ULOSTEEN KALPROTEKTIININ MÄÄRITTÄMINEN

Transkriptio

1 ULOSTEEN KALPROTEKTIININ MÄÄRITTÄMINEN Maija Lehtikangas Lisensiaattityö Itä-Suomen yliopisto Terveystieteiden tiedekunta Lääketieteen laitos 2018

2 ESIPUHE Lisensiaattityö on tehty Itä-Suomen laboratoriokeskuksen ISLABin Puijon laboratoriossa osana sairaalakemistin erikoistumiskoulutusta. Haluan esittää kiitokseni alkuperäiselle ohjaajalleni, jo eläköityneelle sairaalasolubiologi Aino Laatikaiselle arvokkaista neuvoista projektin alkuvaiheessa. Kiitos kuuluu myös osastonylilääkäri Jarkko Romppaselle hyvistä kommenteista ja lääketieteellisestä näkökulmasta lisensiaattityöni viimeistelyvaiheessa. Toinen ohjaajani professori Kari Pulkki on ollut mukana koko prosessin ajan ja vaikuttanut osaltaan työni loppuun saattamiseen. Suuri kiitos myös työni tarkastajille, ylikemisti Marja-Kaisa Koivulalle ja sairaalakemisti Jani Rytköselle, asiantuntevista kommenteista ja lausunnoista. Vilpittömät kiitokseni Ossille, joka annoit aikaa työni tekemiseen ja tukea koko pitkän rupeaman aikana. Sinä ja pojat muistutatte siitä, mikä on lopulta tärkeintä. Kuopiossa kesäkuussa 2018 Maija Lehtikangas

3 TIIVISTELMÄ Tulehdukselliset suolistosairaudet ovat kasvava tautiryhmä etenkin länsimaissa. Tulehduksellisissa suolistosairauksissa tulehduksen sijainti ja sen aiheuttamat muutokset vaihtelevat tautityypistä toiseen. Diagnoosi ja hoidon tehon seuranta perustuvat potilaan oireiden lisäksi endoskooppisiin tutkimuksiin ja histologisiin löydöksiin. Endoskooppisista tutkimuksista aiheutuu kuitenkin merkittävää epämukavuutta potilaalle ja taloudellista taakkaa terveydenhuollolle. Tulehduksen voimakkuutta ja sijaintia pitäisikin pystyä arvioimaan muulla tavalla. Ruuansulatuskanavan tulehduksessa suolen pinnan läpäisevyys lisääntyy, mikä johtaa suolen sisällön muutoksiin. Tulehdusreaktiossa erityisesti neutrofiilisten granulosyyttien ja niiden erittämien aineiden määrä lisääntyy limakalvolla ja suolistossa. Neutrofiilien sisältämän kalprotektiiniproteiinin on tulehduksellisissa suolistosairauksissa todettu kertyvän ruuansulatuskanavaan ja sitä kautta ulosteeseen. Kalprotektiinin määrä ulosteessa voidaan puolestaan mitata vakiintuneilla immunologisilla menetelmillä melko yksinkertaisesti. Näin voidaan havainnoida ruuansulatuskanavan tulehdusreaktion astetta helposti saatavan ulostenäytteen avulla ilman invasiivista kuvantamistutkimusta. Tässä tutkimuksessa kartoitettiin kaupallisesti saatavilla olevia ulosteen kalprotektiinin määritysmenetelmiä ja arvioitiin niiden soveltuvuutta Itä-Suomen laboratoriokeskuksen ISLABin toimintaympäristöön. Menetelmien toimivuutta ja suorituskykyä testattiin kokeellisessa osuudessa sekä manuaalisella analysoinnilla että käytössä olevilla automaatiolaitteistoilla. Tuloksia verrattiin alihankintalaboratorion tuloksiin. Lisäksi tarkasteltiin eri menetelmissä saatujen tulosten kliinistä vastaavuutta. Menetelmien käytettävyydessä painotettiin yksinkertaista toteutustapaa ja automatisointia lisääntyvien näytemäärien vuoksi. Myös ulostenäytteen käsittelyssä käytettävien uuttovälineiden suorituskykyä ja käytettävyyttä testattiin. Eri määritysmenetelmien todettiin vastaavan suorituskyvyltään pääosin valmistajien ilmoittamia tietoja. Tulostasoissa menetelmien välillä havaittiin kuitenkin huomattavia eroja. Myös määritysmenetelmien automatisoitavuudessa oli eroja. Tutkimuksen havaintojen perusteella Thermo Scientific EliA Calprotectin -määritysmenetelmä Phadian Immunocap 250 -analysaattorilla todettiin testatuista menetelmistä toimivimmaksi aiottuun käyttötarkoitukseen ISLABin toimintaympäristössä. Uuttovälineiden todettiin olevan käyttökelpoisia, uuttovaihetta helpottavia ja niillä suoritettavan uuton olevan toistettava. Uuttovälineet soveltuvat kuitenkin parhaiten tietyn koostumuksen omaavien ulostenäytteiden uuttoon. Uuttovälineiden käyttöönotto ISLABin toimintaympäristössä vaatisi laajempaa ja kattavampaa testausta.

4 ABSTRACT Inflammatory bowel diseases are a growing disease group especially in western societies. The region and the changes caused by the inflammation vary depending on the type of inflammatory bowel disease. Diagnosis and the effect of treatment are based on patient s symptoms as well as endoscopic and histologic findings. However, endoscopy causes discomfort to a patient and financial burden to healthcare. Therefore, the degree and location of inflammation should be able to be assessed using some other method. In the inflammation of gastrointestinal tract the permeability of guts surface increases which leads to changes in guts contents. In inflammation especially the amount of neutrophilic granulocytes and the substances secreted by them is increased on intestinal mucosa. Therefore, calprotectin of neutrophils has been shown to accumulate in gastrointestinal tract and faeces in inflammatory bowel diseases. The amount of calprotectin in faeces can be measured using well established immunological measuring methods. This enables the assessment of degree of gastrointestinal inflammation without invasive endoscopy by easily obtainable faecal sample. In this study commercially available faecal calprotectin assays were surveyed and the methods suitability to the working environment of Eastern Finland Laboratory Centre was assessed. In the study s observational part the functionality and performance of the assays were tested using manual analysing and automated instruments in use. The results were compared to results obtained from subcontracting laboratory. Also the clinical comparability of assays was considered. Simple implementation and automatisation of the assays were emphasized in usability assessment due to increasing number of samples. The performance and usability of extraction devices for faecal extraction were tested as well. Different assays met mostly the performance characteristic informed by the manufacturers. However, there where noticeable systematic differences in results between the assays. Differences were also found in automatisation of different assays. Based on the observations Thermo Scientific EliA Calprotectin assay for Phadia Immunocap 250 analyser was found to be most suitable in the intended use in ISLAB working environment. The extraction devices were found to be usable facilitating the extraction phase. The repeatability of extraction was also good. In addition, the extraction devices are most suitable for extraction of samples of certain faecal consistency. A routine use of extraction devices in ISLAB would require more extensive testing.

