Virukset lääketieteen apuvälineinä. Veijo Hukkanen, Veli-Matti Kähäri ja Timo Hyypiä

Transkriptio

1 Kuvat kertovat Veijo Hukkanen, Veli-Matti Kähäri ja Timo Hyypiä Virusten molekyylitasoinen tuntemus on tehnyt mahdolliseksi hyödyntää viruksia niiden luonnollisessa tehtävässä geenien kuljettimina eli vektoreina. Viruksia käytetään kasvainsolujen kohdistettuun tuhoamiseen ja varsinaiseen geenihoitoon eli elimistön muuntuneiden geenien korjaukseen tai korvaamiseen. Geenihoitoon on jalostettu vektoreita useista eri virusryhmistä, mm. adeno-, herpes-, retro- ja parvoviruksista. Virusten hyötykäyttö on lääketieteessä muutenkin tuttua: heikennettyjä viruksia on hyödynnetty rokotteina jo vuosikymmeniä. Virustutkimus on tuottanut luonnontieteellisen tutkimuksen käyttöön uusia välineitä, kuten käänteiskopioijaentsyymin cdna-kloonaukseen. Bakteriofagien käyttö kloonauksessa ja sekvensoinnissa sekä bakulovirusten käyttö proteiinien tuottamisessa ovat biolääketieteellisen tutkimuksen keskeisiä menetelmiä. Tässä kirjoituksessa esittelemme virusten hyötykäyttöä tutkimuksessa ja geenihoidoissa sekä selvitämme yleisimpien geenihoitovektorien toimintaperiaatteita. Edesmenneellä arkkiatri Nils Oker-Blomilla oli tapana todeta virusten mahdollisia hyötyjä pohdittaessa:»ei mitään niin pahaa, ettei jotain hyvääkin.» Viruksista näyttääkin olevan myös hyötyä. Lisääntynyt tietämys virusten rakenteen ja lisääntymiskierron yksityiskohdista on tuonut monia uusia työkaluja biolääketieteen käyttöön. Virusten hyötykäyttö pohjautuu niiden edullisiin ominaisuuksiin: virukset lisääntyvät nopeasti ja tehokkaasti, ja niiden genomi on pienikokoinen, joten siihen on melko yksinkertaista sijoittaa siirto- tai merkkigeeni. Evoluution tuloksena virukset ovat huipputehokkaita solujen välisiä geeninsiirtäjiä, mihin perustuu niiden suosio vektoreina. Monitehorokotteet Viruksia käytettiin lääketieteen välineinä jo ennen kuin niiden olemuksesta oli mitään tietoa. Edward Jenner onnistui 1700-luvun lopulla saamaan aikaan suojan isorokkoa vastaan istuttamalla lehmänrokkoviruksen ihmiseen. Eri lajin virus oli taudinaiheuttamiskyvyltään heikompi, ja sen avulla onnistuttiin lopulta hävittämään isorokko maailmasta. Tälle rokotevirukselle on myöhemminkin löytynyt käyttöä, sillä siihen siirretty vesikauhuviruksen geeni saa aikaan immuniteetin myös rabiesta vastaan eläimillä. Tällaista toisen viruksen (vektorin) kantamaa immunogeeniä käytetään menestyksekkäästi eläinten vesikauhurokotteena. Vaikka isorokkorokotevirus olisi suuren genominsa ansiosta otollinen vektori myös ihmisen monitehorokotteiden tuottoon, varsin yleiset ja usein vakavat haittavaikutukset estävät todennäköisesti sen käytön. Monitehorokotteissa on tarkoituksena liittää yhteen vektoriin usean mikrobin geenejä, jolloin voitaisiin saada aikaan laajakirjoinen suojateho ja säästää monista rokotuskerroista ja -valmisteista johtuva vaiva ja kustannukset. Tarkoitukseen soveltuvia vektoriehdokkaita on useita, mm. adenovirus, herpes simplex -virus (HSV) ja salmonellarokotuksiin käytetty bakteeri. Todennäköisesti myös uudet DNA-rokotteet, joissa Duodecim 2001;117:

