Peptidisynteesi. Kiinteän faasin peptidisynteesi. SPPS:n Periaate Aminohappo kytketää. synthesis (SPPS) Suuret peptidiainemää

Transkriptio

1 eptidisynteesi uoritetaan yleensä kiinteän n faasin pinnalla; solid phase peptide synthesis () uuret peptidiainemää äärät t valmistetaan liuosfaasissa.. B. Merrifield: ribonukleaasientsyymin synteesi vuonna 1969 (obel 1984) :n eriaate Aminohappo kytketää ään linkkerin avulla kovalenttisesti karboksyylipää äästään liukenemattomaan polymeeriin. ivuketjut suojataan pysyvästi iitettävän aminohapon t. peptidin -terminaaliin kiinnitetään väliaikainen suojaryhmä iitettävän n aminohapon t. peptidin karboksyyliterminaali aktivoidaan Kunkin reaktiovaiheen jälkeen j peptidin sisält ltävä polymeeri suodatetaan ja pestää ään n sopivilla pesuliuottimilla. Valmis peptidi irrotetaan polymeeristä reagensseilla, joka katkaisee peptidin ja polymeerin välisen v kovalenttisen sidoksen. Kiinteän faasin peptidisynteesi olid phase peptide synthesis () 1) olymeeriin liitetään linkkeri () johon ensimmäinen suojattu aminohappo liitetään. 2 2 n n 1) uojaryhmä ()( ) poistetaan terminaalisesta aminoryhmästä. 2) isätään seuraava aminohappo ja muodostetaan peptidisidos. 3) Toistetaan vaiheet 2 ja 3 (n- kertaa) kunnes saadaan haluttu peptidi 4) oistetaan viimeinen - terminaalinen suojaryhmä sekä sivuketjujen suojaryhmät ja peptidi irrotetaan linkkeristä. 1

2 Aktivointireagensseja Disykloheksyylikarbodi-imidi imidi (D) eptidisidoksen muodostamiseen tarvitaan karboksyyliterminaalin aktivointi. D muodostaa -asyyliurea- rakenteen,, joka aktivoi karbonyylihiilen aminoryhmän nukleofiiliselle hyökkäykselle; peptidisidos muodostuu ja kiinteä disykloheksyyliurea (DU) saostuu. D AA AA 2 DU Muita aktivointireagensseja 3 3 DI di-isopropyylikarbodi-imidi ED; EDI; EDA -(3-dimethylaminopropyl)- '-ethylcarbodiimide u -hydroksisukkini-imidi Bt -hydroksibentsotriatsoli DI,'-karbonyylidiimidatsoli DMA p-nitrofenoli,-dimetyyliaminopyridiini Fosfoniumsuolat: esim. B (Bentsotriatsol-1- yylioksitris(dimetyyliamino)-fosfoniumheksafluorofosfaatti) F - 6 Me 2 Me 2 Me 2 AA F - 6 Me 2 Me 2 Me 2 AA AA 2 2

3 Aminoryhmän suojaryhmät D-koplauksessa aminoryhmä suojataan polymeroitumisen estämiseksi. leisimmät t suojaryhmät t ovat karbamaatteja AA benzyloxycarbonyl (bz) AA t-butyloxycarbonyl (tboc) AA 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) Kullakin suojaryhmällä on oma poistomenetelmänsä Fmoc tboc bz aq. 3 tai 20% piperidiini 100%, rt, 1 h 2 /d- uojaryhmän poisto-olosuhteet on valittava sellaisiksi, etteivät ne poista sivuryhmien suojaryhmiä. Bentsyylioksikarbonyyli (bz tai Z) 3 Bz (benxyloxycarbonyl chloride) a Bz-AA (carbobenzyloxy) Emässtabiili Voidaan poistaa hydraamalla ( 2,d/) tai voimakkaalla hapolla Kysteiini ja metioniini voivat myrkyttää d/- katalyytin, joten sen sijaan käytetään Boc- ja Fmoc-suojaryhmiä Käytetään edelleen sivuryhmien suojauksessa Useimpia Bz, Boc ja Fmoc-aminohappoja on kaupallisesti saatavissa. 3

4 Tert-butyylioksikarbonyyli (Boc) Boc-suojaryhmä voidaan liittää Boc-anhydridillä tai Boc-n -reagenssilla (Boc) 2 tai 3 a tai Et 3 Boc-AA (Butyloxycarbonyl) Boc-n (t-butoxycarbonyloximinophenylacetonitrile) Boc on emässtabiili ja kestää vedytyksen Boc-suoja poistetaan hapolla (, Br,,, F) Boc-AA F Merrifield-peptidisynteesi aminohapon amiinipää suojataan Boc-ryhmällä sivuketjut suojataan bentsyyliryhmillä (Bn( Bn) Boc-suojan poisto 50% /DM Fenyyliasetamidometyyli (AM) AM)-linkkeri ivuketjujen suojaryhmät poistetaan vahvalla hapolla (F tai Br/) F s Boc-asparagiinihapon cesium suola F AM-linkkeri Merrifield-hartsi 4