5 1 JOHDANTO TEOREETTINEN OSUUS Kalprotektiini Tulehdukselliset suolistosairaudet Tulehduksellisten suolistosairauksien diagnosointi Tulehduksellisten suolistosairauksien hoito ja seuranta Ärtyvän suolen oireyhtymä Ulosteen kalprotektiini tulehduksellisissa suolistosairauksissa Ulosteen kalprotektiinin analysointi Ulostenäyte Uuttovälineet ELISA-tekniikat Immunofluorometrinen määritysmenetelmä FEIA Point of Care -testit VALIDOINTI JA VERIFIOINTI TUTKIMUKSEN TARKOITUS KOKEELLINEN OSUUS Materiaalit ja menetelmät Näytteet Määritysmenetelmät Ulostenäytteiden uutto Määritysmenetelmien testaus Tulosten tilastollinen käsittely TULOKSET Bühlmann Laboratories AG Calprotectin ELISA Bülhmann määritysmenetelmä EVOLIS-automaatilla CALPRO AS Calprolab Calprotectin ELISA Calprolab Calprotectin -menetelmä ja EVOLIS-automaatti Immundiagnostik AG PhiCal Calprotectin ELISA Thermo Scientific EliA Calprotectin Ulosteen uuttamisen testaus POHDINTA... 46

6 8 JOHTOPÄÄTÖKSET LIITTEET LÄHTEET... 59

7 1 JOHDANTO Tulehduksellisia suolistosairauksia sairastavien potilaiden määrä on kasvanut viime vuosina voimakkaasti ja kasvaa edelleen etenkin länsimaisissa yhteiskunnissa. Tulehdusreaktion aste, sijainti ja patologiset muutokset ruuansulatuskanavassa vaihtelevat, minkä mukaan tautien luokittelu tehdään. Kaksi päätyyppiä ovat Crohnin tauti ja haavainen paksusuolen tulehdus, jotka molemmat ovat etiologialtaan tuntemattomia kroonisia ruuansulatuskanavan tulehdustiloja. Tulehdukselliset suolistosairaudet aiheuttavat merkittävää elämänlaadun heikkenemistä vaihtelevien ja vaikeasti hallittavien oireidensa vuoksi. Tulehduksellisten suolistosairauksien diagnosointi perustuu pääasiallisesti potilaan oireisiin, endoskooppisiin tutkimuksiin ja histologisiin löydöksiin. Endoskopiatutkimukset ovat kuitenkin kalliita suorittaa ja aiheuttavat epämukavuutta potilaalle. Tulehduksen astetta ja suolen limakalvon kuntoa tulisikin voida arvioida jollakin muulla tavalla. Ruuansulatuskanavan tulehduksessa suolen pinnan läpäisevyys lisääntyy. Läpäisevyyden lisääntyminen johtaa erilaisten solujen vapauttamien aineiden kulkeutumiseen suolenseinämän läpi. Suoliston tulehduksessa erityisesti neutrofiilisten granulosyyttien määrä limakalvolla kasvaa ja niitä kertyy suolistoon. Tämä johtaa solujen ja niiden vapauttamien aineiden pitoisuuden kasvamiseen myös ulosteessa. Ulosteesta voidaankin määrittää soluperäisiä merkkiaineita, jotka kuvastavat suoliston tulehdusta. Kalprotektiini on neutrofiilisissä granulosyyteissä esiintyvä proteiini, joka on hyvin kestävä ja säilyvä proteiini. Ruuansulatuskanavan neutrofiileistä peräisin oleva kalprotektiini kerääntyy ajan myötä ulosteeseen. Ulosteen kalprotektiinipitoisuuden onkin todettu vastaavan hyvin suolistossa vallitsevaa tulehdusta. Uloste on lisäksi käyttökelpoinen näytemuoto, sillä sitä on helposti saatavilla ja eikä muilla kuin suoliston sairauksilla ole sen merkkiainepitoisuuksiin juurikaan vaikutusta. Kalprotektiini voidaan määrittää ulostenäytteestä yksinkertaisella entsyymivälitteisellä immunologisella menetelmällä. Tulehduksellisten suolistosairauksien määrän ja tutkimustiedon lisääntymisen myötä myös ulosteen kalprotektiinimääritysten tarve kasvaa. Kliinisessä laboratoriossa tutkimusten kliininen tarve ja kustannukset ohjaavat analytiikkaa tuotettavaksi joko alihankintana tai omana tuotantona. Pääsääntöisesti yksinkertaisesti määritettävät ja tilausmäärältään suuret 5

8 tutkimukset kannattaa tuottaa omassa laboratoriossa. Tällöin myös vastausviive lyhenee, kun erillistä näytteiden lähettämistä alihankintalaboratorioon ei tarvita. Tässä tutkimuksessa tarkoituksena oli kartoittaa kaupallisesti saatavia ulosteen kalprotektiinin määritysmenetelmiä ja testata niiden toimivuutta Itä-Suomen laboratoriokeskuksen liikelaitoskuntayhtymän ISLABin toimintaympäristössä. Määritysmenetelmien valinnassa painotettiin yksinkertaista ja mahdollisimman automatisoitua toteutustapaa. 2 TEOREETTINEN OSUUS 2.1 Kalprotektiini Kalprotektiini on 36 kda proteiini, joka muodostaa heterodimeerisen rakenteen kahdesta 14 kda raskasketjusta ja yhdestä 8 kda kevytketjusta. Kalprotektiinia esiintyy pääasiallisesti neurofiilisissa granulosyyteissä ja jonkin verran myös monosyyteissä ja reaktiivisissa makrofaageissa. Neutrofiileissä sytosolin proteiinimäärästä jopa 60 % koostuu yksinomaan kalprotektiinista. Solun kokonaisproteiinimäärästä noin 5 % on kalprotektiinia. ( 1 Montalto ym. 2013; 2 Johne ym. 1997). Kalprotektiinimolekyyli tunnistettiin ensimmäisen kerran 1980-luvulla. Sen jälkeen useat tutkimusryhmät tekivät osittain samanaikaisia havaintoja molekyylin ominaisuuksista ja toiminnasta. Tämän vuoksi kirjallisuus tuntee kalprotektiinin myös lukuisilla muilla nimikkeillä kuten S100A8/S100A9, cystic fibrosis associated protein CFA, 27E10- antigeeni, myelomonocyte related protein MRP8/14, leucocyte-derived L1, calgranulin A/B ( 2 Johne ym 1997; 3 St íž ja Trebichavský 2004). Sittemmin nimike calprotectin on vakiintunut kuvaamaan alayksiköiden muodostamaa heterodimeeristä kokonaisuutta ( 4 Fagerhol 1996). Kalprotektiini pystyy sitomaan kalsiumia ja sinkkiä. Heterodimeerisen rakenteen ketjut pystyvät sitomaan kukin kaksi kalsiumionia, joten kokonaisuudessaan kalprotektiiniin voi sitoutua kuusi kalsiumionia. Kalsiumin sitoutuessa kalprotektiiniproteiiniin sen konformaatio muuttuu ja se pystyy muodostamaan heterodimeerejä erilaisten molekyylien 6

9 kanssa ja kaksoisheterodimeerisia rakenteita toisten kalprotektiinimolekyylien kanssa. Kalsiumin sitoutuminen proteiiniin tekee kalprotektiinista erittäin hyvin kuumuutta ja proteolyysiä kestävän, mikä mahdollistaa kalprotektiinin määrittämisen ulostenäytteestä jopa viikon huoneenlämmössä tapahtuneen säilytyksen jälkeen ( 2 Johne ym 1997). Kalprotektiinin kyky sitoa itseensä sinkkiä antaa sille antimikrobisia ominaisuuksia. Mikrobit tarvitsevat sinkkiä, josta kalprotektiini voi kilpailla niiden kanssa ja siten estää mikrobien proliferaatiota. Myös matriksin metalloproteinaasit (matrix metallo-proteinases MMPs), jotka ovat keskeisessä roolissa muun muassa kudostuhossa, verisuonten uudismuodostuksessa (angiogeneesi), haavan paranemisessa, tulehduksissa ja syövässä, ovat riippuvaisia sinkistä ( 2 Johne 1997; 3 St íž ja Trebichavský 2004). Kalprotektiini kykenee biologisesti merkittävillä pitoisuuksilla inhiboimaan MMP:ien vaikutuksia soluissa sitomalla vapaan sinkin, ja siten vaikuttamaan lukuisiin elimistön reaktioihin ( 5 Isaksen ja Fagerhol 2001). Kalprotektiinia esiintyy erilaisissa kehon nesteissä. Sen pitoisuus plasmassa ja seerumissa nousee neutrofiilien aktiivisuuden kasvaessa, joten kalprotektiinia voidaan hyödyntää erilaisten tulehdustilojen havaitsemisessa. Tutkimuksissa on huomattu seerumin kalprotektiinin olevan lupaava merkkiaine muun muassa sepsiksen, umpilisäkkeen tulehduksen ja erilaisten reumatautien erotusdiagnostiikassa ( 6 Decembrino ym 2015, 7 Bealer ym 2010, 8 Inciarte-Mundo ym 2016). Kalprotektiinia erittyy myös virtsaan, sylkeen, nivelnesteeseen ja muihin elimistön eritteisiin ( 3 St íž ja Trebichavský 2004). Ruuansulatuskanavan neutrofiilisista granulosyyteistä peräisin oleva kalprotektiini erittyy ulosteeseen. Koska ulosteen kalprotektiini on pääasiallisesti peräisin ruuansulatuskanavan neutrofiileista, kalprotektiinin pitoisuus ulosteessa nousee erilaisten tulehdustilojen yhteydessä. Suoliston alueen tulehduksissa suolen pinnan läpäisevyys lisääntyy. Tämä mahdollistaa erilaisten solujen ja niiden vapauttamien aineiden kulkeutumisen suolen seinämän läpi. Tulehdustiloissa neutrofiilisten granulosyyttien määrä lisääntyy, jolloin ne pääsevät kulkeutumaan suolen seinämän läpi suolen sisään. Näin ollen neutrofiilien ja niiden erittämän kalprotektiinin pitoisuus ulosteessa nousee. Ulosteen kalprotektiinipitoisuuden on havaittu nousevan muun muassa tulehduksellisissa suolistosairauksissa, paksusuolen syövässä, ärtyvän suolen oireyhtymässä, keliakiassa, kroonisessa ripulissa ja 7

