Laboratorio-opas. mikrobiologisten asumisterveystutkimusten. Anna-Mari Pessi, erikoistutkija Aerobiologian yksikkö

Transkriptio

1 Laboratorio-opas mikrobiologisten asumisterveystutkimusten laadunvarmistus Anna-Mari Pessi, erikoistutkija Aerobiologian yksikkö

2 Laboratorio-opas Asumisterveysasetus Asumisterveysasetuksen soveltamisohje, 20 Osa IV Mikrobiologiset olot Laboratorio-ohje Osa IV: Mikrobiologiset olot Toim. Anna-Mari Pessi (TY), Kaisa Jalkanen (THL)

3 Asumisterveysasetus (STM 545/2015) 20 Mikrobit Toimenpideraja Ylitys: Korjaamaton kosteus- tai lahovaurio; aistinvaraisesti todettu / tarvittaessa analyyseillä varmistettu Miten? 1) Rakennusmateriaali; laimennossarjaviljely- tai suoraviljelymenetelmällä 2) Pintanäyte, ilmanäyte Ilmanäyte edellyttää muuta näyttöä 3) Muut menetelmät: validointiedellytys

4 Asumisterveysasetuksen soveltamisohje, 20 Osa IV Mikrobiologiset olot Toimenpiderajan ylittyminen määritelmät eri menetelmissä muutos rakennusmateriaalin aktinomykeettien pitoisuusrajassa Menetelmät Rakennusmateriaali laimennussarja- /suoraviljely; suoramikroskopointi viljelyä tukevana Tulkinnat; lajiston huomioiminen tulkinnassa

5 Laboratorio-ohje Näytteenoton ohjeistus: materiaali, pinta, ilma Laimennussarjaviljelyt materiaali, pinta Menetelmäkuvaus = Asumisterveysopas 2009 Suoraviljely Menetelmäkuvaus, reseptiikka, Suoramikroskopointi Menetelmäkuvaus, milloin Tulosten tulkinta Kosteusvaurioindikaattorit Sienisystematiikan muutosten huomiointi; laho Työturvallisuus Tutkimusten laadunvarmistus Mittausepävarmuuden määrittely

6 Mikrobiologisten asumisterveystutkimusten laadunvarmistus

7 Epävarmuustekijät: rakennusmateriaali ja pintanäytteet Analyysi Näytteenotto Näytteen käsittely, osanäytteen otto, viljely, inkubointi Luentaan ja pesäkkeiden tunnistukseen liittyvät epävarmuustekijät Näytteenottokohdan valinta, näytteenoton onnistuminen, kontaminaatio Säilytys, kuljetus, dokumentointi Vaurioalue Näytteen mikrobisto, heterogeenisuus Matriisi = materiaalityyppi, aika

8 Epävarmuustekijät: ilmanäytteet Analyysi Näytteenotto Tila Näytteen käsittely, inkubointi Luentaan ja pesäkkeiden tunnistukseen liittyvät epävarmuustekijät Elävyyden säilyminen Laitteiden käyttö, kontaminointi, säilytys, kuljetus, dokumentointi Tilan mikrobit, kasvuston ominaisuudet Taustapitoisuudet, asumistoiminnot, vuodenaika, hetkelliset vaihtelut; ilman kosteus, painesuhteet

9 Näytteenoton ohjeistus

10 Näytteenoton ohjeistus laboratoriossa Vain varsinainen näytteenotto Ei näytteenottosuunnitelmaa tai näytteenottokohdan valintaa Pitkäranta 2016 (toim.). Rakennuksen kosteus- ja sisäilmatekninen kuntotutkimus. Ympäristöministeriö, Näytedokumentaatio Näytetiedot laboratoriota varten vrt. ISO/IEC Näytteenottajan oma dokumentaatio Materiaalinäytteet: vain yhtä rakennusmateriaalia

11 Vertailunäytteet Materiaalinäytteet Ei pitoisuustulkintaa (vrt. Asumisterveysohje 2003); Mahdollista lopullisen tulkinnan helpottamiseksi Pintanäytteessä edellytys Vaurio-vertailupari Ei tule käyttää laskeutuneen pölyn mikrobiston selvittämiseen

12 Ilmanäyte Virtaustilavuuden epävarmuus Impaktoripumppujen virtauksen vaihtelu ja häiriöt (laitteen imutehon vaihtelu keräyksen aikana, ilmamäärän kasvu laitteen lämmetessä) Impaktori-pumppuparien virtaustilavuuden säätö Tilavuusvirran varmistaminen Pumpun lämmitys - virtaustilavuuden vakioitumiseen kuluva aika tiedossa Rotametrin käyttö / säännölliset virtaus-tarkistukset Elatusalustan määrä kasvualustoilla Säädössä käytettävän virtausmittarin kalibrointi

13 Impaktori-pumppuparin virtaustilavuuden säätö

14 Rakennusmateriaalinäytteet

15 Rakennusmateriaalinäytteet Kelpoisuus, aistinvarainen arvio Dokumentointi: Märkä, laho tai hyönteisvioittunut näyte, Näkyvä tummentuma, muu värimuutos Silminnähtävä kasvusto Voimakas mikrobiperäinen haju materiaalissa Säilytys Ennen viljelyä ja sen jälkeen viileässä Viljely 3 päivän sisällä näytteenotosta. Jos näyte on kostea, näytteenottoa seuraavana päivän.

