Molekyyligeneettiset testit syövän hoidon suuntaajina Laura Lahtinen Molekylibiologi, FT Patologia Keski-Suomen keskussairaala
Perinteisesti kasvaimet on luokiteltu histologian perusteella Samanlainen morfologia, erilainen geneettinen tausta
Yksilöidyt syöpähoidot Syövän genomin profilointi
Syövän tunnusmerkit Immuunipuolustusmekanismien välttäminen Piittaamattomuus kasvurajoitteista Proliferaatiosignaloinnin ylläpito Rajoittamaton jakautumiskyky, immortaliteetti Muutokset energiametaboliassa Tuumorimuodostusta edistävä tulehdus Apoptoosin välttäminen Invaasio- ja metastasointikyky Kyky stimuloida uudisverisuonimuodostusta Genomin epätasapaino, mutaatioalttius Hallmarks of cancer. (Adapted from Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell 2011; 144:646.) Robbins and Cotran Pathologic Basis of Disease Copyright 2015
Mikro RNA muutokset Kopiolukumuutokset
Mutaatioiden määrä vaihtelee eri syövissä Kiinteät kasvaimet ~33-66 mutaatiota/kasvain melanooma ja keuhkosyöpä ~ 200 mutaatiota/kasvain Tupakoitsijoilla 10 kertaa enemmän mutaatioita Kasvaimissa joissa DNA korjausmekanismit vaurioituneet esiintyy jopa tuhansia mutaatioita Vogelstein et al 2013
Syövät pystytään jaottelemaan yhä pienempiin alaryhmiin Keuhkosyöpä NSCLC Adenocarcinoma 1987 80 % 20 % SCLC NSCLC 70 % 20 % 10 % Squamous Large-Cell Adenocarcinoma 75 % 25 % KRAS unknown Adenocarcinoma 2004 24 % KRAS 54 % EGFR 22 % unknown Adenocarcinoma 2017 KRAS 8 % ALK 26 % RET BRAF 20 % 20 % FGFR1 MET 4 % NRAS 3 % 7 % EGFR ROS1 AKT1 DDR2 MEK1 PIK3CA PTEN
Kasvaintautien prediktiiviset molekyylipatologiset tutkimukset prediktiivinen pari Syöpätyyppi Biomarkkeri Lääke Lääkkeen kohde Rintasyöpä Estrogeenireseptori Tamoksifeeni (1984) Estrogeenireseptori Rintasyöpä HER2-monistuma Trastuzumab (2000) HER2 Kolorektaalikarsinooma RAS-status (WT) Setubimab (2004) Panitumumab (2007) EGFR Keuhkosyöpä (NSCLC) Aktioiva EGFR-mutaatio EGFR p.t790m mut. Erlotinibi (2005) Gefitinibi (2009) Afatinibi Osimertinibi EGFR Keuhkosyöpä (NSCLC) ALK EML4-ALK-uudelleenjärjestymä Kritsotinibi (2012) Seritinibi Alektinibi ALK Melanooma Aktivoiva BRAF-mutaatio (V600E/K) Vemurafenibi (2012) BRAF GIST PDGFRA, C-KIT Imatinibi (2001) Abl, PDGFRA, KIT Rinta-, munasarja- ja eturauhassyöpä BRCA-mutaatio Olaparibi PARP
Kasvaintautien prediktiiviset molekyylipatologiset tutkimukset Prediktiiviset tutkimukset ennustavat hoitotulosta DIAGNOOSI HOITO Molekyylitason kohdennettujen lääkkeiden käyttö potilaille, jotka näistä hoidoista todennäköisimmin hyötyvät
BRAF inhibiittori hoito Levinnyt melanooma jossa BRAF V600E mutaatio 10 päivää hoidon aloituksen jälkeen 3 viikkoa hoidon aloituksen jälkeen
Solumäärän lisääntyminen ja väheneminen ovat normaalisti tarkkaan säädeltyjä
Täsmälääkkeet eli biologiset syöpälääkkeet Täsmälääkkeitä ovat muun vasta-ainelääkkeet ja pienimolekyyliset estäjät, jotka estävät jonkin tietyn reseptorin tai proteiinin toiminnan. Niiden etuna ovat monesti solunsalpaajia ja sädehoitoa vähäisemmät haittavaikutukset, koska lääkeaineen vaikutus kohdistuu pääasiassa syöpäsoluihin.