10 divertikkelitaudisssa ( 9 Konikoff ja Denson 2006). Myös tulehduskipulääkkeiden aiheuttamat limakalvovauriot, suoliston allerginen reaktio, bakteeri- ja virusinfektiot sekä polyypit ja pahanlaatuiset kasvaimet nostavat ulosteen kalprotektiinipitoisuutta ( 10 Sipponen ja Kolho 2011 Duodecim katsaus). Terveillä aikuisilla kalprotektiinia erittyy ulosteeseen noin 0,9 mg vuorokaudessa ja keskimääräinen kalprotektiinipitoisuus on 2 mg/l, joka vastaa pitoisuutta 10 µg/g ( 11 Tibble ym 2000). Tutkittaessa terveitä lapsia ( 12 Rugtveit ja Fagerhol 2002; 13 Fagerberg ym. 2003; 14 Li ym. 2015) on havaittu, että ulosteen kalprotektiinipitoisuus on lapsilla korkeampi kuin aikuisilla. Pienillä imeväisikäisillä (ikä 1-6 kuukautta) kalprotektiinipitoisuudet ovat tyypillisesti µg/g, kun taas vanhemmilla lapsilla (1-5 vuotta) kalprotektiinipitoisuudet ovat keskimäärin 60 µg/g. Yli neljävuotiailla lapsilla pitoisuuksien on havaittu olevan lähellä aikuisten viitearvoja. Fagerberg ym. ( ) määrittivät vuotiaiden terveiden lasten kalprotektiinin mediaanipitoisuudeksi 13,6 µg/g. Lapsilla määritettyjen korkeampien pitoisuuksien taustalla arvellaan olevan neutrofiilien suurempi määrä ruuansulatuskanavassa, mikä liittynee suoliston immuunipuolustusjärjestelmän kehittymiseen. Ulosteen kalprotektiinipitoisuuden ei ole havaittu systemaattisesti muuttuva aikuisilla iän myötä ( 15 Manz ym. 2012). 2.2 Tulehdukselliset suolistosairaudet Tulehdukselliset suolistosairaudet (inflammatory bowel diseases IBD) ovat kroonisia ruuansulatuskanavan tulehdustiloja. Kaksi päätyyppiä on Crohnin tauti ja haavainen paksusuolen tulehdus eli ulseroiva koliitti. Ulseroivassa koliitissa tulehdus on pääasiallisesti paksusuolessa ja suolen seinämän limakalvossa, mutta Crohnin taudissa tulehtunutta kudosta voi löytyä mistä tahansa ruuansulatuskanavasta ja se ulottuu suolen seinämän kaikkiin kerroksiin. Molemmat tautityypit ovat kroonisia, mutta niissä esiintyy tyypillisesti oireettomia kausia, jolloin tauti on remissiossa. ( 16,17 Sipponen 2016) Tulehduksellista suolistosairauksista kärsivien potilaiden määrä lisääntyy kaikkialla maailmassa. Erityisesti länsimaissa taudin esiintyvyys on ollut pysyvässä kasvussa jo kolmen vuosikymmen ajan. Erot taudin esiintyvyydessä vaihtelevat kuitenkin maantieteellisesti siten, että esiintyvyys on suurinta Pohjois-Amerikassa ja Euroopassa ja 8

11 pienintä Aasiassa. ( 18 Molodecky 2011). Arvioiden mukaan Crohnin taudin esiintyvyys Euroopassa on 6-9 potilasta per asukasta ( 19 EurodisCare 2009) ja Suomessa potilasta per asukasta ( 16 Sipponen 2016). Haavaista paksusuolen tulehdusta esiintyy pääsääntöisesti noin vuotiailla miehillä, kun taas Crohnin tauti puhkeaa tyypillisesti vuotiaalle naiselle ( 20 Burri ja Belringer 2012). Crohnin taudin etiologiaa ei ole pystytty selvittämään. Vallalla olevan käsityksen mukaan yksi tai useampi laukaiseva tekijä saa aikaan geneettisesti alttiilla henkilöillä suolen säätelyhäiriön ( 21 Hugot ym. 2003). Häiriötila aiheuttaa muutoksen immunologisessa toleranssissa, joka normaalitilassa vallitsee suolistossa olevaa bakteeristoa kohtaa. Muutos saa aikaan jatkuvan tulehdustilan ja lymfosyyttien aktivoitumisen, joka johtaa tulehdustilan voimistumiseen Tulehduksellisten suolistosairauksien diagnosointi Tulehduksellisten suolistosairauksien diagnoosi ja hoidon seuranta perustuu potilaan oireisiin, kliiniseen tutkimukseen, laboratoriotutkimuksiin, radiologisiin ja endoskooppisiin tutkimuksiin sekä histopatologisiin löydöksiin ( 1 Montalto ym 2013). Usein potilaiden oireet ja taudin kliininen kuva eivät kuitenkaan ole yksiselitteisiä. Koska haavainen paksusuolen tulehdus keskittyy ainoastaan paksusuolen alueelle, on sen diagnosointi endoskooppisesti mahdollista. Crohnin taudissa tulehdusta voi kuitenkin esiintyä koko ruuansulatuskanavan alueella, jolloin tulehduksen kuvantaminen on huomattavan paljon hankalampaa. ( 11 Tibble ym 2000). Moninaisten oireiden vuoksi Crohnin taudin diagnosointi on usein vaikeaa. Tyypillisiä oireita ovat muun muassa vatsakipu, ripuli, ummetus, niveloireet, kasvun hidastumat lapsilla, osteoporoosi ja erilaiset neurologiset häiriöt. Kyselytutkimuksen mukaan (n=670) keskimääräinen aika ensimmäisestä kliinisestä oireesta Crohnin taudin diagnoosiin oli 12 kuukautta, mutta oikean diagnoosin saaminen kesti osalla potilaista useita vuosia. Kyselyyn vastanneista potilaista yli puolet sai ensin väärän diagnoosin ja 83 % väärää hoitoa ennen lopullista diagnoosia. ( 19 EurodisCare 2009). 9

