkimukset ovat selvästi osoittaneet, että Moraxella catarrhalis 10 -infektioista johtuvien välikorvantulehdusten sekä poskiontelotulehdusten ilmaantuvuus on lisääntymässä ja että tämä organismi on nykyisin kolmanneksi yleisin taudinaiheuttajaorganismi. Välikorvantulehdus on julkaistuissa raporteissa itse asiassa katsottu yleisimmäksi vauvaikäisille ja lap- 15 sille suunnattujen terveydenhoitotoimenpiteiden kohteena olevaksi taudiksi [Consensus, (1989)]. "Conåensus"-raportissa, johon edellä viitattiin, tultiin siihen johtopäätökseen, että välikorvantulehduksen ehkäiseminen on terveydenhuollon tärkeä päämäärä, koska 20 tautia esiintyy sekä vauvaikäisillä että lapsilla sekä kaikkiin ikäryhmiin kuuluvissa tietyissä populaatioissa. Välikorvantulehduksesta johtuvien taloudellisten kokonais- rasitusten on itse asiassa arvioitu olevan vuosittain aina- kin 2,5 miljardia, eli noin 3 å terveydenhuollon budjetis- 25 ta. Rokotteiden katsottiin useista syistä olevan halutuin ratkaisuvaihtoehto tämän taudin ehkäisemiseksi. Mikäli esi- merkiksi rokotteilla voitaisiin vähentää välikorvantuleh- duksen ilmaantuvuutta 30 prosentilla, niin arvioidut vuo- sittaiset säästöt terveydenhuollossa olisivat tällä tulok- 30 sella ainakin 400 miljoonaa dollaria. Vaikkakin rokotteiden kehittämisessä kandelle näistä kolmesta välikorvantulehduk- sen yleisestä patogeenista, jotka ovat Streptococcus pneu- moniae ja Haemophilus influenzae, on tapahtunut jonkin ver- ran edistystä, ei mikään viittaa samanlaiseen edistymiseen 35 Moraxella catarrhaliksen ollessa kyseessä. Tämä on erityi- sen huolestuttavaa huomioiden sen, että noin 17-20 5'6- kai-

3 106844 kista välikorvantulehdusinfektioista johtuu nykyisin Moraxella catarrhaliksesta [Murphy, (1989)]. Aiemmin on tehty yrityksiä sellaisten Moraxella catarrhaliksen antigeenien tunnistamiseksi ja luonnehtimisek- 5 si, jotka voisivat toimia infektiota vastaan muodostuneen ihmisen immuunivasteen potentiaalisina merkittävinä kohteina [Murphy, (1989); Goldblatt, et al., (1990); Murphy, et al., (1990)]. Yleisesti ottaen Moraxella catarrhaliksen pinta koostuu ulkomembraaniproteiineista (OMP:t), lipo- 10 oligosakkaridista (LOS) ja fimbrioista. Kuten Murphy korostaakin, vaikuttaa Moraxella catarrhalis olevan jonkin verran muista gramnegatiivisista bakteereista poikkeava siinä mielessä, että yritykset tämän organismin ulkomembraanin eristämiseksi solujen vaipan detergenttifraktioinnilla ovat 15 osoittautuneet yleensä johtavan epätyydyttäviin lopputuloksiin siinä mielessä, että suoritetuilla toimenpiteillä ei ole saatu yhtäpitäviä tuloksia. Preparaattien oli havaittu lisäksi olevan kontaminoituneita sytoplasmamembraaneilla, mikä viittaa siihen, että Moraxella catarrhaliksen solun 20 vaipan ominaisuudet ovat epätavalliset. Tällä alalla työskentelevät tutkijat ovat kuitenkin osoittaneet, että Moraxella catarrhaliksella on 7 tai 8 tärkeintä OMP-molekyylityyppiä, ja että nämä ovat melko yhdenmukaisia bakteerikannasta toiseen tutkittujen kantojen 25 suuresta vaihtelevuudesta huolimatta. Esimerkiksi Campagnari, et al., ovat merkinneet OMP-molekyylejä kirjaimilla A - H, jotka alkavat moolimassaltaan 98 kd:n suuruisesta vyöhykkeestä (OMP-A) ja jatkuvat noin 21 kd:n moolimassaiseen vyöhykkeeseen (OMP-A). [Campagnari, et al., (1987)]. 30 Moraxella catarrhaliksen LOS:ää on myös ehdotettu mandolliseksi rokotteiden kehityskohteeksi. LOS on eristetty Moraxella catarrhalis -kannoista ja se on tutkittu SDS- PAGE:11a ja hopeavärjäyksellä [Murphy, (1989)]. Raportin mukaan yhtä kantaa lukuunottamatta kaikki kannat tuottivat 35 samanlaiset tulokset LOS-värjäyksessä. Vaikuttaa siis siltä, että Moraxella catarrhaliksen LOS on säilynyt antigee-

4 106844 neiltään hyvin suuressa määrin muuttumattomana, minkä perusteella tulisi mandolliseksi käyttää LOS-molekyylin osaa rokotteen komponenttina. Lopuksi on mainittava, että fimbrioita on ehdotettu 5 mandollisiksi ehdokkaiksi rokotteisiin. Fimbrioilla on ilmeisesti osuutta joidenkin bakteerien kiinnittymisessä ja kolonisaatiossa limakalvojen onteloihin. Tällä alalla työskentelevät tutkijat ovat esittäneet sen väittämän, että mikäli fimbrioissa ilmentyy antigeeneina muuttumattomina säi- 10 lyviä epitooppeja, niin on mandollista, että näitä epitooppeja vastaan suunnatut vasta-aineet voisivat olla terapeuttisesti käyttökelpoisia tai että tällaiset epitoopit voisivat toimia rokotteen komponentteina. Vaikkakin Moraxella catarrhalis -solun useiden eri- 15 laisten osakomponenttien on ehdotettu olevan kohteita, joista rokotteiksi kelpaavia ehdokkaita voitaisiin ryhtyä etsimään, ei valitettavasti ole vielä tunnistettu yhtään tällaista ehdokasta. Minkään antigeenisen epitoopin tai antigeenisten epitooppien ei ole varmuudella osoitettu saavan 20 aikaan suojaavien vasta-aineiden muodostumista. On siten ilmeistä, että nykyisin on tarvetta ottaa selvää siitä, mitkä Moraxella catarrhaliksen komponenteista voisivat mahdollisesti toimia esimerkiksi sekä passiivisten että aktiivisten immunoterapeuttisten reagenssien, kuten rokotteiden, 25 valmistukseen soveltuvina käyttökelpoisina antigeeneina, mikäli näitä on lainkaan. Mikäli tällainen antigeeni tai tällaiset antigeenit saadaan tunnistettua, on lisäksi tarpeellista tuoda käyttöön menetelmiä ja koostumuksia, joilla näitä rokotteita on mandollista valmistaa sellaisia määriä, 30 että niiden laajamittainen käyttö hoito-ohjelmissa on mahdollista. Keksinnön yhteenveto Edellä olevan esityksen mukaisesti tämä keksintö koskee yleisessä ja kaikenkattavassa mielessä sairauden 35 diagnoosissa mandollisesti käytettävien Moraxella catarrha- liksen antigeenityyppien tunnistamista ja näiden valmistus-