2 pakkaussignaali hoitogeeni retrovirusgenomi Hoitogeenin sisältävä defektiivinen retrovirusgenomi siirretään pakkaussoluun Pakkaussolu gag pol env Pakkaussolun sisältämät retroviruksen geenit Hoitogeenisekvenssin sisältävä retrovirusvektorin RNA (sisältää pakkaussignaalin) Kopiointi Luenta Retroviruksen mrna (ei pakkaussignaalia) Retroviruksen rakenneproteiineja Rekombinantti-RNA pakkautuu retroviruskaidiin Retrovirusvektori Kuva 1. Retrovirusvektorin valmistus pakkaussoluissa. gag = kaidiproteiinien geenit, pol = käänteistranskriptaasin geeni, env = pintaproteiinien geenit V. Hukkanen ym.

3 mikrobin geeni annetaan suoraan nukleiinihapon muodossa, tulevat olemaan varteenotettava vaihtoehto uusia rokotteita kehitettäessä. Geenihoito Koska virukset osaavat siirtää omia geenejään solujen sisään, ne ovat olleet myös ensisijainen työväline haluttaessa korjata tai paremminkin kompensoida mutatoituneita tai virheellisesti ilmentyviä geenejä. Satojen sairauksien mekanismi tunnetaan jo DNA-tasolla ja monien ihmisen tautien geenihoitoa on jo alettu kokeilla. Yksi näistä taudeista on vakava immuunipuutos, jonka saa aikaan adenosiinideminaasi-entsyymin (ADA) geenivirhe. Siirtämällä toimiva geeni retrovirusvektoreiden avulla potilaasta otettujen valkosolujen DNA:han ja palauttamalla solut takaisin verenkiertoon on saatu aikaan merkittävää korjautumista ADA-arvoissa. Retrovirusvektorien toimintaperiaate on esitetty kuvissa 1 ja 2. Retrovirusvektori Kohdesolun infektio Erittynyt proteiini Luenta Retrovirusvektorin RNA Käänteiskopiointi (viruksen RT-entsyymi) RNA Hoitogeeni ilmentyy integroituneesta DNA:sta Käänteis-DNA:n hakeutuminen tumaan ja integraatio solun DNA:han Virusvektorin, hoitogeenin ja solun genomin yhdistelmä tumassa Kohdesolu Kuva 2. Retrovirusvektorin toimintaperiaate. RT = retroviruksen käänteiskopioijaentsyymi. 1061

4 Toinen vaihtoehto on käyttää adenovirus- tai herpesvirusvektoreita, jolloin siirrettävä geeni ei siirry osaksi isäntäsolun DNA:ta vaan tuottaa haluttua valkuaisainetta erillisenä yksikkönä solussa. Kyseessä on tavallaan uudentyyppinen lääkkeenantotapa. Menettely täytyy monessa tapauksessa toistaa aika ajoin jatkuvan vaikutuksen aikaansaamiseksi. Uutena tulokkaana geeniterapiavektoreiden sarjaan on liittynyt parvovirus AAV (adeno-associated virus), joka ei pysty lisääntymään itsenäisesti ja kulkeutuu siksi soluissa adenoviruksen ohella. Sen ei ole todettu aiheuttavan ihmiselle tauteja, vaikka se siirtää perintöaineksensa osaksi isäntäsolun DNA:ta ja turvaa näin olemassaolonsa silloin, kun adenoviruksia ei ole läsnä. Herpes simplex -virusvektorit (HSV-vektorit) ovat osoittautuneet lupaaviksi erityisesti keskushermoston kasvainten hoitoon sekä haluttaessa siirtogeenin pitkäaikaista ilmentymistä. Tämä johtuu HSV:n luontaisesta kyvystä aiheuttaa pysyvästi latentti, oireeton infektio hermosoluissa. Käytettäessä virusvektoreita poistetaan osa luonnonvirusten geeneistä ja tehdään näin»geeniammuksia», jotka siirtävät korjaavat geenit soluihin mutta eivät lisäänny isäntäsolussa (kuvat 3 ja 4). Viruksia koskevan molekyylibiologisen tiedon karttuessa pystytään vähitellen kehittämään geeniterapiaan paremmin soveltuvia vektoreita räätälintyönä tarvitsematta enää muokata ihmisen taudinaiheuttajia tähän tarkoitukseen. Tällöin tulee myös mahdolliseksi koh- Siirtogeeni E2 Adenovirusvektorin DNA E2 E1 E4 Adenovirusvektori Pakkaussolu Kuva 3. Adenovirusvektorin valmistus pakkaussolussa. Virusvektorin DNA sisältää siirtogeenin viruksen omien varhaisten E1-, E3- ja E4-geenien tilalla. Pakkaussolussa ilmennetään erillisistä DNA-yksiköistä viruksen muodostumiselle tärkeät E1- ja E4-geenit V. Hukkanen ym.