12 Perinteinen tutkimus ruuansulatuskanavan häiriötilojen selvittelyssä on ollut neutrofiilien leimaaminen 111 indiumilla. Tutkimuksessa potilaan neutrofiilit eristetään, leimataan 111 indiumilla ja injisoidaan takaisin potilaaseen. Gammaskintigrafian eli gammakamerakuvauksen ja neljän vuorokauden ulostekeräyksen avulla määritetään leimattujen neutrofiilien jakautumista elimistöön ja niiden määrää ulosteessa. ( 22 Saverymuttu ym 1985). Menetelmää on pitkään pidetty standardina tulehduksellisten suolistosairauksien diagnosoinnissa, mutta sen selkeinä haittapuolina ovat leimattujen solujen valmistukseen liittyvät vaatimukset, hinta, pitkittynyt ulostekeräys ja potilaalle aiheutuva säteily ( 11 Tibble ym 2000, 1 Montalto ym 2013). Nykyisen Käypä Hoito -suosituksen mukaan Crohnin taudin diagnoosi perustuu taudin kliiniseen kuvaan, endoskopia- ja kuvantamistutkimuksiin sekä histologisiin löydöksiin. Lisäksi tarvittaessa käytetään erilaisia kuvantamistutkimuksia, kuten magneetti- tai kapselikuvausta. Tyypillisiä laboratoriotutkimuksia ovat verenkuva, lasko ja C-reaktiivisen proteiinin määritys, joissa havaitaan lievää anemiaa ja leukosytoosia sekä laskon ja CRP:n nousua. Myös ulosteen kalprotektiinipitoisuus nousee Crohnin taudin yhteydessä. ( 23 Käypä hoito -suositus, 2011) Tulehduksellisten suolistosairauksien hoito ja seuranta Tulehduksellisten suolistosairauksien hoito määräytyy taudin levinneisyyden ja oireiden vakavuuden mukaan. Hoidolla pyritään vähentämään taudin aiheuttamia komplikaatioita ja oireita ja siten parantamaan potilaan elämänlaatua. Crohnin tautiin ei ole olemassa parantavaa hoitoa, mutta lääkehoidolla pyritään rauhoittamaan aktiivinen tauti remissioon ja pitämään sitä yllä. Käytössä olevia lääkeaineita ovat muun muassa 5-aminosalisyylihappovalmisteet, sulfasalatsiini, kortikosteroidit, antibiootit ja erilaiset immunomoduloivat lääkkeet eli immunosupressantit sekä niin sanotut biologiset lääkkeet, jotka muuttavat immuunivastetta. Erityisesti tuumorinekroositekijä alphan (TNF- ) monoklonaaliset vasta-aineet infliksimabi, adalimumabi ja sertolitsumabi ovat osoittautuneet tehokkaiksi lääkeaineiksi Crohnin taudin hoidossa ( 16 Sipponen 2016; 24 Hämäläinen ym. 2011). Vaikeissa taudin muodoissa saatetaan tarvita lääkkeellisen hoidon lisäksi leikkaushoitoa. 10

13 Haavaisessa paksusuolen tulehduksessa voidaan käyttää paikallisia tulehduslääkkeitä kuten 5-aminosalisyylihappoa tai hydrokortisonia, kortikosteroideja ja tiopuriinia. Kuten Crohnin taudissa myös ulseroivassa koliitissa TNF- :n estäjät infliksimabi, adalimumabi ja golimumabi ovat osoittaneet tehokkuutensa. ( 17 Sipponen 2016). Tulehduksellisten suolistosairauksien seurannassa on perinteisesti käytetty kolonoskopiaa lisääntyneen syöpäriskin vuoksi, jos tautiin liittyy koliittia. 2.3 Ärtyvän suolen oireyhtymä Ärtyvän suolen oireyhtymä (irritable bowel syndrome IBS) aiheuttaa usein samankaltaisia oireita kuin tulehdukselliset suolistosairaudet, mutta kyseessä on ruuansulatuskanavan toiminnallinen toimintahäiriö. IBS:ssä ei ole yleensä havaittavissa endoskooppisia löydöksiä. Oireina ovat tyypillisesti vatsan kiputilojen lisäksi ummetus tai ripuli tai molemmat yhdessä. Diagnoosihetkellä oireita tulee olla esiintynyt edellisen kolmen kuukauden aikana vähintään kolme kertaa kuukaudessa ( 25 Voutilainen 2016). Diagnoosi perustuu ärtyvän suolen oireyhtymässä muiden vastaavia oireita aiheuttavien tilojen, kuten IBD, keliakia, laktoosi-intoleranssi ja paksusuolensyöpä, poissulkuun. ( 25 Vuotilainen 2016). IBS:n esiintyvyys on maailman laajuisesti noin 11 %, vaikka taudin määrittely ei olekaan yksiselitteinen. Hoitoon oireisista potilaista hakeutuu kuitenkin vain keskimäärin 30 %. ( 26 Canavan ym. 2014). IBS:n ja IBD:n erotusdiagnostiikka on hyvin tärkeää, sillä tautien hoitosuositukset poikkeavat toisistaan merkittävästi. Nopea diagnoosi on tärkeä myös sen vuoksi, että yhtenevien oireiden vuoksi potilaat joutuvat usein IBS:n selvittelyssä endoskooppisiin tutkimuksiin, joista ei kuitenkaan ole vastaavaa hyötyä taudin diagnoosin kannalta ja ne aiheuttavat turhia kustannuksia sekä epämukavuutta potilaalle ( 20 Burri ja Beglinger 2012). 11

14 2.4 Ulosteen kalprotektiini tulehduksellisissa suolistosairauksissa Tulehduksellisiin suolistosairauksiin yhdistettyjä ulosteen merkkiaineita on viime vuosina tutkittu paljon. Uloste on näytemuotona erittäin käyttökelpoinen, sillä sitä on useimmiten helposti saatavissa ja usein muut kuin suoliston sairaudet vaikuttavat sen merkkiainepitoisuuksiin vähemmän kuin esimerkiksi plasman vastaaviin pitoisuuksiin. ( 27 Vermeire ym 2006). Ulosteen kalprotektiini on yksi lupaavimmista neutrofiiliperäisistä merkkiaineista, sillä sen osuus solujen kokonaisproteiinimäärästä on niin suuri. Sen vuoksi ulosteen kalprotektiinipitoisuuden voidaan katsoa olevan suoraan verrannollinen ruuansulatuskanavan neutrofiilien määrän kanssa. ( 27 Vermeire ym 2006). Tulehduksellisissa suolistosairauksissa suolen pinnan läpäisevyys lisääntyy, mikä johtaa neutrofiilien ja niiden vapauttaman kalprotektiinin määrä lisääntymiseen suolen sisällä. Tämä nostaa ulosteen kalprotektiini pitoisuutta. Koska kalprotektiinin määrittäminen ulosteesta on melko yksinkertaista ja näytteen saaminen ja säilyttäminen helppoa, voidaan sitä hyvin käyttää toistuviin pitoisuusmäärityksiin esimerkiksi hoidon vastetta arvioitaessa. Ulosteen kalprotektiinin pitoisuuden viite- ja raja-arvojen määrittäminen on osoittanut haasteelliseksi tehtäväksi. Konikoffin ja Densonin ( ) katsauksessa terveiden aikuisten mediaani kalprotektiinipitoisuus oli 22,5 µ/g, kun mediaani tulehduksellista suolistosairautta sairastavilla oli 394,9 µg/g. Vastaavat pitoisuudet lapsilla olivat 28,1 µg/g ja 221,3 µg/g. Useat määritysmenetelmien valmistajat ilmoittavat raja-arvoksi 50 µg/g. Käytännössä tutkimuksissa on havaittu, että raja-arvon tulee olla korkeampi, jotta saavutetaan riittävä spesifisyys ja sensitiivisyys. von Roon ym. ( ) havaitsivat meta-analyysissään, että kalprotektiinin diagnostinen tarkkuus erottaa tulehduksellinen suolistosairaus oli parempi raja-arvolla 100 µg/g kuin 50 µg/g. Korkeampi raja-arvo päti myös eroteltaessa Crohnin tautia sairastavia heistä, jotka kärsivät ärtyvän suolen oireyhtymästä. Meta-analyysin mukaan tulokset ovat sovellettavissa sekä aikuisilla että lapsilla. Toisaalta kalprotektiinipitoisuus < 250 µg/g korreloi hyvin vahvasti normaalien endoskooppisten löydösten kanssa remissiossa olevilla tulehduksellista suolistosairautta sairastavilla potilailla ( 29 Roseth ym. 2004). Vaikka kalprotektiinin pitoisuus ulosteessa ei ole täysin spesifinen tulehduksellisille suolistosairauksille, sen on useissa tutkimuksissa havaittu olevan tietyillä raja-arvoilla 12

