MALDI-TOF massaspektrometria mikrobitunnistuksessa: oikotie parempaan asumisterveysdiagnostiikkaan? Anna-Mari Pessi ¹, Santeri Kankaanpää ¹, Inka Harju ², Erkki Eerola ², Annika Saarto ¹, Antti Hakanen² ¹ ² Aerobiologian laboratorio Kliininen mikrobiologia
Miksi tunnistaa? Vaurion paikallistaminen Poikkeava / vauriolle tyypillinen lajisto Kosteusvaurioindikaattorit Rakennusten ekologia Tiettyjä rakennusmateriaaleja suosivat lajit Mikrobivuorovaikutukset Lajispesifinen patogeenisyys, sekundäärimetabolia
MALDI-TOF massaspektrometria mikrobitunnistuksessa: oikotie parempaan asumisterveysdiagnostiikkaan? 1) Mikä MALDI-TOF MS? 2) Miksi MALDI-TOF MS? 3) Sovellettavuus asumisterveystutkimuksiin - alustava selvitys 1) Olemassa olevat MALDI-TOF MS tietokannat 2) Homeet 3) Aktinomykeetit 4) Tietokantojen täydentäminen kosteusvauriomikrobistolla 4) MALDI-TOF MS menetelmä Asumisterveysdiagnostiikkaa ajatellen plussat ja miinukset
MALDI-TOF MS atrix ssisted aser esorption/ onization ime f light ass pectrometry Matriisiavusteinen laser-desorptio/ionisaatio-lentoaika massaspektrometria Idea: mitata mikrobin proteiinimolekyylien paino sekä määrä ja tunnistaa mikrobi sen perusteella Erikokoisten proteiinimolekyylien määristä lasketaan massaspektri (spektri, sormenjälki ) Mitattua massaspektriä verrataan tietokannassa (spektrikirjastossa) olevien mikrobien spektreihin
MALDI-TOF MS -menetelmä matriisiavusteinen laser-desorptio/ionisaatio-lentoaika massaspektrometria 1 1 Näyte: - kokonaisia soluja tai - uutettua proteiinisuspensiota - sekoitetaan näytelevyllä 2. matriisin kanssa Matriisi: HCCA eli α-cyano-4-hydroxycinnamic acid Andrew E. Clark et al. Clin. Microbiol. Rev. 2013; doi:10.1128/cmr.00072-12
MALDI-TOF MS -menetelmä matriisiavusteinen laser-desorptio/ionisaatio-lentoaika massaspektrometria 2 - Matriisilla kiteytettyä näytettä pommitetaan laserpulsseilla - Erikokoiset molekyylit irtoavat (desorptio) näytelevyltä, kaasuuntuvat ja ionisoituvat. - Kiihdytetyt ionit lentävät tyhjiössä detektoriin hiukkasen massasta riippuvalla nopeudella. - Lentoajan perusteella saadaan mitattua näytteen massaspektri Andrew E. Clark et al. Clin. Microbiol. Rev. 2013; doi:10.1128/cmr.00072-12
MALDI-TOF MS menetelmä - Miksi? + Nopea tulokset jopa muutamassa minuutissa + Edullinen: + kustannukset/näyte <1 + vähentää jatkokasvatuksia ja testejä + Helppokäyttöinen + Kirjastoa voi täydentää / luoda oman kirjaston jo viljellyistä näytteistä Mutta Laite 100000 200000 + huolto kunhan lajit löytyvät tietokannasta Anna-Mari Pessi
MALDI-TOF MS menetelmä Miksi? + Nopea tulokset jopa muutamassa minuutissa + Edullinen: + kustannukset/näyte <1 + vähentää jatkokasvatuksia ja testejä + Helppokäyttöinen + Kirjastoa voi täydentää / luoda oman kirjaston jo viljellyistä näytteistä Yleistynyt kliinisissä laboratoriossa: Mutta bakteerit, homeet Laite 100000 200000 & Ympäristömikrobiologisia huolto sovelluksia kunhan lajit löytyvät tietokannasta Anna-Mari Pessi
Sovellettavuus asumisterveystutkimuksiin Alustava selvitys menetelmien toimivuudesta
