AIVOKUDOKSEN IMMUNOHISTOKEMIALLISEEN VÄRJÄYKSEEN KÄYTETTYJEN VASTA-AINEIDEN SPESIFISYYDEN TESTAAMINEN

AIVOKUDOKSEN IMMUNOHISTOKEMIALLISEEN VÄRJÄYKSEEN KÄYTETTYJEN VASTA-AINEIDEN SPESIFISYYDEN TESTAAMINEN Henri Rönkkö Pro gradu tutkielma Biotieteiden koulutusohjelma, biokemia Luonnontieteiden ja metsätieteiden tiedekunta / biotieteet Itä-Suomen yliopisto Toukokuu 2013

ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Luonnontieteiden ja metsätieteiden tiedekunta Biotieteiden koulutusohjelma, biokemian pääaine RÖNKKÖ, HENRI J. T. : Aivokudoksen immunohistokemialliseen värjäykseen käytettyjen vasta-aineiden spesifisyyden testaaminen Pro gradu -tutkielma, 68 sivua Ohjaajat: tutkimusjohtaja, dosentti, FT Riitta Miettinen, UEF, tutkimusjohtaja, FT Antero Salminen, UEF, yliopistotutkija, FT Ale Närvänen, UEF, nuorempi tutkija, FM Tapio Nuutinen, UEF ja yliopistolehtori, dosentti, FT Annikka Linnala-Kankkunen, UEF. Marraskuu 2012 Avainsanat: immunohistokemiallinen värjäys, vasta-aineiden spesifisyys, hippokampus, kalretiniini Työssä pyrittiin testaamaan viiden kaupallisesti tuotetun, rutiininomaisesti aivokudoksen immunohistokemialliseen tutkimukseen käytetyn vasta-ainevalmisteen spesifisyyttä. Näin tehtiin, koska julkaisija oli edellyttänyt laboratoriolta itsenäistä vasta-aineiden testaamista. Kaikilla valmisteilla tehtiin SDS-PAGE-pohjainen Western Blot kohdekudoksen, rotan hippokampuksen, proteomille. Yksi vasta-ainevalmisteista, anti-kalretiniini, affiniteettipuhdistettiin käyttäen rekombinantti-kalretiniinia sitomaan spesifiset vastaainemolekyylit. Alkuperäisellä valmisteella ja puhdistuksesta saaduilla fraktioilla tehtiin immunohistokemiallinen värjäys rotan aivoleikkeelle. Värjäystuloksia verrattiin toisiinsa ja Allen Brain Atlaksesta löytyneeseen hiiren in situ hybridisaatiokuvaan sekä yleisellä tasolla että erityisesti hippokampusta tarkastellen. Western blot -analyysissä saatiin melko paljon epäspesifistä signaalia. Osalla vasta-ainevalmisteista spesifinen signaali oli epäspesifistä voimakkaampaa, osalla ei. Epäspesifisyys saattoi johtua SDS-PAGElle ominaisesta proteiinien denaturoitumisesta. Immunohistokemiallisten värjäysten perusteella alkuperäinen anti-kalretiniini ei tullut affiniteettipuhdistamalla merkittävästi spesifisemmäksi. Immunohistokemialliset tulokset olivat samansuuntaiset hiiren in situ -hybridisaatiokuvien kanssa, joskaan eivät täysin samanlaiset, mitä voivat selittää yksilönsisäiset ja lajienväliset erot proteiinin ja vastaavan lähetti-rna:n sijainnissa. Tutkimusta parantaisi, jos saataisiin in situ -hybridisaatiokuva rotan aivoista ja/tai onnistuttaisiin erottelemaan proteiinit Western Blotissa vähemmän denaturoivasti, esimerkiksi isoelektrisellä fokusoinnilla. Näiden onnistuessa affiniteettipuhdistus ei luultavasti antaisi tutkimukselle paljon lisäarvoa. Monoklonaalisten valmisteiden tapauksessa spesifisyyden tarkastukseksi riittänee yleensä värjäys rinnakkaisvalmisteella.

UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of Science and Forestry Study Programme of Biosciences, Major of Biochemistry RÖNKKÖ, HENRI J. T. : Assessing the Specificity of Antibodies Used for Immunohistochemical Staining of Brain Tissue Master s Thesis, 68 pages Supervisors: Group Leader, Docent Riitta Miettinen, PhD, UEF, Group Leader Antero Salminen, PhD, UEF, Research Scientist Ale Närvänen, PhD, UEF, Younger Scientist Tapio Nuutinen, MSc, UEF and Lecturer, Docent Annikka Linnala-Kankkunen, PhD, UEF. November 2012 Keywords: immunohistochemical staining, specificity of antibodies, hippocampus, calretinin The goal of the work was to test the specificity of five commercially produced antibodies routinely used for immonohistochemical staining of brain tissue. The goal was set because a publisher had demanded independent testing of antibody specificity from the research group. An SDS-PAGE based Western Blot was performed with each of the antibodies on the proteome of the rat hippocampus. One of the products, anti-calretinine, was affinity purified, using recombinant calretinin to bind the specific antibody molecules. A series of rat brain slices were immunohistochemically stained using both the original product and the fractions obtained from the purification. The immunohistochemical results were compared with each other as well as to a mouse situ hybridization image obtained from Allen Brain Atlas, both on the general level and specifically with respect to the hippocampus. In the Western Blot analysis, a high level of unspecific signal was obtained. With some of the antibody products the specific signal was stronger the unspecific one, with others it was not. The unspecificity may have been caused by the denaturation of proteins characteristic of SDS-PAGE. Based on the immunohistochemical stains, the process of affinity purification did not significantly increase the specificity of the anti-calretinine. The immunohistochemical staining results were similar to the in situ hybridization patterns of the mouse brain, though not identical, which may be explained by intra-individual and interspecies differences in the localization of protein and the respective messenger RNA. The study would be improved by the acquisition of an in situ hybridization image of a rat brain and/or a variation of Western Blotting that utilized a less denaturing way of protein separation, such as isoelectric focusing. Should one succeed in these, affinity purification would not add much to the picture. In the case of monoclonal products, staining with another monoclonal produced against the same antigen is probably, in the majority of cases, a sufficient means of testing specificity.

ESIPUHE Yksi keskeinen syy siihen, että Riitta Miettisen laboratorio oli minulle yksi vaihtoehto hakiessani gradupaikkaani, oli kiinnostukseni aivoja kohtaan. En ollut vakuuttunut siitä, että jatkaisin tutkijanuraani gradunteon jälkeen (kuten en ole edelleenkään). Tutkijanuran jatkuessakin menetelmät ja aihepiirit voivat vaihtua väitöskirjaprojektin alkaessa. Yritin kuitenkin rajoittuneesta näkökulmastani jonkin verran spekuloida, mikä saattaisi olla minulle hyödyllistä. Immunohistokemiaa käytetään neurotieteissä paljon hermoston organisaation selvittämiseen, ja Miettisen laboratoriossa oli selvitelty erilaisten interneuronien paikkaa hippokampuksen, tuon deklaratiivista muistia palvelevan aivorakenteen, verkostoissa. Hermoston organisaatio on kiinnostanut minua pitkään, koska sen tunteminen lienee yksi hermoston toiminnan ymmärtämiseen vaadittavista tekijöistä. Toisaalta uskon myös, että toiminnan ymmärtäminen pelkästään organisaation pohjalta ei hermostomme tapauksessa ole yksinkertainen tehtävä. Laboratoriotutkimukset tehtiin kolmessa vaiheessa kolmessa eri laboratoriossa. Tämän paketin organisointi ja koordinointi vei oman osansa graduprojektiin käytetystä energiasta. Laboratoriossa päivät olivat joskus pitkiä, ja muita tekemisiään joutui välillä rajoittamaan. Sama päti toki toisinkin päin: lääketieteen opintojen aloitus ja erinäiset muut toimet ovat hajauttaneet graduprojektia ajallisesti. Karvaat pettymykset epäonnistuneiden suoritusten jälkeen ovat asia, jonka itse kukin tieteentekijä uransa varrella joutunee kohtaamaan. Mutta silloin kun kokeen saattoi jälkeenpäin todeta tulleen onnistuneesti tehdyksi oltuaan ensin neuroottisen epävarma siitä, tuliko kaikki tehtyä oikein, tuntui elämä hetken valoisammalta. Miettisen ohjauksella aloin luonnostella tutkielmani runkoa jo ennen laboratorioon astumista, ja käytännön töiden loputtua tunsin kulkeneeni pitkänkin tien. Sain kuitenkin nähdä, että tekemistä riitti vielä runsaasti. Pyrkiessäni kirjoittamaan tutkielmaa loppuun loppu ei välillä tuntunut lähestyvän lainkaan, koska yritykset vastata kysymyksiin tuntuivat synnyttävän uusia kysymyksiä ja jokainen tehty ratkaisu poikivan uusia ratkaisunpaikkoja. Tuntui, kuin olisin zoomannut fraktaaliin, joka aina vain muutti muotoaan sen sijaan, että olisi päästänyt minut lähemmäksi itseään. Mutta lopulta eräänä päivänä huomasin, että tekemäni lopulliset viimeistelyt olivatkin sillä kertaa olleet oikeasti lopullisia. Kuten mainittu, tämän tutkimuksen teossa hyödynnettiin kolmen eri laboratorion tietotaitoa ja varustusta. Pääohjaaja, dosentti Riitta Miettinen antoi tutkimusaiheen ja johdatti minut immunohistokemian maailmaan. Hänen laboratoriossaan tein immunohistokemialliset

värjäykset. Tutkimusjohtaja, filosofian tohtori Antero Salmiselta puolestaan saatiin tarvittavat asiat Western Blotien tekoon. Suuren osan käytännön opastuksesta hänen laboratoriossaan antoi nuorempi tutkija, filosofian maisteri Tapio Nuutinen. Western blot lienee ollut mittavin kaikista tämän työn laboratorio-osuuksista. Affiniteettipuhdistuksen tein filosofian tohtori, yliopistotutkija Ale Närväsen laboratoriossa, jossa töiden suoritusta ohjasi filosofian maisteri, projektitutkija Sari Pitkänen. Lehtori Annikka Linnala-Kankkunen puolestaan toimi yhdyssiteenä biokemian laitokseen. Kiitän kaikkia tämän gradun valmistumiseen myötävaikuttaneita.

LYHENNELUETTELO ABA = ABC = AEC = BSA = CA 1, 2 tai 3 = DAB = ELISA = Fc-domeeni = FITC = FDC = GABA = HAT-liuos = Ig = ISH = PAP = PBS = PVDF = SDS = SDS-PAGE = TBS = Tris = Allen Brain Atlas Avidin-Biotin Complex 3-amino-9-EthylCarbazole Bovine Serum Albumin Cornu Ammonis, hippokampuksen osa 3,3 -DiAminoBenzidineTAI 3,3 -DiAminoBenzidine tetrahydrochloride Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Fragment, Crystallisable domeeni (vasta-ainemolekyylin häntä ) Fluorescein IsoThioCyanate Follicular Dendritic Cell Gamma-AminoButyric Acid (gamma-aminovoihappo) Hypoxanthine-Aminopterin-Thymidine -kasvatusliuos ImmunoGlobulin In Situ Hybridization Peroxidase Anti-Peroxidase Phosphate-Buffered Saline PolyVinylidene DiFluoride Sodium Dodecyl Sulphate SDS PolyAcrylamide Gel Electrophoresis Tris Buffered Saline Trishydroxymethylaminomethane

SISÄLLYSLUETTELO 1. JOHDANTO 8 2. KIRJALLISUUSKATSAUS 10 2.1. Vasta-aineet 10 2.1.1. Elimistön vasta-ainetuotanto 10 2.1.2. Vasta-aineiden isotyypit 15 2.1.3. Mono- ja polyklonaaliset vasta-ainevalmisteet 17 2.1.4. Vasta-ainevalmisteiden tuotanto 18 2.1.5. Vasta-aineiden affiniteetti ja spesifisyys ja tuotantoprosessin optimointi niiden kannalta 20 2.1.6. Vasta-aineella paikantaminen biotieteellisessä tutkimuksessa 23 2.2. Vasta-aineita hyödyntäviä molekyylibiologisia menetelmiä 25 2.2.1. ELISA 25 2.2.2. Western blot 26 2.3. Immunohistokemialliset menetelmät 29 2.3.1. Menetelmien perusteoria 29 2.3.2. Leimat ja signaalin havaitseminen 29 2.3.3. Vasta-aineiden spesifisyyden kontrollointi 32 2.4. Affiniteettipuhdistus 36 2.5. Hippokampus 37 2.5.1. Yleistä hippokampuksesta 37 2.5.2. Tunteiden ja stressin vaikutus hippokampuksen toimintaan 38 2.5.3. Tutkittujen vasta-aineiden antigeenit hippokampuksessa 38 3. TUTKIMUKSEN TAVOITTEET 41 4. MATERIAALIT JA MENETELMÄT 42 4.1. Materiaalit 42 4.1.1. Kudostyyppi, testatut primaarivasta-aineet ja rekombinantti-kalretiniini 42 4.2. Menetelmät 43 4.2.1. Kudosnäytteiden hankinta ja esikäsittely 43 4.2.2. Western blot 43 4.2.2.1. Elektroforeesi ja siirrostus 43 4.2.2.2. Immuunikompleksien muodostaminen 44 4.2.2.3. Signaalin tuotto ja kerääminen 45 4.2.3. Kalretiniinin vasta-aineen affiniteettipuhdistus 45 4.2.4. ELISA 47 4.2.5. Immunohistokemiallinen värjäys 48 5. TULOKSET 51 5.1. Vasta-aineiden toiminta Western blotin olosuhteissa 51 5.2. Affiniteettipuhdistuksen arviointi ELISAlla 54 5.3 Immunohistokemiallisen värjäyksen tulokset 54 6. POHDINTA 60 7. LÄHDELUETTELO 65 7

1. JOHDANTO Immunohistokemiallista värjäystä käytetään runsaasti sekä kliinisessä diagnostiikassa että bio- ja lääketieteellisessä tutkimuksessa. Immunohistokemian avulla saadaan paikallistettua makromolekyylejä kudoksesta. Neurotieteissä sitä käytetään hermoston organisaation selvittämiseen. Immunohistokemian avulla on mahdollista tunnistaa hermostosta mm. erilaisia solutyyppejä ja niiden tuoja- ja viejähaarakkeillaan muodostamia ratoja. Immunohistokemiassa hyödynnetään vasta-aineita, joita tuotetaan immunisoimalla eläimiä makromolekyylille. Immunohistokemian antama tieto on luotettavaa kuitenkin vain siinä tapauksessa, että käytetyt vasta-aineet ovat spesifisiä kohteilleen. Tässä tutkimuksessa pyrittiin kehittämään käytäntö, jolla immunohistokemiallinen laboratorio voisi varmistua vasta-ainevalmisteen spesifisyydestä. Vaikka valmistajat kontrolloivat tuotteitaan, vaaditaan tutkijoitakin usein arvioimaan työkalujensa taso. Näin oli käynyt myös Riitta Miettiselle. Lehteen lähetetty käsikirjoitus oli tullut takaisin kera vaateen, että spesifisyys olisi todistettava. Osaa tutkittavista vasta-aineista oli valmistajan mukaan arvioitu SDS-PAGE-pohjaisella Western Blotilla. SDS kuitenkin denaturoi antigeeneina toimivat proteiinit, joten se ei välttämättä ole luotettava keino arvioida vasta-aineiden toimintaa ympäristössä, jossa proteiinit ovat luontaisessa konformaatiossaan. Western blotit SDS:n kera tehtiin tässä tutkimuksessa kaikille tutkittaville vasta-aineille, eikä suurin osa niistä toiminut tällöin spesifisesti. Tutkittavia vasta-aineita ei ollut puhdistettu muista aspiroidun ruumiinnesteen komponenteista. Ylimääräisten komponenttien vaikutusta valmisteen spesifisyyteen arvioitiin affiniteettipuhdistamalla yksi kaupallinen polyklonaalinen vasta-ainevalmiste, kalretiniinin antiseerumi SWANTilta. Puhdistuksen jälkeen tehtiin immunohistokemiallinen värjäys rotan aivoleikkeelle alkuperäisellä valmisteella sekä puhdistuksesta saadulla spesifisellä ja epäspesifisellä fraktiolla, ja verrattiin tuloksia keskenään. Epäpuhtausfraktion todettiin tuottavan jonkin verran taustaa, mutta alkuperäinen valmiste ja puhdistettu fraktio antoivat yhtenevät tulokset. Immunohistokemiallisen värjäyksen tulosta verrattiin myös lähetti-rna:n paikallistumiseen eli in situ -hybridisaatioon (ISH) perustuvia kuvia, joita on hiiren aivoista kerätty Allen Brain Atlas tietokantaan. Tulokset olivat samansuuntaisia. Tutkielmassa ehdotetaan myös muutoksia spesifisyyden arviointiin käytettävään menetelmäpatteristoon. Luotettavampi vertailukohta vasta-aineen tuottamalle värjäytymistulokselle rotan aivoissa olisi ISH rotan aivoista hiiren sijaan. Jos rotan aivoleikkeestä saataisiin ISH-kuva joko itse ottamalla tai muualta, ISH itsessään voisi olla riittävän pitävä tapa 8

spesifisyyden osoittamiseen, joskin tulosten tulkintaa voisivat välillä hankaloittaa mahdolliset erot proteiinin ja lähetti-rna:n sijainneissa. ISH:n tueksi voisi yrittää saada aikaan Western Blotin vähemmän denaturoivilla menetelmillä. Tällainen saattaisi olla mahdollista saada aikaan erottelemalla proteiinit niiden isoelektrisen pisteen perusteella. Vasta-ainevalmisteen affiniteettipuhdistuksen tuottaman lisähyödyn näitä menetelmiä käytettäessä arvioidaan olevan useimmissa tapauksissa vähäinen. Monoklonaalisten valmisteiden tapauksessa spesifisyyden selvittämiseksi voi riittää rinnakkainen värjäys rinnakkaisvalmisteella, mikäli sellainen on saatavissa. 9