15 erittäin käyttökelpoinen merkkiaine tulehduksellisten suolistosairauksien diagnosoinnissa. Van Rheenen ym ( ) totesivat kirjallisuuskatsauksessaan aikuisilla ulosteen kalprotektiinipitoisuuden sensitiivisyydeksi 93 % ja spesifisyydeksi 96 % tutkittaessa IBDepäilyä. Vastaavat arvot lapsilla ja nuorilla tehdyissä tutkimuksissa olivat 92 % ja 76 %. Meta-analyysissä oli mukana useita tutkimuksia, jotka sisälsivät erilaisia ja eriasteisia tulehduksellisia suolistosairauksia. Tutkijat havaitsivat myös, että kalprotektiinin määrittäminen ulostenäytteestä diagnoosivaiheessa voisi vähentää endoskopioiden tarvetta aikuisilla jopa 67 % ja lapsipotilaillakin 35 % ( 30 van Rheenen ym 2010). Diamanti ym. ( ) puolestaan havaitsivat, että ulosteen kalprotektiini pystyy raja-arvolla 160 µg/g erottamaan IBD:n normaalista suoliston tilasta alle 18-vuotiailla lapsilla ja nuorilla sensitiivisyydellä 100 % ja spesifisyydellä 80 %. Tutkijoiden mukaan kalprotektiinin systemaattinen määrittäminen auttaa välttämään tarpeettomia endoskopiatutkimuksia. Erityisesti kalprotektiinin hyvä sensitiivisyys ja korkea negatiivinen ennustearvo auttavat kohdentamaan endoskopiatutkimuksia oikeille potilaille ( 32 Jensen ym. 2011). Manz yms ( ) totesivat, että kohonnut kalprotektiinipitoisuus ennustaa hyvin merkittäviä endoskooppisia löydöksiä myös valikoimattomalla potilasjoukolla. Ulosteen kalprotektiinin spesifisyys merkittäville löydöksille oli heidän tutkimuksessaan 85 %. Lisäksi he havaitsivat kohonneen kalprotektiinipitoisuuden olevan yhteydessä ruokatorvessa esiintyviin haavaumiin. Siten kalprotektiinin merkitys myös ylemmän ruuansulatuskanavan kunnon arvioinnissa saattaa olla hyvinkin merkityksellinen. Ulosteen kalprotektiinipitoisuus korreloi selvästi Crohnin taudin aktiivisuuden kanssa. Tibble ym. ( ) havaitsivat, että kertaulostenäytteen kalprotektiinipitoisuus oli erittäin sensitiivinen (100 %) ja spesifinen (97 %) erottamaan aktiivisen Crohnin taudin ja IBS:n toisistaan, kun raja-arvona käytettiin pitoisuutta 30 mg/l (vastaa pitoisuutta 150 µg/g). Schoepferin ym. ( ) tutkimuksessa ulosteen kalprotektiinimäärityksen kokonaistarkkuus tulehdukselliselle suolistosairaudelle oli 89 %, kun verrattiin kalprotektiinipitoisuuksia IBS- ja IBD-potilailla. Vastaavia havaintoja on tehty myös suolisto-oireisilla lapsipotilailla ( 27 Vermeire ym. 2006; 34 Fagerberg ym. 2007; 35 Komraus ym. 2012). 13

16 Ulosteesta mitattavan kalprotektiinipitoisuuden avulla voidaan arvioida myös tulehduksellisten suolistosairauksien ennustetta ja mahdollista relapsia eli taudin uusiutumista. Tutkittaessa Crohin tautia sairastavia lapsia havaittiin, että kalprotektiinipitoisuus >400 µg/g ennusti relapsia seuraavan 9 kk aikana. Lisäksi taudin uusiutumisen riski oli huomattavan pieni lapsilla, jolla pitoisuus jäi alle 400 µg/g. ( 36 Walkiewicz ym. 2008). Ulosteen kalprotektiinipitoisuutta voidaan hyödyntää myös hoidon tehon ja lääkeannostusten arvioinnissa ( 37 Sorrentino ym. 2010). Suomessa käytetään yleisesti raja-arvona kalprotektiinin pitoisuutta < 100 µg/g, jonka on todettu olevan pätevä tulehduksellisten suolistosairauksien erotusdiagnostiikassa ja seurannassa. Tuloksia alueella µg/g voidaan pitää hieman kohonneina ja tulos voidaan tarkistaa uusintamäärityksellä. Lisäksi, arvioitaessa tulehduksellisen suolistosairauden relapsia, raja-arvona käytetään pitoisuutta 150 µg/g, jonka ylittyessä relapsin mahdollisuus lisääntyy. ( 10 Sipponen ja Kolho, 2011). 2.5 Ulosteen kalprotektiinin analysointi Ulostenäyte Tutkimusten mukaan ulosteessa oleva kalprotektiini on hyvin stabiili ja tasaisesti jakautunut. Tibble ym. ( ) havaitsivat, että neljän päivän ulostekeräyksen kalprotektiinipitoisuus (mediaani 101 mg/l, vastaa 505 µg/g) vastasi merkitsevästi kertaulostenäytteen kalprotektiinipitoisuutta (mediaani 118 mg/l, vastaa 590 µg/g). Toisaalta he havaitsivat myös, että käytettäessä kertaulostenäytettä keräyksen sijaan laski toistettavuus, etenkin matalilla pitoisuuksilla. Kertaulostenäytteen CV % päivien välillä oli keskimäärin 54 %, minkä tutkijat olettivat aiheutuvan pääasiallisesti ulosteen määrän ja vesipitoisuuden muutoksista. Jos ulosteen kalprotektiinia käytetään aktiivisten tulehduksellisten suolistosairauksien diagnosoinnissa tai seurannassa, tämä ei kuitenkaan ole ongelmallista, sillä kalprotektiinin pitoisuudet ovat joka tapauksessa kymmenkertaisia normaaleihin arvoihin verrattuna. ( 11 Tibble ym 2000). Ulosteen kalprotektiinipitoisuudessa esiintyy suurta vaihtelua päivän aikana. Vaihtelu johtuu luultavimmin ruuansulatuskanavassa kulkeutuvien aineiden konsentroitumisesta suolistossa ulostuskertojen välillä. Tutkittaessa akuuttia 14