5 106844 ta tunnistamisen jälkeen. Keksinnössä on yksityiskohtaisesti kyse siitä, että se koskee sen tekijöiden yllättävää havaintoa, että tietyt nimenomaiset Moraxella catarrhaliksen OMP-antigeenit, joihin kuuluvat 30 kd:n, 80 kd:n ja HMWP- 5 OMP-antigeenit, ovat erityisen käyttökelpoisia rokotteen kehittämisessä. Tämän johdosta tämän keksinnön tekijät ehdottavat, että näitä antigeeneja olisi mandollista käyttää komponenttina rokotetta valmistettaessa tai että niitä olisi mandollista käyttää vastaavan tai samanarvoisen antigee- 10 nin valmistamiseksi niiden jaksoa analysoimalla. On korostettava sitä, että tässä keksinnössä arvellaan näiden OMP-antigeenien joukosta juuri 30 kd- ja HMWPtyyppien osoittautuvan käyttökelpoisimmiksi siinä mielessä, että suoritetuissa tutkimuksissa on osoitettu näitä kahta 15 OMP-tyyppiä vastaan suunnattujen vasta-aineiden kykenevän reagoimaan laaja-alaisesti Moraxella catarrhaliksen alalajien ja isolaatioiden kanssa. 80 kd -tyyppiä vastaan suunnattujen vasta-aineiden ei kuitenkaan ole tähän mennessä osoitettu reagoivan kaikkien alalajien kanssa, eikä tämä 20 tyyppi siten saata olla yleisesti reagoiva. Tämän keksinnön erityisen edulliset sovellutusmuodot koskevat siten 30 kd:n ja HMWP-OMP-antigeenien valmistusta, näitä antigeeneja ja niitä muistuttavia molekyylityyppejä koodaavia DNA-fragmentteja sekä näitä antigeenityyppejä tunnistavien vasta- 25 aineiden ja muiden vastaavien molekyylien valmistusta. Keksinnön mukaiselle menetelmälle antigeenikoostumuksen valmistamiseksi, joka käsittää puhdistetun proteiini- tai peptidiantigeenin, joka sisältää M. catarrhaliksen 30 kd:n, 80 kd:n tai HMWP - OMP:n kanssa immunologisesti ris- 30 tireagoivan epitoopin, on tunnusomaista, että se käsittää vaiheet, joissa: a) valikoidaan solut, jotka kykenevät ilmentämään sellaisen epitoopin sisältävää proteiini- tai peptidiantigeeniä, joka ristireagoi immunologisesti M. catarrhaliksen 35 30 kd:n, 80 kd:n tai HMWP-OMP:n kanssa;

6 106844 b) viljellään soluja antigeenin ilmentymisen mahdollistavissa olosuhteissa; c) kootaan antigeeni talteen koostumuksen valmistamiseksi. 5 Keksinnön mukaiselle DNA-segmentille on tunnus- omaista se, että se koodaa proteiini-tai peptidiantigeeniä, johon sisältyy Moraxella catarrhaliksen 30 kd:n, 80 kd:n tai HMWP-OMP:n kanssa immunologisesti ristireagoiva epitooppi. Keksinnön mukaiselle yhdistelmävektorille on 10 tunnusomaista se, että siihen sisältyy patenttivaatimuksen 15 mukainen DNA-segmentti ja keksinnön mukaiselle isäntäsolulle on tunnusomaista se, että se käsittää käsittää patenttivaatimuksen 15 mukaisen DNA-segmentin. Lisäksi keksinnön mukaiselle menetelmälle vasta-aineen valmistamisek- 15 si on tunnusomaista se, että vasta-aine valmistetaan käyttäen immunogeeninä patenttivaatimuksessa 1 määriteltyä antigeeniä. Tietyissä sovellutusmuodoissa tämä keksintö siis koskee menetelmää antigeenikoostumuksen valmistamiseksi, 20 joka valmistettava antigeeni käsittää sellaisen epitoopin sisältävän puhdistetun proteiini- tai peptidiantigeenin, joka ristireagoi immunologisesti yhden tai useamman edellä olevan M. catarrhaliksen OMP-antigeenin kanssa. Vaikka puh- distettu proteiini- tai peptidiantigeeni käsittää tavalli- 25 sesti pelkän alkuperäisen OMP:n, niin tästä patenttiseli- tyksestä saadaan käyttöön menetelmiä, joita voidaan käyttää näiden OMP-antigeenien varianttien, alkuperäiseen antigee- niin liittyviä antigeenisiä epitooppeja sisältävien pepti- dien sekä niiden kaikkien antigeeneinä toimintakykyisten 30 vastineiden valmistamiseen. Koska tässä keksinnössä on ku- vattu useita erilaisia OMP-antigeenejä koodaavia DNA- segmenttejä, voidaan antigeenit lisäksi yhdistelmä-dna- tekniikkaa soveltamalla saada käyttöön olennaisesti sellai- sessa muodossa, ettei niissä esiinny muista M. catarrhalik- 35 sen antigeeneistä peräisin olevia antigeenisia epitooppeja. Tämä tarkoittaa sitä, että antigeeni voidaan valmistaa il-

7 106844 mentämällä yhdistelmä-dna:ta käyttäen muuta isäntäsolua kuin M. catarrhalista tai tämän sukulaislajia, minkä avulla antigeeni saadaan käyttöön olennaisesti antigeenisesti puhtaassa muodossa muihin M. catarrhaliksen antigeeneihin näh- 5 den. Näissä preparaateissa ei tämän johdosta olisi esimerkiksi LOS- tai fimbria-antigeenejä. Tässä keksinnössä kuvattuja DNA-segmenttejä voidaan vielä muissa sovellutusmuodoissa sekvensoida tavanomaista DNA:n sekvensointitekniikkaa käyttäen ja tästä DNA-sekvens- 10 siitä voidaan määrittää valittua OMP-proteiinia vastaava aminohappojakso riippumatta siitä, onko kyseessä 30 kd:n, 80 kd:n tai HMWP-OMP-molekyylityyppi. Kun tämä informaatio on saatu käyttöön, on sopivien antigeeniepitooppien tunnistaminen melko mutkatonta käyttämällä apuna esimerkiksi alan 15 ammattikokemuksen perusteella käyttöön saatavia tietokoneohjelmistoja tällaisten epitooppien ennustamiseksi. Näiden "epitooppisten ydinjaksojen" aminohappojakso voidaan sitten liittää vaivatta lyhyehköihin peptideihin joko peptidisynteesin avulla tai yhdistelmä- DNA-tekniikalla. 20 Edullisten peptidien pituus on tavallisesti 15-50 aminohapon suuruusluokkaa ja niiden pituus on edullisesti noin 15-30 aminohappoa. Tässä keksinnössä tehtävän ehdotuksen mukaisesti on valitun OMP:n epitooppeja sisältävistä lyhyehköistä antigeenisistä peptideistä hyötyä tie- 25 tyissä olosuhteissa, esimerkiksi rokotteiden valmistuksessa tai immunologisissa havaitsemismäärityksissä. Esimerkkeihin näistä hyödyllisistä piirteistä kuuluu se, että niiden avulla kyetään välttämään kontaminaatio- ja puhtausasteongelmia, joita esiintyy usein yhdistelmä-dna-tekniikalla 30 tuottamalla valmistettujen proteiinien yhteydessä, koska tämänpituiset peptidit ovat valmistettavissa vaikeuksitta synteettisesti peptidisynteesilaitteilla. Muissa sovellutusmuodoissa tämä keksintö koskee menetelmiä sellaisten koostumusten valmistamiseksi, joihin 35 sisältyy puhdistettuja proteiini- tai peptidiantigeenejä, joihin kuuluu 30 kd:n, 80 kd:n tai HMWP-OMP-molekyylityyp-