2. KIRJALLISUUSKATSAUS 2.1. Vasta-aineet 2.1.1. Elimistön vasta-ainetuotanto Vasta-aineita (kuva 1) esiintyy leuallisilla selkärankaisilla (Abbas ym. 2010, s. 6). Ne ovat immunoglobuliinien ryhmään kuuluvia proteiineja, joiden tehtävä elimistössä on tarttua vieraisiin makromolekyyleihin (Abbas ym. 2010, s. 75). Näin ne auttavat torjumaan elimistön toimintaa uhkaavia loiseliöitä, mikrobeja ja viruksia. Yksi vasta-ainemolekyyli tarttuu hanakimmin juuri tiettyyn kohteeseen, mitä kutsutaan spesifisyydeksi. Spesifisyyden määräävät vasta-ainemolekyylin antigeenejä sitovien domeenien kohdemolekyylin kanssa muodostamat sähköstaattiset vuorovaikutukset (ionit ja dipolit, Van der Waals, vesihakuisuus-vesipakoisuus), joiden syntyminen edellyttää pinnanmuotojen yhteensopivuutta ja oikeanlaisia varauksia oikeissa paikoissa. Antigeeni Antigeeniä sitovat domeenit Fc-domeenit ( häntä ) Kuva 1. Yleisluontoinen kaavakuva IgG-vasta-ainemolekyylistä Muokattu Wikipedian kuvasta, jonka tehnyt nimimerkki Fvasconcellos. Tässä irrallisiksi piirrettyjä ketjuja sitovat oikeasti toisiinsa disulfidisidokset. Vasta-aineet ovat tärkeä osa adaptiivista immuunijärjestelmää. Immuunipuolustuksen toinen peruskomponentti on synnynnäinen immuunijärjestelmä, joka reagoi esim. havaitessaan bakteerien kalvorakenteille yleisesti ominaisia lipopolysakkarideja. Synnynnäinen immuniteetti ei kuitenkaan riitä huolehtimaan koko immuunipuolustuksesta, koska taudinaiheuttajien 10

evoluutio on paljon nopeampaa kuin isäntäeliöiden, minkä takia taudinaiheuttajille kehittyy helposti tapoja kiertää synnynnäinen immuniteettijärjestelmä, bakteerien kohdalla esim. lipopolysakkaridien naamiointi muilla makromolekyyleillä. Taudinaiheuttajien evoluutiota nopeuttaa nopea sukupolvien vaihtuminen ja suuret populaatiokoot, sekä joukko muita tekijöitä. Bakteerit voivat vaihtaa keskenään perimätekijöitään esim. plasmidien ja transposonien muodossa, bakteriofagienkin (bakteerien virusten) joskus osallistuessa sekoitusprosessiin (Campbell ja Reece 2008, s. 386). Bakteerien geneettiset elementit useinkin siirtyvät bakteerilajilta toiselle. Esimerkkinä Escherichia colin tiettyjen EHEC-kantojen (EnteroHaemorrhagic E. Coli) edustajilla on genomiin integroituneen bakteriofagin koodittama, aitotumallisissa soluissa proteiinisynteesin pysäyttävä Shiga-toksiini, joka on lähes identtinen erään Shigella dysentriae muodon tuottaman toksiinin kanssa (Hedman ym. 2010, s. 181). Virukset puolestaan voivat poimia geneettisiä elementtejä isäntäeliöistään, ja eri virusten genomit voivat sekoittua, kun erilaisia viruksia pesii samassa solussa. Lisäksi etenkin RNAja yksisäie-dna-virusten geneettisen materiaalin replikaatiossa syntyy mutaatioita enemmän kuin isäntäeliön DNA-replikaatiossa. Tiheämpi mutatoituminen lisää toimintakyvyltään huonompien varianttien syntymisen todennäköisyyttä, mutta tämän haitan mahdollisesti kompensoi suurempi muuntelu, joka antaa suojaa immuunijärjestelmää vastaan (Hedman ym. 2010, s. 466-469). Adaptiivinen immuunijärjestelmä antaa elimistölle mahdollisuuden pysyä nopeasti muuntuvien taudinaiheuttajien perässä, vaikka voittamaton se ei sentään ole. Kun vieraita molekyylejä pääsee kehon sisään, adaptiivisessa immuunijärjestelmässä käynnistyy immunisoitumisprosessi. Sen kuluessa syntyy elimistössä valmiina olevista B-soluista suuria määriä spesifistä vasta-ainetta tuottavia plasmasoluja sekä muistisoluja. (Vastaavanlaisen prosessin käyvät läpi myös T-solut soluvälitteisen immuniteetin puolella, mutta aihepiiri on tämän vasta-aineisiin liittyvän gradun ulkopuolella.) Plasmasolut ovat lyhytikäisiä, mutta niitä voidaan tuottaa nopeasti muistisoluista, jos vasta-ainetuotannon alun perin laukaissutta molekyyliä eli antigeeniä pääsee elimistöön uudestaan. Jo se, että vasta-aine sitoutuu toksiinin, viruksen tai bakteerin pintaan, auttaa usein vähentämään elimistöön kohdistuvaa uhkaa. Tätä partikkelin päällystymistä vasta-aineilla kutsutaan opsonoinniksi. Tämä yksistään ei kuitenkaan yleensä ole riittävä puolustusmekanismi niin mikrobeja kuin viruksiakaan vastaan. Mikrobeilla on elävinä olentoina pintansa alla viruksista ja toksiineista poiketen omia toimintoja, joita opsonointi ei pysty pysäyttämään. Virukset puolestaan lisääntyvät elimistön soluissa (kuten myös jotkin bakteerit), ja vapautuvat niistä suurina määrinä tartuttamaan muita soluja. Vasta-aineet eivät välttämättä ehdi neutraloida kaikkia viruksia, eivätkä joka tapauksessa pääse solujen sisään. 11

Mikrobeja vastaan puolustautumista edistää opsonoinnin edesauttama fagosytoosi, joka usein myös edellyttää opsonointia. Fagosytoosi on energiaa kuluttava prosessi, jota käytetään yli 0,5 µm:n kokoisiin partikkeleihin (Abbas ym. 2010, s. 36). Fagosytoosissa syöjäsolu ottaa partikkelin sisäänsä solukalvostaan kuromaansa rakkulaan. Tämän jälkeen syöjäsolu pyrkii hajottamaan fagosytoidun aineksen. Elimistömme syöjäsoluja ovat makrofagi-monosyyttilinjan solut sekä neutrofiiliset granulosyytit, ja niillä on kalvoreseptori, jonka avulla ne paikallistavat partikkeliin tarttuneet vasta-aineet. Monilla mikrobilajeilla on molekyylirakenteita, joiden funktio on haitata fagosytoosia, ja opsonointi on usein välttämätöntä niiden fagosytoimiseksi. Fagosytoosilla on merkitystä myös viruksia vastaan puolustautumisessa, joiden fagosytointi on täysin opsonoinnista riippuvaa. Syöjäsolut toimivat enimmäkseen soluvälitilassa. Verenkierrossa mikrobien tuhoamisesta huolehtii pääosin komplementtijärjestelmä, joka koostuu joukosta proteiineja. Se voi toimia osana niin synnynnäistä kuin hankittua immuunijärjestelmää. Jälkimmäisessä tapauksessa komplementtivasteen laukaisee vasta-aineen sitoutuminen mikrobin pintaan. Komplementtivasteessa komplementtiproteiineista muodostuu mikrobin solukalvoon sen läpäiseviä kanavia (membrane attack complex). Nämä reiät häiritsevät mikrobin toimintaa saaden sen lopulta kuolemaan. Eosinofiiliset granulosyytit, jotka tuhoavat loiseliöitä pommittamalla niitä hajotusentsyymeillään, tunnistavat nekin kohteensa siihen tarrautuneiden vasta-aineiden perusteella. Virusinfektion taltuttamisessa adaptiivisen immuunijärjestelmän soluvälitteinen osa on yleensä vasta-ainevälitteistä oleellisempi. Kun sytotoksinen T-solu (T tulee Thymuksesta eli kateenkorvasta, jossa T-solut kypsyvät) havaitsee elimistön oman solun pinnan MHCIkompleksissa vierasantigeenin, se käynnistää tapahtumaketjun, jonka tarkoitus on solun hävittäminen. Soluvälitteinen järjestelmä on tarpeen paitsi solujen sisälle meneviä taudinaiheuttajia vastaan puolustautumisessa, myös esisyöpäsolujen poistamisessa (Abbas ym. 2010, s. 122). Luonto on täynnä biologista variaatiota. On ollut taudinaiheuttajakantoja, jotka ovat kyenneet lyömään useimpien ihmisten immuunijärjestelmän; vastaavasti henkiinjääneillä ihmisillä on ollut ominaisuuksia, jotka ovat suojanneet kyseisiä kantoja vastaan. Monille bakteerilajeille ja virustyypeille on luonnollisesti kehittynyt sopeutumia, joiden avulla ne pystyvät suojautumaan adaptiiviseltakin immuunijärjestelmältä ainakin niin pitkään, että ehtivät leviämään uusiin isäntiin. Isäntänsä elimistön nopeasti romuttava taudinaiheuttaja ei kuitenkaan monissa olosuhteissa ole kovin leviämiskykyinen. Esim. HIV lopulta tyypillisesti saa aikaan isäntänsä kuoleman (ainakin ilman antiretroviraalisia lääkkeitä), mutta prosessi on hidas. Toisaalta arviolta n. 10 %:lla eurooppalaisperäisistä ihmisistä on geenimutaatio, joka homotsygoottisena 12

antaa vahvan, joskaan ei täydellisen, suojan HIV:tä vastaan (Lucotte 2001). Mutaation suhteellisen korkea frekvenssi saattaa johtua siitä, että se on aikaisemmin suojannut joltain muulta taudinaiheuttajalta. Elimistön kyky kehittää vasta-ainetta antigeenille, jota se ja mahdollisesti koko sen edustama laji ei ole koskaan aikaisemmin kohdannut, nojaa vahvasti muuntelun ja valinnan hyödyntämiseen. Sikiönkehityksen aikana B-solujen vasta-ainegeenielementeissä tapahtuu rekombinaatiota, ja syntyy joukko B-soluklooneja, joista kukin tuottaa vasta-ainetta, jolla on omanlaisensa antigeeninsidontadomeeni (Abbas ym. 2010, s. 155). Osa B-soluklooneista reagoi elimistön omiin molekyyleihin; nämä kloonit elimistö pyrkii poistamaan. Elimistöön jää arviolta 10 7 erilaista B-solukloonia. Antigeenin kohdatessaan elimistö vielä tuottaa osasta näitä soluja entistä spesifimpejä ja tehokkaampia vasta-aineita valmistavia versioita muuntelu- ja valintasyklin avulla. B-solua, joka ei ole vielä kohdannut antigeeniään, kutsutaan naiiviksi. Sen tuottamilla vastaaineilla on domeeni, joka ankkuroi vasta-aineen solukalvoon (vakioalueestaan, niin että vaihtelevat alueet voivat edelleen sitoa antigeenejä). Nämä solukalvoon kiinnittyneet vastaaineet toimivat reseptorien tavoin. Elimistöä itseään vastaan toimivia vasta-aineita tuottavat B-solut pyritään tuhoamaan heti, kun ne ovat erilaistuneet luuytimen hematopoieettisista kantasoluista. Tämä tuhoaminen perustuu siihen, että elimistö antaa apoptoosi- eli solukuolemakäskyjä niille B-soluille, jotka luuytimessä tarttuvat reseptorivasta-aineillaan johonkin. Luuytimessä ei tavallisesti ole vierasantigeenejä, joten valintaprosessi tuhoaa niitä B-soluja, joiden vasta-aineet reagoivat elimistön omiin molekyyleihin. Käytännössä tällaisiakin B-soluja voi päästä seulan läpi, osaksi siksi, että luuytimessä ei esiinny kaikkia elimistön antigeenejä, ainakaan kovin suurina pitoisuuksina. Tämän jälkeen B-solut päätyvät imusolmukkeisiin. Siellä ne alkavat lisääntyä, ja osa linjoista johtaa lopullisiin plasmasoluihin, jotka tuottavat vasta-aineesta solunulkoiseen tilaan erittyvää muotoa. Osana prosessia vasta-aineet mukautuvat paremmin elimistön kohtaamaa immunologista haastetta vastaaviksi. Tässä tapahtumasarjassa ovat keskeisessä osassa auttaja- T-solut (helper T cell), dendriittisolut (DC eli Dendritic Cell) ja follikulaariset dendriittisolut (FDC eli Follicular Dendritic Cell). Dendriittisolut fagosytoivat mikrobeja. Mikrobien tunnistaminen tapahtuu mikrobien tiettyjen yleisesti ilmentämien pinta-antigeenien, kuten mannoosin, perusteella (Abbas ym. 2010, s. 120). Mikrobit hajotetaan dendriittisolujen sisällä. Proteiineja pilkkoutuu lyhyiksi peptideiksi, joiden osasia päätyy dendriittisolujen solukalvolle MHCII-proteiineihin (Major Histocompatibility Complex) sitoutuneina. 13

Imusolmukkessa on imukerästen ulkopuolisessa tilassa aktivoitumattomia auttaja-t-soluja, jotka tunnustelevat reseptoreillaan jatkuvasti dendriittisolujen MHCII-proteiineja (Abbas ym. 2010, s. 223). B-soluille analogisella tavalla auttaja-t-solutkin muodostavat klooneja, joista kukin ilmentää kalvoreseptoria, joka reagoi tietynlaisiin antigeeneihin. Kun sopiva auttaja-tsolu löytää MHCII:sta antigeeninsä, se aktivoituu ja siirtyy imukeräsen rajapintaan. Samalla imukeräsessä sijaitsevat naiivit B-solut, jotka tuottavat sopivanlaista vasta-ainetta, aktivoituvat löytäessään antigeeniään. Ne fagosytoivat antigeeniä, ja sisään otettuja proteiineja hajoaa peptideiksi B-solujen MHCII:ien esiteltäviksi. Aktivoituneet B-solut myös siirtyvät imukeräsen rajapinnalle. Imukeräsen rajapinnalla aktivoituneet B- ja auttaja-t-solut kohtaavat. Jos auttaja-t-solu havaitsee kalvoreseptorillaan antigeeniaan B-solun MHCII:ssa, auttaja-t-solu aktivoi B-solun edelleen uuteen toimintatilaan. Tällöin B-solu muuttaa imukeräsen sisäosaan, jossa on follikulaarisia dendriittisoluja (Abbas ym. 2010, s. 228). Näitä soluja ei tule sekoittaa yllä mainittuihin auttaja-t-solujen kanssa vuorovaikuttaviin dendriittisoluihin. Follikulaarisilla dendriittisoluilla ei ole MHCII-proteiineja. Niillä on Fc- (Fragment, crystallizable, vastaainemolekyylin häntä ) ja komplementtireseptoreita, joiden avulla ne pystyvät tarttumaan vasta-aineisiin ja komplementtiin ja sitä kautta niiden kompleksoimiin antigeeneihin, joita follikulaariset dendriittisolut sitten esittelevät B-soluille pilkkomattomina. T-solujen aktivoimat B-solut, jotka tarttuvat follikulaarisen dendriittisolun esittelemään molekyyliin, saavat follikulaariselta dendriittisolulta lisääntymissignaalin. Tällöin nämä B-solut alkavat lisääntyä, ja samalla niiden Ig V eksonien (jotka koodittavat vasta-aineiden Variable-alueita, jotka määräävät vasta-aineiden spesifisyyden) DNA:n pistemutaatiotaajuus kohoaa nisäkkäillä 10 3-10 4 kertaiseksi muuhun DNA:han nähden (Abbas ym. 2010, s. 233). Näin syntyy joukko muunnelmia alkuperäisestä B-solusta. Ne muunnelmat, jotka tarttuvat antigeeniinsa vahvimmin, viettävät pidempiä aikoja tiiviissä kosketuksessa follikulaaristen dendriittisolujen kanssa, ja saavat eniten lisääntymiskäskyjä. Tämän toistaan seuraavista muuntelu- ja valintavaiheista koostuvan prosessin vaikutuksesta syntyy B-soluja, jotka tuottavat vieläkin vahvemmin antigeeniinsa sitoutuvia vasta-aineita. Prosessin englanninkielinen nimi on affinity maturation. On hyvä huomata, että B-solulla ja sitä aktivoivalla auttaja-t-solulla ei tarvitse olla eikä luultavasti yleensä olekaan sama epitooppi. B-solut tunnistavat reseptoreillaan yleensä natiivissa konformaatiossa olevia kokonaisia biomolekyylejä, kun taas auttaja-t-solut tunnistavat lyhyitä peptidejä, joita niitä esittelevät solut ovat pilkkoneet endosytoimistaan suuremmista molekyyleistä. B-solun ja sitä aktivoivan auttaja-t-solun antigeenina tulee 14

kuitenkin toimia sama molekyyli. Koska T-solut tunnistavat vain peptidejä, ne voivat aktivoida B-soluja ainoastaan, jos antigeeni on tai siihen on kiinteässä yhteydessä peptidi. Vasta-aineiden tuottaminen onnistuu joskus myös peptideistä vapaita molekyylejä vastaan, mutta vaste jää tällöin usein vaatimattomammaksi. B-soluvasteen saattaa mahdollistaa tällaisissa tapauksissa antigeenin sitoutuminen proteiineihin kehossa (Abbas ym. 2010, s. 114). Osa ei-peptideistä ei laukaise vasta-ainetuotantoa ollenkaan. Seuraava vaihe B-solujen kypsymisessä on vasta-aineen isotyypin vaihto. Vasta-ainemolekyylin solukalvoon sitova domeeni häviää. Tämän jälkeen vasta-ainemolekyylit pystyvät liikkumaan vapaasti, ja ne jakautuvat tasaisesti elimistön solunulkoiseen nestetilaan. B-solusta on tullut plasmasolu. Plasmasolujen energiankulutus on suurta ja proteiinisynteesi laajamittaista, ja ne polttavatkin itsensä loppuun muutamassa päivässä. Uusia plasmasoluja kuitenkin eriytyy B-solukannasta niin pitkään kuin antigeeniä havaitaan, ja osasta plasmasoluja eriytyvät muistisolut ylläpitävät immuniteettia pidemmällä aikajänteellä. 2.1.2. Vasta-aineiden isotyypit Useampaa kuin yhtä vasta-aineen isotyyppiä esiintyy ainakin Tetrapoda-yläluokan eläimillä (sammakkoeläimillä, matelijoilla, linnuilla ja nisäkkäillä). Eniten erilaisia isotyyppejä tiedetään olevan nisäkkäillä. Tässä tarkastellaan ihmiselimistössä esiintyviä isotyyppejä (Abbas ym. 2010, s. 87). Kuva 2. Kaavakuva IgM-kompleksista Piirretty Abbasin ym. (2010) mukaan. Solukalvossa kiinni oleva muoto on monomeerinen. Kuva 3. IgG-vasta-aine Piirretty Abbasin ym. (2010) mukaan. B-solut, jotka eivät vielä ole kohdanneet antigeeniään, ilmentävät isotyyppejä IgD ja IgM (kuva 2). Ne ovat kiinni solukalvossa ja toimivat reseptorien tavoin. Plasmasoluksi muuntuessaan B-solu vaihtaa isotyyppinsä vapaasti liikkuvaan. Olosuhteet ratkaisevat, minkä isotyypin vasta- 15

ainetta elimistössä tarvitaan, ja eri immuunisolujen erittämillä sytokiineilla on suuri merkitys siinä, minkä isotyypin B-solu valitsee (Abbas ym. 2010, s. 228). Ensimmäinen vapaasti liikkuva vasta-aine, jota immunisoitumisen yhteydessä aletaan tuottaa, on IgM:n solunulkoiseen tilaan erittyvä versio. Muista vasta-aineista poiketen se esiintyy pentameerina, jossa viisi vasta-ainemolekyyliä on liittynyt kovalentisti Fc-domeeneistaan yhteen. Tämä parantaa IgM:n kykyä tarttua taudinaiheuttajiin, mutta hidastaa sen diffuusiota kudoksissa. IgM on tehokas aktivoimaan komplementtireaktiota. Immuunivasteen edetessä pidemmälle muuntelu- ja valintasykli tuottaa B-solupopulaatioita, joiden tuottamien vasta-aineiden antigeenejä sitovat domeenit tarttuvat antigeeniin tiukemmin. Nämä vasta-aineet pystyvät täten toimimaan pentameereja pienempinä kokonaisuuksina ja samalla kulkeutumaan kudoksessa paremmin. Edenneessä immuunivasteessa tuotetuista vastaaineista yleisluontoisin on IgG (kuva 3), joka esiintyy monomeerina. IgM:n tavoin sekin voi aktivoida komplementtireaktion. Sen tärkeitä erityistehtäviä ovat fagosytoosin auttaminen ja väliaikaisen passiivisen immuniteetin anto jälkikasvulle, johon se kulkeutuu maidon ja istukan kautta. Jos on merkkejä siitä, että antigeenit ovat peräisin monisoluisista loisista, aletaan erittää IgEtyypin vasta-aineita (kuva 4), jotka ovat nekin monomeerisia. Kun IgE on päällystänyt loisen, loisia torjuva eosinofiili-granulosyytti löytää sen helpommin. IgE myös osallistuu paikallisen tulehdustilan aikaansaamiseen. IgE on normaalisti harvalukuinen, eikä siksi aktivoi syöttösolua, jonka aktivointiin tarvitaan useampi IgE. Kun kehossa on vieraita partikkeleita, joihin IgE sitoutuu, muodostuu useita IgE-molekyylejä sisältäviä komplekseja, jotka pystyvät aktivoimaan syöttösoluja, saaden nämä sidekudoksessa ja limakalvoilla esiintyvät solut vapauttamaan tulehdustekijöitä. IgE:n ympärillä pyörivällä immuunijärjestelmän osalla on merkitystä myös allergiana tunnetussa toimintahäiriössä. On esitetty, että loiskuormitus vähentäisi allergioiden esiintyvyyttä. Kuva 4. IgE Piirretty Abbasin ym. (2010) mukaan. Kuva 5. IgA Piirretty Abbasin ym. (2010) mukaan. IgA (kuva 5) puolestaan on vasta-ainetyyppi, jota erittyy kyynelnesteeseen, sylkeen, keuhkojen ja ruoansulatuskanavan limaan sekä virtsa- ja sukuelinten eritteisiin. Se säilyttää toimintakykynsä ruoansulatuskanavassa muita isotyyppejä paremmin, ja suojaa kehoa 16