17 ulseroivaa koliittia sairastavien potilaiden ulosteen kalprotektiinipitoisuutta ( 38 Lasson ym. 2015) havaittiin, että pitoisuus vaihtelee suuresti sekä päivän eri ulostamiskertojen välillä että päivästä päivään. Toisaalta tutkimuksessa todettiin, että tutkitulla potilasjoukolla kalprotektiinipitoisuus oli joka tapauksessa korkea, joten vaihtelulla ei välttämättä ole suurta kliinistä merkitystä. Tutkimuksessa korostettiin kuitenkin sitä, että yksittäisen potilaan ulostenäytteenotto pitäisi tehdä samaan aikaan vuorokaudesta tai siten, että edellisestä ulostamiskerrasta on jotakuinkin yhtä pitkä aika. Kristensen ym. ( ) havaitsivat suurta päivittäistä vaihtelua kalprotektiinipitoisuuksissa myös ulseroivaa koltiittia ja Crohnin tautia sairastavilla potilailla, joilla kalprotektiinipitoisuudet eivät olleet yhtä korkeita. Yksittäiselle pitoisuusmääritykselle ei tutkijoiden mukaan voidakaan antaa liian suurta painoarvoa arvioitaessa taudin vakavuutta tai muutettaessa potilaan hoitoa. Kalprotektiini säilyy useiden tutkimusten mukaan ulosteessa hyvin. Kalprotektiinin on todettu säilyvän huoneenlämmössä useita päiviä, vaikkakin yli kolmen vuorokauden säilytyksen jälkeen pitoisuus alkaa vähitellen laskea ( 38 Lasson ym 2015). Käytännössä potilas voi kuitenkin suorittaa näytteenoton kotona ja toimittaa näytteen laboratorioon huoneenlämmössä, kunhan tarpeetonta säilytystä kotona vältetään. Lisäksi laboratorion tulee huomioida näytteiden säilyvyys, jos analytiikkaa tehdään esimerkiksi vain kerran viikossa. Kalprotektiinin on havaittu olevan melko hyvin säilyvä myös jääkaappilämpötilassa ja pakkasessa säilytetyissä ulostenäytteissä. Lisäksi kalprotektiinin pitoisuusmääritystä varten tehdyn uuton jälkeen näytteiden on todettu säilyvän useita tunteja huoneenlämmössä ja useita kuukausia pakastettuna -20 C. ( 40 Tøn ym. 2000) Uuttovälineet Määritettäessä kalprotektiinipitoisuutta ulostenäyte tulee käsitellä ennen varsinaista analysointia. Kalprotektiini uutetaan ulosteesta uuttopuskuriin, joka on yleensä jokaiselle määritysmenetelmälle spesifinen. Uutto voidaan tehdä niin sanotulla manuaalitekniikalla, jossa ulostetta punnitaan tyypillisesti mg uuttopuskuriin siten, että saadaan 1:50 laimennos. Käyttämällä uuttamisessa manuaalitekniikkaa ei 15

18 ulosteen koostumuksella ole kovinkaan suurta vaikutusta, sillä hyvin nestemäisiä näytteitä voidaan käsitellä pipetoimalla. Manuaalinen punnitseminen on kuitenkin melko työlästä ja aikaa vievää, kun jokainen näyte punnitaan erikseen ja lisättävä uuttopuskurin määrä ei ole vakio. Markkinoille on viime vuosina tullut erilaisia uuttovälineitä helpottamaan manuaalisesti suoritettavaa uuttoa. Uuttovälineissä on yleensä jonkinlainen ura tai kuoppa, jonne näytettä jää tunnettu pitoisuus, esimerkiksi 50 mg. Näin punnitseminen jää pois ja lisättävän uuttopuskurin määrä on vakio. Joissakin välineissä uuttopuskuri on valmiina ja ulostenäyte lisätään puskuriin tikussa, jonka uriin näyte on kiinnittynyt. Näin myös uuttopuskurin pipetointi jää pois ja uuttovaihe yksinkertaistuu edelleen. Tutkimusten mukaan potilaat voivat myös itse suorittaa ulosteen uuttovaiheen, jos käytetään välinettä, jossa uuttopuskuri on valmiina ( 39 Kristensen ym. 2016). Tällöin laboratoriossa suoritettavan työn määrä ja kuormitus vähenee, mutta potilaan ohjaukseen tulee kiinnittää erityistä huomiota onnistuneen preanalyyttisen vaiheen takaamiseksi ja luotettavien tulosten saamiseksi. Käytettäessä ulosteen uutossa uuttovälineitä on ulosteen koostumuksella suurempi merkitys kuin manuaalisessa uuttotekniikassa. Hyvin vetiset ulosteet eivät välttämättä tartu uuttovälineeseen, jolloin kalprotektiinipitoisuus arvioidaan todellisuutta pienemmäksi. Whitehead ym ( ) havaitsivat uuttovälineiden antavan käytetystä määritysmenetelmästä riippuen keskimäärin 20 % matalampia pitoisuuksia manuaalitekniikkaan verrattuna. Manuaalista punnitusta pidetäänkin luotettavimpana uuttomenetelmänä, vaikka uuttovälineen käytön aiheuttaman tulostason pienenemisen kliininen merkitys lienee useissa tapauksissa vähäinen ELISA-tekniikat Entsyymivälitteinen immunosorbenttimääritys (Enzyme-linked immunosorbent assay) eli ELISA on biokemiallinen tekniikka, jolla voidaan määrittää vasta-aineiden avulla erilaisia aineita biologisista näytteistä. ELISA-tekniikassa näytteen tutkittavat antigeenit havaitaan spesifisten vasta-aineiden avulla. Menetelmän ensimmäisessä vaiheessa näytteen antigeenit sidotaan kiinteään faasiin. Kiinteänä faasina voi toimia 16

19 esimerkiksi kuoppalevy tai automaattilaitteiston analyysikuppi. Sitoutuminen kiinteään faasiin voi olla epäspesifistä ja perustua vain antigeenin adsorptioon tiettyyn pintaan tai siinä voidaan hyödyntää erilaisia vasta-aineita, joissa on halutun antigeenin spesifinen sitoutumispaikka. Toisessa vaiheessa lisätään entsyymileimattua vastaainetta, joka sitoutuu kiinteään faasiin sitoutuneeseen antigeenin. Eri vaiheiden väleissä suoritetaan pesuja, joilla sitoutumattomat molekyylit saadaan poistettua reaktiosta. Kun viimeisessä vaiheessa lisätään entsyymin substraattia, käynnistyy reaktio, jossa syntyy mitattavaa signaalia, kuten väriainetta. Mitattavan signaalin voimakkuudesta voidaan päätellä alkuperäisen näytteen sisältämä antigeenipitoisuus. ELISA-tekniikat jaetaan antigeeni-vasta-aine-sitoutumisperiaatteen mukaan suoriin, epäsuoriin, kilpaileviin ja niin sanottuihin kaksoisvasta-aine- eli sandwichtekniikoihin. Suorassa ELISA-tekniikassa (kuva 1) näytteen sisältämä antigeeni sitoutuu suoraan kiinteään faasiin, esimerkiksi kuoppalevyn pohjaan. Seuraavassa vaiheessa entsyymileimattu vasta-aine sitoutuu spesifisesti antigeeniin. Suorassa ELISA-tekniikassa entsyymileimatun vasta-aineen ja siten mitattavan signaalin määrä on suoraan verrannollinen näytteen antigeenipitoisuuden kanssa. Suora ELISAtekniikka ei ole kovinkaan herkkä menetelmä, sillä määritettävän antigeenin lisäksi myös muut näytteen sisältämät proteiinit voivat sitoutua kiinteään faasiin. Menetelmä ei sovellukaan sellaisten analyyttien määrittämiseen, joiden pitoisuus näytteessä on hyvin pieni. Kuva 1. Suoran ELISA-tekniikan periaate Epäsuorassa ELISA-tekniikassa käytetty kiinteä faasi on päällystetty määritettävälle molekyylille spesifisellä antigeenilla (kuva 2). Määritettävä vasta-aine sitoutuu näin kiinteään faasiin spesifisemmin kuin suorassa ELISA-tekniikassa, jolloin menetelmä on myös herkempi. Muutoin loput työvaiheet ja signaalin muodostuminen noudattelevat samaa periaatetta kuin suorassa ELISA-tekniikassa. 17