8 106844 pien kanssa immunologisesti ristireagoivia epitooppeja. Näihin menetelmiin kuuluvan yleisen käytännön mukaisesti valitaan ensin käyttöön solut, jotka kykenevät ilmentämään tällaista proteiini- tai peptidiantigeeniä, viljellään näi- 5 tä soluja antigeenin ilmentymisen mandollistavissa olosuhteissa ja otetaan antigeeni talteen sellaisen koostumuksen valmistamiseksi, johon tätä antigeenia käytetään. Haluttaessa valmistaa varsinainen OMP-antigeeni on haluttua valmistaa ensimmäisenä vaiheena M. catarrhalis -soluviljelmä. 10 Tässä tapauksessa antigeeni saadaan ilmentymisensä jälkeen käyttöön solun ulkomembraanifraktiosta. Antigeeni valmistetaan sitten valmistamalla ensin membraanifraktio, jonka jälkeen suoritetaan antigeenin solubilisointi ja sen uutto valmistetuista membraaneista käyttäen ionittuvaa tai ionit- 15 tumatonta detergenttiä. Antigeeni voidaan puhdistaa pidemmälle useilla erilaisilla menetelmillä, joihin kuuluvat fraktiointi pylväässä, isoelektrinen fokusointi ja muut näitä muistuttavat menetelmät tai jopa immunoadsorptio OMP:tä vastaan suunnattuja vasta-aineita käyttäen. 20 Tässä esitetyn patenttiselityksen valossa voidaan halutun antigeenin valmistamiseksi valita luonnollisesti käytettäväksi edellä kuvattuja sovellutusmuotoja edullisempia sovellutusmuotoja, joihin kuuluu antigeenia koodaavan DNA-segmentin ilmentäminen yhdistelmäisäntäsolussa. Edulli- 25 sia yhdistelmäisäntäsoluja kuvattujen antigeenien ilmentämiseksi ovat tyypillisesti bakteeri-isäntäsolut siinä mielessä, että antigeeni on bakteerin antigeeni. Edullisiin bakteeri-isäntäsoluihin kuuluvat E. coli, H. influenzae, Salmonella-lajit, Mycobacterium-lajit tai jopa Bacillus 30 subtilis -solut. Haluttaessa voidaan haluttua antigeenia tai haluttuja antigeenejä luonnollisesti myös ilmentää eukaryoottisoluissa. Kuten edellä mainittiin, tämä keksintö koskee tietyissä sovellutusmuodoissaan haluttua proteiini- tai pepti- 35 diantigeenia koodaavia DNA-segmenttejä. Tässä keksinnössä on kuvattu menetelmiä, joilla tällaisia segmenttejä saadaan

9 106844 käyttöön puhtaina niiden luonnolliseen esiintymisympäristöön verrattuna. Näillä DNA-segmenteillä on useita etuja ja käyttömuotoja. Kokonaista OMP-geeniä koodaavat segmentit voidaan esimerkiksi viedä yhdistelmäisäntäsoluihin ja näitä 5 voidaan käyttää koko proteiiniantigeenin ilmentämiseen. Vaihtoehtoisesti voidaan yhdistelmä-dna-tekniikkaa soveltamalla valitun OMP-geenin pienempiä osia tai johdannaisia käyttää sellaisten lyhyehköjen peptidijaksojen valmistamiseen, joihin kuitenkin vielä sisältyy haluttuja antigeenie- 10 pitooppeja. Lisäksi tämän keksinnön mukaisia DNA-jaksoja voidaan kohdemutageneesimenetelmillä muokata uuteen muotoon koodaavan jakson muuttamiseksi, esimerkiksi epitooppien ydinjaksojen antigeenisyyttä parantavien muutosten tekemiseksi ja sitä kautta antigeenisilta ominaisuuksiltaan vas- 15 taavien toimintakykyisten peptidien aikaansaamiseksi. Haluttaessa voidaan myös luonnollisesti valmistaa fuusiopeptidejä esimerkiksi sijoitettaessa samassa ilmentämisyksikössä antigeenia koodaavia alueita jonkin toisen halutun antigeenin tai sellaisten proteiinien tai peptidien yhtey- 20 teen, jotka sisältävät haluttuja toimintoja, kuten immunologisiin havaitsemistarkoituksiin tulevia toimintoja (esimerkiksi entsyymileimaa koodaavat alueet). Käytetyn isäntäjärjestelmän mukaan voidaan tiettyjä nimenomaisia etuja saada silloin, kun tämän keksinnön mu- 25 kaiset DNA-segmentit on liitetty asianomaisiin vektorijaksoihin, jotka voivat esimerkiksi parantaa isäntäsolujen transfektiotehokkuutta. Bakteeri-isäntäsoluja käytettäessä on ehdotettu voitavan käyttää käytännöllisesti katsoen mitä tahansa tällä alalla tunnettua vektoria, joka soveltuu va- 30 litulle isäntäsolulle. E. colin ollessa kyseessä voidaan siten saada tiettyjä etuja käyttämällä plasmidivektoreita, kuten pbr322:ta, tai bakteriofageja, kuten 7GEM - 11:tä. Muita erityisiä esimerkkejä on kuvattu tuonnempana. Sellaisia yhdistelmäkloonipankkeja valmistettaessa, 35 joista valikoidaan asiaankuuluvalla tavalla transfektoitu- neita soluja, on asianlaita tavallisesti niin, että valit-

10 106844 tuja OMP-geenijaksoja voidaan ilmentää näissä isäntäsoluissa käyttämättä vektoreita, joilla on näille itselleen ominaisia promoottorijaksoja. Tämä johtuu siitä, että kloonipankin valmistamiseen käytettyihin M. catarrhaliksen geno- 5 min DNA-fragmentteihin sisältyy useisiin erilaisiin koodaaviin jaksoihin liittyviä endogeenisia promoottoreja. Tämän keksinnön tekijät kuitenkin ehdottavat, että viime kädessä voi olla haluttua muokata tässä kuvattua antigeenia koodaavien fragmenttien promoottorialue uudelleen heterologisen 10 promoottorin liittämiseksi. Tämä voi mandollistaa OMPantigeenin yli-ilmentymisen verrattuna sen luonnolliseen ilmentymiseen M. catarrhalis -soluissa. Tämän keksinnön mukaisilla nukleiinihapposegmen- teillä katsotaan olevan useita muita käyttömuotoja kuin ne, 15 jotka liittyvät antigeenisten peptidien tai proteiinien il- mentämiseen. Esimerkiksi nukleiinihapposegmenttejä, joiden pituus on ainakin noin 14 nukleotidia ja joihin sisältyy OMP-geenijakson alueita, voidaan käyttää selektiivisinä hy- bridisaatiokoettimina valikoiduissa näytteissä olevien M. 20 catarrhaliksen jaksojen havaitsemiseksi tai esimerkiksi kloonipankkien seulomiseen sellaisten kloonien tunnistami- seksi, jotka käsittävät vastaavia tai näitä muistuttavia jaksoja. Lyhyitä segmenttejä voidaan lisäksi käyttää nukle- iinihappoalukkeina, kuten PCR-menetelmän yhteydessä käytet-. 25 tävinä alukkeina, missä tahansa lukuisista sovellutuksista, joihin kuuluvat esimerkiksi kloonaus- ja muokkaustoimenpiteet tai PCR:ään perustuvat havaitsemismenetelmät. Tämä keksintö koskee vielä muissa sovellutusmuodoissaan sellaisten vasta-aineiden valmistusta, jotka kyke- 30 nevät muodostamaan immunologisia komplekseja OMP-antigeenin.. epitooppien kanssa. Tiettyjä nimenomaisia menetelmiä tässä kuvattujen vasta-aineiden valmistamiseksi on kuvattu tuonnempana. Tässä keksinnössä esitetään kuitenkin käytettäväksi yleensä mitä tahansa tällä alalla tunnettua vasta- 35 aineiden valmistusmenetelmää, joka voi perustua joko monoklonaaliseen tekniikkaan tai polyklonaaliseen tekniik-