limakalvoille kulkeutuneilta mikrobeilta. IgA esiintyy dimeerinä, ja on kehon eniten tuotettu vasta-aineisotyyppi. 2.1.3. Mono- ja polyklonaaliset vasta-ainevalmisteet Vasta-aineille on kehitetty erilaisia sovellutuksia tutkimustyöhön, diagnostiikkaan ja terveydenja sairaanhoitoon. Ensimmäinen askel tuotannossa on eläimen immunisointi antigeenillä. Saadut vasta-aineet ovat yleensä IgG-tyyppiä. Jonkin verran vasta-aineita tuotetaan kananmunissa, jolloin isotyyppi on nisäkkäissä esiintymätöntä IgY-tyyppiä (Tini ym. 2001). Koska antigeenissä on yleensä useita epitooppeja kohtia, jonka tunnistava B-solu elimistöstä löytyy yksi antigeeni yleensä aktivoi useamman eri B-solukloonin. Täten immuunivaste saa aikaan vasta-aineseoksen, jossa vasta-ainemolekyyleillä on erilaisia polypeptidisekvenssejä vaihtelevilla alueillaan (variable regions). Siten seoksessa on vasta-aineita, jotka sitoutuvat antigeenin eri epitooppeihin. Tällaista seosta kutsutaan polyklonaaliseksi vasta-aineeksi. Pelkästään yhdenlaisen vasta-ainemolekyylin joukkoa kutsutaan monoklonaaliseksi vastaaineeksi. Molemmilla on sovellutuksia tutkimuksessa ja lääketieteessä, ja halutunlaisten vastaaineiden tuotantoon on tekniikkansa (Abcam 2012). Monoklonaalisen vasta-aineen tuottaminen on monimutkaisempaa ja kalliimpaa kuin polyklonaalisen tuottaminen. Yleisesti ottaen monoklonaaliset vasta-aineet ovat polyklonaalisia spesifisempiä. Koska monoklonaaliset vastaaineet sitoutuvat vain yhteen antigeenin epitoopeista, monoklonaaliset vasta-aineet löytävät epitooppeja useammasta kuin yhdestä makromolekyylistä polyklonaalisia epätodennäköisemmin. Tämä spesifisyys on hyödyksi niin tietyissä terapeuttisissa kuin tutkimuksellisissakin sovellutuksissa. Monoklonaalisen vasta-aineen käyttö vähentää virheellisten positiivisten tulosten todennäköisyyttä ristiinreagoinnin vähentyessä, ja esim. proteiinin tietyn domeenin spesifinen tunnistaminen tulee mahdolliseksi. Taustasignaali vähenee, ja koska erien välillä ei ole toiminnallisia eroja, kuten joskus polyklonaalisten tapauksessa, tutkimusten toistettavuus paranee. Joihinkin käyttötarkoituksiin polyklonaaliset vasta-aineet sopivat paremmin. Jos antigeenin määrät ovat pieniä, esimerkiksi tutkittaessa kudosta, jossa tutkittavaa proteiinia ilmentyy vähän, polyklonaalisen suurempi herkkyys on eduksi. Polyklonaalinen vasta-aine on monoklonaalista vähemmän herkkä antigeenin pienille poikkeavuuksille, joita voi aiheuttaa esim. polymorfia (peptidisekvenssien yksilökohtainen vaihtelu) tai se, että eri ekspressiosysteemeissä proteiinin glykosylaatio voi olla erilaista. Polyklonaalinen vasta-aine myös tunnistaa denaturoituneen proteiinin monoklonaalista todennäköisemmin, koska se tunnistaa useita eri epitooppeja, joista jokin voi säilyä tunnistuskelpoisena. Polyklonaaliset vasta-aineet myös todennäköisemmin 17

tunnistavat homologisen proteiinin eri eliölajeista. 2.1.4. Vasta-ainevalmisteiden tuotanto Ensimmäinen käyttöalue ihmiskehon ulkopuolella tuotetuille vasta-aineille oli ihmisten passiivinen immunisointi tauteja vastaan eläimissä tuotetun antiseerumin avulla. Eläimiin ruiskutettiin taudinaiheuttajia, ja ne alkoivat valmistaa vasta-aineita. Yleensä antiseerumin tuotantoon käytettiin hevosta, koska siitä voitiin laskea suurempia määriä verta kuin pienemmistä eläimistä. Nämä vasta-aineet olivat luonnollisesti polyklonaalisia. Niin eläimistä kuin ihmisistäkin eristettyjä vasta-aineita käytetään yhä useiden tautien hoitoon ja toksiinien vaarattomaksi tekemiseen. Tutkimuskäyttöön polyklonaalisia vasta-aineita tuotetaan yleensä pienemmissä eläimissä. Osa kerätään myös immunisoitujen kanojen keltuaisista (Tini ym. 2001). Munien käytön hyviä puolia on mm., että eläimiä ei tarvitse stressata veren keräämisellä ja että vasta-ainetta saadaan samassa ajassa yhtä kanaa kohti enemmän kuin vastaavankokoisesta nisäkkäästä. Immuunireaktion tehostamiseksi voi olla tarpeen ruiskuttaa eläimeen antigeenin lisäksi adujuvanttia, ainetta, joka aktivoi synnynnäistä immuunijärjestelmää, joka vuorostaan aktivoi adaptiivista järjestelmää (Abbas ym. 2010). Lisäksi voi olla tarpeen kiinnittää molekyyli proteiiniin (esim. glutaraldehydillä), jotta molekyyliä vastaan saataisiin syntymään vastaainetta. Kompleksia vastaan syntyvistä vasta-aineista osa tarttuu alkuperäiseen molekyyliin eli hapteeniin, osa myös tai ainoastaan proteiiniin. Menetelmää täytyy usein käyttää, jos halutaan vasta-aineita ei-peptidiä vastaan (koska ilman auttaja-t-soluvuorovaikutuksia vastaainetuotanto voi jäädä vähäiseksi tai olemattomaksi, ks. kohta 2.1.1). Kohler and Milstein julkaisivat monoklonaalisten vasta-aineiden tuotantomenetelmän 1975. Seuraavassa esitetty kuvaus menetelmästä perustuu Encyclopedia of Life Sciences teoksen artikkeliin Production of Monoclonal Antibodies (Liddell 2005) sekä kirjaan Cellular and Molecular Immunology (Abbas ym. 2010). Kuten polyklonaalisten vasta-aineiden tuotannossa, ensimmäinen askel on eläimen immunisointi. Monoklonaalisten vasta-aineiden tapauksessa kyseessä on Balb/c-kannan hiiri. Immunisoitua eläintä ei kuitenkaan käytetä suoraan vastaaineen tuotantoon, vaan sopivia monoklonaalisia vasta-aineita tuottavien plasmasolujen lähteenä. Immunisoinnin jälkeen eläimelle annetaan uusi annos samaa antigeeniä. Tämä saa sille spesifistä vasta-ainetta tuottavien plasmasolujen määrän kasvamaan huomattavasti muutamassa päivässä. Sen jälkeen hiiri lopetetaan, ja sen pernasta otetaan talteen plasmasoluja. Niitä sijoitetaan 18

kuoppalevyn kuoppiin yhdessä myeloomasolujen kanssa. (Myelooma on plasmasoluperäinen syöpä.) Plasma- ja myeloomasoluja saadaan sulautumaan hybridoomasoluiksi polyetyleeniglykolikäsittelyllä. Kasvuliuoksessa on hypoksantiinia, aminopteriinia ja tymidiiniä, joista se saa nimekseen HATliuos. Sen tehtävä on estää myeloomasolujen ja kahden myeloomasolun muodostamien hybridien lisääntyminen. Aminopteriini estää soluja käyttämästä pääasiallista puriinien synteesitietään, jolloin niiden ainoaksi tavaksi tuottaa puriineja jää turvautuminen niin kutsuttuun pelastustiehen (salvage pathway), puriinien muokkaamiseen hypoksantiinista ja tymidiinistä. Myeloomasolut on kuitenkin käsitelty niin, etteivät ne tuota hypoksantiiniguaniinifosforibosyylitransferaasientsyymiä, joka katalysoi tähän tarvittavaa reaktiota. Koska myeloomasolut eivät pysty syntetisoimaan puriineja, ne eivät pysty kahdentamaan DNA:taan, eivätkä näin ollen jakautumaan. Hiirestä saadut plasmasolut sen sijaan pystyvät tuottamaan puriineja pelastusteitse ja voivat jakautua. Plasmasolupopulaatiot eivät kuitenkaan selviydy soluviljelmässä muutamaa viikkoa pidempään, kuten eivät myöskään pelkkien plasmasolujen muodostamat hybridit. Plasma- ja myeloomasoluista muodostuneet hybridoomasolut sen sijaan jakautuvat ja selviytyvät viljelmässä loputtomiin, koska niillä on sekä pernasoluilta saatu kyky syntetisoida puriineja että myeloomasoluilta saatu kuolemattomuus. (Syöpäsolujen kyky selviytyvä ja jakaantua viljelmissä ei vaikuttaisi yleensä heikentyvän ajan kuluessa.) Näin HAT-kasvualustaa käyttämällä saadaan valikoitua soluista plasma- ja myeloomasolujen muodostamat hybridoomasolut. Sitten hybridoomasolut sekoitetaan suurempaan nestetilavuuteen, laimentaen solupitoisuutta niin, että nesteestä otetussa näytteessä voidaan odottaa olevan keskimäärin yksi solu. Näytteet siirretään 96-kuoppaisen, ns. mikrotiitterikuoppalevyn kuoppiin, ja hybridoomasolujen annetaan lisääntyä. Mikäli kuoppaan tuli vain yksi solu, siihen muodostuu monoklooni. Mikäli soluja tuli kuoppaan enemmän kuin yksi, korjautuu tämä virhe myöhemmässä vaiheessa. Solujen lisäännyttyä viljelynesteeseen erittyneiden vasta-aineiden reaktiivisuutta antigeenin kanssa tutkitaan esim. ELISA-menetelmällä (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Jos kuoppaan todetaan erittyneen antigeenille reaktiivista vasta-ainetta, kloonien toisistaan erottuminen varmistetaan laimennosta ja viljelyä vuorottelemalla tai hajauttamalla solut puolikiinteään agariin, johon kasvaa pesäkkeitä yksittäisistä soluista. Reaktiivista vasta-ainetta tuottavat kloonit valikoidaan jälleen. Vasta-aineen reaktiivisuus antigeenin kanssa testissä ei riitä takaamaan spesifisyyttä. Reaktiivisuuskaan ei ole vielä taattu kaikissa menetelmissä, kuten esimerkiksi Western blotissa, jossa proteiinit ovat SDS:n denaturoimia, tai immunohistokemiassa. Valikoitujen solukloonien 19

tuottamien vasta-aineiden toimintaa täytyy arvioida tavoilla, jotka varmistavat vasta-aineiden oikeanlaisen toiminnan niiden lopullisessa käyttökohteessa. Aikaisemmin monoklonaalisten vasta-aineiden laajamittaiseen tuotantoon käytettiin yleensä hiiriä ja askitesmenetelmää. Askites on lääketieteellinen termi vatsaonteloon kerääntyvälle nesteelle. Menetelmässä hybridoomasoluja ruiskutetaan hiiren vatsaonteloon. Ne lisääntyvät ja tuottavat vasta-ainepitoista nestettä. Vatsan turpoamista odotetaan noin kaksi viikkoa, minkä jälkeen askitesta imetään ruiskulla. Käytetyt hiiret ovat samaa Balb/c-kantaa kuin ne, joista B- ja myeloomasolut eristettiin, mikä mahdollistaa tuotettujen hybridoomasolujen kasvattamisen niiden sisällä ilman kudosyhteensopivuusongelmia. Nykyään monoklonaalisia vasta-aineita tuotetaan yleisemmin soluviljelmissä (Böcker ja Buchwalow, s. 5). Askitesmenetelmä on kustannustehokkaampi, mutta soluviljelmien käyttöä puoltavat eettiset näkökohdat. Askitesmenetelmä aiheuttaa hiirille kärsimystä, vaikka käytössä on ollut ohjeita askitesnesteen kertymisen ja keräämiskertojen rajoittamiseksi. Soluviljelmässä voidaan jatkaa hybridoomasolujen kasvatusta, tai vasta-aineen geeni voidaan siirtää johonkin muuhun solulinjaan, kuten kiinankääpiöhamsterin munasarjasyöpäsoluihin (CHO, Chinese Hamster Ovary cells). Rekombinantti-DNA-tekniikan avulla myös home- ja kasvisolut on saatu tuottamaan monoklonaalista vasta-ainetta kasvatusliuokseensa ja kanat muniinsa, mutta näitä tekniikoita ei vielä hyödynnetä tuotannossa ainakaan kovin laajamittaisesti (Zhu ym. 2005). Monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamisessa soluviljelmissä ja/tai ei-eläinsoluissa on sekin hyvä puoli, että nämä tuotantojärjestelmät eivät tuota muita kuin haluttua vasta-ainetta. Askitesnesteessä on jonkin verran hiiren oman immuunijärjestelmän tuottamia muita vastaaineita. 2.1.5. Vasta-aineiden affiniteetti ja spesifisyys ja tuotantoprosessin optimointi niiden kannalta Sitä, kuinka vahvasti vasta-ainemolekyyli sitoutuu kohteeseensa, kutsutaan sen affiniteetiksi (Kimball 2003). Affiniteetin määrittämiseen on tarjolla erilaisia menetelmävaihtoehtoja. Perinteisesti vasta-ainemolekyylin affiniteettia tiettyä molekyyliä kohtaan on määritetty tasapainodialyysillä (equilibrium dialysis). Sitä varten tarvitaan kalvo, joka päästää lävitseen antigeenin mutta ei vasta-ainetta, ja nestetila, jonka kalvo jakaa kahtia. Diffuusion vaikutuksesta antigeenimolekyylit alkavat liikkua nestetilasta toiseen. Jos vasta-ainemolekyylin affiniteetti antigeenille on nolla, antigeeni on jakautunut tasapainotilassa tasaisesti kumpaankin nestetilaan. Mitä korkeampi affiniteetti on, sitä enemmän tasapainotila poikkeaa tästä 20

tilanteesta vasta-ainemolekyyliä sisältävän puolen hyväksi. Yksi menetelmä, joka sopii nesteen antigeenipitoisuuden arviointiin, on tuonnempana käsiteltävä ELISA. Affiniteetin määrittämiseen sovelletaan myös muita menetelmiä, joiden käyttöön liittyy erilaisia etuja, mutta joiden selittäminen vaatii enemmän fysiikan käsitteistöä ja mennee siten tämän tutkielman aihealueen ulkopuolelle. Tällaisia menetelmiä ovat ainakin high-mass Matrix- Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) massaspektrometria ja Surface Plasmon Resonance (SPR) (Bich ym. 2008). (Esim. YouTubesta löytää näistä helposti havainnollisia animaatioita.) Korkea affiniteetti ei kuitenkaan yksinään vielä tarkoita sitä, että vuorovaikutus olisi myös spesifinen että vasta-ainemolekyylillä olisi korkean affiniteetin vuorovaikutuksia ainoastaan tarkastellun antigeenin kanssa. Riittävän samankaltaisia epitooppeja voi löytyä muistakin kohteista. Proteiineihin liittyen voidaan todeta, että elimistössä on monia toistensa kanssa vaihtelevasti homologisia proteiineja, ja myös ei-homologisilla proteiineilla voi olla keskenään samankaltaisia epitooppeja. Eri sovelluskentät asettavat vasta-aineen spesifisyydelle erilaisia vaatimuksia, joten vasta-aineen spesifisyyden testaamiseen valitaan menetelmät sen mukaan, mihin vasta-ainetta on tarkoitus käyttää. Näitä menetelmiä käydään läpi tarkemmin tuonnempana. Vasta-aineen spesifisyyteen tähtääviä ratkaisuja voidaan tehdä jo tuotantovaiheessa (Polak ja van Noorden 1987). Antigeenin on hyvä olla mahdollisimman puhdasta, jotta immunisaatiossa ei syntyisi vasta-aineita ylimääräisiä antigeenejä kohtaan. Nämä ylimääräiset vasta-aineet voisivat aiheuttaa tutkimuksissa ylimääräistä signaalia. Mikäli antigeeniä täytyy käyttää hapteenina osana suurempaa kompleksia, kompleksin suurempi molekyyli pyritään luonnollisesti valitsemaan siten, että sitä tai sen kaltaisia molekyylejä ei esiintyisi lopullisessa käyttökohteessa. Monoklonaalisten vasta-aineiden tuotannossa tämän asian kanssa ei tarvitse olla yhtä tarkka kuin polyklonaalisten kohdalla, koska monoklonaalisten tuotantoprosessissa on mahdollista valita solulinja, jonka tuottamat vasta-aineet reagoivat ainoastaan hapteeniin. Sellainenkin vasta-aine, jota elimistö tuottaa haluttua antigeeniä (eikä esim. antigeenivalmisteen epäpuhtautta) vastaan, voi reagoida ristiin. Tällaisten vasta-aineiden syntymisen todennäköisyyttä voidaan vähentää ottamalla selvää siitä, mitkä antigeeniproteiinin pintarakenteista ovat kaikista omaleimaisimpia, ja immunisoida eläintä sitten näillä pelkillä proteiinin osasilla. Tämä kuitenkin saa eläimen tuottamaan myös vasta-ainemolekyylejä, joita se ei tuottaisi kokonaista proteiinia vastaan. Kun proteiinista käytetään palasta, paljastuu osia ja epitooppeja, joita B-solujen reseptorit/vasta-aineet eivät huomaisi normaalitilanteessa. Palasella immunisoitu elimistö alkaa tuottaa vasta-aineita näille epitoopeille. Tällaisten vasta-aineiden affiniteetti natiivia (luonnollisessa tilassa olevaa) proteiinia kohtaan on heikko, mutta ne voivat reagoida ristiin joidenkin tutkittavassa näytteessä olevien makromolekyylien kanssa. Polyklonaalisen vasta- 21