5 9-(fluorenyylimetyylioksi)karbonyyli (Fmoc) Et 3 leisin suojausmenetelmä Kestää happoja ja vedytystä oistetaan miedolla emäksellä (esim. piperidiinillä tai morfoliinilla) Muita Fmoc-reagensseja: X = X = Fmoc-AA (fluorenylmethyloxycarbonyl) X = X Fmoc- Fmoc- Fmoc-bt Fmoc-peptidisynteesi Wanghartsi ivuketjut suojataan tert- butyyliryhmillä 4-Bentsyylioksibentsyyli- alkoholi (Wang) Wang)-linkkeri Amiinipään Fmoc-ryhmä poistetaan piperidiinillä ivuketjujen suojaryhmät poistetaan :lla ja samalla peptidi irtoaa hartsista Fmoc-u (fluorenylmethyloxycarbonyloxysuccinimide) 5

6 ivuryhmien suojaus Gly (glysiini) glysiini)-,, Ala (alaniini)( alaniini)-, Val (valiini) valiini)-, e (fenyylialaniini) fenyylialaniini)-, eu (leusiini) leusiini)- Ile (isoleusiini)( isoleusiini)-, Met (metioniini) metioniini)-,, ro (proliini)( proliini)-, Trp (tryptofaani) tryptofaani)-, Asn (asparagiini) asparagiini)- ja Gln (glutamiini) glutamiini)- aminohappoja ei yleensä tarvitse suojata ysiinin ε-aminoryhmä ja kysteiinin -ryhmä on suojattava aina Muiden ryhmien suojaus vähentää sivureaktioden määrää ivuryhmien suojaus Fmoc-kemiassa Fmoc-kemiassa käytettyjä suojaryhmiä, jotka voidaan poistaa :lla tai trimetyylisilyylibromdilla (TMBr) Arginiini: Me 2 Arginine or TMBr or TMBr Arg(Boc)2,'-bis(t-butyloxycarbonyl)-Arg Arg(Mtr) -γ -4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl--arginine Arg(bf) -γ - (2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl) -- arginine Arg(mc) -γ-(2,2,5,7,8- pentamethylchroman-6-sulfonyl)--arginine 6

7 ivuryhmien suojaus Fmoc-kemiassa ysiini: 2 Kysteiini: ysine ystein or TMBr ys(boc) -(t-butyloxycarbonyl)-ys ys(mtt) -ε-4-methyltrityl--lysine ys(trt) -trityl--cystein ivuryhmien suojaus Fmoc-kemiassa istidiini: is(boc) is(trt) eriini, treoniini ja tyrosiini: erine er(tbu) -t-butyl--serine Thr(tBu) Tyr(tBu) 7

8 ivuryhmien suojaus Fmoc-kemiassa Asparagiini- ja glutamiinihappo Aspartic acid Asp(tBu) -aspartic acid 4-tert-butyl ester Glu(tBu) eptidit lääkeaineina Aivolisäkkeen takalohko tuottaa peptidihormoneja mm. vasopressiinia ja oksitosiinia. iklosporiini lisää kudossiirränn nnäisten pysyvyyttä. iklosporiinia käytetään n myös nivelreuman ja vaikean psoriaasin hoidossa. Monet AE-est estäjät ovat peptidirakenteisia, esim. enalapriili enalapriili 2 ksitosiini 2 2 Gly eu ro ys Asn Gln 2 2 ys Tyr Ile siklosporiini 8

9 Kirjallisuutta ouben-weyl Weyl Methods of rganic hemistry. ynthesis of eptides and eptidomimetics; ; M. Goodman, A. Felix,. ; M. Moroder and. Toniolo Ed.; Georg Thieme Verlag: : tuttgart, 2001; Vols.. E22a- d.. kada,, ynthesis of eptides by olution Methods. urr. rg. hem , 5, 1. Aimoto,, ontemporary methods for peptide and protein synthesis. urr. rg. hem , 5, 45 M. A. Walker,, rotein synthesis by chemical ligation of unprotected peptides in aqueous solution. Angew. hem., Int.. Ed. Engl. 1997, 36, 1069 loyd-williams, F. Albericio,, E. Giralt, hemical Approaches to the ynthesis of eptides and roteins.; : Boca aton, Florida,