11 106844 kaan. Tässä kuvattujen OMP-antigeenien epitooppeja voidaan käyttää rokotekoostumusten valmistamisessa. Edellä esitetyn perusteella tämä keksintö kohdistuu sekä menetelmään tämän keksinnön mukaisesti valmistettujen antigeenin sisältävien 5 rokotekoostumusten valmistamiseksi että menetelmään tällaista antigeenia vastaan suunnattujen vasta-aineiden valmistamiseksi, joiden yhteydessä käytetään farmaseuttisesti hyväksyttävää kantaja-ainetta, laimenninta tai adjuvanttia. Tässä kuvataan vielä immunologisia havaitsemismene- 10 telmiä. Tässä keksinnössä ehdotetaan, että sen mukaisesti valmistettuja antigeenejä voitaisin käyttää näiden antigeenien kanssa reagoivien vasta-aineiden havaitsemiseksi tai vaihtoehtoisesti sitä, että tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja vasta-aineita voitaisiin käyttää antigeenien ha- 15 vaitsemiseen. Näihin menetelmiin kuuluvat tavallisesti vaiheet, joissa hankitaan ensin käyttöön näyte, jonka epäillään sisältävän tällaista vasta-ainetta tai antigeenia, minkä jälkeen näyte saatetaan kosketukseen tämän keksinnön mukaisesti valmistetun vasta-aineen tai antigeenin kanssa 20 kulloinkin kyseessä olevan tapauksen mukaisesti olosuhteissa, joissa vasta-aineen on mandollista muodostaa immunokompleksi havaittavana olevan vasta-aineen tai antigeenin kanssa, ja havaitaan antigeenin esiintyminen näytteessä immunokompleksin muodostumisesta tehtävän havainnon avulla. 25 Immunokompleksin muodostumista koskevien havaintojen teko on yleensä melko hyvin tunnettua tällä alalla ja tähän tarkoitukseen on käytössä useita erilaisia mandollisia ratkaisutapoja. Tässä keksinnössä ajatellaan esimerkiksi käytettäväksi ELISA-, RIA-, immunoblotti- ja täpläblot- 30 timenetelmiä ja epäsuoria immunofluoresenssimenetelmiä ja. muita näitä vastaavia menetelmiä. Immunokompleksin muodostuminen havaitaan tavallisesti käyttämällä leimaa, kuten radioaktiivista leimaa tai entsyymileimaa (kuten alkalista fosfataasia, piparjuuriperoksidaasia tai muuta vastaavaa 35 leimaa). Muita etuja voidaan luonnollisesti saada käyttämällä sekundääristä sitoutuvaa ligandia, kuten toista vas-

12 106844 ta-ainetta tai biotiinista ja avidiinista muodostuvaa ligandia sitovaa järjestelmää, tällä alalla tunnetulla tavalla. Tässä keksinnössä ehdotetaan diagnostisiin tarkoi- 5 tuksiin käytettäväksi käytännöllisesti katsoen mitä tahansa mandollista näytettä, jonka epäillään sisältävän havaittavana olevaa antigeenia tai vasta-ainetta. Esimerkkeihin näistä näytteistä kuuluvat kliiniset potilasnäytteet, kuten veri- tai seeruminäytteet, vanutikulla korvasta otetut 10 näytteet, sylkinäytteet tai välikorvaneste, tai voidaan ehkä käyttää jopa virtsanäytteitä. Lisäksi näitä sovellutusmuotoja ajatellaan voitavan soveltaa ei-kliinisiin näytteisiin, kuten antigeeni- tai vasta-ainenäytteiden titraukseen tai hybridoomien selektioon ja muihin näitä muistuttaviin 15 sovellutuksiin. Piirrosten pääpiirteittäinen kuvaus Kuvio 1: M. catarrhaliksen proteiinien Westernblottausanalyysi, jossa koettimena oli käytetty 80 kd:n OMP:n tunnistavaa monoklonaalista 10F3-vasta-ainetta. Kana- 20 va A on Rainbow-proteiinimoolimassamarkkeri (14,3-200 kd:n suuruiset moolimassat, Amersham); kanava B on negatiivinen kontrolli, joka käsittää 4B1/pBR322/RR1:n kokosolulysaatin (4B1 on M. catarrhaliksen geeni, joka koodaa tutkittavista proteiineista täysin poikkeavaa monoklonaali- 25 sen 4B1-vasta-aineen tunnistamaa proteiinia); kanavat C ja D ovat 10F3/pBR322/RR1:n kokosolulysaatteja; ja kanava E on nollakoekontrolli. Kuvio 2: pmeh120:n alustava restriktiokartta, joka käsittää Mab 10F3:n kanssa reagoivaa 80 kd -antigeenia koo- 30 daavan segmentin. Kuvio 3: MEH200-faagin alustava restriktiokartta, joka käsittää Mab 17C7:n kanssa reagoivaa HMWP-antigeenia koodaavan segmentin. Kuvio 4: M. catarrhaliksen proteiinien Western- 35 blottausanalyysi, jossa koettimena oli käytetty 30 kd:n OMP:n tunnistavaa monoklonaalista 8B6-vasta-ainetta. Kanava

13 106844 A on Rainbow-proteiinimoolimassamarkkeri (14,3-200 kd:n suuruiset moolimassat, Amersham); kanava B on edeltä käsin värjätty pienimoolimassainen SDS-PAGE-standardi (16-110 kd:n suuruiset moolimassat, Bio-Rad); kanava C sisältää 5 30 kd:n OMP:tä ilmentävän yhdistelmä-e. colin (LE392/8B6) faagilysaatista peräisin olevia proteiineja; kanava D on nollakoekontrolli; kanava E on negatiivinen kontrolli (HMWP-OMP:tä ilmentävästä yhdistelmä-e. colista, LE392/17C7:stä, peräisin oleva faagilysaatti); ja kanava F 10 on positiivinen kontrolli (M. catarrhalis 035E:n ulkomembraanivesikkeleitä). Kuvio 5: M. catarrhaliksen proteiinien Westernblottausanalyysi, jossa koettimena oli käytetty HMWP-OMP:n tunnistavaa monoklonaalista 17C7-vasta-ainetta. Kanava A on 15 Rainbow-proteiinimoolimassamarkkeri (14,3-200 kd:n suuruiset moolimassat, Amersham); kanava B on edeltäkäsin värjätty pienimoolimassainen SDS-PAGE-standardi (16-110 kd:n suuruiset moolimassat, Bio-Rad); kanavat C, D ja E sisältävät HMWP-OMP:tä ilmentävän yhdistelmä-e. colin (LE392/17C7) 20 faagilysaatista peräisin olevia proteiineja; kanava F on nollakoekontrolli-; kanava H on negatiivinen kontrolli (30 kd:n OMP:tä ilmentävän yhdistelmä-e. colin faagilysaatti, E. coli/8b6 -faagilysaatti); ja kanava G on positiivinen kontrolli (M. catarrhalis 035E:n ulkomembraanivesikke- 25 leitä). Edullisten sovellutusmuotojen yksityiskohtainen se- litys Tämä keksintö liittyy siihen, että sen tekijät ovat tunnistaneet Moraxella catarrhaliksen tiettyjä nimenomaisia 30 ulkomembraaniproteiineja (OMP:t), joilla on havaittu olevan erityisen käyttökelpoisia ominaisuuksia esimerkiksi diagnostisten reagenssien valmistuksessa. Nämä proteiinit vaikuttavat luonnollisessa tilassaan olevan esillä solun pinnalla ja niiden moolimassat ovat noin 30 kd, 80 kd ja noin 35 200-700 kd:n alueella, vastaavassa järjestyksessä mainit- tuna, SDS-PAGE:lla määritettynä. Tietyt nimenomaiset sovel-