aineen tapauksessa ongelmaan auttaa affiniteettipuhdistus (menetelmästä enemmän kohdassa 2.4). Monoklonaalisessa tuotannossa voidaan yksinkertaisesti valita se solulinja, joka tuottaa vasta-ainetta, joka tarttuu sekä proteiinin osaseen että natiiviin proteiiniin. Melko yleisesti tutkimustyöhön käytettäviä vasta-ainevalmisteita ei ole puhdistettu, jolloin monoklonaalinen vasta-ainevalmiste on soluviljelyliuosta tai askitesnestettä, polyklonaalinen valmiste yleensä veriseerumia. (Kun polyklonaalista vasta-ainetta tuotetaan kananmunassa, on vasta-aineen puhdistus keltuaisesta tarpeen, mutta IgY:n puhdistus spesifisemmäksi on vaihtoehtoinen askel.) Näin on mm. tässä tutkimuksessa tarkasteltujen vasta-aineiden laita. Kuten yleensä, valmisteet on kylmäkuivattu säilyvyyden parantamiseksi. Puhdistamattomassa valmisteessa on mukana kaikkea muutakin kuin haluttuja vastaainemolekyylejä. Veriseerumin ja askitesnesteen muiden komponenttien ohella mukana ovat kaikki eläimen sillä hetkellä tuottamat vasta-aineet. Ei-haluttuja vasta-aineita on suhteellisesti enemmän antiseerumissa kuin monoklonaalista vasta-ainetta sisältävässä askiteksessa (Boenisch 2009). Mikäli tuotantoon on käytetty soluviljelmää, mukana ei ole ylimääräisiä vasta-aineita. Jotta muut komponentit haittaisivat tutkimusta, niiden pitäisi joko estää vasta-aineen tarttumista kohteeseensa, tai aiheuttaa väärää signaalia. Ensimmäistä asiaa ei ilmeisesti ole havaittu tapahtuvan. Tämä on myös loogista, koska olisi elimistön toiminnan kannalta epätarkoituksenmukaista, että se tuottaisi molekyylejä, jotka haittaisivat vasta-aineiden toimintaa. (Toisaalta, jos tuotantojärjestelminä aletaan käyttää muita kuin eläinsoluja, ei tämä ehkä ole enää niin ilmeistä.) Jälkimmäinen edellyttäisi sitä, että näytteessä olisi ei-haluttuja vasta-aineita, jotka löytäisivät tutkittavasta näytteestä sopivia epitooppeja. Tämä vaara on merkittävämpi polyklonaalisten valmisteiden kohdalla. Sitä voidaan torjua estämällä eläintä joutumasta kosketuksiin sellaisten antigeenien kanssa, joita on tutkittavassa näytteessä. Tätä on mahdollista toteuttaa pitkälle kasvatettaessa laboratorioeläimiä, joiden ympäristö yleensä on yksipuolinen ja tiukasti kontrolloitu. Toisaalta, tutkittavan näytteen molekyyleissä voi sattumalta olla samankaltaisia epitooppeja kuin eläimen elinympäristössä, vaikka näillä molekyyleillä ei muuten olisi mitään tekemistä eläimen kohtaamien antigeenien kanssa. Tämä ei kuitenkaan liene erityisen todennäköistä. Joka tapauksessa, onnistuneen immunisaation jälkeen antiseerumissakin haluttua antigeeniä vastaan tuotetun vasta-aineen osuus on verraten suuri (vaikka edustaakin vain pientä osaa kokonais-igg:stä, Ale Närväsen tiedonanto), koska eläimen sisälle ruiskutettu antigeeni (jonka mukana eläin usein saa immuunireaktiota tehostavaa adjuvanttia) yleensä aiheuttaa voimakkaamman immuunireaktion kuin etupäässä pintaepiteelien kanssa kosketuksiin pääsevät ympäristön antigeenit. Joka tapauksessa, sen lisäksi, että vasta-aineiden tuotannossa tähdätään spesifisyyteen, myös 22

vasta-aineita hyödyntävissä immunologisissa tutkimusmenetelmissä käytetään kontrolleja, joiden avulla virheellisen positiivisen tuloksen mahdollisuutta pyritään minimoimaan. 2.1.6. Vasta-aineella paikantaminen biotieteellisessä tutkimuksessa Fysikaalis-kemiallisilla olosuhteilla on vaikutuksensa niin vasta-aineisiin kuin antigeeneihinkin. Niinpä erilaisille tutkimuksellisille, diagnostisille ja terapeuttisille menetelmille on omat vasta-ainevalmisteensa. Biotieteellisen tutkimustyön sovellutuksissa vasta-aineen tehtävä on usein auttaa paikallistamaan näytteestä antigeeni. Tällöin vasta-aineeseen saadaan jotain kautta liittymään signaalia tuottava komponentti, joka auttaa paikannuksessa. Ennen signaalin paikallistamista ylimääräiset, sitoutumattomat vasta-aineet ja signaalia tuottavat komponentit huuhdellaan pois. Signaalin tuottamiseen käytetty komponentti vaihtelee jonkin verran sovellutuksen mukaan. Yksi usein käytetty komponentti on entsyymi, joka saa aikaan jollain tavalla havaittavan signaalin katalysoimansa reaktion kautta. Entsyymi voidaan liittää Fc-domeeniin kovalentisti suoraan esim. glutaraldehydin avulla. Entsyymi ja/tai vasta-aine voi kuitenkin menettää tällöin tehoaan. Hellävaraisemmin liitos saadaan aikaan hyödyntämällä biotiinia ja streptavidiinia. Biotiini tunnetaan myös B7-vitamiinina. Streptavidiini on Streptomyces avidini bakteerista eristetty proteiini, jolla on neljä biotiinia sitovaa domeenia, joista kukin pystyy sitomaan yhden biotiinimolekyylin (Polak ja van Noorden 1987). Streptavidiini on yksi avidiiniperheen proteiineista, joita esiintyy myös muissa eliöissä. Toinen immunologiassa yleisesti käytetty avidiini löytyy kananmunan valkuaisesta. Kaikki tunnetut avidiiniproteiinit sitovat biotiinimolekyylejä hyvin lujasti. Streptavidiinin etu kananmunan avidiiniin nähden on, ettei sillä ole sähköistä varausta eikä hiilihydraattiryhmiä. Varauksettomuuden ansiosta se ei sitoudu epäspesifisesti sähköstaattisilla vuorovaikutuksilla, eivätkä näytteen lektiiniproteiinit pysty sitoutumaan streptavidiiniin hiilihydraattiryhmien puuttuessa. Biotinyloimalla vasta-aineen häntä siihen saadaan sitoutumaan avidiinimolekyylejä (joiden kaikkia biotiininsidontapaikkoja ei ole täytetty), joihin on konjugoitu entsyymejä. Biotinyloituun häntään mahtuu kiinnittymään useita avidiineja, ja biotiini-avidiinimenetelmällä on yleensä saavutettu parempi herkkyys kuin glutaraldehydikiinnityksellä. Avidiinin ja biotiinin 23

kompleksoitumista hyödyntäviä menetelmiä kutsutaan ABC-menetelmiksi (Avidin-Biotin Complex). Osassa menetelmiä käytetään paikannukseen entsyymien sijasta fluorokromeja eli fluorensoivia yhdisteitä. Niistä ainakin FITC (Fluorescein IsoThioCyanate) kiinnittyy vasta-aineeseen emäksisissä olosuhteissa ilman muita reagensseja (mekanismina on FITCin tapauksessa tioureasidoksen muodostuminen vasta-aineiden primaaristen amiinien kanssa). Signaalia tuottavaa komponenttia ei yleisesti liitetä suoraan siihen vasta-aineeseen, joka liittyy paikallistettavaan antigeeniin, eli primaarivasta-aineeseen. Sen signaalia tuottava komponentti liitetään yleisimmin sekundaarivasta-aineeseen, joka löytää primaarivasta-aineen Fc-domeenin. Tällä tavalla leimatun sekundaarivasta-aineen käyttöä kutsutaan epäsuoraksi menetelmäksi (ks. kuva 8, kohta (b) 1, jossa yksinkertainen esimerkki). Immunohistokemiassa (kudosten mikroskooppinen tutkimus, jossa kiinnostuksen kohteena oleva antigeeni paikallistetaan vasta-aineella) on ollut myös käytössä kolmikerroksinen PAP-menetelmä (Peroxidase Anti-Peroxidase käytetyn entsyymin mukaan, ks. kuva 8, kohta (b) 2). Siinä sekundaarivasta-aine tarttuu toisella antigeeninsidontadomeenillaan primaarivasta-aineeseen, toisella tertiäärivasta-aineeseen. Primaari- ja tertiäärivasta-aine ovat siis samasta ja sekundaarivasta-aine toisesta lajista. Tertiäärivasta-aine sitoo entsyymin. Avidiini-biotiinimenetelmä on yksinkertaisempana kuitenkin melko pitkälti syrjäyttänyt PAPmenetelmän. Epäsuoran menetelmän käytölle on kaksi perustetta, joista molempiin liittyy kustannusten vähentäminen. Ensinnäkin, jos leima liitettäisiin suoraan primaarivasta-aineeseen, leima tai biotiiniryhmät pitäisi liittää kaikkiin erilaisiin primaarivasta-aineisiin. Käytettäessä sekundaarivasta-ainetta täytyy käsitellä pienempi joukko erilaisia vasta-aineita. Esimerkiksi hiiren IgG-vasta-aineen vasta-ainetta (sekundaarivasta-aine) voi käyttää kaikkien hiiren IgGvasta-aineiden (primaarivasta-aine) kanssa. Toiseksi epäsuora menetelmä on herkempi kuin suora. Primaarivasta-aine on symmetrinen molekyyli, jolla on kaksi kappaletta kutakin epitooppia. Niinpä monoklonaalisen sekundaarivasta-aineen käyttö kaksinkertaistaa signaalin. Polyklonaalinen sekundaarivastaaine kasvattaa signaalia vielä enemmän. Herkkyyden takia epäsuorissa menetelmissä voidaan käyttää pienempiä primaarivasta-ainekonsentraatioita kuin suorassa menetelmässä. 24

2.2. Vasta-aineita hyödyntäviä molekyylibiologisia menetelmiä 2.2.1. ELISA ELISA-menetelmää käytetään näytteessä esiintyvän antigeenin tai vasta-aineen määrän mittaamiseen (Paulie ym. 2006). ELISAn yleisimmin käytetty muoto on nk. sandwich (kuva 6; ks. myös Abbas ym 2010, s. 526). Sandwichiä käytetään yleisimmin jonkin antigeenin määrittämiseen. Tällöin kuoppalevyn kuoppaan kiinnitetään tutkittavalle antigeenille spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta vakioitu määrä niin, että antigeeniensidontadomeeneja jää vapaaksi. Sitten tutkittavaa näytettä pipetoidaan kuoppaan. (Vaihtoehtoisesti kyse voi olla pohjaan kiinnitettävän vasta-aineen detektoinnista, jolloin antigeenin määrä on tunnettu.) Näytteen sisältämät antigeenimolekyylit tarttuvat vasta-ainemolekyylien antigeeninsidontadomeeneihin. Seuraavaksi kuoppaan lisätään toista kyseiselle antigeenille spesifistä mutta toiseen epitooppiin liittyvää monoklonaalista vasta-ainetta, joka myös sitoutuu antigeenimolekyyliin. Joko näiden tai erillisten sekundaarivasta-aineiden Fc-domeeneihin on liitetty tai liittyy entsyymi. Entsyymi katalysoi reaktion, jossa näytteeseen lisättävä substraatti muuttuu aineeksi, jolla on alkuperäisestä poikkeava absorptiospektri. ELISAsta on olemassa myös mm. fluoresenssiin ja radioaktiivisiin leimoihin perustuvia muunnelmia. Yleisimmin ELISAssa käytetyt entsyymit ovat emäksinen fosfataasi (alkaline phosphatase), piparjuuriperoksidaasi (horseradish peroxidase) ja β-galaktosidaasi. Ennen entsyymien substraatin lisäystä sitoutumaton entsyymi huuhdotaan pois. Sitten entsyymien aikaansaamasta värjäytymästä voidaan standardien perusteella määrittää spektrofotometrin avulla entsyymien, sitä kautta vasta-ainemolekyylien ja sitä kautta antigeenimolekyylien konsentraatio näytteessä. 1 2 3 4 5 Kuva 6. Sandwich -ELISA 1. Pohjustusvasta-ainetta on kiinnitetty kuopan pohjalle. 2. Kuoppaan lisätään tutkittavaa näytettä, jonka antigeenistä osa tarttuu vasta-aineisiin. 3. Ylimääräinen antigeeni on huuhdottu pois. 4. Kuoppaan on lisätty vasta-ainetta, johon on liitetty tai liittyy entsyymejä. Ylimääräisen entsyymilinkatun vasta-aineen poishuuhtelu on tässä ohitettu. Yleistä myös on, ettei entsyymejä liitetä suoraan näihin vasta-aineisiin, vaan käytetään vielä sekundaarivasta-ainekerrosta. 5. Entsyymit tuottavat liuokseen väriainetta substraattien lisäyksen jälkeen. 25

Sandwichin lisäksi ELISAsta on muita variantteja, joista kuvassa 7 on esitelty epäsuoraa ELISA-menetelmää (Thermo Fisher Scientific 2013). Suora menetelmä on muuten samanlainen, mutta entsyymi on linkattuna ensimmäiseen vasta-ainekerrokseen. Epäsuora menetelmä, jossa käytetään sekundaarivasta-ainetta, on näistä kahdesta yleisempi (kohdassa 2.1.6 käsitellyistä syistä). Menetelmää voidaan käyttää näytteen sisältämän antigeenin osoitukseen, jolloin näytettä kiinnitetään epäspesifisesti pohjaan. Vaihtoehtoisesti voidaan määrittää liuoksessa olevaa vasta-ainetta, jolloin tutkittava vasta-aine on ensimmäinen vasta-ainekerros. Näin tehtiin tässä tutkimuksessa. 1 2 3 4 5 Kuva 7. Epäsuora ELISA 1. Antigeeniä on kiinnitetty kuopan pohjalle. 2. Kuoppaan lisätään vasta-ainetta, josta osa tarttuu antigeeniin. 3. Ylimääräinen vasta-aine on huuhdottu pois. 4. Kuoppaan on lisätty sekundaarivasta-aineet, joihin on liitetty tai liittyy entsyymejä. Ylimääräisen sekundaarivastaaineen poishuuhtelu on tässä ohitettu. 5. Entsyymit tuottavat liuokseen väriainetta substraattien lisäyksen jälkeen. Piirros tehty Wikimedia Commonsin kuvan pohjalta, jonka on tehnyt nimimerkki Cawang. 2.2.2. Western blot Western blotissa näytteen proteiinit erotellaan ensin polyakryyliamidigeelielektroforeesilla eli PAGE:lla (Boyer 2000). Proteiinit voivat olla natiivikonformaatiossa, jolloin muutkin tekijät kuin molekyylipaino vaikuttavat proteiinien geelille sijoittumiseen, tai ne voidaan denaturoida ja varata negatiivisesti SDS:n (Sodium Dodecyl Sulfate) avulla (SDS-PAGE). Natiivikonformaatiossa olevat proteiinit voidaan erotella geelille isoelektrisen fokusoinnin avulla. Isoelektrisessa fokusoinnissa geelille aikaansaadaan ph-gradientti. Geeliin kohdistettu sähkökenttä saa proteiinit liikkumaan, kunnes ne osuvat ph-alueelle, jolla niiden kokonaisvaraus on neutraali; tätä kohtaa geelillä kutsutaan isoelektriseksi pisteeksi. SDS on negatiivisesti varautunut yhdiste, joka päällystää proteiinit ei-kovalenttisesti. Kun myös huolehditaan proteiineissa mahdollisesti esiintyvien, tertiäärirakennetta ylläpitävien disulfidisidosten poistamisesta pelkistämällä ne esim. merkaptoetanolin avulla, SDS saa 26

proteiinit oikenemaan polypeptidiketjuiksi, niin että sekundaari-, tertiääri ja kvartäärirakenteet häviävät. SDS myös tekee proteiinien väliset luontaiset varauserot merkityksettömiksi. Proteiinien liike sähkökentässä perustuu SDS:n varaukseen, ja pidemmät polypeptidiketjut liikkuvat geelissä hitaammin. Tällöin proteiinit asettuvat geelille molekyylipainonsa mukaiseen järjestykseen. Molekyylipainoja voidaan arvioida ajamalla samoissa olosuhteissa molekyylejä joiden molekyylipainot tunnetaan, ja tarkastelemalla näiden kulkemia matkoja ( ladder ). Koeasetelmassa on otettava huomioon, että ei-kovalentisti tai disulfidisidoksin (mikäli nämä poistetaan) toisiinsa kiinnittyvät alayksiköt irtoavat toisistaan, ja päätyvät geelille eri kohtiin, mikäli niillä on eri molekyylipainot. SDS:ää hyödynnettäessä valmistetaan usein erikseen ylä- ja alageeli. Geeliliuskat ovat toimivassa kokoonpanossa pystyssä ja ylägeeli alageelin yläpuolella. Ylägeelin (stacking gel) polyakryyliamidi on harvempaa, ja siinä on matalampi ph ja erilainen ionikoostumus kuin alageelissä (resolving gelissä). Ylägeeliin valetaan kaivot, joihin proteiinit pipetoidaan. Kaivojen välinen geeli estää näytteiden sekoittumista toisiinsa. Elektroforeesin käynnistyttyä proteiinit kuitenkin siirtyvät ylägeelissä nopeasti ylä- ja alageelin väliselle rajapinnalle, jonne proteiinit keskittyvät vaakasuuntaisiksi muodostelmiksi samalle lähtöviivalle. Erottelu tapahtuu alageelissä, jonka tiheämpi polyakryyliamidi vastustaa molekyylien kulkua enemmän. Ns. gradienttigeeliä käytettäessä erillistä ylägeeliä ei tarvita. Elektroforeesin jälkeen proteiinit siirretään geelistä kalvolle, jossa proteiinit säilyvät kuivumisen jälkeen hyvin, ja josta niitä voidaan paikallistaa vasta-aineiden avulla. Kalvomateriaalina käytetään joko nitroselluloosaa, PVDF:ää (polyvinyylidifluoridia) tai nylonia, joista kullakin on hyvät ja huonot puolensa, ja joista nitroselluloosaa käytetään yleisimmin. Tässä tutkimuksessa käytettiin PVDF:ää. Käytetyt kalvot sitovat proteiineja epäspesifisesti vesipakoisuuteen perustuen (Boyer 2000, s. 322). Proteiinit siirretään geelistä kalvolle kapillaari-ilmiön tai yleisimmin sähkökentän avulla. Kapillaari-ilmiötä voidaan käyttää, jos ei käytetä SDS:ää; jos SDS on käytössä, käytetään sähkökenttää, jolloin vaihe sujuu nopeammin. Molekyylipaino ja isoelektrinen piste ovat proteiinien ominaisuuksia, joita voidaan hyödyntää niiden tunnistamisessa. Reaktiivisuus tietyn vasta-aineen kanssa on kolmas ominaisuus. Yhdistämällä molekyylipaino tai isoelektrinen piste immunologiseen tunnistukseen saadaan pienennettyä virheellisen positiivisen tuloksen todennäköisyyttä. Western blot siis itsessään sisältää jonkinasteisen kontrollin vasta-aineen spesifisyydelle. Jotta kalvosta voitaisiin luodata vasta-aineella tiettyä proteiinia, kalvon polymeerejä täytyy estää sitomasta lisää proteiineja, joita vasta-aineetkin ovat. Tämä onnistuu käsittelemällä kalvo proteiininsiirron jälkeen jollain valmisteella, joka sitoutuu polymeereihin vieden näin epäspesifiset sitoutumispaikat vasta-aineilta. Tähän käytetään naudan veren albumiinia (bovine 27

serum albumin, BSA) tai rasvatonta maitojauhetta, joka sisältää paljon erilaisia proteiineja. Tämän käsittelyn jälkeen kalvoa inkuboidaan primaarivasta-aineen kanssa. Pesun (joka poistaa sitoutumattomat vasta-ainemolekyylit) jälkeen kalvoa inkuboidaan sekundaarivasta-aineen kanssa. Western blotissa on perinteisesti visualisoitu proteiinin sijainti kalvolla hyödyntämällä värillisiä saostumia tuottavia reaktioita. Tällaisia saadaan aikaan esim. piparjuuriperoksidaasientsyymin avulla sopivia substraatteja käyttäen. Myös autoradiografisia menetelmiä, joissa vasta-aine leimataan radioaktiivisella isotoopilla, on käytetty. Muiden menetelmien kehityttyä autoradiografiasta on melko pitkälti luovuttu, sillä sen käyttämistä monimutkaistavat säteilyturvallisuusnäkökohdat. Uudempi ja väriä tuottavia menetelmiä paljon, jopa tuhat kertaa, herkempi tapa signaalin tuottamiseen on peroksidaasin katalysoima kemiluminenssi (Boyer 2000, s. 324). Kemiluminesenssia hyödynnettiin tämänkin tutkimuksen Western blotissa. Tässä tutkimuksessa käytetty kemiluminesenssin muoto on seuraavanlainen (Miura ym. 1998). Immuunikomplekseihin kiinnittynyt piparjuuriperoksidaasi katalysoi reaktion, jossa vetyperoksidi hapettaa luminolin. Luminolista hapettunut yhdiste muokkautuu edelleen reaktiossa jodofenolin kanssa, minkä jälkeen siitä irtoaa 3-aminoftalaatti-ioni ja valoa, jota emittoituu voimakkaimmin 5 20 min siitä, kun reagenssit on saatettu yhteen. Vaihtoehtoisesti sekundaarivasta-aineeseen voidaan liittää fluorokromeja ja saada signaali niiden fluoresenssista. Menetelmän herkkyys on perinteisesti ollut pienempi kuin kemiluminesenssin, mutta signaalin vahvuus on lineaarisemmassa suhteessa proteiinin määrään. Valmistaja Licor kertoo verkkosivuillaan uuden near infrared fluorescence kuvantamismenetelmän pärjäävän kemiluminesenssille herkkyytensäkin puolesta. Fluorokromien käytön ongelmana on tiettyjen biomolekyylien autofluoresenssi, joka antaa taustaa. Natiivi-Westernin avulla on mahdollista arvioida vasta-aineen spesifisyyttä sovellutuksissa, joissa proteiinin natiivimuoto säilyy. Vasta-aineen oikea toiminta voidaan kontrolloida sen tunnistaman proteiinin isoelektrisen pisteen perusteella. Koska SDS-western denaturoi näytteen proteiinit, sen antamat tulokset vasta-aineen spesifisyydestä eivät ole yleistettävissä muihin olosuhteisiin. On hyvä varmistaa, aiheuttaako Western blotissa käytetty sekundaarivasta-aine epäspesifistä signaalia. Tämä saadaan selville tekemällä koe ilman primaarivasta-ainetta. Jos tällöin ilmenee vyöhykkeitä, niiden takana on sekundaarivasta-aineen sitoutuminen näytteessä oleviin proteiineihin. Voimakas tausta kertoo luultavasti sekundaarivasta-aineen sitoutumisesta kalvon 28