Sovellettavuus asumisterveystutkimuksiin? 1. Massaspektri-kirjastot eli MALDI-TOF MS tietokannat Kaupalliset tietokannat, pääosin kliinisiin tarkoituksiin Bruker Daltonics (Saksa); laitevalmistaja Homeet: pääosin sieni-infektioiden aiheuttajia mutta myös rakennushomeita mm. Aspergillus suvun lajeja, Chaetomium globosum, Pseudogymnoascus (=Geomyces) pannorum, Scopulariopsis brevicaulis, Stachybotrys chartarum ja Trichoderma longibrachiatum Aktinomykeetit suppeasti: <20 Streptomyces -lajia, 1-2 Nocardiopsis, Pseudonocardia tai Saccharopolyspora -lajia. Vitek MS Andromas SA (Ranska) Laboratorioiden sisäiset tietokannat
Sovellettavuus asumisterveystutkimuksiin? 2. Homeet: Homesienet Solunseinärakenteet rikottava uutos proteiinisuspensioksi Schulthess-menetelmä (2014) (TYKS, vakiomenetelmä) 24-48h nesteviljelmässä (Sabouraud rikasteliemi), ravistelu Keräys sentrifugoimalla Pesu ultrapuhtaalla vedellä Etanoli-muurahaishappouutto Testi: 10 Aspergillus -kantaa
Sovellettavuus asumisterveystutkimuksiin? 2. Homeet: Testattu kanta Aspergillus fumigatus (Aero) DB A. flavus IHEM 932 DB Tunnistustulos Luotettavuus / pistearvo A. niger (Aero) DB A. ryhmä Usti (Aero) A. ustus IHEM 1637 - A. terreus MUCL 614 DB A. creber IHEM 2646 - A. penicillioides IHEM 2476 DB A. restrictus IHEM 818 - Eurotium repens MUCL 15977 - Aero = tunnistettu laboratorion sisällä mikroskooppisesti, muut kantapankeista Brukerin tietokannassa
Sovellettavuus asumisterveystutkimuksiin? 2. Homeet: Testattu kanta Tunnistustulos Luotettavuus / pistearvo Aspergillus fumigatus (Aero) DB A. fumigatus +++ / 2,59 A. flavus IHEM 932 DB A. flavus A. oryzae +++ / 2,43 +++ / 2,50 A. niger (Aero) DB A. niger +++ / 2,44 A. ryhmä Usti (Aero) A. ustus +++ / 2,31 A. ustus IHEM 1637 - A. ustus + / 1,74 A. terreus MUCL 614 DB A. terreus + / 1,85 A. creber IHEM 2646 - ei tunnistustulosta - / < 1,7 A. penicillioides IHEM 2476 DB ei tunnistustulosta - / < 1,7 A. restrictus IHEM 818 - ei tunnistustulosta - / < 1,7 Eurotium repens MUCL 15977 - ei tunnistustulosta - / < 1,7 Aero = tunnistettu laboratorion sisällä mikroskooppisesti, muut kantapankeista Brukerin tietokannassa
Sovellettavuus asumisterveystutkimuksiin? 2. Homeet: Testattu kanta Tunnistustulos Luotettavuus / pistearvo Aspergillus fumigatus (Aero) DB A. fumigatus +++ / 2,59 A. flavus IHEM 932 DB A. flavus A. oryzae +++ / 2,43 +++ / 2,50 A. niger (Aero) DB A. niger +++ / 2,44 A. ryhmä Usti (Aero) A. ustus +++ / 2,31 A. ustus puniceus IHEM IHEM 1637 1637 - A. ustus + / 1,74 A. terreus MUCL 614 DB A. terreus + / 1,85 A. creber IHEM 2646 - ei tunnistustulosta - / < 1,7 A. penicillioides IHEM 2476 DB ei tunnistustulosta - / < 1,7 A. restrictus IHEM 818 - ei tunnistustulosta - / < 1,7 Eurotium repens MUCL 15977 - ei tunnistustulosta - / < 1,7 Aero = tunnistettu laboratorion sisällä mikroskooppisesti, muut kantapankeista Brukerin tietokannassa Spektrien yhtenevyyttä verrataan pistearvoihin - piikkien tiheys, sijainti (koko), voimakkuus Erittäin tn. lajitason tunnistus (2,30 3,00) Varma sukutason tunnistus, tn. lajitason tunnistus 2,00 2,29 Tn. sukutason tunnistus 1.70 1.99 Ei tunnistustulosta. 0 1,69