14 106844 lutusmuodot liittyvät näiden proteiinien, antigeenisten osafragmenttien, varianttien ja muiden näitä vastaavia molekyylejä koodaavien jaksojen kloonaamiseen yhdistelmä-dnatekniikalla. Tämä keksintö liittyy myös menetelmään näitä 5 M. catarrhaliksen OMP-molekyylejä vastaan suunnattujen monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseen. Tämän patenttiselityksen suojapiiriin kuuluvat yhdistelmä-dna-kloonit, jotka ilmentävät yhtä tai useampaa valittua OMP-molekyyliä ja joita voidaan käyttää puhdistettujen OMP-antigeenien se- 10 kä mutatoituneiden tai varianttiproteiinityyppien valmistamiseen merkittävinä määrinä. Valitun OMP-antigeenin ja sen varianttien otaksutaan olevan merkittävässä määrin käyttökelpoisia M. catarrhalis -infektioiden diagnoosissa. Näitä OMP-antigeenejä tai peptidivariantteja ehdotetaan käytettä- 15 väksi esimerkiksi mandollisissa M. catarrhaliksen havaitsemiseen tarkoitetuissa immunomäärityksissä. Alan ammattimiesten avustamiseksi tämän keksinnön kohteiden pitkälle menevien yksityiskohtien käytössä talletettiin sellaiset yhdistelmä-dna-kloonit, joissa kussakin 20 oli 30 kd:n, 80 kd:n ja HMWP-OMP-antigeenejä koodaavat DNAsegmentit, talletuslaitokseen American Type Culture Collection (ATCC) 4.8.1992 Budapestin sopimuksen ehtojen mukaisesti. Yksityiskohtaisesti ilmoitettuna plasmidi pmeh300 (ATCC:n hakunumero 69 049), jossa on 30 kd:n OMP-antigeeniä 25 koodaava segmentti; plasmidi pmeh120 (ATCC:n hakunumero 75 285), jossa on 80 kd:n OMP-antigeeniä koodaava segmentti; ja faagi MEH 200 (ATCC:n hakunumero 75 286), jossa on HMWP-antigeeniä koodaava segmentti, talletettiin joko faagilysaatin muodossa (MEH 200), puhdistetun plasmidi-dna:n 30 muodossa (pmeh120) tai yhdistelmä-e. coli -kannan RR1 (pmeh300) muodossa. pmeh300-plasmidi voidaan luonnehtia modifioiduksi plg338-vektoriksi, jossa plg338 oli pilkottu XhoI:llä ja johon oli lisätty SacI-kytkijäjaksot. Tämä uusi vektori si- 35 sältää Moraxella catarrhaliksen kromosomaalisesta DNA:sta koostuvan liitosjakson, joka on noin 20 ke:n suuruinen ja

15 106844 joka voidaan irrottaa pilkkomalla SacI:llä. Tämä liitosjakso sisältää monoklonaalisen vasta-aineen 8B6 kanssa reagoivaa 30 kd:n antigeeniä koodaavan M. catarrhaliksen geenin. Koko vektori on siten noin 27 ke:n suuruinen ja vektori kä- 5 sittää vain noin 7,3 ke. 80 kd:n OMP:tä koodaava geeni kloonattiin alunperin pbr322:een perustuvassa yhdistelmä-dna-plasmidissa, jolle oli annettu nimitys pmeh100. Tämä geeni jatkokloonattiin myöhemmin pbluescriptissä sen jakson analysoimiseksi. 10 ATCC:hen talletettu plasmidi oli juuri tämä uusi plasmidi, jolle oli annettu nimitys pmeh120. Yhdistelmä-DNA-plasmidi pmeh120 on pbluescript II SK+ -vektori, joka sisältää M. catarrhaliksen kromosomaalisesta DNA:sta muodostuvan liitosjakson, jonka suuruus on noin 4,5 ke ja joka koodaa noin 15 80 kd:n suuruista proteiinia, joka kykenee reagoimaan monoklonaalisen 10F3-vasta-aineen kanssa. pmeh120:n alustava restriktiokartta on esitetty kuviossa 2. Mab 17C7:n kanssa reagoivaa HMWP-OMP-antigeeniä koodaavaa geeniä ei jatkokloonattu 2.GEM-11-faagista MEH200, 20 jota käytettiin tuonnempana esitetyissä esimerkeissä kuvattuun kloonaustyöhön.?,gem-11-faagivektori sisältää M. catarrhaliksen kromosomaalisesta DNA:sta muodostuvan liitosjakson, jonka on kooltaan noin 11 ke ja joka voidaan irrottaa faagin DNA:sta pilkkomalla joko SfiI:llä tai SacI:llä. 25 Alustava restriktiokartta on esitetty kuviossa 3. Tässä keksinnössä esitetyn yksityiskohtaisen patenttiselityksen valossa on tämän alan ammattimiehille selvää, että edellä olevien ATCC:hen talletettujen tai joidenkin muiden erityisten sovellutusmuotojen tarkoituksena ei 30 ole millään tavoin rajoittaa tätä keksintöä. Tarkasteltavaksi valittua OMP-antigeeniä tai niiden variantteja koodaavat nukleiinihappojaksot voivat olla käyttökelpoisia M. catarrhaliksen havaitsemiseen tarkoitetussa hybridisaatio- tai polymeraasiketjureaktio (PCR) 35 -menetelmässä. Edellä olevien näkökohtien perusteella tämän keksinnön selitykseen sisältyy informaatiota, jota voidaan