16 Suoraviljely

17 Suoraviljely Inkubointi: Sienet 7 ±1 vrk; aktinomykeetit: tarvittaessa jatkoinkuboinnin jälkeen 14 ± 1 vrk. Hagem-agar (Rose bengal malt extract agar) Rose Bengal hillitsee nopeakasvuisten homeiden kasvua Rose Bengal muuttuu valossa sienille myrkylliseksi Säilytys pimeässä Valmistuksen sekä viljelyn aikana maljoille tapahtuva valoaltistus pidetään alle kahdessa tunnissa. Alustalla kasvavia sieniä ei inkuboida valossa itiöinnin edistämiseksi.

18 Hagem-agar (Rose bengal malt extract agar) Reiman ja muut, Proc. Indoor Air '99, 4: g KH₂PO₄ 0,5 g MgSO₄ 7H₂O 0,5 g NH₄Cl 5 g glukoosi 5 g mallasuute 15 g agar ml deionisoitua vettä 35 mg streptomysiini 35 mg Rose Bengal 1 ml 1 % FeCl₃ -käyttöliuos Kuiva-aineet, vesi, sekä Rose Bengal sekä 1 % FeCl3₃ käyttöliuos sekoitetaan 1 % FeCl3₃ -käyttöliuos valmistetaan veteen Steriloidaan 121 ± 3 C, 15 min. Streptomysiini liuotetaan etanoliin ja lisätään n. 50 C agarseokseen. Elatusalustalle ei phvaatimuksia. Säilytys: pimeässä, 5 ± 3 C

19 Tunnistuksen laadunvarmistus Kasvualusta vaikuttaa kasvuston tunnistettavuuteen Aspergillus fumigatus M2, DG-18, Hagem Geomyces pannorum M2, Hagem

20 Suoramikroskopointi

21 Rakennusmateriaalinäytteen suoramikroskopointi osana viljelyanalyysiä Viljelyllä Havaitaan elinkykyiset/ käytetyllä kasvualustalla kasvavat mikrobit Ei havaita kuollutta, jo kuivunutta kasvustoa. Suoramikroskopointi varmentavana menettelynä

22 Milloin? Sienipitoisuus alle määritysrajan, pesäkemäärät ovat pieniä ja/tai lajiston poikkeavuus viittaa vanhaan kuivuneeseen vaurioon Vauriokohta on selkeästi näkyvissä preparoitavissa Lähinnä kovilta pinnoilta Ei yleensä luotettavasti sovellettavissa huokoisilta/ jauhemaisilta/ jauhaantuneilta materiaaleilta (mineraalivilla, hiekka, rappaus, sahanpuru) Pinnan tummentuma / muu selvä värimuutos, poikkeava pintarakenne tai haju, lahoepäily tai on syytä olettaa, että kostunut materiaali on kuivunut

23 Miten? 1. Havainnot näytteestä: visuaaliset / stereomikroskopia 2. Teippipreparaatti / preparointi suoraan materiaalista (ISO ) Osa vauriopinnasta talteen / kestopreparaatti saapuessa Värjääminen, petausaineet Mikroskopia: havainnoidaan sienirihmojen ja muiden sienirakenteiden esiintyminen, rakenteet kirjataan ylös

24 Tulkinta? Yhtenäinen tai laikuittainen sienikasvustoksi epäiltävä muutos Silmämääräisesti / stereomikroskooppisesti havaittavissa Rihmaston esiintyminen varmennetaan valomikroskopoinnilla Muu muutos/epäily Preparaatin systemaattinen luenta Pelkät itiöt eivät riitä: voivat viitata kontaminaatioon muusta lähteestä Rihmastoa havaittava, yksittäiset rihmaston kappaleet eivät riitä: vrt. Harvaa, pistemäistä (esim. pesuhuoneen pinnoilla ja muissa kosteudelle alttiissa tiloissa esiintyvää yleensä huonosta ilmanvaihdosta johtuvaa) mikrobikasvua ei tulkita vaurioituneeksi.

25 Suoramikroskopointi käytännössä Yhtenäinen tai laikuittainen sienikasvustoksi epäiltävä muutos Muu värimuutos/epäily

26 Vain viljelyn tukena. Miksi? Opinnäytetyöt: Miettinen 2012, Tulonen 2005; Validointiaineisto: Aerobiologian yksikkö 2012: Väärien negatiivisten näytteiden korkea osuus Pieni osanäyte; edustavuuden ongelmat Erityisesti huokoisissa materiaaleissa Ei sovellu bakteerikasvustojen, mukaan lukien aktinomykeetti-kasvustojen, luotettavaan havainnointiin Laajempi käyttö: validoitava viljelymenetelmään nähden Määriteltävä soveltuvat materiaalit, suurennos, osanäytteiden koko ja havainnoitava pinta-ala/materiaalimäärä,