20 Kuva 2. Epäsuoran ELISA-tekniikan periaate. Kilpailevassa ELISA-tekniikassa (kuva 3) määritettävä antigeeni sitoutetaan ensin leimaamattomaan vasta-aineeseen, yleensä erillisessä liuoksessa, jolloin muodostuu antigeeni-vasta-aine-komplekseja. Seuraavassa vaiheessa spesifinen vasta-aine ja määritettävän antigeenin ja vasta-aineen muodostamat kompleksit kilpailevat sitoutumisesta kiinteän faasin spesifiseen antigeenin. Lopuksi lisättävä entsyymileimattu vasta-aine saa aikaan substraatin lisäyksen jälkeen mitattavan signaalin. Kilpailevassa ELISA-tekniikassa mitattavan signaalin määrä on kääntäen verrannollinen näytteen antigeenipitoisuuteen, sillä mitä enemmän näytteessä olevaa antigeenia sitoutuu vasta-aineeseen, sitä vähemmän leimattua vasta-ainetta voi kiinteään faasiin sitoutua. Kilpailevassa ELISA-tekniikassa voidaan käyttää leimatun vasta-aineen sijaan myös entsyymileimattua antigeenia, joka kilpailee näytteen sisältämän antigeenin kanssa sitoutumisesta leimaamattomaan vasta-aineeseen. Kuva 3. Kilpailevan ELISA-tekniikan periaate. Kaksoisvasta-ainetekniikassa (kuva 4) näytteen sisältämään antigeeniin sitoutetaan vasta-ainetta. Ensimmäinen vasta-aine on sidottuna kiinteään faasiin, esimerkiksi kuoppalevyn pohjalle. Kun reaktioon lisätään näytettä, sen antigeenit sitoutuvat kiinteän faasin vasta-aineeseen. Seuraavassa vaiheessa lisättävä toinen vasta-aine 18

21 sitoutuu antigeeniin muodostaen vasta-aine-antigeeni-vasta-aine-kompleksin. Käyttämällä kaksoisvasta-ainetekniikka saadaan ELISA-menetelmän herkkyyttä ja spesifisyyttä parannettua verrattuna tekniikoihin, joissa käytetään vain yhtä vastaainetta. Kuva 4. Kaksoisvasta-aine- eli sandwich-tekniikan periaate. ELISA-reaktiossa syntyvää signaalia mitataan tyypillisesti spektrofotometrisesti. Substraatti saa yleensä entsymaattisen reaktion viimeisessä vaiheessa aikaan värinmuodostuksen tai muutoksen jo aiemmissa reaktioissa muodostuneeseen väriin. Syntyneen värin intensiteettiä mitataan reaktiolle spesifisellä aallonpituudella, jolloin saadaan näytteelle optical density eli OD-arvo. Näytteestä mitattua OD-arvoa verrataan tunnetun pitoisuuden omaavista näytteistä tehdyn standardisuoran ODarvoihin, jolloin näytteen pitoisuus saadaan selville. Markkinoilla olevat ulosteen kalprotektiinin määritysmenetelmät perustuvat yleensä kaksoisvasta-aine-elisa-tekniikkaan. Niissä humaanille kalprotektiinille spesifinen monoklonaalinen vasta-aine on sitoutunut analyysissä käytetyn kuoppalevyn tai näytekupin pohjaan. Uutetun näytteen tai käytettyjen standardien ja kontrollien sisältämä kalprotektiini sitoutuu vasta-aineeseen ja jää kiinni kuopan tai kupin pohjaan. Ylimääräinen näyte pestään pesupuskurilla pois, minkä jälkeen lisättävä entsyymileimattu vasta-aine sitoutuu kalprotektiiniin. Entsyymileima voi olla peroksidaasi-, fosfataasi- tai galaktosidaasipohjainen. Käytetty vasta-aine puolestaan voi olla joko mono- tai polyklonaalinen. Kun ylimääräinen entsyymileimattu vastaaine on pesty pois, entsyymin substraattia lisätään reaktioon, jolloin muodostuu tyypillisesti sinistä väriä. Viimeisessä vaiheessa reaktioon lisätään hapanta liuosta, 19

22 mikä pysäyttää entsymaattisen reaktion ja muuttaa värin keltaiseksi. Muodostuneen keltaisen värin intensiteetti mitataan spektrofotometrisesti. Koska muodostuneen värin intensiteetti on suoraan verrannollinen alkuperäisen näytteen kalprotektiinipitoisuuteen, voidaan standardien tunnetun pitoisuuden ja OD-arvojen perusteella piirretystä kuvaajasta määrittää näytteen kalprotektiinipitoisuus. ELISA-tekniikalla tehtäviä määritysmenetelmiä on viime vuosina automatisoitu. Automaatioratkaisuissa pipetointi ja pesuvaiheet voidaan suorittaa omalla laitteistollaan, jonka jälkeen varsinainen detektio tehdään erillisellä spektrofotometrisellä mittalaitteella. Markkinoilla on myös täysautomaattisia ELISAlaitteistoja, jotka pipetointi- ja pesuvaiheiden lisäksi mittaavat ja tulostavat pitoisuustiedot ja kuvaajat. Erityisesti täysin automatisoiduilla laitteilla voidaan vähentää kokonaisprosessiin sitoutuvaa työpanosta huomattavasti. Manuaaliset työvaiheet aiheuttavat myös ergonomista kuormitusta, sillä isoissa näytesarjoissa pipetointia on paljon Immunofluorometrinen määritysmenetelmä FEIA Immunofluorometrinen määritysmenetelmä (fluorescence enzyme immonoassay FEIA) perustuu aineiden kykyyn fluoresoida valoa. Immunofluorometriassa mitattava yhdiste sitoutetaan edellä kuvattujen ELISA-tekniikoiden periaatteita noudattaen kiinteään faasiin, kuten kuoppalevyn pohjan tai analyysikuppiin. Viimeisessä vaiheessa lisättävä substraattiliuos saa aikaan fluoresoivan yhdisteen muodostumisen. Fluoresoiva yhdiste voi syntyä esimerkiksi 4-metyyliumbelliferyylifosfaatin hydrolysoituessa 4- metyyliumbelliferyyliksi. Vertaamalla fluoresenssin määrää tunnettujen vakioiden fluoresenssiin voidaan mitattavan yhdisteen pitoisuus määrittää. Mitattavan fluoresenssin määrä on suoraan tai kääntäen verrannollinen määritettävän yhdisteen pitoisuuteen, riippuen reaktiossa käytetystä antigeenin ja vasta-aineen sitoutumisperiaatteesta. 20

23 2.5.5 Point of Care -testit ELISA-tekniikkaan perustuvien monivaiheisten kalprotektiinin määritysmenetelmien lisäksi markkinoilla on Point of Care -analyyseja (POC) eli niin sanottuja pikatestejä. Pikatestejä voidaan käyttää joko suoraan hoitoyksikössä ja poliklinikoilla tai laboratoriossa. Niitä voidaan hyödyntää esimerkiksi positiivisten näytteiden seulonnassa. Pikatestit vaativat kalprotektiinia analysoitaessa yleensä vastaavan uuttovaiheen kuin ELISA-tekniikkaan perustuvat menetelmät, jolloin kynnys testin tekemiseen hoitoyksikössä saattaa nousta. Pikatestit perustuvat pääsääntöisesti immunokromatografiaan ja nesteen kulkeutumiseen huokoisessa materiaalissa kapillaarivoimien avulla. Näyte lisätään nestemäisessä muodossa testikasetille, jossa on valmiina vasta-aine tutkittavalle aineelle. Kun vasta-aine ja tutkittava aine reagoivat, syntyy testikasetille värillinen viiva. Syntyneen viivan intensiteetti on suoraan verrannollinen näytteen pitoisuuden kanssa. Immunologinen reaktio tutkittavan aineen ja testin sisältämän vasta-aineiden välillä voi olla tyypiltään suora, epäsuora, kilpaileva tai kaksois-vasta-ainereaktio aivan kuten ELISA-tekniikoissakin. Pikatestit voivat olla mittaustavaltaan kvalitatiivisia, semikvantitatiivisia tai kvantitatiivisia. Kvalitatiivisissa testeissä tulos annetaan muodossa positiivinen tai negatiivinen eikä numeerinen tulos ole mahdollinen. Semikvantitatiivissa testeissä tulos ilmoitetaan jollekin välille, esimerkiksi alle 50 µg/g, µg/g tai yli 200 µg/g. Kvantitatiiviset testit puolestaan antavat mittausalueellaan tarkan numeerisen tuloksen. Kvantitatiivisten testien tulosten tulkinnassa käytetään apuna usein lukulaitetta, joka mittaa syntyneen väriviivan intensiteettiä ja ilmoittaa tuloksen tarkkana pitoisuutena. Kvalitatiivisten ja semikvantitatiivisten testien tulkinta voidaan tehdä myös visuaalisesti tarkastelemalla ja vertaamalla viivan intensiteettiä testin valmistajan esimerkkituloksiin. Kalprotektiinin määrittämisessä kaupallisesti tarjolla olevat pikatestit ovat tyypillisesti semikvantitatiivisia tai kvantitatiivisia. Valmistajasta riippuen testissä voi olla esimerkiksi erilaisille pitoisuusalueille tarkoitettuja testiliuskoja, jolloin 21