16 106844 keksinnön selitykseen sisältyy informaatiota, jota voidaan käyttää useiden sellaisten erilaisten DNA-fragmenttien valmistamiseen, joilla on lukuisia mandollisia käyttömuotoja, kuten antigeenin suhteellisten lyhyiden immunogeenisten tai 5 antigeenisten peptidyyliosafragmenttien valmistus, DNA- tai RNA-jaksojen käyttö koettimina PCR- tai hybridisaatiotutkimuksissa bakteerin havaitsemiseksi in vitro -olosuhteissa, sekä M. catarrhalis -infektioiden tutkimukseen ja diagnoosiin liittyvät muut käyttökelpoiset lääketieteelliset ja 10 biolääketieteelliset sovellutukset. Tämän keksinnön mukaisesti valmistetuista OMP-antigeeneistä käytetään nimityksiä 30 kd:n OMP, 80 kd:n OMP ja HMWP-OMP. Nämä proteiinit tunnistetaan tässä keksinnössä monoklonaalisilla vasta-aineilla, jotka on valikoitu M. ca- 15 tarrhaliksen ulkomembraanivesikkeleitä vastaan suunnattujen monoklonaalisten vasta-aineiden kokoelmasta. Näitä vastaaineita käytettiin Western-blottauskoettimina vastaavien antigeenien tunnistamiseksi M. catarrhalis 035E:n ulkomembraanivesikkelipreparaattien SDS-PAGE-analyyseissä. 30 kd:n 20 OMP:n tunnistavalle monoklonaaliselle vasta-aineelle on annettu nimitys 8B6, 80 kd:n OMP:n tunnistavalle vastaaineelle on annettu nimitys 10F3 ja HMWP kd-antigeeniä tunnistavasta vasta-aineesta on käytetty nimitystä 17C7 (nämä on esitetty kuvioissa 1, 4 ja 5). 25 Yhdistelmä-DNA-vektorien ja -kloonien talletusta vastaavasti talletettiin 30.7.1992 ATCC:hen Budapestin sopimuksen ehtoja noudattaen myös hybridoomat, jotka erittävät edullisia OMP-antigeenejä tunnistavia edellä mainittuja monoklonaalisia vasta-aineita. Talletetut hybridoomat erit- 30 tävät 30 kd:n OMP-antigeenin tunnistavaa monoklonaalista vasta-ainetta 8B6 (ATCC:n hakunumero HB11 091); 80 kd:n OMP-antigeenin tunnistavaa monoklonaalista vasta-ainetta 10F3 (ATCC:n hakunumero HB11 092); ja HMWP-OMP-antigeenin tunnistavaa monoklonaalista vasta-ainetta 17C7 (ATCC:n ha- 35 kunumero HB11 093).

17 106844. Tässä keksinnössä nähdään mandolliseksi saada käyttöön useita erilaisia tapoja sekä tuottaa että eristää tässä kuvattuja OMP-antigeeniproteiineja, joiden tapojen lähtökohtana on puhdistetun tai osittain puhdistetun proteii- 5 nin eristäminen luonnollisista lähtömateriaaleista (esimerkiksi M. catarrhalis -bakteeerisoluista) tai yhdistelmä- DNA-lähtömateriaalin (esimerkiksi E. coli- tai mikrobisolujen) käyttö. Viimeksi mainitussa tapauksessa voidaan tässä kuvattuja OMP-antigeenejä tai näistä peräisin olevia anti- 10 geenisiä peptidejä saada käyttöön olennaisesti antigeeneiltään puhtaina, koska niistä puuttuvat aina kunkin kysymyksessä olevan epitoopin ulkopuolelle jäävät M. catarrhaliksen epitoopit. Tässä keksinnössä esitetään, että OMP-antigeeni 15 voitaisiin tämän keksinnön mukaan eristää luonnollisista tai yhdistelmä-dna-lähtömateriaaleista eristämällä joko soluvaippapreparaatti tai solun ulkomembraanit ja puhdistamalla antigeeni sitten detergenttiin perustuvaa puhdistuskaaviota käyttäen. Yhdistelmäsolujen ollessa kyseessä voi 20 haluttu antigeeni esiintyä inkluusiokappaleissa. Koska tässä keksinnössä on kuvattu menetelmä 30 kd:n, 80 kd:n ja HMWP-OMP-antigeenejä vastaan suunnattujen monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi, odotetaan immunoabsorbenttimenetelmien olevan kelvollisia OMP- 25 antigeenin tai sen immunologisesti ristireagoivien varianttien puhdistamisessa. Tähän tarkoitukseen käyttökelpoiset vasta-aineet ehdotetaan valmistettaviksi yleensä tuonnempa- na kuvattavilla menetelmillä tai monoklonaalisten vastaaineiden valmistuksen alalla yleisesti tunnetuilla menetel- 30 millä (tätä kysymystä on käsitelty esimerkiksi US- patenttijulkaisuissa nro 4 514 498 ja 4 740 467) ja näistä poimitaan esiin halutun OMP-proteiinin tai haluttujen OMPpeptidien kanssa reagoivat vasta-aineet. Edellä olevan yleisen eristystavan arvellaan lisäksi toimivan yhtä hyvin 35 silloin, kun on tarkoitus eristää OMP-variantteja tai proteiinin antigeenisiä tai immunogeenisiä osafragmentteja,

18 106844 mihin tarvitaan pelkästään sitä, että valmistetaan ja käytetään sellaisia vasta-aineita, joilla on affiniteettia haluttua peptidyylialuetta kohtaan. DNA - mutageneesin tyyppisiä menetelmiä käyttämällä 5 on tämän keksinnön avulla lisäksi mandollista valmistaa vaikeuksitta niin sanottuja "toisen sukupolven" molekyylejä, joiden proteiinirakenteet ovat modifioituja tai yksinkertaistettuja. Toisen sukupolven proteiineilla on täysimittaiseen antigeeniin verrattuna tyypillisesti yksi tai 10 useampi yhteinen ominaisuus, kuten tietty nimenomainen antigeeninen tai epitooppiydinjakso. Suhteellisen lyhyisiin molekyyleihin perustuvia epitooppijaksoja voidaan saada käyttöön peptidiä tai sen perustana olevaa DNA-jaksoa koskevan tiedon perusteella. Tällaiset molekyylivariantit ei- 15 vät saata ainoastaan olla peräisin proteiinirakenteen valituista immunogeenisistä tai antigeenisistä alueista vaan niihin voi lisäksi tai vaihtoehtoisesti sisältyä yksi tai useampi toiminnallisesti vastaava aminohappo, joka on valittu luonnollisen jakson suhteen esiintyvien samankaltai- 20 suuksien tai jopa eroavuuksien perusteella. OMP-antigeenien epitooppien ydinjaksot Kuten edellä mainittiin, tässä keksinnössä on tehty se ehdotus, että epitooppisia tai immunogeenisiä ydinjakso- ja sisältävien synteettisten peptidien valmistamisesta voi- 25 taisiin saada tiettyjä nimenomaisia etuja. Näiden epitoop- piydinjaksojen on tunnistettu olevan tässä keksinnössä sen tietyissä nimenomaisissa kohteissa OMP-antigeenin hydrofii- lisiä alueita. Tässä keksinnössä on tehty se ehdotus, että nämä alueet edustavat sellaisia alueita, jotka todennäköi- 30 simmin edistäisivät T-solujen tai B-solujen stimuloitumista ja saisivat siten aikaan spesifisten vasta-aineiden muodos- tumisen. Epitooppiydinjakso on tässä keksinnössä suhteelli- sen lyhyt aminohappojen muodostama jakso, joka on "komple- mentäärinen" OMP:tä vastaan suunnattujen vasta-aineiden si- 35 toutumiskohtien suhteen ja se sitoutuu tämän vuoksi näihin. Epitooppiydinjakso on tämän lisäksi tai vaihtoehtoisesti