5 distaa geeniterapia tarkemmin tiettyyn kudokseen, saada aikaan terapiageenin hakeutuminen halutulle paikalle ja säädellä sen toimintaa luonnollisella tavalla. Virusvektoreita on jopa onnistuttu muokkaamaan vaihtamalla niiden kudoshakuisuudesta huolehtivia pintaproteiineja halutun tarkoituksen mukaisesti. Solujen kohdennettu tuhoaminen virusten avulla Virukset ovat mestareita solujen tuhoamisessa, ja tätä ominaisuutta on alettu käyttää hallitusti hyväksi. Monet näistä sovelluksista liittyvät pahanlaatuisten kasvainten hoitoon. Gliooma on Adenovirusvektori Erittynyt proteiini Luenta RNA Hoitogeeni ilmentyy virusvektorin DNA:sta Virusvektorin ydinosa Virusvektorin ja hoitogeenin yhdistelmä-dna tumassa Kohdesolu Kuva 4. Adenovirusvektorin toiminta. HSV-vektorit toimivat kohdesolussa samalla tavoin. Adenovirus- ja HSV-vektorit infektoivat kohdesolun reseptoriensa välityksellä, ja niiden DNA kulkeutuu solun tumaan, mutta ei integroidu osaksi isäntäsolun DNA:ta. Hoitogeeni (tummennettu) ilmentyy tumassa RNA:ksi kuin se olisi solun geeni (käytetyn säätelyalueen mukaan), ja tästä RNA:sta transloituu haluttua hoitoproteiinia. Hoitogeenin ilmentymisen kesto riippuu säätelyalueesta ja viruksesta, ja ilmentyminen saattaa loppua ajan myötä tai jos virusvektori on solulle toksinen. Tuoteproteiini voi jäädä soluun tai erittyä solusta. HSV-vektoreissa, ja joskus adenovirusvektoreissa hoitogeeninä, on HSV:n tymidiinikinaasigeeni (tk), joka herkistää infektoituneen solun herpeslääkkeille (esim. gansikloviirille). Tätä ominaisuutta on hyödynnetty aivokasvainten tuhoamisessa. 1063