24 käyttötarkoituksesta riippuen voidaan käyttää havaintorajalla 50 µg/g tai 200 µg/g olevaa liuskaa. Perusterveydenhuollossa voidaan 50 µg/g testiliuskaa käyttää tulehduksellisten suolistosairauksien seulonnassa, sillä tulos <50µg/g sulkee suurella todennäköisyydellä vakavan suoliston tulehdustilan. Uusimpana markkinoille on tullut myös älypuhelimien sovelluksiin perustuvia pikatestejä. Niissä näytteenotto, uutto ja analysointi suoritetaan potilaan kotona ja älysovelluksen ja puhelimen kameran avulla tulos arvioidaan ja kvantifioidaan. Tämän tyyppisissä pikatesteissä tuloksen tulkinta on automatisoitu ilman erillistä liuskan lukulaitetta. Periaatteessa tulokset olisivat siirrettävissä sovelluksen kautta myös hoitoyksikön käyttöön, mutta Suomessa tällaista tiedonsiirtoa ei käytetä. 3 VALIDOINTI JA VERIFIOINTI Mittausmenetelmän validoinnilla tarkoitetaan niitä toimenpiteitä, joilla osoitetaan analyyttisen menetelmän sopivuus aiottuun käyttötarkoitukseen ja arvioidaan sen suorituskykyä ( 42 Kemian metrologian opas 2005). Validoinnissa pyritään selvittämään menetelmän ominaisuuksia ja rajoituksia sekä tunnistamaan niihin vaikuttavia tekijöitä. Uutta mittausmenetelmää validoitaessa tutkitaan muun muassa menetelmän spesifisyys, lineaarisuus, mittaus-alue, toistettavuus ja tarkkuus (Kemian metrologian opas 2005). Validointi liittyy kiinteästi uusien menetelmien kehitykseen, mutta myös olemassa olevia menetelmiä voidaan validoida, jos niissä tai valitsevassa ympäristössä tapahtuu merkittäviä muutoksia. Verifionnilla tarkoitetaan validoidun menetelmän toimivuuden osoittamista. Tällaisessa tapauksessa laboratoriossa otetaan käyttöön menetelmä, jonka jokin toinen taho on jo validoinut ja siten varmistanut sen sopivuuden ja suorituskyvyn. Validoinnin on voinut suorittaa esimerkiksi laitevalmistaja. Verifioinnilla varmistetaan, että menetelmä täyttää sille asetetut vaatimukset myös uudessa käyttöympäristössä ja että sen on käyttökelpoinen. Verifioinnin laajuus on laboratorion itse määriteltävissä ja riippuu mittausmenetelmään tehtävistä muutoksista. Verifioinnin kriteerit tulee kuitenkin määritellä etukäteen verifiointisuunnitelman avulla. 22

25 Itä-Suomen laboratoriokeskuksen liikelaitoskuntayhtymä ISLABin menetelmien verifiointiohjeistuksessa todetaan, että CE-merkittyjen menetelmien suorituskykyominaisuudet tulee todentaa riittävänlaajoilla testauksilla. Lisäksi verifioinnilla on varmistettava, että menetelmä vastaa tutkimustulosten käyttötarkoitusta. ( 43 Menetelmien validointi, verifiointi ja käyttöönotto sekä koekäytöt ISLABissa, 2015). 4 TUTKIMUKSEN TARKOITUS Tutkimuksen tarkoituksena oli verifioida Itä-Suomen laboratoriokeskuksen liikelaitoskuntayhtymän, ISLABin, käyttöön menetelmä ulosteen kalprotektiinin määrittämiseksi. Aiemmin ISLAB on lähettänyt kalprotektiininäytteet alihankintalaboratorioon, mutta analyysimäärien kasvettua tutkimus halutaan omaan tuotantoon. Lisäksi vastaukset on mahdollista saada pyytävään yksikköön nopeammin, jos tutkimus tehtäisiin itse. Määritysmenetelmän valinnassa painotettiin yksinkertaista toteutustapaa ja mahdollisimman pitkälle vietyä automatisointia järkevillä kustannuksilla. Uudella menetelmällä saatujen tulosten tulisi luonnollisesti olla luotettavia ja vastata kliinikoiden tarpeisiin spesifisyyden ja kliinisen vastaavuuden suhteen. Tutkimuksen tavoitteena oli kartoittaa markkinoilla olevia kaupallisia kalprotektiinin määritysmenetelmiä ja testata mahdollisten vaihtoehtojen toimivuus ISLABin toimintaympäristössä. Menetelmien toimivuutta testattiin sekä manuaalisesti tehtävinä analyyseinä että käytettävissä olevilla automaatiolaitteistoilla. Vertailukohtana käytettiin valmistajien ilmoittamia ominaisuuksia ja alihankintalaboratoriosta saatuja tuloksia. 5 KOKEELLINEN OSUUS 5.1 Materiaalit ja menetelmät Näytteet Kalprotektiinin määritysmenetelmien testauksessa tarvittavat näytteet saatiin pyytämällä ulosteen kalprotektiini -tutkimusta (F-Calpro, KL 4803) tilaavia yksiköitä ohjeistamaan potilaita antamaan kaksi rinnakkaista ulostenäytettä. Ensimmäinen 23

26 näytteistä lähetettiin analysoitavaksi alihankintalaboratorioon laboratorion normaalin käytännön mukaan. Toinen näytteistä säilytettiin menetelmien vertailua varten joko jääkaappilämpötilassa (korkeintaan 10 vrk) tai -20 C:ssa ennen ulostenäytteiden uuttamista. Näytteitä saatiin keräysaikana yhteensä 124 kpl. Määritykset tehtiin vuoden 2012 aikana. Kolmea näytteistä ei voitu analysoida yhdelläkään testattavista menetelmistä, sillä näytemäärä oli liian vähäinen. Näin ollen lopullinen näytemäärä oli 121 kpl. Näytteistä 46 % (56 kpl) oli lapsista (< 18 vuotta) ja 54 % (65 kpl) täysi-ikäisistä ( 18 vuotta). Näytteiden antaneiden potilaiden keski-ikä oli 25 vuotta (jakauma 2-77 vuotta) ja alle 5-vuotiaiden lasten näytteitä oli 10 kpl. Taulukkoon 1. on koottu keskeisimmät tiedot aineistosta. Taulukko 1. Keskeisimmät tiedot aineistosta Kalprotektiini pitoisuus µg/g (HUSLAB laboratorio) Ikäryhmä n keskiarvo minimi a maksimi positiivisia, kpl (> 100 µg/g) < 5 vuotta 10 (8 %) 83,8 5,0 351, vuotta 46 (38 %) 163,1 5,0 762,0 16 > 18 vuotta 65 (54 %) 200,5 5,0 2369,0 23 kaikki 121 (100 %) 176,6 5,0 2369,0 41 a HUSLAB laboratorion alin vastattava pitoisuus 5,0 µg/g Määritysmenetelmät Tässä tutkimuksessa valittiin kartoituksen perusteella testattaviksi kalprotektiinin määritysmenetelmiksi neljä eri valmistajan kaupallista ELISA-tekniikkaan perustuvaa analyysia. Testattavat menetelmät olivat Bühlmann Laboratorioes AG Calprotectin ELISA, CALPRO AS Calprolab Calprotectin ELISA, Immundiagnostik AG PhiCal Calprotectin ELISA ja Thermo Scientific EliA Calprotectin. Taulukkoon 2 on koottu eri määritysmenetelmien ominaisuuksia. 24