19 106844 sellainen jakso, joka saa aikaan sellaisten vasta-aineiden muodostumisen, jotka ristireagoivat OMP:tä vastaan suunnattujen vasta-aineiden kanssa. On selvää, että tässä patenttiselityksessä termi "komplementäärinen" tarkoittaa amino- 5 happoja tai peptidejä, joilla on kyky vetää toisiaan puoleensa. Tässä kuvatut tietyt epitooppiydinjaksot voidaan siten määritellä toiminnallisesti sillä perusteella, että ne kykenevät kilpailemaan halutun OMP-antigeenin kanssa sitoutumisesta vastaavaa OMP:tä vastaan suunnattuihin anti- 10 seerumeihin tai ehkä syrjäyttämään tämän antigeenin. Polypeptidiantigeenin koon ei tavallisesti uskota olevan erityisen ratkaiseva, mikäli polypeptidin koko on ainakin sitä luokkaa, että tunnistettu ydinjakso tai ydinjaksot mahtuvat siihen. Tämän patenttiselityksen edellyttä- 15 män pienimmän käyttökelpoisen ydinjakson pituus tulisi olemaan noin 15 aminohapon luokkaa. Se vastaa siten suuruudeltaan tavallisesti tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja pienimpiä peptidiantigeenejä. Antigeeni voi kuitenkin haluttaessa olla kooltaan suurempi kunhan se vain sisältää 20 keskeisen epitooppiydinjakson. Edellä olevien näkökohtien mukaan tämän keksinnön tekijän aikomuksena on peptidijaksojen analyysiin tarkoitettua tietokoneohjelmaa (DNAStar Software, DNAStar, Inc. Madison, Wisc.) käyttäen tunnistaa 30 kd:n, 80 kd:n tai 25 HMWP-OMP-antigeenin tietyt nimenomaiset hydrofiiliset peptidyylialueet, joiden arvellaan muodostavan proteiinin tiettyihin nimenomaisiin epitooppeihin sisältyviä epitooppiydinjaksoja. Epitooppijaksoja tai sellaisia peptidejä, joiden 30 jaksoon sisältyy antigeeninen epitooppi, syntetisoidaan vaikeuksitta tavanomaisilla synteesimenetelmillä, kuten kiinteän faasin menetelmällä (esimerkiksi käyttämällä kau- pallisesti saatavilla olevaa peptidisynteesilaitetta, kuten Applied Biosystems -yhtiön mallin 430A -peptidisynteesi- 35 laitetta). Tällä tavoin syntetisoidut peptidit voidaan ja- kaa ennakolta määrätyn suuruisiin eriin ja varastoida ennen

20 106844 niiden käyttöä tavanomaisin keinoin, kuten vesiliuoksina tai vieläkin edullisemmin jauheena tai lyofilisoituina. Peptidejä voidaan niiden suhteellisen hyvän pysyvyyden johdosta säilyttää kätevästi vesiliuoksina melko 5 pitkiä aikoja, esimerkiksi jopa kuusi kuukautta tai tätäkin pidempään käytännöllisesti katsoen missä tahansa vesiliuoksessa niiden merkittävästi hajoamatta tai niiden antigeenisen aktiivisuuden häviämättä. Mikäli peptidejä aiotaan säilyttää vesiliuoksissa pitkään, on liuoksissa tavallisesti 10 haluttua käyttää puskureita, kuten Tris- tai fosfaattipuskureita ph:n säilyttämiseksi alueella 7,0-7,5. Voi lisäksi olla haluttua lisätä liuoksiin mikrobien kasvua estäviä aineitta, kuten natriumatsidia tai mertiolaattia. Vesipitoisessa olomuodossa tapahtuvaa pitkäaikaista varastointia 15 varten on haluttua varastoida liuokset 4 C:ssa tai edullisemmin pakastettuna. Mikäli peptidi(t) varastoidaan lyofilisoitu(i)na tai jauhemaisena(ina), niitä voidaan luonnollisesti varastoida rajoittamattoman pitkään esimerkiksi määrätyn suuruisina erinä, jotka voidaan ennen käyttöä hyd- 20 ratoida uudelleen ennakolta määrätyllä määrällä vettä (edullisesti tislattua vettä) tai puskuria. Antigeenisilta toiminnallisilta ominaisuuksiltaan toisiaan vastaavat aminohapot Kuten edellä mainittiin, halutun OMP-antigeenin tai 25 sen antigeenisten tai immunogeenisten rakenneosien rakennetta otaksutaan voitavan muuttaa monien eri modifikaatioiden tai muutosten avulla, ja tuloksena olisi silti ominaisuuksiltaan vastaavanlainen tai muulla tavoin haluttu molekyyli. 30 On esimerkiksi tunnettua, että tiettyjen proteiinin rakenteeseen kuuluvien aminohappojen tilalla voidaan käyttää muita aminohappoja proteiinin antigeenisen tai immunogeenisen aktiivisuuden muokkaamiseksi tai parantamiseksi (tätä on käsitelty esimerkiksi julkaisuissa Kyte, et al., 35 tai Hopp, US-patenttijulkaisu nro 4 554 101. Antigeeniseen peptidiin voidaan esimerkiksi tehdä pieniä konformaatioon

21 106844 vaikuttavia muutoksia käyttämällä alkuperäisten aminohappojen tilalla vaihtoehtoisia aminohappoja, mikä johtaa antigeenin ja vasta-aineen sitovien alueiden affiniteetin suurenemiseen. Toisena vaihtoehtona on se, että tiettyihin 5 OMP:n antigeenisiin peptideihin tehtyjä aminohapposubstituutioita voidaan käyttää sellaisten ryhmien aikaansaamiseksi, jotka voidaan sitten liittää muihin molekyyleihin sellaisten peptidin ja tämän molekyylin konjugaattien aikaansaamiseksi, joissa alkuperäisen peptidin antigeenisyys 10 on säilynyt riittävässä määrin ollakseen kelvollinen muihin tarkoituksiin käytettäväksi. Voitaisiin esimerkiksi konstruoida jokin kiinteään kantaja-aineeseen sidottu OMPpeptidi, josta olisi tiettyjä etuja diagnostisissa sovellutusmuodoissa. 15 Kysymystä, joka koskee aminohappojen hydropaattisuuskertoimen tärkeyttä proteiinin vuorovaikutteisten biologisten toimintojen syntymiselle on tarkasteltu yleisesti julkaisussa Kyte, et al., (1982), jossa on päädytty siihen, että tietyt aminohapot voidaan korvata muilla sellaisilla 20 aminohapoilla, joiden hydropaattisuuskerroin tai arvo on samansuuruinen, biologisen aktiivisuuden säilyessä kuitenkin samanlaisena. Aminohapoille on annettu hydropaattisuuskerroin niiden hydrofobisuus- ja varausominaisuuksien perusteella, kuten tuonnempana esitettävästä taulukosta käy 25 ilmi. Aminohapon suhteellisen hydropaattisen luonteen arvellaan määräävän tuloksena olevan proteiinin sekundäärirakenteen, jonka perusteella puolestaan proteiinin ja sen substraattimolekyylien välinen vuorovaikutus määräytyy. Sitoutumiskykyyn vaikuttavien ominaisuuksien kannalta edulli- 30 sina substituutioihin käytettävinä aminohappoina tarkastellaan tavallisesti aminohappoja, joiden kertoimien arvot poikkeavat toisistaan ±2 yksikköä, edullisemmin ±1 yksikköä ja tätäkin vielä edullisemmin ±0,5 yksikköä. 35