6 aivokasvain, joka voidaan yleensä poistaa kirurgisesti, mutta jäljelle jäävät syöpäsolut saavat usein aikaan kasvaimen uusiutumisen kohtalokkain seurauksin. Lopuista syöpäsoluista pyritään tekemään selvää virusten avulla. Aivokasvainten hoitoon on kehitetty HSV:n johdannaisia. Niistä on poistettu neurovirulenssigeeni tai muita geenejä, joiden puutteessa HSV pystyy lisääntymään vain nopeasti jakautuvissa soluissa, kuten juuri kasvainsoluissa. HSV:n luontaista tymidiinikinaasia on käytetty myös aivokasvainsolujen herkistämiseen herpesviruslääkkeille (esim. gansikloviirille) infektoimalla aivokasvaimia heikennetyillä herpesvirus- tai adenovirusvektoreilla (kuva 3 ja 4). Tätä tarkoitusta varten adenovirusvektoreihin on siirretty HSV:n tymidiniinikinaasigeeni. Sen tuote pystyy muuttamaan herpesviruslääkkeet aktiiviseen muotoon juuri niissä soluissa, joihin vektori on asettunut. Niinpä ruiskuttamalla kasvainalueelle kyseinen, normaalioloissa harmiton tappajayksikkö ja antamalla sen jälkeen gansikloviiria pyritään tuhoamaan pahanlaatuiset solut myös kasvaimen lähiympäristöstä. Samaa menetelmää on käytetty estämään sepelvaltimon seinämän uudelleen tukkeutuminen pallolaajennuksen jälkeen. Kyseessä on taloudellisestikin merkittävä uusi mahdollisuus sepelvaltimotaudin hoitoon, sillä hyvistä tuloksistaan huolimatta nykyiset sepelvaltimoiden ohitusleikkaukset ovat vaikeita ja kalliita. Adenoviruksista on myös tehty muunnos, joka pystyy lisääntymään vain soluissa, joista puuttuu p53-kasvunrajoiteproteiini, ja tuhoamaan ne. Tämän proteiinin tuotto on vähentynyt yli puolessa pahanlaatuisista kasvaimista. Tarkoituksena on päästä näiden kasvainsolujen spesifiseen tuhoamiseen virusvektorilla. Edellä mainittujen, vielä osittain kokeiluasteella olevien menetelmien lisäksi monien virussovellusten käyttö on molekyylibiologian laboratorioissa niin jokapäiväistä, ettei siihen juuri kiinnitetä huomiota. Keskeisimpiä yhdistelmä- DNA-tekniikan reagensseista on retrovirusten käänteiskopioijaentsyymi (RT). Sen avulla voidaan kääntää RNA-molekyylien informaatio DNA-muotoon, mikä on välttämätön edellytys geenien toiminnan tutkimiselle. Bakteerien virukset, bakteriofagit, ovat puolestaan kunnostautuneet kloonauksen ja sekvensoinnin apuvälineinä. Niiden etuna on suurten virusmäärien nopea ja edullinen tuotto bakteereissa. Bakteriofageja käytetään myös uudentyyppisten vasta-aineiden tuottamiseen, jolloin ei enää tarvita koe-eläimiä, vaan haluttu molekyyli voidaan valita kloonatuista kirjastoista. Virukset ovat myös keskeinen työväline syntetisoitaessa suuria määriä proteiineja soluviljelmissä. Erityisen suuren suosion on saavuttanut hyönteissoluissa lisääntyvä bakulovirus. HSV:n transaktivoiva proteiini VP16 (αtif) on nykyisin yleinen työväline laboratorioissa tutkittaessa proteiinien vuorovaikutuksia kaksihybridimenetelmällä. HSV:n tymidiinikinaasi on puolestaan tunnettu apuväline tuhottaessa soluja viruslääkityksellä. Herpesviruksen tarkka geeniensäätelykaskadi on toiminut tunnettuna mallina tutkittaessa eukaryoottisten solujen geenien säätelyä. Lopuksi Vaikka tietomme virusten anatomiasta siis genomien ja viruspartikkelien rakenteesta alkavat olla jo varsin perusteelliset, virusten lisääntymiskierron yksityiskohdat ovat vielä epäselviä. Todennäköisesti molekyylivirologinen tutkimus paljastaa taas lähitulevaisuudessa uusia virusten käyttämiä kepposia, joita voidaan hyödyntää myös biolääketieteen tutkimuksessa ja potilaiden hoidossa. Virukset molekyylibiologian työkaluina Suomen Geeniterapiaseura (FGTS), verkko-osoite: organizations/fgts/index.htm, edistää tietämystä geenihoidoista ja niissä käytetyistä virusvektoreista V. Hukkanen ym.

7 Kirjallisuutta Glorioso J, Bender M, Goins W, DeLuca N, Fink D. Herpes simplex virus as a gene-delivery vector for the central nervous system. Kirjassa: Kaplitt M, Loewy A, toim. Viral vectors. Gene therapy and neuroscience applications. San Diego: Academic Press, 1995, s Markert J, Medlock M, Rabkin S, ym. Conditionally replicating herpes simplex virus mutant, G207 for the treatment of malignant glioma: results of a phase I trial. Gene Ther 2000;7: VEIJO HUKKANEN, dosentti veijo.hukkanen@utu.fi Turun yliopisto, virusoppi Turku VELI-MATTI KÄHÄRI, dosentti veli-matti.kahari@utu.fi Turun yliopisto, Biotekniikan keskus Turku TIMO HYYPIÄ, dosentti, Suomen Akatemian vanhempi tutkija thyypia@helsinki.fi Haartman-instituutti, virologian osasto PL 21, Helsingin yliopisto 1065