polymeereihin, jolloin sen blokkaus BSA:lla tai maitoproteiinilla ei ole onnistunut täydellisesti. 2.3. Immunohistokemialliset menetelmät Immunohistokemian (Kroese 2001, Naish 1989) avulla voidaan saada näkyviin, missä osissa mikroskopoitavaa kudosleikettä on tiettyjä antigeenejä. Immunohistokemian tutkimuskohteena ovat kudosnäytteet, joissa kudoksen organisaatio on säilynyt, toisin kuin immunosytokemiassa. Immunosytokemiassa solut ovat viljeltyjä, tai näytteestä on tarkoituksellisesti poistettu muita komponentteja, tai solut on otettu tutkittavasta eliöstä tavalla, joka poistaa kudoksen luontaisen organisaation. Molemmissa menetelmissä voidaan havainnoida, miten tutkittava molekyyli lokalisoituu solunsisäisesti. Kuten edellisetkin menetelmät, immunohistokemia perustuu signaalia tuottavan leiman ja antigeenin löytävän vasta-aineen yhdistämiseen toisiinsa. Immunohistokemialliseen protokollaan vaikuttaa paljon se, minkä tyyppistä kudosta tutkitaan. 2.3.1. Menetelmien perusteoria Kudoksesta höylätään leikkeitä mikrotomilla, joka on kiskojen varassa liikkuva, hyvin terävä terä. Kudoksesta voi leikata ohuempia leikkeitä, jos sen jäykistää ensin korvaamalla veden parafiinilla tai jäädyttämällä. Tässä tutkimuksessa käytettiin suhteellisen paksuja (50 μm) leikkeitä, joten jäykistämiseen ei ollut tarvetta. Värjäyksen aikana näytteet voivat olla kiinni objektiivilasissa tai kellua vapaina nesteessä. Jälkimmäinen vapaaksi kelluvien leikkeiden tekniikaksi kutsuttu menetelmä mahdollistaa reagenssien tunkeutumisen leikkeeseen sen molemmilta puolilta, mikä on hyödyllistä käytettäessä suhteellisen paksuja leikkeitä. Niinpä menetelmää käytettiin tässä tutkimuksessa. Primaarinen, sekundaarinen tai tertiäärinen vasta-aine merkitään niin, että syntyy mikroskoopilla näkyvä signaali (kuva 8). Lisäksi on kehitetty menetelmiä, joissa leima ei liity vasta-aineeseen, vaan polymeeriin, johon on kiinnitetty vasta-aineita. 2.3.2. Leimat ja signaalin havaitseminen Immunohistokemiassa käytetään leimoina entsyymejä, fluorokromeja tai kultapartikkeleita. Entsyymin tapauksessa signaali perustuu entsyymin katalysoimaan värjäävään reaktioon, jonka lopputulosta tarkastellaan tavallisella valomikroskoopilla. Fluorokromien rakenteet taas synnyttävät fluoresenssia, jonka näkemiseen tarvitaan fluoresenssi- tai konfokaalimikroskooppi. 29

(a) Suora immunohistokemiallinen värjäys 1. Leima primaarivasta-aineessa 2. Enhanced Polymer One-Step (EPOS) -systeemi (b) Epäsuora immunohistokemiallinen värjäys 1. Leima kiinnitetty suoraan sekundaarivasta-aineeseen 2. Entsyymi-antientsyymi, esim. peroksidaasi-antiperoksidaasi (PAP) 3. Avidiini-biotiinimenetelmät (i) Leimattu avidiini (Labelled Avidin eli LAB), kaksi askelta (ii) LAB, kolme askelta Leimattu avidiini-biotiinikompleksi (Avidin-Biotin Complex eli ABC) 4. Polymeeripohjainen, esim. EnVision Primaarivasta-aine Sekundaarivasta-aine Polymeerirunko Kudosantigeeni Avidiini Biotiini Leima Vasta-aineen sisältämä epitooppi Kuva 8. Immunohistokemiallisen värjäyksen menetelmät. Leima voidaan kiinnittää vasta-aineeseen suoraan tai se voi olla siinä kiinni polymeerirangan välityksellä (vähemmän yleistä). Kuva muokattu lähteessä Kroese 2001 olevasta kuvasta Elsevierin luvalla. 30

Fluoresenssiin perustuva signaali on paremmin verrannollinen antigeenin määrään kuin värjääntymiseen perustuva, ja konfokaalimikroskooppi mahdollistaa kolmiulotteisen solutason visualisoinnin. Värjäävien reaktioiden etu fluorokromeihin nähden taas on, että värjäys kestää ajan kulumista, kun taas fluorokromien signaali heikkenee photobleaching-ilmiön takia (Polak ja van Noorden 1987). Immunohistokemiassa on usein toivottavaa, että näytettä voidaan palata mikroskopoimaan myöhemmin. (Western blotista tuttu kemiluminesenssi antaa signaalia vain lyhyen aikaa, eikä sitä käytetä immunohistokemiassa.) Kultapartikkeleita käytetään, kun näytettä tutkitaan läpivalaisuelektronimikroskoopilla, ja niiden tuottama signaali perustuu elektronien sirotukseen. Edellä käsitellyn Western Blotin tapaan immunohistokemiassakin on historiallisesti hyödynnetty autoradiografiaa. Myös immunohistokemiassa siitä on melko pitkälti luovuttu, paitsi säteilyturvallisuuden vaatiman lisätyön vuoksi, myös siksi, ettei autoradiografian erotuskyky nykyään pärjää muille menetelmille. Entsyymivälitteisessä immunohistokemiassa entsyymi katalysoi reaktion, jonka vaikutuksesta näytteeseen lisätty vesiliukoinen väriaine muuttuu niukkaliukoiseen ja värilliseen muotoon ja sakkautuu nopeasti immuunikompleksin läheisyyteen. Entsyyminä käytetään yleisimmin piparjuuriperoksidaasia. Toinen yleisesti käytetty entsyymi on emäksinen fosfataasi (alkaline phosphatase). Piparjuuriperoksidaasi katalysoi vetyperoksidin pelkistymistä vedeksi. Kun entsyymikonjugoidut immuunikompleksit ovat rakentuneet, vetyperoksidin ja kromogeenin lisääminen näytteelle saa aikaan värjäytymisen. Piparjuuriperoksidaasi pelkistää vetyperoksidia kromogeenilta saadulla vedyllä, muuttaen kromogeenin hapettuneeseen, näkyvään muotoonsa. Yleisimmät piparjuuriperoksidin kanssa käytetyt kromogeenit ovat DAB (3,3 -DiAminoBentsidiinitetrahydrokloridia) ja AEC (3-Amino-9-EthylCarbazole). Yleisimmin käytetty fluorokromi on FITC. Myös rodamiinia ja tetrametyylirodamiiniisotiosyanaattia eli TRITCiä käytetään. Fluorokromien kanssa käytetään perinteistä fluoresenssimikroskooppia tai fluoresenssiin perustuvaa konfokaalimikroskooppia. Konfokaalimikroskoopissa hyödynnetään tekniikkaa, jonka ansiosta se perinteisestä fluoresenssi- ja valomikroskoopista poiketen vastaanottaa signaalia aina vain yhdestä leikkeen avaruudellisesta pisteestä kerrallaan. Fluoresenssimikroskoopissa valoa sen sijaan tulee myös tarkasteltavan pisteen ympäristöstä, sivuilta ja ylä- ja alapuolelta, mikä vähentää kuvan tarkkuutta sitä enemmän, mitä paksumpaa leikettä käytetään. Konfokaalimikroskoopilla voi sen sijaan kuvantaa suhteellisen paksun leikkeen sisäistä kolmiulotteista rakennetta, jos käytetyt aallonpituudet vain pääsevät etenemään näytteessä. 31

2.3.3. Vasta-aineiden spesifisyyden kontrollointi Western blotissa proteiini tunnistetaan yhtä aikaa immunologisesti ja molekyylipainonsa tai isoelektrisen pisteensä perusteella. Tällöin koeasetelma itsessään testaa vasta-aineen spesifisyyttä, joskin lisävarmistukset voivat joskus tulla tarpeeseen. Immunohistokemiallisessa tutkimuksessa puolestaan menetelmään itseensä ei ole rakennettu rinnakkaista vahvistusmekanismia immunologiselle signaalille, joten vasta-aineen spesifisyys on aina testattava erikseen. Rhodes ja Trimmer (2006) käsittelevät artikkelissaan Antibodies as Valuable Neuroscience Research Tools versus Reagents of Mass Distraction hermoston immunohistokemiaan tarkoitettujen kaupallisten vasta-aineiden spesifisyyttä ja keinoja sen testaamiseen. Heidän mukaansa monien tällaisten valmisteiden spesifisyys jättää toivomisen varaa, ja neurotieteellinen julkaisukenttä yhä useammin vaatii tutkijaa kertomaan tutkimusartikkelissaan, miten tämän käyttämien vasta-aineiden spesifisyys on testattu. Primaarivasta-ainevalmisteen epäspesifisyys voi johtua kahdesta seikasta. 1. Kuten kohdassa 2.1.5. Vasta-aineiden affiniteetti ja spesifisyys esitettiin, valmisteessa voi olla mukana vasta-aineita, jotka eivät reagoi tarkoitettuun antigeeniin, mutta reagoivat joidenkin tutkittavan kudoksen makromolekyylien kanssa. Ongelma on merkittävin polyklonaalisilla valmisteilla, ja ainakaan soluviljelmässä tuotetuilla monoklonaalisilla valmisteilla sitä ei pitäisi esiintyä. Ongelman todennäköisyys pienenee, jos immunisointiin käytetty antigeeni on puhdasta ja natiivissa konformaatiossa. Valmisteen affiniteettipuhdistus myös auttaa asiaa. 2. Valmisteen ne vasta-aineet, jotka reagoivat antigeenin kanssa, saattavat tarttua muihinkin kohteisiin, jos niistä löytyvät epitoopit ovat riittävän samankaltaisia. Natiivimuotoista antigeeniä käytettäessä vaara on pienempi. On myös hyvä huomioida, että fysikaalis-kemiallisilla olosuhteilla on vaikutusta siihen, mihin vasta-ainemolekyyli tarttuu. Niinpä spesifisyys on jossain määrin olosuhdekohtaista ja voidaan poistaa olosuhteita muuttamalla. Syystä 1 johtuvaa epäspesifisyyttä on siis aiheellisinta kontrolloida polyklonaalisten vasta-aineiden kohdalla. Kontrollointi onnistuu aukottomasti ns. preabsorborption avulla. Preabsorptiossa valmisteesta poistetaan ne vasta-ainemolekyylit, jotka tarttuvat puhtaaseen antigeeniin. Tämä tapahtuu käytännössä affiniteettipuhdistuksella, jossa ligandina käytetään antigeeniä. Jos preabsorboidulla vasta-aineella saadaan värjättyä kudosta, todistetaan syystä 1 johtuvaa vasta-aineen epäspesifisyyttä. 32

Yksinkertaisempi ja yleisempi tapa testata, aiheuttavatko polyklonaalisen vasta-ainevalmisteen ylimääräiset vasta-aineet signaalia, on kuitenkin immunisoimattoman eläimen seerumin käyttö vasta-ainevalmisteen tilalla. Ideaalisinta olisi käyttää ei-immuunisen seerumin lähteenä samaa yksilöä, jota käytetään vasta-aineiden lähteenä, mutta tämä on käytännössä hankalaa. On todettu, että mikäli ei-immuuninen seerumi on peräisin samassa ympäristössä kasvatetusta samasta eläinkannasta, se todennäköisesti sisältää samat ylimääräiset vasta-aineet mitä preabsorboitu vasta-ainekin, mikäli itse immunisaatio ei ole synnyttänyt ylimääräisiä vasta-aineita. Barkerin ja McKelvyn toimittamassa teoksessa Current Methods in Cellular Neurobiology (1983) esitetään preabsorptiosta seuraavanlainen versio, joka sopii syystä 2 johtuvan epäspesifisyyden erittelyyn ja, tietyin varauksin, toteamiseen. Vasta-ainevalmistetta jaetaan fraktioihin, joista yhtä inkuboidaan tarkoitetun antigeenin kanssa, muita tälle homologisten molekyylien kanssa. Tämän jälkeen fraktioita käytetään rinnakkaisiin värjäyksiin, joiden lopputuloksia verrataan keskenään. Mitä enemmän vasta-ainetta on kiinnittynyt inkuboitaessa siihen molekyyliin, jonka kanssa vasta-ainetta on inkuboitu, sitä heikompi on värjäystulos. Näin voidaan selvittää, reagoiko vasta-aine ristiin tiettyjen tarkoitetulle antigeenille homologisten molekyylien kanssa. Toisaalta, menetelmä ei kerro, reagoiko vasta-aine ristiin muiden kuin tutkittujen antigeenien kanssa. Lisäksi olosuhteet, joissa vasta-aineita inkuboidaan antigeenille homologisten molekyylien kanssa, eivät ole samat kuin ne, joissa vasta-aineet toimivat histologisessa tutkimuksessa. Jos halutaan vain selvittää, toimiiko vasta-ainevalmiste spesifisesti, ilman sen erittelyä, onko takana syy 1 vai 2, on joukko erilaisia vaihtoehtoja. Koska monoklonaalisten vasta-aineiden mahdollinen epäspesifisyys luultavasti johtuu syystä 2, voidaan niiden kohdalla edetä suoraan yleisluontoiseen menetelmään. Epäspesifisyys yleensä voidaan periaatteessa kontrolloida pitävästi negatiivisella näytteellä - kudosnäytteellä, josta olisi jollain keinolla poistettu vasta-aineen virallinen antigeeni, mutta jossa olisi tallella kaikki muu. Jos tällainen näyte värjäytyisi, vasta-aine olisi epäspesifistä. Käytännössä tällaisen näytteen saaminen voi olla hankalaa. Rhodes ja Trimmer (2006) esittävät yhdeksi mahdollisuudeksi geenimuunnellun eläimen kudoksen käytön. Joissain tapauksissa on mahdollista tuottaa eläin, jonka tutkittavassa kudoksessa ei ole vasta-aineen antigeeniä. Knockout-eläin, jolla proteiinin valmistukseen tarvittava geeni ei toimi ollenkaan, kuitenkin kehittyy usein epänormaalisti tai kuolee kesken kehityksen. Jos proteiinia tarvitaan normaalin yksilönkehityksen läpikäymiseen, mutta aikuinen yksilö pystyy toimimaan ilman sitä ainakin jonkin aikaa, ongelma on periaatteessa mahdollista kiertää Cre-Lox-rekombinaatiolla tai RNA-interferenssillä. Näiden menetelmien avulla proteiinin ilmentyminen voidaan pysäyttää missä vaiheessa tahansa, antaen eläimen kuitenkin kehittyä normaalisti siihen saakka. 33

Jos sopivanlainen geenimuunneltu eläinkanta tai RNA-interferenssiprotokolla on jo käytössä ennestään, näitä voi olla perusteltua hyödyntää spesifisyyden testauksessa. Siirtogeenisen eläimen tuottaminen ja RNA-interferenssi tuntuvat kuitenkin melko raskailta menetelmiltä, jos ne otetaan käyttöön pelkästään vasta-aineen spesifisyyden selvittämistä varten. Lisäksi elimistö voi kompensoida jonkin proteiinin puutetta tuottamalla lisää toista, homologista proteiinia, mikä voisi sotkea tuloksia (Fritschy 2008). Teoreettinen mahdollisuus olisi homogenoida kudosnäyte, poistaa siitä tutkittavan vasta-aineen antigeeniproteiini ja tutkia sitten riittävän herkällä menetelmällä, esim. ELISAlla, sitoutuuko vasta-aine johonkin jäljellä olevassa fraktiossa. Lähemmin tarkasteltuna tämä ajatus ei kuitenkaan vaikuta kovin toimivalta. Antigeeniä voitaisiin monoklonaalista vasta-ainetta testattaessa periaatteessa affiniteettipuhdistaa homogenaatista rinnakkaisella monoklonaalisella valmisteella (joiden saatavuus tosin ei ole taattu, ks. alempana). Monoklonaalinen rinnakkaisvalmiste poistaisi homogenaatista ehkä myös jotain muuta kuin tarkoitettua antigeeniään, mutta todennäköisyys sille, että tämä jokin muu olisi jotain sellaista, johon tutkittava monoklonaalinen vasta-aine sitoutuisi, olisi erittäin pieni. Tutkittavan vasta-aineen ollessa polyklonaalinen ristiinreagoimisten todennäköisyys on suurempi, joten voisi ajatella, ettei menetelmä sopisi polyklonaalisille vasta-aineille. Monoklonaalisillekaan vasta-aineille menetelmää ei loppujen lopuksi varmaan kannattaisi käyttää, sillä joka tapauksessa olisi käytännöllisempää yksinkertaisesti värjätä toinen samanlainen leike toisella monoklonaalisella valmisteella. Homogenaatista voitaisiin ainakin joissain tapauksissa poistaa antigeeniä myös eiimmunologisilla menetelmillä. Osa proteiineista sitoutuu vahvasti spesifisiin ligandeihin, joita voitaisiin hyödyntää affiniteettipuhdistuksessa. Jokaiselle proteiinille ei kuitenkaan ole sopivaa ligandia, sekä luonnon että reagenssimarkkinoiden asettamien rajoitusten vuoksi. Lisäksi, vaikka proteiinin puhdistaminen homogenaatista on biokemiassa rutiininomainen menetelmä, puhdistus on yleensä monivaiheinen prosessi, jonka eri vaiheissa näytteen makromolekyylejä voi denaturoitua (Nelson ja Cox 2004, s. 92). Homogenaatissa olosuhteet ovat yleensäkin monin tavoin erilaiset kuin histologisessa preparaatissa. Puhdistukseen kuuluva asia on myös hukka, mikä tarkoittaa käänteisesti ajatellen sitä, että antigeeniproteiinia saattaisi jäädä homogenaattiin häiritsevän paljon. Rhodes ja Trimmer (2006) toteavat, että mikäli primaarivasta-aine on monoklonaalista, sen spesifisyyden puolesta antaa riittävän voimakasta näyttöä se, että toisen valmistajan monoklonaalinen vasta-ainevalmiste värjää näytteen samalla tavalla. Ajatuksena on, että koska näillä monoklonaalisilla vasta-aineilla on todennäköisimmin eri epitoopit, olisi 34