22 106844 Taulukko I Hydropaattisuus- Aminohabpo kerroin Isoleusiini 4,5 5 Valiini 4,2 Leusiini 3,8 Fenyylialaniini 2,8 Kysteiini/kystiini 2,5 Metioniini 1,9 10 Alaniini 1,8 Glysiini -0,4 Treoniini -0,7 Tryptofaani -0,9 Seriini -0,8 15 Tyrosiini -1,3 Proliini -1,6 Histidiini -3,2 Glutamiinihappo -3,5 Glutamiini -3,5 20 Asparagiinihappo -3,5 Asparagiini -3,5 Lysiini -3,9 Arginiini -4,5 25 Siten esimerkiksi isoleusiini, jonka hydropaattisuuskerroin on +4,5, vaihdetaan edullisesti sellaiseen aminohappoon kuin valiini (+4,2) tai leusiini (+3,8). Vaihtoehtoisesti asteikon toisessa päässä olevan lysiinin (-3,9) tilalla käytetään edullisesti arginiinia (-4,5) jne. 30 Toisiaan muistuttavat aminohapot voidaan korvata toisillaan hydrofiilisyyden perusteella varsinkin silloin, kun tällä tavoin muodostettua biologisesti toiminnallisesti vastaavaa proteiinia tai peptidiä aiotaan käyttää immunologisissa sovellutusmuodoissa. US-patenttijulkaisussa nro 35 4 554 101, on mainittu, että proteiinin suurin paikallinen hydrofiilisyys, jonka määräytyy siihen kuuluvien peräkkäis-

23 106844 ten aminohappojen perusteella, korreloi tämän immunogeenisyyteen ja antigeenisyyteen, toisin sanoen proteiinin biologiseen ominaisuuteen. Kuten US-patenttijulkaisussa nro 4 554. 101 on yksi- 5 tyiskohtaisesti esitetty, on aminohapporyhmille annettu seuraavat hydrofiilisyysarvot: arginiini (+3,0); lysiini (+3,0); aspartaatti (+3,0 ±1); glutamaatti (+3,0 ±1); seriini (+0,3); asparagiini (+0,2); glutamiini (+0,2); glysiini (0); (0 ±1); treoniini (-0,4); alaniini (-0,5); his- 10 tidiini (-0,5); kysteiini (-1,0); metioniini (-1,3); valiini (-1,5); leusiini (-1,8); isoleusiini (-1,8); tyrosiini (-2,3); fenyylialaniini (-2,5); tryptofaani (-3,4). On selvää, että aminohappo voidaan korvata toisella aminohapolla, jonka hydrofiilisyysarvo on samanlainen ja saada silti syn- 15 tymään biologisesti vastaava proteiini ja varsinkin immunologisesti vastaava proteiini. Näissä muutoksissa on edullista korvatå toisilla aminohapoilla sellaiset aminohapot, joiden hydrofiilisyysarvot ovat ±2 yksikön alueella ja näistä ovat erityisen edullisia ne, joiden arvot ovat 20 ±1 yksikön alueella ja vielä tätäkin edullisempia ovat ±0,5 yksikön alueella olevat arvot. Edellä sanotun perusteella nämä aminohapposubstituutiot perustuvat tavallisesti R-ryhmäsubstituenttien suhteelliseen samankaltaisuuteen esimerkiksi koon, elektrofii- 25 lisen luonteen, varauksen ja muiden näitä vastaavien ominaisuuksien suhteen. Tavallisesti edullisiin substituutioihin, joissa monet edellä kuvatuista ominaisuuksista on huomioitu, kuuluvat seuraavat substituutiot:

24 106844 Taulukko II Alku- peräinen ryhmä Esimerkkinä olevat substituutiot 5 Ala gly; ser Arg Asn Asp Cys lys gln; his glu ser 10 Gln asn Glu Gly His Ile asp ala asn; gln leu; val 15 Leu ile; val Lys arg; gln; glu Met Ser Thr leu; ala thr ser 20 Trp tyr Tyr Val trp; phe ile; leu M. catarrhaliksen OMP-molekyylejä vastaan suunnat- 25 tujen monoklonaalisten vasta-aineiden valmistus Tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja Moraxella catarrhaliksen OMP-molekyylejä vastaan voidaan valmistaa spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita käyttäen tavanomaisia immunisaatiomenetelmiä. Valmistus voidaan aloittaa 30 immunisoimalla koe-eläin, kuten hiiri, koostumuksella, kuten ulkomembraanivesikkelipreparaatilla, joka sisältää OMP:n antigeenisiä epitooppeja, josta eläimestä hankitaan myöhemmässä vaiheessa käyttöön perna- tai lymfasolupopulaatio. Perna- tai lymfasolut voidaan tämän jälkeen fuusioida 35 solulinjoihin, kuten humaani- tai hiirimyeloomakantoihin, vasta-aineita erittävien hybridoomien aikaansaamiseksi. Nä-

25 106844 mä hybridoomat voidaan eristää yksittäisinä klooneina, joista voidaan sitten seuloa esiin haluttua OMP:tä vastaan suunnattua vasta-ainetta erittävät kloonit. Tämän keksinnön tietyissä nimenomaisissa kohteissa 5 käytetään M. catarrhaliksesta peräisin olevia ulkomembraanifragmentteja aiheuttamaan immuunivaste koe-eläimissä. Immunisoinnin jälkeen pernasolut poistetaan ja fuusioidaan plasmasytoomasoluihin käyttäen fuusioinnin suorituksessa tavanomaista menettelytapaa (tätä on käsitelty esimerkiksi 10 julkaisussa The Cold Spring Harbor Manual for Hybridoma Development) sellaisten hybridoomien aikaansaamiseksi, jotka erittävät ulkomembraaniproteiineja vastaan suunnattuja monoklonaalisia vasta-aineita. Hybridoomat, jotka tuottavat valittua OMP:tä vastaan suunnattuja monoklonaalisia vasta- 15 aineita, tunnistetaan tavanomaisia menetelmiä, kuten ELI- SA:a ja Western-blottausmenetelmiä, käyttäen. Hybridoomaklooneja voidaan tämän jälkeen viljellä nestemäisissä kasvatusliuoksissa ja niistä voidaan puhdistaa viljelmäsupernatantit OMP-spesifisten monoklonaalisten 20 vasta-aineiden aikaansaamiseksi. OMP-antigeenejä vastaan suunnattujen monoklonaalisten vasta-aineiden käyttö Haluttua M. catarrhaliksen OMP-antigeeniä vastaan suunnattuja monoklonaalisia vasta-aineita voidaan tavalli- 25 sesti käyttää esimerkiksi M. catarrhalis -infektioiden diagnoosissa. Tämän keksinnön tekijöiden näkemyksen mukaan tulee tämän keksinnön mukaisesti valmistetuilla monoklonaalisilla vasta-aineilla olemaan käyttökelpoisia sovellutuksia tavan- 30 omaisissa immunokemiallisissa menetelmissä, kuten ELISA:ssa ja Western-blottausmenetelmissä, sekä muissa menetelmissä, joissa voidaan käyttää hyväksi OMP-epitooppeja vastaan spesifistä vasta-ainetta. Vielä yhden tämän keksinnön tekijöiden näkemyksen 35 mukaan voidaan tiettyä OMP:tä vastaan spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita käyttää muissa käyttökelpoisissa so-