Reseptorityrosiinikinaasit (RTK) Blume-Jensen & Hunter, Nature 2001
Reseptorityrosiinikinaasit (RTK)
Sama mutaatio, sama lääke? EGFR KRAS NRAS BRAF Growth factor Cetuximab Panitumumab Vemurafenib
Melanooma vs kolorektaalisyöpä Mao et al. 2013, Clin Cancer Res
Sama mutaatio, eri hoitoteho Samoja geenimuutoksia esiintyy useissa eri syövissä, mutta lääkkeiden teho ei olekaan samanlainen Solujen erilaiset signalointireitit ja niiden säätely Histologinen luokittelu edelleen keskeistä
Tutkittava näyte, tutkimuksen laajuus ja menetelmien herkkyys määrittää mitä voidaan todeta Näytteen edustavuus? Menetelmän herkkyys? Mitä muutoksia menetelmä kattaa? Primääri vs metastaasi?
Kudosnäytteen ongelmat Komplikaatioriskit Ei aina mahdollista saada Voi kulua loppuun muussa diagnostiikassa Ei edusta taudin koko geneettistä profiilia Hankala kerätä hoidon eri vaiheissa
Syövän heterogeenisyys ja evoluutio Potilaiden välinen heterogeenisyys Kasvaimen sisäinen heterogeenisyys Kasvainten välinen heterogeenisyys Valintapaineen aiheuttama muuntuminen Hoidot
Nestebiopsia Verinäyte tai muu ruumiinneste, josta voidaan tehdä molekyylipatologisia kasvaimen ominaisuuksia kuvaavia määrityksiä Kiertävät tuumorisolut, DNA, RNA, mirna
Plasman solunulkoinen DNA Solujen tuhoutuminen ja aktiiviset eritysmekanismit vapauttavat verenkiertoon DNA:ta, jota voidaan eristää ja analysoida = circulating cell-free DNA (cfdna) Liikunta Aktiivinen Raskaus eritys Autoimmuuni sairaudet Aivohalvaus Apoptoosi Nekroosi Trauma Syöpä
Plasman kiertävä kasvain DNA Syöpäsoluista plasmaan vapautunut DNA = cell-free circulating tumor DNA (ctdna) määrä plasmassa vaihtelee syöpätyypin, kasvaintaakan ja muiden kasvaimen kliinis-patologisten ominaisuuksien mukaan
Määrä CtDNA:n hyödyntäminen Leikkaus Biologinen lääkitys Kemoterapia Kasvaintaakka Alkuvaiheen mutaatio resistenssimutaatio Aika Taudin varhainen toteaminen Jäännöstaudin seuraaminen Hoitovasteen seuranta Hoitovastetta ennakoiva mutaatiotestaus Resistenssimutaatioiden havaitseminen Kuva modifioitu artikkelista Isomursu et al. 2015
Nestebiopsian ongelma Syöpäsoluista peräisin oleva DNA edustaa vain murto-osaa soluvapaan DNA:n kokonaismäärästä Vaatii erittäin herkkiä menetelmiä!
Sanger sequencing >10% Pyrosequencing 10% NGS 2% qpcr 1% dpcr 0,01%
Digitaalinen PCR (dpcr) Yhden PCR reaktion sijasta, satoja tai jopa tuhansia reaktioita + Apsoluuttinen kvantitaatio + Riippumaton PCR tehokkuudesta + Vähemmän kilpailua DNA juosteiden kesken + Vähemmän altis PCR inhibiittoreille + Laaja dynaaminen alue + Mahdollistaa hyvin pienten muutosten mittauksen Herkyys riippuu käytetyn DNA:n määrästä sekä alukkeiden ja koettimien spesifisyydestä
cfdna EGFR testaus KSSHP 26 % 19 % ex. 19 del 29 % 74 % EGFR mutaatio todettu ei mutaatiota 39 % 10 % L858R T790M ex.19del ja T790M 3 % L858R ja T790M 2016-2018 n= 118 näytettä
cfdna ja NGS Alhaisten varianttifrekvenssien toteaminen vaatii kudosnäytteitä suurempaa sekvensointisyvyyttä Vaatii yleensä bioinformatiikan säätämistä Miten erottaa sekvensointivirheet ja todelliset pienen frekvenssin mutaatiot?
Digitaalinen sekvensointi Lasketaan ja analysoidaan alkuperäisten DNA pätkien määrää = Digitaalinen sekvensointi Perinteinen sekvensointi Digitaalinen sekvensonti 1 indeksi 5 indeksiä edustaa 5:tä alkuperäistä molekyyliä
NGS ddpcr
Molekyylipatologian haasteet Bioinformatiikka IT-ratkaisut Löydösten tulkinta Tulosten raportointi
NGS ddpcr