epätodennäköistä, että niiden ristiinreagointi olisi samanlaista, jolloin yhtenevät värjäystulokset osoittaisivat, että ristiinreagointia ei olisi tapahtunut. Voi olla, että ajatus ei sovellu täysin ainakaan tilanteeseen, jossa antigeeni on hyvin pieni molekyyli. Polyklonaalista valmistetta testattaessa on joka tapauksessa todennäköisempää, että ristiinreagoinnissa on päällekkäisyyttä, joten menetelmä ei ole polyklonaalisen valmisteen tapauksessa luotettava. Monoklonaalistenkin vasta-aineiden tapauksessa rinnakkaiset valmisteet voi joutua teettämään tilaustyönä tai tekemään itse. Tässä tutkimuksessa tarkastelluille vasta-aineille oli vaikea löytää markkinoilta immunohistokemialliseen käyttöön suunnattuja rinnakkaistuotteita. Melko hyvältä tavalta testata vasta-aineiden spesifisyyttä vaikuttaisi Western blot, jossa proteiineja ei denaturoitaisi SDS:llä, vaan eroteltaisiin toisistaan isoelektrisen fokusoinnin avulla, jolloin immunologisen tunnistuksen vahvistaisi vyöhykkeen oikea isoelektrinen piste. Tässäkään Western blotin muodossa olosuhteet eivät toki ole samat kuin histologisessa tutkimuksessa. Tutkimukseen ryhdyttäessä mieleen ei kuitenkaan ilmeisesti tullut kartoittaa tätä mahdollisuutta, vaan päädyttiin käyttämään SDS-Westerniä, joka on yleisemmin käytetty menetelmä. Proteiinin immunologista paikannusta on mahdollista verifioida myös etsimällä vastaavanlaisesta kudosleikkeestä proteiinia vastaavaa lähetti-rna:ta in situ -hybridisaatiolla. Etsimiseen käytetään lähetti-rna:lle komplementaarista, fluorensoivaksi leimattua RNA-pätkää. In situhybridisaatiosta ja immunohistokemiasta saatujen kuvioiden yhteneväisyys antaisi näyttöä vasta-aineen spesifisyyden puolesta. Menetelmää käytettäessä tulisi ottaa huomioon, että lähetti-rna ja proteiini voivat sijaita soluanatomisella tasolla eri paikoissa. Ilmaiseksi käytettävissä oleva internetin Allen Brain Atlas tietokokanta voi ehkä tarjota oikotien in situ hybridisaation tekemiselle. Atlaksesta löytyy hiiren aivoista leikekuvia, joissa tietyn geenin lähetti-rna:ta on paikallistettu in situ-hybridisaatiolla. Tässä tutkimuksessa käytettiin rottia, jotka ovat suhteellisen läheistä sukua hiirille, mutta lajienväliset erot geeniekspressiossa ovat toki mahdollisia, ja jonkinasteiset neuroanatomiset erot tuovat vertailuun lisähaastetta. Joka tapauksessa tietokannasta löytyi in situ hybridisaatiokuvia kaikkiin niihin proteiineihin liittyen, joihin kohdistettuja vasta-aineita tässä tutkimuksessa tutkittiin. Ei varmaankaan ole mielekästä pyrkiä vahvistamaan jokaista immunohistokemiallista tutkimusta erillisellä in situ hybridisaatiolla. Tällöinhän olisi monissa tapauksissa sama hylätä immunohistokemia kokonaan ja turvautua pelkästään in situ hybridisaatioon. In situ hybridisaatiolla lienee järkevintä kontrolloida vasta-aineen spesifisyys jossain kohtalaisen yleisluontoisessa asetelmassa ja yleistää tästä spesifimpiin asetelmiin. Fritschyn (2008) esittämä yksi tapa vahvistaa immunohistokemiallisen värjäyksen tulos on, 35

että etsittyä makromolekyyliä pyrittäisiin eristämään kudosleikkeestä ja tunnistamaan jollain biokemiallisella menetelmällä. Fritschy ei kuvaa tarkemmin, mikä tämä tunnistusmenetelmä voisi olla. Haluttaessa varmistaa proteiinin immunohistokemiallista tunnistusta voisi kyseeseen tulla vastaavan lähetti-rna:n toteaminen käänteistranskription jälkeisellä kvantitatiivisella PCR:llä (Q-PCR), mikä on yleisesti käytetty menetelmä geeniekspression tutkintaan. Joka tapauksessa, tämän tutkimuksen puitteissa tätä mahdollisuutta ei koettu mielekkääksi lähteä selvittämään. Sekundaarivasta-aineen spesifisyyttä tutkitaan immunohistokemiallisen tutkimuksen yhteydessä rutiininomaisesti toteuttamalla protokolla ilman primaarivasta-ainetta. Tällöin kudosleikkeen ei pitäisi värjäytyä. 2.4. Affiniteettipuhdistus Affiniteettipuhdistuksessa sidotaan kovalentisti yhdisteitä lopullisessa muodossaan inerttiin (käyttöolosuhteissa kemiallisesti reagoimattomaan) hartsiin (Boyer 2000). Sitotuneeseen yhdisteeseen tarttuu ei-kovalentisti makromolekyylejä puhdistettavasta näytteestä. Loput näytteestä huuhdotaan pois hartsista. Tällä tavoin voidaan näytteestä joko poistaa tai eristää haluttu makromolekyyli. Jälkimmäisessä tapauksessa huuhdonnan jälkeen muutetaan hartsissa vallitsevia kemiallisia olosuhteita niin, että ei-kovalentit sidokset heikkenevät ja kiinnostuksen kohteena oleva makromolekyyli irtoaa. ph:n muuttaminen on yleinen tapa, jota sovellettiin myös tässä työssä. Tässä työssä käytettiin CNBr-activated Sepharose 4B -hartsia. Sefaroosi on kovalentein, lysiinipohjaisin ristisidoksin jyväsiksi sidottua agaroosia, ja agaroosi on puolestaan polysakkaridia, jota saadaan tiettyjen punalevien soluseinistä. Syanogeenibromidilla aktivoitu sefaroosi on syanaattiesteri, joka muodostaa kovalentteja sidoksia amiiniryhmien kanssa, tehokkaimmin emäksisessä ph:ssa. Kun halutun yhdisteen on annettu sitoutua kovalentisti CNBr-aktivoidun sefaroosin reaktiivisiin ryhmiin, loput näistä ryhmistä blokataan (GE Healthcare 2009). Tämä saadaan aikaan ilman lisäreagensseja jatkamalla hartsin pitoa emäksisessä ph:ssa, jolloin ylimääräiset ryhmät hydrolysoituvat. Blokkaus kuitenkin tehostuu, jos liuoksessa on molekyylikooltaan pientä primaarista amiinia, kuten Tris-HCl:ää, etanoliaminiinia tai glysiiniä, jotka kondensoituvat ylimääräisiin ryhmiin. 36

2.5. Hippokampus 2.5.1. Yleistä hippokampuksesta Hippokampus muodostuu ns. arkkikorteksista. Se on aivokuorta, jossa on vain kolme solukerrosta, toisin kuin neokorteksi, jossa kerroksia on kuusi. Neokorteksi on nykyeläimistä vain nisäkkäiltä löytyvä aivojen rakenne, joka sijaitsee aivoissa päällimmäisenä. Arkkikorteksia on myös ainakin matelijoilla ja linnuilla (Squire ym. 2008, s. 1024-1025). Neokorteksi toimii mm. informaation varastoimisessa ja ennustusten tekemisessä. Nisäkkäät pystyvätkin suoriutumaan monimutkaisempaa käyttäytymistä ja tiedonkäsittelyä vaativista tehtävistä kuin matelijat (Hawkins 2004). Selkärankaisten parissa äly on myös lintujen lahkossa kehittynyt osalla lajeista pitkälle; neokorteksin sijasta linnuille on muotoutunut korkeampia henkisiä toimintoja varten toisenlainen rakenne (Prior ym. 2008). Hippokampus vaikuttaisi varastoivan väliaikaisesti tietoa, joka pitäisi välittää pitkäaikaismuistiin. Tähän sopii mm. se, että rakenne on plastinen ja muokkautuu helposti ärsykkeiden vaikutuksesta. Hippokampuksessa on synapseja, joissa tapahtuu herkästi kestovahvistuminen eli Long- Term Potentiation, LTP (Bear 2007, s. 776-777). Kestovahvistuminen tarkoittaa sitä, että synapsin vastaanottava (postsynaptinen) puoli tulee herkemmäksi suhteellisen pitkäksi aikaa. Muovautuvuutta ehkä lisäävät myös hippokampuksen pihtipoimussa (englanniksi dentate gyrus) elävät neuronien kantasolut, jotka toimivat paikallisena uusien neuronien lähteenä (Eriksson ym 1998). Hippokampuksen sijaintikin on tehtävän kannalta otollinen. Informaatiota tulee sinne viereisen entorinaalisen aivokuoren kautta neokorteksin assosiaatioalueilta primaaristen aisti- tai liikealueiden sijaan (Bear 2007, s. 741). Hippokampuksen saama informaatio on jo siis valmiiksi käsitellyssä muodossa. Tiettävästi muistitilaamme täyttävät enemmänkin erilaiset abstraktiot ja asioiden funktioita heijastelevat skeemat kuin raakadata (Anderson 1980). On esitetty, että hippokampus varastoi juuri sellaisia havaintoja, joita neokorteksi ei pystynyt ennustamaan (esim. Hawkins 2004). Varastoidun tiedon avulla aivot sitten täydentävät muistia eri muodoissaan (Hawkins 2004), jotka ovat tiedollinen (mitä on) ja taidollinen (miten jokin tehdään) (Bear 2007, s. 740-741). Hippokampuksen omaksuma tieto iskostunee aivokuoreen suureksi osaksi nukuttaessa ja luultavasti osaksi myös rennossa, toimettomassa valvetilassa. Näissä tiloissa esiintyy aivoissa purskeittaista toimintaa, jota kokeellisesti häirittäessä äskettäin opitut asiat tahtovat unohtua 37

(Girardeau ym. 2009). 2.5.2. Tunteiden ja stressin vaikutus hippokampuksen toimintaan Havaitsemisen aikana vallinneet tunnetilat vaikuttavat siihen, kuinka vahvasti tieto tallentuu. Kun organismin valtaa emotionaalinen kiihtymys tai jokin ärsyke kiinnittää sen huomion, vapautuu kaikkialle aivoihin noradrenaliinia aivorungon sinertävän aivotäplän eli locus coeruleuksen viejähaarakkeista. Hippokampuksenkin neuroneilla on kalvollaan adrenergisia reseptoreita, joita stimuloimalla noradrenaliini edistää informaationtallennusta (tarkemmin ottaen luultavasti solun camp:n eli syklisen adenosiinimonofosfaatin pitoisuutta nostamalla, Squire ym. 2008, s. 209). Psyykkisesti kiihdyttävissä tai stressaavissa tilanteissa sekä fyysisen rasituksen vaikutuksesta myös erittyy lisämunuaisista kortikosteroidia (joka on ihmisillä kortisoli, Squire ym. 2008, s. 916), johon hippokampuksen neuronit reagoivat tumansisäisten glukokortikoidireseptoreidensa välityksellä. Myös kortisoli voimistaa syntyviä muistijälkiä (Kalat 2009, s. 272 ja 387). Mekanismin evolutiivinen tarkoitus lienee edistää eliön biologisen funktion kannalta merkityksellisten asioiden muistamista. Kortisolilla ja noradrenaliinilla on luultavasti osansa posttraumaattinen stressioireyhtymän synnyssä, jollaisen traumaattinen kokemus osalle yksilöistä aiheuttaa (Newport ja Nemeroff 2003). Pitkittyneen psyykkisen stressin aiheuttama jatkuva altistus kortikosteroidille kuitenkin aiheuttaa hippokampuksen hermosoluissa vaurioita, ja voi saada ne kuolemaankin (Squire ym. 2008, s. 917), jolloin muistin toiminta huononee. 2.5.3. Tutkittujen vasta-aineiden antigeenit hippokampuksessa Seuraavaksi esitetään tietoja tässä tutkimuksessa tarkastelluista proteiineista ja niiden sijainnista ja tehtävistä hippokampuksessa. Samalla esitetään kirjallisuusarvot molekyylipainoille, mikä on oleellista Western blotin tulosten tulkinnan kannalta. Kalbindiini D28 (englanniksi calbindin D28, myös calbindin 1), on USA:n National Insitute of Healthin Entrez-verkkopalvelun geeniontologian mukaan kaikkialla neuronin solulimassa esiintyvä, kalsiumioneja ja D-vitamiinia sitova proteiini. Se osallistuu neuronin soluliman kalsiumtasapainon säätelyyn. Kalbindiini D28:aa esiintyy hippokampuksessa ainakin pyramidija jyvässoluissa (Carter ym. 2008) sekä joissain interneuroneissa (Lawrence ym. 2010). Soluliman kalsiumpitoisuuden säätelijänä Kalbindiini D28:lla on merkitystä kestovahvistumisessa; jos proteiinin ilmentyminen estetään, kestovahvistumista ei tapahdu. (Jouvenceau ym. 2002). 38

Kalbindiini D28:aa esiintyy linnuilla myös munuaisissa, suolistossa ja munankuorta erittävissä rauhasissa, missä se edesauttaa kalsiumin siirtoa (Bar 2008). Tässä tutkimuksessa tarkastellun kalbindiini D28:n vasta-aineen tuotannossa antigeenina käytetty proteiini olikin eristetty kanan suolesta. (Tuotemateriaaleissa vasta-aineen kerrotaan toimivan spesifisesti myös mm. rotan kudoksessa). Molekyylipainon kirjallisuusarvo on 28 kda (Katsetos ym. 1994, Taylor ym. 1999). Kalretiniini (englanniksi calretinin, myös calbindin 2) on toinen kalsiumioneja sitova proteiini, joka esiintyy solukalvolla aukkoliitosten yhteydessä (Entrez). Kalretiniiniä on rotan hippokampuksessa enimmäkseen soluissa, jotka tuottavat inhibitorista GABA-välittäjäainetta (Gamma-AminoButyric Acid eli gamma-aminovoihappo). Nämä solut ovat interneuroneita. Interneuronit muodostavat synapseja ainoastaan lähiympäristönsä hermosolujen kanssa. Rotan hippokampuksesta on löydetty kalretiniiniä myös neuroneista, joiden enimmäkseen ei ole havaittu tuottavan GABAa. Edellisistä poiketen näillä on synaptisia okahaarakkeita (spines) (Miettinen ym. 1992). Molekyylipainon kirjallisuusarvo on 29 kda (Mistry ym. 2001, Bearzatto ym. 2006). Parvalbumiini (englanniksi parvalbumin) on Entrezin geeniontologian mukaan sekin kalsiumioneja sitova proteiini, ja sijoittuu viejähaarakkeen solulimaan. Sitä esiintyy hippokampuksessa GABAergisissä välihermosoluissa, joita tiedetään olevan useaa eri tyyppiä. Ne vaikuttavat synnyttävän hippokampukseen rytmistä sähköistä toimintaa eli oskillaatiota (Klausberger ym. 2005). Rotan hippokampuksen kalretiniiniä ilmentävissä neuroneissa ei ole parvalbumiinia, tai ehkä joissain harvoissa (Miettinen ym. 1992). Molekyylipainon kirjallisuusarvo on 12 kda (Vongvatcharanon ym. 2006). Somatostatiini (englanniksi somatostatin) toimii hormonina (Entrezin geeniontologia) mutta myös välittäjäaineena, ja vapautuu sitä sisältävien solunsisäisten kalvorakkuloiden sulautuessa solukalvoon. Hippokampuksessa on GABAergisiä interneuroneita, jotka vapauttavat yhdessä GABAn kanssa somatostatiinia (prosessi on englanniksi cotransmission). Somatostatiinin on esitetty moduloivan hippokampuksessa glutamatergistä ja GABAergistä välitystä. Sen on todettu parantavan muistia eläinten dementiamalleilla ja edistävän kestovahvistumista. Akuutti stressi ja deksametasoni (kortikosteroidianalogi) lisäävät somatostatiinin vapautumista hippokampuksen pihtipoimussa, mikä sopisi yhteen lyhytaikaisen stressin ja kortikosteroidierityksen muistitallennusta parantavan vaikutuksen kanssa (Nyitrai ym. 2003). Somatostatiinista tunnetaan kaksi aktiivista muotoa, joista toisessa on 14, toisessa 28 aminohappoa (Weckbecker ym. 2003). Kirjallisuudesta löytyy molekyylipainolle useita arvoja. 39

PubMedin proteiinitietokonnassa olevalle rotan somatostatiinin aminohapposekvenssille saadaan molekyylipainoksi 12,75 kda Science Gatewayn Protein Molecular Weight Calculator työkalulla. Dopamiini-β-hydroksylaasi (englanniksi dopamine β-hydroxylase) eli DBH katalysoi dopamiinin hydroksyloitumista noradrenaliiniksi ja esiintyy noradrenaliinia tuottavissa soluissa. Hippokampuksessa itsessään ei sijaitse tällaisten solujen solurunkoja, mutta hippokampukseen kulkee aksoneita edellä käsitellystä locus coeruleuksesta. DBH koostuu nejästä identtisestä alayksiköstä, joista yksi painaa hiilihydraatteineen 72,5 kda, ilman hiilihydraatteja 68,875 kda (Rush ja Geffen 1980). 40

3. TUTKIMUKSEN TAVOITTEET Työn tarkoitus oli testata tiettyjen aivokudoksen immunohistokemialliseen tutkimukseen käytettyjen vasta-aineiden spesifisyys. Ajatuksena oli, että sopivan menetelmäpatteriston löydyttyä ja osoittauduttua toimivaksi histologian laboratorio voisi hyödyntää sitä jatkossakin. Työssä käytettäviksi menetelmiksi valikoituivat: 1. Western blot polyakryyliamidigeeliä ja SDS:ää sisältävää puskuriliuosta käyttäen. Se tehtiin jokaisella alkuperäisellä vasta-aineella rotan hippokampushomogenaatille. Koska saatavissa ohjeissa kerrottiin sopivat vasta-ainekonsentraatiot vain immunohistokemiallisia menetelmiä varten, edellytti sopivien Western blot konsentraatioiden löytäminen useita yrityksiä. Tutkitut vasta-ainevalmisteet olivat: a. Kalbindiini D28:n monoklonaalinen vasta-aine (SWANT 300). b. Kalretiniinin polyklonaalinen vasta-aine (antiseerumi, SWANT 7699/4). c. DBH:n monoklonaalinen vasta-aine (Millipore MAB 308). d. Parvalbumiinin polyklonaalinen vasta-aine (antiseerumi, SWANT PV-28). e. Somatostatiinin monoklonaalinen vasta-aine (Millipore MAB 354). 2. Affiniteettipuhdistus, joka päätettiin taloudellisten (tarvittava proteiinivalmiste maksaa) ja työn laajuuteen liittyvien rajoitusten vuoksi tehdä vain yhdelle vastaaineelle. Puhdistuksesta arvioitiin olevan todennäköisemmin hyötyä, jos se tehtäisiin polyklonaaliselle vasta-aineelle. Kun oli käyty läpi Western blot värjäyksistä saadut tulokset, laboratorion intressit ja markkinoiden tarjonta affiniteettipuhdistukseen tarvittavien proteiinien suhteen, päädyttiin affiniteettipuhdistamaan kalretiniinin antiseerumi. 3. Affiniteettipuhdistuksen jälkeen tehtiin rinnakkaiset immunohistokemialliset värjäykset rotan aivoleikkeille käyttäen alkuperäistä kalretiniinin antiseerumia sekä affiniteettipuhdistuksessa erotettuja spesifistä ja epäspesifistä fraktiota. Sitten värjäystuloksia vertailtiin. 41