Sovellettavuus asumisterveystutkimuksiin? 3. Aktinomykeetit: Menetelmäoptimointi: Suora siirto Maldi-TOF levylle / nopea etanoli-muurahaishappouutto (vakiomenetelmät bakteereille) Mykobakteerien uuttomenetelmä (helmihajotus, - -uutto ) Nestekasvatus & uutos proteiinisuspensioksi (vrt. Schulthess, 2014) 24-96 h nesteviljelmässä (THG / FAB rikasteliemi), ravistelu Keräys sentrifugoimalla, pesu ultrapuhtaalla vedellä Etanoli-muurahaishappouutto 50 rakennusmateriaaleista tai ilmasta eristettyä kantaa (2011 2017) Tyypitys: THG; 14 vrk, alustaan kiinnittynyt, jauhoinen, kuiva pesäke
Sovellettavuus asumisterveystutkimuksiin? 3. Aktinomykeetit Testattu kanta Tunnistustulos Luotettavuus / pistearvo a/486; mineraalivilla Streptomyces badius ++ / 2,03 a/560, finn foam S. violaceoruber ++ / 2,01 a/582, mineraalivilla Streptomyces violaceoruber ++ / 2,06 a/434, polyuretaani Streptomyces violaceoruber ++ / 2,02 a/589, mineraalivilla Kocuria sp. ¹ + / 1,92 19 kpl kantoja Streptomyces sp. ² + / 1,7 1,96 26 kpl kantoja ei tunnistustulosta - / < 1,7 Spektrien yhtenevyyttä verrataan pistearvoihin - piikkien tiheys, sijainti (koko), voimakkuus Erittäin tn. lajitason tunnistus (2,30 3,00) Varma sukutason tunnistus, tn. lajitason tunnistus 2,00 2,29 Tn. sukutason tunnistus 1.70 1.99 Ei tunnistustulosta. 0 1,69 ¹ lähin tunnistus lajiin Kocuria rhizophila ² lähin tunnistus lajeihin S. badius, S. griseus, S. scabiei tai S. violaceoruber
Sovellettavuus asumisterveystutkimuksiin? 4. Kirjaston täydentäminen kosteusvauriomikrobistolla? Edellytykset Luotettava lajitason tunnistus: kirjastossa oltava 10 saman lajin kantaa Esitutkimusaineisto Samankaltaisten spektrien ryhmiä Kustakin ryhmästä tyyppikanta Tyyppikannasta laatutarkasteltu vertailuspektri väh. 20 rinnakkaista hyväksyttyä mittausta Liittäminen laboratorion spektrikirjastoon Vertailu aiemmin mitattuihin spektreihin useita Erittäin tn. lajitason tunnistuksia (2,30 3,00) Tyyppikantojen sekvensointi 10 kpl, 16S-rRNA ei lajitason tunnistusta Streptomyces, Nocardia ja Pseudonocardia -suvut
Sovellettavuus asumisterveystutkimuksiin? MALDI-TOF MS menetelmä Asumisterveysdiagnostiikkaa ajatellen + Tukee viljelymenetelmää + Parantaa tunnistettavuutta + Kustannustehokas, nopea, helppokäyttöinen + Sovellettavissa heti rajoitetusti + Osa homeista lajitasolla + Osa aktinomykeeteistä sukutasolla + Laajempi bakteeritunnistus Perustuu viljelymenetelmään Supistaa esille saatavaa lajistoa Laitehankinta kallis Edellyttää rinnakkaista käyttöä Spektrikirjastoa täydennettävä rakennusmikrobistolla Tunnistettujen kantojen puute Anna-Mari Pessi
Kiitos! Santeri Kankaanpää, Anna-Mari Pessi, Raisa Ilmanen, Annika Saarto; Aerobiology Unit, Biodiversity Unit of the University of Turku Inka Harju, Erkki Eerola, Antti Hakanen Unit of Clinical Microbiology, Turku University Hospital