27 Kosteusvaurioindikaattorimikrobit

28 Kosteusvaurioindikaattorimikrobit Vaurioituneissa materiaaleissa ja vaurioituneiden kohteiden ilmassa esiintyy usein tavanomaisten sienisukujen lisäksi mikrobeja, joita harvemmin esiintyy vauriottomien rakennusten rakenteissa ja ilmassa. Julkaisut, konsensuslistat jo 1990-luvulta alkaen Perustunut viljely- ja mikroskopointimenetelmiin sekä niihin perustuvaan sienisystematiikkaan DNA-menetelmät muuttaneet sienisystematiikka

29 Uudempaan DNA:n perustuvaan systematiikkaan perustuen lajistoa ei voi "kaventaa" (ilman tutkimustietoa). Huomioitava kirjallisuutta ja vertailukantoja käytettäessä! Lajien jakautuminen useisiin eri lajeihin sektiot, lajiryhmät, sensu lato (laajasti ymmärrettynä) Ulkonäköön perustuvat polyfyleettiset suvut (lajit todellisuudessa eri suvuista polveutuvia) Aiemmilla menetelmillä saatua kosteusvaurioindikaattorilistaa käytetään edelleen nykysystematiikka huomioiden Aspergillus versicolor mm. A. jensenii, A. puulaauensis, A. versicolor = Aspergillus sectio versicolores; Aspergillus versicolor sensu lato Aspergillus ochraceus mm. A. ochraceus, A. westerdijkiae = Aspergillus ochraceus ryhmä, Aspergillus ochraceus sensu lato Phialophora sensu lato: Phialophora, Cadophora, Coniophora, Coniochaeta/Lecytophora

30 Lahovaurio - lahottajasienet Korjaamaton lahovaurio = toimenpiderajan ylitys Laboratorio-opas: lyhyt lahon ja lahottajasienten kuvaus Milloin ohjata lahottaja-analyysiin Phialophora hoffmannii Coniophora hoffmannii kesikkä

31 Mittausepävarmuus ja muu epävarmuuden arviointi

32 Mikrobiologisen määrityksen tuloksen mittausepävarmuus Riippuu mittaustuloksesta Ei menetelmäkohtaista mittausepävarmuutta Pesäkelaskenta Poisson-jakautunutta count-dataa Pesäkeluvun hiukkastilastollinen epävarmuus kasvaa pesäkemäärän pienentyessä Mittausepävarmuus arvioidaan erikseen kunkin tuloksen osalta

33 Mittausepävarmuus- laskentatapoja Osatekijöiden yhdistäminen Yhdistää mikrobien hiukkastilastollisen hajonnan laimennoskertoimen & siirrostilavuuden epävarmuuden laboratoriokohtainen lukemaepävarmuuden Lukemaepävarmuus menetelmittäin (=kasvualustat, maljahajotus/impaktiokuvio) Niemelä; Mikes J1/2001 Laskukaavat: Evira, Mikrobiologisten menetelmien mittausepävarmuus ohje laboratorioille Globaali arviointi Kokonaisepävarmuutta tarkastellaan ulkoa päin, välittämättä mistä eri komponenteista se koostuu ISO Microbiology of food and animal feeding stuffs Guide on estimation of measurement uncertainty for quantitative determinations. Rinnakkaiset toistomittaukset samasta näytteestä; analysointiolosuhteiden tulee vaihdella uskottavasti, kuten todellisuudessa. > 10 näytettä/matriisi

34 Osatekijöiden yhdistäminen Materiaalinäyte laimennuskertoimen epävarmuus (yhdistelmä kaikkien homogenaatin laimentamiseksi tarvittavien tilavuusmittausten mittausepävarmuuksista) pesäkelaskennan lukemaepävarmuus maljahajotusviljelystä Ilmanäyte Ilmavirtauksen epävarmuus: näytteenoton vaikutus Pesäkelaskennan lukemaepävarmuus Korjatun pesäkemäärän luottamusväli (Macher, 1989: korjaustaulukko, CI 95% )

35 Näytteenottotapahtuma Laboratorio ei yleensä voi tehdä Ohjeistus näytteenottoon liittyen. Tulos & mittausepävarmuus laboratoriossa tehtävä osanäytteen valintaan liittyvä epävarmuus Näytteenoton huomioiva tulosten lopullinen tulkinta ja tulosten merkitys kokonaisuuteen ei yleensä kuulu laboratoriolle.

36 Ilmanäyte Virtaustilavuuden epävarmuus Impaktoripumppujen virtauksen vaihtelu ja häiriöt (laitteen imutehon vaihtelu keräyksen aikana, ilmamäärän kasvu laitteen lämmetessä) Impaktori-pumppuparien virtaustilavuuden säätö Tilavuusvirran varmistaminen Pumpun lämmitys - virtaustilavuuden vakioitumiseen kuluva aika tiedossa Rotametrin käyttö / säännölliset virtaus-tarkistukset Elatusalustan määrä kasvualustoilla Säädössä käytettävän virtausmittarin kalibrointi

37 Kiitos