4. MATERIAALIT JA MENETELMÄT 4.1. Materiaalit 4.1.1. Kudostyyppi, testatut primaarivasta-aineet ja rekombinantti-kalretiniini Käytetty kudos oli peräisin rotan hippokampuksesta, jossa esiintyviä interneuronityyppejä ja noradrenergisia aksoneja tunnistetaan Riitta Miettisen laboratoriossa tässä tutkimuksessa tarkastelluilla vasta-aineilla. Vasta-aineiden affiniteettipuhdistuksessa hyödynnettiin Escherichia coli -bakteerin tuottamaa ihmissekvenssistä kalretiniinia (yhtiö SWANT, Bellinzona, Sveitsi). Tässä rekombinanttiproteiinissa oli ylimääräinen kuuden histidiinin häntä. Histidiinihäntä saadaan aikaan muokkaamalla proteiinia tuottavaan eliöön siirrettävää DNAsekvenssiä. Histidiinihännän tarkoitus on helpottaa proteiinin puhdistusta; sen välityksellä proteiini saadaan tarttumaan affiniteettipuhdistuksessa sopivanlaisia metalli-ioneita, yleisimmin nikkeliä, sisältävään hartsiin (Nelson ja Cox 2004, s. 329). Rekombinantti-kalretiniini olikin affiniteettipuhdistettu. Tämän tutkimuksen kannalta histidiinihäntä oli tarpeeton, mutta Ale Närvänen arvioi sen tuskin kuitenkaan häiritsevän puhdistusprosessia. Aitotumallisessa solussa ja bakteerissa proteiineja prosessoidaan eri tavoin translaation jälkeen. Niinpä rekombinanttiproteiinin muoto ja pinnan fysikokemialliset ominaisuudet voivat poiketa alkuperäisistä. Tämä voi myös heijastua vuorovaikutuksiin vasta-aineiden kanssa. Seuraavaksi valmistajien tuotekuvausten tietoja tässä tutkimuksessa tarkastelluista primaarivasta-ainevalmisteista. Kalbindiini D28:n monoklonaalinen vasta-aine (SWANT 300). Hiiren IgG. Tuotannossa antigeenina toiminut kanan suolesta puhdistettu kalbindiini D28. Kalretiniinin polyklonaalinen vasta-aine (antiseerumi, SWANT 7699/4). Kanin IgG. Tuotannossa antigeenina toiminut rekombinanttitekniikalla tuotettu ihmissekvenssinen kalretiniini. DBH:n monoklonaalinen vasta-aine. (Millipore MAB 308). Hiiren IgG. Tuotannossa antigeenina toiminut puhdistettu naudan DBH. Parvalbumiinin polyklonaalinen vasta-aine (antiseerumi, SWANT PV-28). Kanin IgG. Tuotannossa antigeenina toiminut rotan lihaksesta puhdistettu parvalbumiini. Somatostatiinin monoklonaalinen vasta-aine (Millipore MAB 354). Rotan IgG. Tuotannossa antigeenina toiminut synteettinen 1-14-syklinen somatostatiini (tuote-esite ei kerro, mistä somatostatiinityypistä on kyse, eikä sitä, mistä eläinlajista sekvenssi on peräisin). 42

4.2. Menetelmät 4.2.1. Kudosnäytteiden hankinta ja esikäsittely Rottien kanta oli Wistar-Kuo. Western blotiin käytetyn aivohomogenaatin vahvuus oli 5 % (w/v). Puskurina oli T-Per, valmistaja Pierce. Homogenaatti sentrifugoitiin (3000 rpm, 1 min) ja sakka hylättiin. Näytteen proteiinipitoisuus määritettiin spektrofotometrillä (reagenssina DC Protein Assay, spektrofotometrinä Bio-Rad Model 550 Microplate Reader, aallonpituutena 655 nm), jotta näytettä osattaisiin käyttää Western blotissa oikeat määrät (homogenaatin proteiinipitoisuudeksi saatiin 6,67 mg/ml). Rotat, joiden aivoja käytettiin immunohistokemiassa, nukutettiin natriumbarbituraatin (Synopharm, konsentraatio seoksessa 9,7 mg/ml), kloraalihydraatin (Merck, Dormstadt, Saksa; 10mg/ml), magnesiumsulfaatin (Merck; 21,2 mg/ml), propyleeniglykolin (Merck; 40 %) ja absoluuttisen etanolin (10 %) seoksella. Sitten rottia perfusoitiin transkardiaalisesti, ensin fysiologisella suolaliuoksella 2-3 min ja sitten 30 min 300 ml:lla kiinnitysliuosta, joka koostui 0,1-molaarisesta fosfaattipuskurista (ph 7,4), jossa oli 4% paraformaldehydiä, 0,05 % glutaraldehydiä ja 0,26 % pikriinihappoa. Aivot poistettiin kalloista ja siirrettiin kylmäsäilytykseen -20 ºC:n lämpötilaan upotettuina 0,25-molaariseen fosfaattipuskuriin (ph 7,4), jossa oli 30% glyserolia ja 30% etyleeniglykolia. Ennen leikkeiden tekoa aivot pestiin 0,1-molaarisella fosfaattipuskurilla (ph 7,4). Aivoleikkeet otettiin koronaaritasossa vibratomilla (Leica VT 100S, Leica Instruments GmBH). 4.2.2. Western blot 4.2.2.1. Elektroforeesi ja siirrostus Ylägeeli valmistettiin tekemällä seuraavanlainen seos: 3,96 % (w/v) bis-akryyliamidia, 0,26 M Tris, 0,1 % (w/v) SDS:ää, 0,05 % (w/v) ammoniumpersulfaattia ja 0,2 % (v/v) Temediä eli tetrametyylidiamidia (ammoniumpersulfaatti ja tetrametyleenidiamiini katalysoivat akryyliamidin polymerisaation tuottamalla vapaita radikaaleja), ph 6,9. Alageeliä valmistettaessa seos oli seuraavanlainen kaikilla paitsi DBH:n erottamiseen tarkoitetuilla: 15 % (w/v) bis-akryyliamidia, 0,375 M Tris, 0,1 % (w/v) SDS, 0,05 % (w/v) ammoniumpersulfaattia ja 0,05 % (v/v) Temediä, ph 7,1. DBH:ta varten valmistettiin alageeli, jossa oli 10 % (w/v) bis-akryyliamidia, koska koska DBH:n molekyylipaino on merkittävästi muita tässä tutkittuja proteiineja suurempi. Hippokampushomogenaattia pipetoitiin sen verran, että kaivoa kohti tuli 43

40 µg proteiinia (eli 6 ml). Elektroforeesilaitteena toimi Gibco BRL Vertical Gel Electrophoresis Apparatus, malli V 15 17, valmistaja Life Technologies. Ajopuskurissa oli 0,015 % (w/v) Trisiä, 0,072 % (w/v) glysiiniä ja 0,005 % SDS:ää ja sen ph oli 8,3. Elektroforeesin virtalähde oli Power Pac 3000, valmistaja Bio-Rad, jännite oli 200 V, ja aikaa käytettiin 2 t 30 min. Proteiinit siirrettiin PVDF-kalvolle (eli polyvinyylidifluoridille, merkki Amersham Hybond TM P, pack no RPN303F, removal rating eli paksuus 45 µm, valmistaja GE Healthcare) 17 V jännitteellä yön aikana. Siirtopuskurissa oli 0,0029 % (w/v) Trisiä, 0,0144 % (w/v) glysiiniä ja 20 % (v/v) metanolia. PVDF:ää käytettiin nitroselluloosan sijaan, koska siirrostuksen jälkeen kalvoja oli tarkoitus säilyttää kuivina, ja tämän oli PVDF:n kohdalla todettu onnistuvan. Ennen siirrostuslaitteistoon sijoittamista PVDF-kalvojen oli annettu olla 100-%:sessa metanolissa vähintään 10 min. 4.2.2.2. Immuunikompleksien muodostaminen Immuunikompleksit muodostettiin kokonaan huoneenlämmössä. Kalvon blokkaukseen, pesuihin ja inkubaatioihin käytettiin tasoravistelijaa (The Belly Dancer Hybridization Water Bath, valmistaja Stovall Life Science), jonka kierrosnopeus oli inkubaatioiden ja blokkausten aikana n. 28 rpm ja pesujen aikana n. 50 rpm. Blokkaus-, inkubaatio- ja pesuliuokset tehtiin TBS-Tweeniin (lukuun ottamatta viimeistä sekundaari-inkubaation jälkeisistä pesuliuoksista, joka oli pelkkää TBS:ää; sillä poistettiin Tweeniä ennen signaalintuottovaihetta). Ensimmäisissä Western bloteissa käytettiin 0,1 % (v/v) Tweeniä, minkä jälkeen otettiin käyttöön 0,2-%:en Tween; tällä suuremmmalla pinta-aktiivisen aineen konsentraatiolla pyrittiin vähentämään taustasignaalia. Inkubaatioliuoksissa oli 1 % BSA:ta. PVDF-kalvojen blokkaukseen kokeiltiin rasvatonta maitojauhetta (3% ja 5% w/v) ja BSA:ta (3 % ja 6 % w/v). BSA:ta käytettäessä proteiinit erottuivat toisistaan terävämmin ja taustasignaalia syntyi vähemmän, joten se otettiin käyttöön blokkausreagenssiksi (6 %:n vahvuisena), joskin anti-somatostatiinin ja anti-dbh:n kanssa päädyttiin käyttämään lisäksi 0,5 % (w/v) maitojauhetta. Näiden primaarivastaaineiden tuottama signaali oli heikko, ja sen tulkintaa häiritsevää taustaa pyrittiin vähentämään tehokkaammalla blokkauksella. Blokkaukseen käytettiin 1 t. Kun blokkaukseen käytettiin rasvatonta maitojauhetta, kalvoja pestiin blokkauksen jälkeen TBS-T:llä, kunnes niistä ei enää näkyvästi irronnut maidon ainesosia pesuliuokseen. Blokkausta seurasi primäärivastaaineinkubaatio, joka kesti 2 t. Kokeilemalla toimivimmiksi konsentraatioiksi primäärivastaaineille saatiin seuraavat: anti-kalbindiini D28-1:5000; anti-kalretiniini - 1:10000; anti-dbh - 1:5000; anti-parvalbumiini - 1:10000; anti-somatostatiini - 1:100. 44

Primääri-inkubaation jälkeen PVDF-kalvot huuhdeltiin nopeasti TBS-Tweenillä ja pestiin kolme kertaa samalla liuoksella. Aluksi kukin pesu kesti 5 min, mutta sitten pesun kestoa pidennettiin 10 minuuttiin taustasignaalin vähentämiseksi. Tätä seuraava sekundaarivasta-aineinkubaatio kesti myös 2 t. Sekundaarivasta-aineiden konsentraatiot olivat samat kuin primäärivasta-aineiden, paitsi anti-somatostatiinin tapauksessa. Käytetyt sekundaarivasta-aineet olivat seuraavat. Lampaan tuottama vasta-aine hiiren IgG:lle, piparjuuriperoksidaasiin kiinnitetty kokonainen vasta-ainemolekyyli, ECL TM, GE Healthcare UK Limited, kataloginumero NA921V. Aasin tuottama vasta-aine kanin IgG:lle, piparjuuriperoksidaasiin kiinnitetty F(ab ) 2 -fragmentti, ECL TM, Amersham Biosciences UK, kataloginumero NA9340V. Vuohen tuottama vasta-aine rotan IgG:lle, piparjuuriperoksidaasiin kiinnitetty kokonainen vasta-ainemolekyyli, Amersham Biosciences UK, kataloginumero NA935V. Sekundaari-inkubaatiota seurasi nopea huuhtelu ja kolme pesua TBS-Tweenillä. Sitten kalvoja pestiin vielä 10 min pelkällä TBS:llä (jotta suurin osa Tweenistä huuhtoutuisi pois). 4.2.2.3. Signaalin tuotto ja kerääminen PVDF-kalvot nostettiin pois pesuliuoksesta ja aseteltiin tasolle. Niille pipetoitiin Milliporen Immobilon TM Western Chemiluminescent HRP Substrate tuotetta, joka yhdessä sekundaarivastaaineisiin liitettyjen piparjuuriperoksidaasien kanssa tuottaa valoa kirjallisuuskatsauksessa kuvatulla tavalla. Luonnollisesti PVDF-kalvojen proteiinipuoli oli se puoli, joka pyrittiin saamaan kosketuksiin reagenssin kanssa. Viiden minuutin jälkeen reagenssi imettiin pipetillä pois kalvoilta ja kalvot aseteltiin piirtoheitinkalvolle sopivaan muodostelmaan (joka taltioituisi filmille). Päälle painettiin toinen piirtoheitinkalvo ja kokonaisuus laitettiin kuvauskasettiin filmin (Fuji Medical X-Ray Film) kanssa. 4.2.3. Kalretiniinin vasta-aineen affiniteettipuhdistus Kalretiniinin vasta-ainetta affiniteettipuhdistettiin syanogeenibromidiaktivoituun sefaroosiin (CNBr-activated Sepharose 4B, GE Healthcare) sidotulla, bakteerien tuottamalla rekombinanttikalretiniinilla (valmistaja SWANT), jonka sekvenssi oli peräisin ihmiseltä. Rekombinantti- 45

kalretiniini kiinnitettiin sefaroosiin seuraavasti. 1. Proteiini liuotettiin 5 ml:aan sidontapuskuria (englanniksi coupling buffer, 0,1 M NaHCO3, 0,5 M NaCl, ph 8,3), joka sitten valutettiin 50 ml:n putkessa olevan CNBrsefaroosin päälle. 2. CNBr-sefaroosia pyöritettiin putkessaan rotaattorilla 1 t huoneenlämpötilassa. Sitten CNBr-sefaroosi siirrettiin PD10 pylvääseen, jossa affiniteettipuhdistus tapahtui. Pylvästä pestiin 5 x 5 ml:lla sidontapuskuria. CNBr-sefaroosin reagoimattomat kohdat blokattiin lisäämällä pylvääseen 5 ml 0,1 M Tris-HCl ph 8.0 puskuria ja sekoittamalla huoneenlämmössä 2 t. Sitten pylväs pestiin seuraavasti. 1. 5 x 3,5 ml:lla asetaattipuskuria (ph 4). 2. 5 x 3,5 ml:lla Tris-HCl-puskuria (ph 8). 3. 5 x 3,5 ml:lla asetaattipuskuria. 4. 5 x 3,5 ml:lla Tris-HCl-puskuria. 5. 5 x 3,5 ml:lla asetaattipuskuria. 6. 5 x 3,5 ml:lla Tris-HCl-puskuria. 7. 15 ml:lla 1x-PBS:ää. Säilytystä varten sisään laitettiin sitten 5 ml 1x-PBS:ää. Affiniteettipuhdistus tapahtui seuraavasti. 1. Pylvääseen lisättiin puhdistettava vasta-aine. 2. Pylvääseen lisättiin 2 ml 1x-PBS:ää. Pylvästä sekoitettiin (rotaattorilla) 30 min huoneenlämpötilassa. Nestefaasi valutettiin fraktioon 1 (epäspesifinen fraktio, jossa pitäisi olla niiden vasta-ainemolekyylien, jotka eivät sitoutuneet kalretiniiniin). 3. Pylvääseen lisättiin 2 ml 1x-PBS:ää. Nestefaasi valutettiin fraktioon 1. 4. Pylvääseen lisättiin 2 ml 0,1 M AcOH-puskuria, ja pylvästä sekoitettiin 2 min huoneenlämpötilassa. (Nyt siis alettiin laskea hartsin ph:ta, jotta vasta-ainemolekyylit irtoaisivat hartsiin sidotusta rekombinanttiproteiinista.) Nestefaasi valutettiin fraktioon 2 (spesifinen fraktio, jossa pitäisi olla kalretiniiniin sitoutuneita vasta-ainemolekyylejä). 46

5. Pylvääseen lisättiin 5 ml 0,1 M AcOH-puskuria, ja pylvästä sekoitettiin 5 min huoneenlämpötilassa. Nestefaasi valutettiin fraktioon 2. 6. Pylvääseen lisättiin 2 ml 0,1 M AcOH-puskuria. Nestefaasi valutettiin fraktioon 2. 7. Pylväs huuhdottiin 15 ml:lla 1x-PBS-T:tä. Lisättiin säilytystä varten 5 ml 1x-PBS-T:tä (PBS-T sisältää Tween-pesuainetta, joka parantaa säilyvyyttä). Fraktioon lisättiin 2 1 ml 10x-PBS:ää, tarkoituksena neutraloida ph. Fraktiot konsentroitiin ja samalla myös fraktion 2 puskuriksi vaihdettiin 1x-PBS seuraavasti. 1. Fraktiota 2 sentrifugoitiin (4000 rpm, huoneenlämpötila) Vivaspin 100 000 putkessa, kunnes kokonaistilavuus oli 50 µl; sitten putkeen laitettiin vielä 1 ml 1x-PBS:ää, ja sentrifugoitiin, kunnes kokonaistilavuus oli 50 µl. (Vivaspin 100 000 putkessa on suodatin, jonka läpi neste poistuu sentrifugoitaessa alkuperäisestä osastostaan putken alaosaan, proteiinien jäädessä alkuperäiseen osastoon.) 2. Vivaspin-putkeen lisättiin 450 µl 1x-PBS:ää ja sekoitettiin varovasti. Liuos siirrettiin Eppendorf-putkeen. 3. Vivaspiniin siirrettiin vielä 500 µl 1x-PBS:ää, ja kokonaisuutta sekoitettiin varovasti. Sitten sisältö siirrettiin edellisessä kohdassa mainittuun Eppendor-putkeen. Näin pyrittiin saamaan talteen Vivaspiniin mahdollisesti jäänyt vasta-aine. 4.2.4. ELISA ELISAlla tutkittiin, millaiset olivat affiniteettipuhdistuksesta saadun spesifisen ja epäspesifisen fraktion proteiinipitoisuudet verrattuna puhdistamattoman vasta-aineen proteiinipitoisuuteen. ELISA siten antoi tietoa puhdistusprosessin onnistumisesta ja saatujen vasta-aineliuosten vahvuuksista. Jälkimmäinen tieto oli tarpeen mietittäessä, kuinka suuria määriä näitä liuoksia käytettäisiin immunohistokemiallisiin värjäyksiin tutkittaessa niiden värjäysjälkeä. Kuoppien pohjille kiinnitettiin samaa rekombinantti-kalretiniinia, jota käytettiin vasta-aineiden affiniteettipuhdistukseen. 1. Kalretiniiniliuos laimennettiin pitoisuuteen 1:2 PU5-puskuriin. Kalretininin tarkkaa pitoisuutta tässä liuoksessa on vaikea arvioida seuraavasta syystä. Ajatus ELISA:n käytöstä puhdistusprosessin arviointiin tuli vasta siinä vaiheessa, kun kaikki käytössä oleva rekombinanttiproteiini oli jo laitettu pylvääseen. Rekombinanttiproteiinista osa 47

kuitenkin jäi sitoutumatta pylvääseen ja tuli läpi, mikä todennettiin spektrofotometrillä (Cecil CE1010). Tätä läpi tullutta rekombinanttiproteiinia sitten hyödynnettiin ELISA:ssa, mutta sen tarkasta määrästä ei ole tietoa. Tämän ja PU5:n seosta kuitenkin pipetoiin 100 µl/kuoppa EB-kuoppalevylle. Levyä inkuboitiin huoneenlämmössä yön yli liimalapulla peitettynä (haihtumisen estämiseksi) pimeässä. 2. Kuopat pestiin PBS-T:llä, 3 x 250 µl. 3. Kuopat blokattiin 1 % BSA:lla (PBS-T:ssä), 150 µl/kuoppa. Inkuboitiin 1 t huoneenlämpötilassa. 4. Kuopat pestiin 3 x 250 µl:lla PBS-T:tä. 5. Seerumi ja vasta-ainefraktiot laimennettiin 1 % BSA:lla (PBS-T:ssä), pipetoitiin 100 µl/ kuoppa. Kuoppalevyä inkuboitiin 30 min huoneenlämpötilassa. 6. Kuopat pestiin 3 x 250 µl:lla PBS-T:tä. 7. Anti-rabbit-IgG-HRP laimennettiin 1:10000-osaan PBS-T:hen, jossa 1 % BSA, ja pipetoitiin 100 µl/kuoppa. Kuoppalevyä inkuboitiin 30 min huoneenlämmössä. 8. Kuopat pestiin 3 x 250 µl:lla PBS-T:tä. 9. PU28-puskuri laimennettiin 1:50-suhteessa PU27-puskuriin, ja laimennosta pipetoitiin 100 µl/kuoppa. Kuoppalevyä inkuboitiin 15 min huoneenlämmössä. 10. Kuhunkin kuoppaan lisättiin 2M rikkihappoa 50 µl ja mitattiin absorbanssit 450 nm:n aallonpituudella (laitteella Labsystem Multiskan RC). 4.2.5. Immunohistokemiallinen värjäys Käytetty immunohistokemiallinen menetelmä oli epäsuora. Sekundaarivasta-aine oli biotinyloitu, ja siihen liitettiin viimeisessä vaiheessa avidiini-biotiinikompleksi, jossa biotiini oli leimattu piparjuuriperoksidaasilla. Näytteet olivat protokollan suorituksen aikana pienissä lasipurkeissa tasoravistelijalla. Värjäyksiä tehtiin viisi rinnakkaista: 1. Alkuperäinen kalretiniinin antiseerumi. 2. Affiniteettipuhdistuksesta saatu kalretiniinin antiseerumin spesifinen fraktio. 3. Affiniteettipuhdistuksesta saatu kalretiniinin antiseerumin epäspesifinen fraktio. 4. Negatiivikontrolli ei mitään vasta-aineita. 48

5. Negatiivikontrolli alkuperäinen kalretiniinin antiseerumi, mutta ei sekundaarivastaainetta. Värjäys eteni seuraavasti: 1. Leikkeet pestiin 0,1 M PBS-puskurilla (Phosphate-Buffered Saline), jonka ph oli 7,4, 3 x 20 min. 2. Leikkeitä inkuboitiin TBS-liuoksessa, jossa Trisin konsentraatio oli 0,05 M ja ph 7,4, 2 x 20 min. TBS on lyhenne nimikkeestä Tris-Buffered Saline eli trishydroksimetyyliaminometaanipuskuroitu suolaliuos. 3. Leikkeitä inkuboitiin 10% normaaliseerumia (vuohesta, Biowestin) ja 0,5% Triton X-100:a sisältävässä TBS-liuoksessa 40 min. (Normaaliseerumi tarkoittaa seerumia, joka on peräisin immunisoitumattomasta yksilöstä. Tässä yhteydessä kyseessä oli siis seerumi yksilöstä, jota ei ollut altistettu antigeenille, jota kudoksesta etsittiin. Normaaliseerumin tarkoitus on peittää näytteestä kohtia, joihin immunohistokemialliset reagenssit voisivat sitoutua epäspesifisesti. Se on peräisin samasta lajista kuin sekundaarivasta-aineet, jotta nämä eivät reagoisi sen kanssa. Triton X-100 on pinta-aktiivinen yhdiste, joka tekee solun kalvorakenteisiin aukkoja, joiden kautta vasta-aineet pääsevät solun sisältämien proteiinien luo. Toinen immunohistokemiassa käytetty pinta-aktiivinen yhdiste on saponiini. Saponiini ei riko solukalvoa pysyvästi, joten sitä käytettäessä solujen rakenne säilyy paremmin. Saponiinin käyttöä hermoston immunohistokemiassa kuitenkin rajoittaa se, ettei sen teho riitä hermosyiden myeliinituppien rei ittämiseen.) 4. Leikkeitä inkuboitiin 1% normaaliseerumia ja 0,5% Triton-X-100:a sisältävässä TBSliuoksessa 15 min. 5. Leikkeitä inkuboitiin primaarivasta-aineen kanssa 1% normaaliseerumia ja 0,5% Triton X-100:a sisältävässä TBS-liuoksessa yön yli huoneenlämpötilassa. Primaarivasta-aineen konsentraatiot olivat seuraavat: 1. Alkuperäinen kalretiniinin antiseerumi: 1:10000. 2. Affiniteettipuhdistuksesta saatu kalretiniinin antiseerumin spesifinen fraktio: 1:100 (käyttiin vahvempaa konsentraatiota affiniteettipuhdistuksen aiheuttaman hävikin takia; hävikkiä arvioi Ale Närvänen ELISA-tuloksesta). 3. Affiniteettipuhdistuksesta saatu kalretiniinin antiseerumin epäspesifinen fraktio: 1:100 (sama syy vahvempaan konsentraatioon). 49

6. Leikkeitä huuhdeltiin ylimääräisen sitoutumattoman primaarivasta-aineen poistamiseksi 1% normaaliseerumia ja 0,5% Triton-X-100:aa sisältävässä TBS-liuoksessa 3 x 30 min. 7. Leikkeitä huuhdeltiin biotinyloidun sekundaarivasta-aineen (kanin IgG:n vasta-aine, markkinanimi Vector BA-1000, erä RO720) kanssa 1% normaaliseerumia ja 0,5% Triton X-100:aa sisältävässä liuoksessa yön yli (noin 16 tuntia) + 4 ºC:ssa. Sekundaarivasta-aineen pitoisuus oli 1:300. 8. Leikkeitä huuhdeltiin 1% seerumia ja 0,5% Triton X-100:aa sisältävässä TBS-liuoksessa 3 x 30 min. 9. Avidiini-biotiinikompleksit muodostettiin inkuboimalla leikkeitä 3 tuntia huoneenlämmössä TBS-liuoksessa, jossa oli 1:500 Vector PK-4000-reagenssia, 1 % seerumia ja 0,5 % Triton X-100:aa. (Vector PK-4000-reagenssissa on avidiinia ja biotynyloitua piparjuuriperoksidaasia; nämä toimitaan erillisinä reagensseina, jotka käyttäjä yhdistää.) 10. Leikkeitä huuhdeltiin TBS-liuoksessa 3 x 20 min. 11. Leikkeitä huuhdeltiin 0,05 M Tris-liuoksessa, jonka ph oli 7,6, 2 x 10 min. 1.1. Sitten niitä inkuboitiin 20 min 0,05 % (w/v) DABia sisältävässä, 0,05-molaarisessa Tris-liuoksessa, jonka ph oli 7,6. 1.2. Jokaiseen leikeastiaan annosteltiin sen verran vetyperoksidia (20 µl), että vetyperoksidin pitoisuudeksi (tilavuuden suhteen) tuli 10-7 %, ja leikkeiden värjäytymistä seurattiin. 11. Leikkeitä huuhdeltiin 0,05-molaarisessa Tris-puskuroidussa (ilman NaCl:ia, joka voisi muodostaa kiteitä) liuoksessa, jonka ph oli 7,6, 3 x 30 min. Tämän vaiheen tarkoitus oli lopettaa värjäytyminen huuhtomalla pois värjäysreagensseja sisältävä liuos. Sitten leikkeitä huuhdeltiin 0,1 M PB-liuoksessa, vaihdettiin tilalle uusi PB-liuos, ja jätettiin säilytykseen yön yli. Sitten laborantti kiinnitti leikkeet objektiivilaseille ja dehydroi ja päällysti ne Depexillä ja peitinlaseilla mikroskopointia varten. 50

5. TULOKSET 5.1. Vasta-aineiden toiminta Western blotin olosuhteissa Spesifinen ja epäspesifinen sitoutuminen, samoin kuin optimaaliset käyttökonsentraatiot, vaihtelivat vasta-aineen mukaan. Toimivimmiksi havaitut primaari- ja sekundaarivasta-aineiden konsentraatiot on esitetty kuvien 9 12 yhteydessä. Polypeptidien molekyylipainoja arvioitiin niiden kulkemista matkoista käyttäen yhtälöä jossa mr on tutkittavan vyöhykkeen viereisistä molekyylimassamarkkereista raskaamman molekyylimassa, mk tutittavan vyöhykkeen viereisistä molekyylimassamarkkereista kevyemmän molekyylimassa, sv tarkasteltavan vyöhykkeen kulkema matka, sr raskaamman molekyylimassamarkkerin kulkema matka ja sk kevyemmän molekyylimassamarkkerin kulkema matka. Sekundaarivasta-aineilla toteutettiin protokolla myös ilman primaarivasta-ainetta, jotta selviäisi, aiheuttavatko sekundaarivasta-aineet epäspesifistä signaalia (kuva 9). Havaittiin, että anti-hiiri tuotti paljon epäspesifistä signaalia, anti-kani ei lainkaan. Anti-rotta tuotti hieman epäspesifistä signaalia, joka sijoittui samoille, n. 37 kda:n kohdille kuin vahvin osa anti-hiiren tuottamasta epäspesifisestä signaalista. Mw (kda) Anti-hiiri Anti-kani Anti-rotta 250 150 100 75 50 37 25 20 15 10 Kuva 9. Sekundaarivasta-aineiden aiheuttama epäspesifinen signaali Valotusaika 2 min. Laimennokset: anti-hiiri 1:5000, anti-kani 1:10000, anti-rotta 1:5000. Blokkausliuoksessa 6 % BSA:ta ja 0,2 % Tweeniä TBS:ssä. Eniten epäspesifistä signaalia tuottaa anti-hiiri. Anti-kani ei tuota sitä, anti-rotta hieman 37 kda:n seutuville. 51

Kalretiniinin vasta-aine (kuva 10) tuotti lukuisia vyöhykkeitä, ja signaalia tuli myös molekyylipainoasteikkoon. Vahvin vyöhyke muodostui 26,5 kda:n kohdalle, mikä on lähellä kalretiniinin molekyylipainon kirjallisuusarvoa 29 kda. Parvalbumiinin vasta-aine (kuva 10) tuotti vähemmän epäspesifistä signaalia. Signaaliksi sopiva vyöhyke n. 13,1 kda kohdalla (kirjallisuusarvo 12 kda) on heikompi kuin kaksi selvästi epäspesifistä vyöhykettä. Koska anti-kalretiniinin ja anti-parvalbumiinin kanssa käytetty sekundaativasta-aine antikani ei aiheuttanut epäspesifistä signaalia, on tässä kuvattu signaali primaarivasta-aineiden aiheuttamaa. Mw (kda) 250 150 100 75 Antikalretiniini Antiparvalbumiini 50 37 25 20 15 10 Kuva 10. Anti-kalretiniini ja anti-parvalbumiini Valotusaika 15 s. Molemmilla samat laimennokset: primaari 1:10000, sekundaari (anti-kani) 1:10000. Molemmilla blokkausliuoksessa 6 % BSA:ta ja 0,1 % Tweeni TBS:ssä. Koska antikani ei aiheuta epäspesifistä signaalia, on signaali primaarivasta-aineen tuottamaa. Anti-kalretiniini tuottaa vahvan vyöhykkeen 37:n ja 25 kda:n markkereiden välille. Skripti antaa sen molekyylipainoksi 26,5 kda. Kalretiniinin molekyylipainon kirjallisuusarvo on 29 kda. Myös molekyylipainoa 29,5 kda vastaava vyöhyke löytyy yläpuolelta, mutta melko heikkona. Anti-parvalbumiinilla saadaan kolme vahvaa vyöhykettä, joita vastaavat molekyylipainot ovat: n. 37, > 25 ja välillä 10-15 kda. Viimeisintä vastaava molekyylipaino, 13.1 kda, on lähimpänä parvalbu miinin kirjallisuusarvoa (12 kda). 52

Mw (kda) 250 150 100 75 50 37 25 20 15 10 Kuva 11. Anti-kalbindiini D28 Valotusaika 30 s. Laimennokset: primaari 1:5000, sekundaari (mouse) 1:5000. Blokkaus: 6 % BSA:ta ja 0,2 % Tweeniä TBS:ssä. Skripti antaa 25 kda markkerin kohdilla olevan vahvan vyöhyke molekyylipainoksi 25,8 kda, mikä on melko lähellä kalbindiinin kirjallisuusarvoa (28 kda). 75-37 kda:n paikkeilla on vyöhykkeitä, jotka voivat olla sekundaarivasta-aineen (anti-hiiren) tuottamia. Mw (kda) 250 150 100 75 Antisomatostatiini Anti- DBH 50 37 25 20 10 + 15 Kuva 12. Anti-somatostatiini ja anti-dbh Valotusaika 15 min. Blokkausliuoksena molemmilla 6 % BSA:ta, 0,5 maitojauhetta ja 0,2 % Tweeniä TBS:ssä. Anti-somatostatiini. Laimennokset: primaari 1:100, sekundaari (anti-rotta) 1:2500. Paljon signaaleja sopimattomilla kohdilla. Hyvin heikko signaali markkerin 15 + 10 kohdalla voi olla spesifinen (kirjallisuusarvo 12,75 kda). Anti-DBH. Laimennokset: primaari 1:5000, sekundaari (anti-hiiri) 1:5000. Markkereiden 75 ja 50 välisistä vyöhykkeistä ylempi sopisi olemaan DBH. Skripti antaa sen molekyylipainoksi 69,5 kda (kirjallisuusarvo 70 kda). 53

Kalbindiinin vasta-aine (kuva 11) tuotti erittäin vahvan vyöhykkeen 25,8 kda:n kohdalle (kirjallisuusarvo 28 kda). Myös molekyylipainoasteikosta tulee jonkin verran signaalia. Muu osa signaalista on luultavasti ainakin osaksi anti-hiiri-sekundaarivasta-aineen aiheuttamaa. Somatostatiinin vasta-aineella (kuva 12) saatu 15 10 kda:n kohdille osuva heikko vyöhyke sopisi olemaan spesifinen signaali (tietokanta-arvo 12,7 kda), mutta signaali jää paljon selkeästi epäspesifisiä signaaleja heikommaksi. DBH:n vasta-aineen (kuva 12) tapauksessa 69,5 kda:n kohdalle osuva vyöhyke voi olla spesifinen (kirjallisuusarvo 70 kda), mutta selkeästi epäspesifiset signaalit ovat voimakkaampia. Anti-somatostatiinia ja anti-dbh:ta käytettäessä saadusta epäspesifisestä signaalista osa lienee anti-hiiri-sekundaarivasta-aineen aiheuttamaa. Tämän arviointia hankaloittaa se, että DBH:n molekyylipainoa silmällä pitäen tiheämmäksi tehdyssä geelissä vyöhykkeet sijoittuvat eri tavalla. 5.2. Affiniteettipuhdistuksen arviointi ELISAlla Ensimmäisen puhdistuskierroksen jälkeen ELISAsta saadut absorbanssit aallonpituudella 450 nm olivat nollatason (pelkkä substraatti ilman näytettä) 0,52 vähentämisen jälkeen: puhdistamaton (ei käytetty pylvään läpi) 0,147, pylvääseen tarttumaton (läpi tullut, epäspesifinen) 0,083 ja pylvääseen tarttunut (puhdistettu, spesifinen) 0,109. Näiden tulosten mukaan kalretiniinin antiseerumi onnistuttiin erotettamaan kahteen eri fraktioon, ja näistä spesifisessä oli enemmän proteiinia. Ensimmäiseltä kierrokselta saatua spesifistä fraktiota puhdistettiin vielä toiseen kertaan. Tämän puhdistuskierroksen onnistumista ei kuitenkaan päästy arvioimaan ELISAn avulla, koska tähän tarvittavaa kalretiniinia ei enää riittänyt. 5.3 Immunohistokemiallisen värjäyksen tulokset Kuvassa 13 on merkitty rotan aivoleikkeeseen ne anatomiset termit, joita käytetään seuraavassa immunohistokemiallisten värjäystulosten tarkastelussa. Negatiivikontrollit eivät antaneet värjäytyvyyttä. Kun tarkastellaan yleisesti aivojen makroanatomista tasoa (kuva 14), voidaan todeta seuraavaa. Puhdistuksesta saatu epäpuhtausfraktio tuottaa melko tasaisen värjäystuloksen 54

ilman suuria kontrastieroja. Alkuperäinen kalretiniinin antiseerumi ja puhdistuksesta saatu spesifinen fraktio värjäävät leikkeen aika lailla samoin, mutta puhdistetun fraktion kontrasti on hieman parempi. Kontrastieroa voi aiheuttaa myös ero vasta-ainekonsentraatiossa. Vaalea aine, johon kuuluvat mm. aivokurkiainen (aivopuolikot toisiinsa liittävä hermosyykimppu), cingulum (cingulate gyruksen ja entorinaalisen aivokuoren liittävä kimppu) ja fimbria (hippokampusta muuhun limbiseen järjestelmään yhdistävä kimppu), värjäytyy kaikilla fraktioilla harmaata heikommin, mutta ero on epäpuhtausfraktiolla pienempi. Alkuperäinen kalretiniinin antiseerumi ja spesifinen fraktio molemmat värjäävät mediaalisesta aivokuoresta syvällä sijaitsevan alueen, jonka arvioidaan olevan mantelitumake eli amygdala. ABA (Allen Brain Atlas) näyttää samaa. Aivokuoren ulkorajapinta värjäytyy kaikilla fraktioilla melko vahvasti - koska vastaavaa ei näy ABA:ssa, kyseessä voi olla artefakta. Talamuksesta värjäytyy alkuperäisellä ja spesifisellä fraktiolla vahvimmin dorsaali- ja lateraalirajapinta. Vastaavaa ei näy epäspesifisellä fraktiolla, mutta ei toisaalta ABA:ssakaan. Hypotalamuksen rajapinta talamuksen ja keskiaivojen kanssa sekä kolmannen aivokammion ympäristö värjäytyvät vahvasti alkuperäisellä ja spesifisellä, epäspesifisellä vastaavaa valikoivuutta ei ole. ABA vahvistaa tämän tuloksen. Hippokampus (kuvat 15 ja 16) värjäytyy epäspesifisellä fraktiolla suunnilleen yhtä vahvasti kuin neokorteksi ja talamus; alkuperäinen ja spesifinen värjäävät hippokampuksen ja dorsaalisen neokorteksin hailakammin. Voimakkaimmin alkuperäinen ja spesifinen värjäävät pihtipoimun jyvässolukerroksen reunat, spesifinen fraktio jonkin verran vahvemmin. Pyramidaalisolukerros kohdissa alueilla CA1 (Cornu Ammonis) ja CA2 värjäytyy näillä myös, spesifisellä fraktiolla alkuperäistä vahvemmin. CA3:n pyramidaalisolukerros puolestaan värjäytyy molemmilla heikommin. ABA:ssa hippokampus visualisoituu samaan tapaan. Epäpuhtausfraktio värjää hippokampuksen tasaisemmin. Pihtipoimun jyvässolualueen reunat ja CA1:n, CA2:n ja CA3:n pyramidaalisolukerrokset värjäytyvät kaikki ympäristöään vahvemmin, keskenään suunnilleen yhtä vahvasti. Hippokampuksen 120x-suurennustakin tarkasteltaessa alkuperäisen ja puhdistetun kalretiniinin antiseerumin värjäysjälki näyttää melko samanlaiselta (kuva 16). Ne ovat molemmat värjänneet hippokampuksesta neuroneita, jotka vaikuttaisivat olevan morfologisesti samaa tyyppiä. Epäpuhtausfraktiolla tulee esiin pieniä pallosia ja pitkulaisia vaaleita alueita. Ensimmäiset lienevät solujen soomia ja jälkimmäiset myelinoituja hermosyitä. 55

CA1:n pyramidaali solukerros neokorteksi hippokampus mantelitumake 3. aivokammio cingulum pihtipoimun jyvässolukerros fimbria aivokurkiainen talamus keskiaivoa hypotalamus CA3:n pyramidaali solukerros CA2:n pyramidaali solukerros Kuva 13. Rotan koronaalinen aivoleike, Nissl-värjäys Anatominen referenssi. Merkinnät ovat suuntaa-antavia. Muokattu www.brainmaps.org -kuvasta. 56

A. B. C. D. Kuva 14. Aivojen koronaalileikkeitä A - C rotasta, 10x-suurennos. A on värjätty alkuperäisellä anti-kalretiniinilla, B puhdistuksesta jääneillä epäpuhtauksilla ja C puhdistuksesta saadulla spesifisellä fraktiolla. Viivaimen pituus 1 mm. D on hiiren aivojen ISH (ei mittakaavassa) Allen Brain Atlaksesta. 57

A. B. C. D. Kuva 15. Suurennos hippokampuksesta Leikkeet samat kuin edellä. Suurennos rotan leikkeillä A - C on 50x. A värjätty alkupe räisellä anti-kalretiniinilla, B epäpuhtauksilla ja C spesifisellä fraktiolla. Viivaimen pituus 1 mm. D hiiren ISH Allen Brain Atlaksesta (ei mittakaavassa). 58

A. B. C. Kuva 16. 120x-suurennos hippokampuksesta Aakkostus kuten edellä, viivaimen pituus 1 mm. 59