Tollin kaltaiset reseptorit lonkan totaaliproteesien septisessä ja aseptisessa irtoamisessa mahdollinen vaste vaarasignaaleihin?

Transkriptio

1 Tollin kaltaiset reseptorit lonkan totaaliproteesien septisessä ja aseptisessa irtoamisessa mahdollinen vaste vaarasignaaleihin? Jukka Pajarinen 1,2,3, Elisabetta Cenni 4, Lucia Savarino 4, Enrique Gomez-Barrena 5, Yasunobu Tamaki 6, Michiaki Takagi 6, Jari Salo 2, Yrjö T. Konttinen 1,7,8 1. Sisätautien osasto, Kliininen laitos, HY 2. Ortopedian ja traumatologian klinikka, Kliininen laitos, HY 3. Anatomian osasto, Biolääketieteenlaitos, HY 4. Laboratory for Pathophysiology of Orthopedic Implants, Istituti Ortopedici Rizzoli, Bologna, Italy 5. Bone and Joint Research Laboratory, Fundación Jiménez Díaz Hospital, Autónoma University of Madrid, Madrid, Spain 6. Department of Orthopaedic Surgery, Yamagata University School of Medicine, Yamagata, Japan 7. Sairaala ORTON 8. Tekonivelsairaala COXA Toll-like receptors (TLRs) recognize both endogenous necrotic cell-derived alarmins and exogenous microbe-derived pathogen-associate molecular patterns. These danger signals are crucial mediators in the activation of both innate and adaptive immunity. It was speculated that TLRs might play a role in aseptic and septic loosening of totally replaced hip prosthesis by recognizing their respective ligands. Bacterial culture-negative, aseptic (n=5) and culture-positive, septic (n=10) synovial-membrane-like interface tissues were compared to osteoarthritis synovial membrane (n=5) for the presence of various inflammatory cells stained with specific markers and two key TLRs, TLR-4 and -9, by immunohistochemical staining using specific antibodies. Both TLR-4 and -9 were expressed in aseptic and septic tissue samples and number of TLR positive cells was greatly increased when compared to osteoarthritic synovium. Interestingly, septic synovial membranes also contained neutrophil and lymphocyte infiltrates in addition to monocyte/ macrophage infiltrates, which dominated in foreign body synovitis in aseptic loosening. In contrast, in osteoarthritis TLR-positive cells were mainly found in vascular endothelium and synovial lining. It is concluded that in aseptic cases a straightforward wear debris-macrophage interaction predominates, perhaps related to a local release of intracellular alarmins upon cell death and tissue necrosis. In septic cases TLR-4 and -9 positive neutrophils and lymphocytes are recruited and engaged, probably by pathogen-associated molecular patterns and antigens, respectively. Thus the observed TLR histopathology might reflect the mode of prosthesis loosening and might be useful diagnostic tool in distinguishing aseptic from septic prosthesis loosening. 282 SOT Suomen Ortopedia ja Traumatologia Vol. 31

2 Johdanto Kaksi keskeisintä lonkan totaaliproteesin revisioleikkauksen aihetta ovat kulumapartikkeleiden aikaansaama aseptinen irtoaminen sekä proteesin infektoituminen (septinen irtoaminen), joista ensimmäisen esiintyvyyttä on yliarvioitu jälkimmäisen kustannuksella (1-3). Tärkein syy proteesi-infektioiden alidiagnostiikkaan vaikuttaisi olevan biofilmin muodostuminen proteesin pinnalle: vita minimaa erittämänsä ekstrasellulaari matriksin suojassa elävien bakteerien osoittaminen tavanomaisilla bakteeriviljelymenettelyillä on haasteellista (4). Poistetun proteesin sonikaation on osoitettu vähentävän vääriä negatiivisi viljelyitä, mutta siitä huolimatta merkittävä osa proteesi-infektioista ja kroonisista, osteolyysiin johtavista periproteettisista tulehduksista saatetaan yhä diagnosoida väärin aseptisiksi irtoamisiksi (5, 6). Nykykäsityksen mukaan sekä luonnollisen, että hankitun immuunijärjestelmän aktivaation aloittaa vaaran aistiminen itulinjaan koodatuilla kymmenellä eri Tollin kaltaisilla reseptoreilla (TLR) sekä muilla luonnollisen immuniteetin solujen ilmentämillä molekyylimuodontunnistusreseptoreilla (7-9). Endogeeniset alarmiinit (nekroottisten solujen vapauttama, kiteytymään pyrkivä uraatti) sekä eksogeeniset patogeeniin liittyvät molekyylimuodot (stafylokokkien soluseinän lipoteikohappo) ovat esimerkkejä näistä TLR:n tunnistamista vaarasignaaleista (10, 11). Näin myös periproteettisessa kudoksessa vapautuvat endotai eksogeeniset vaarasignaalit houkuttelevat paikalle runsaasti immuunijärjestelmän eri soluja. TLR:ien läsnäolo aseptisessa periproteettisessa kudoksessa on vastikään osoitettu ja bakteeriperäisten rakenteiden osuutta aseptisen irtoamisen patogeneesissä laajalti epäilty (12, 13). Nyt oletettiin, että TLR:iä on läsnä myös septisessä periproteettisessa kudoksessa, jossa ne todennäköisesti toimivat patogeenien tai nekroottisten solujen tunnistuksessa. Lisäksi oletettiin, että TLR postitiivisten solujen tarkempi profilointi solutyyppispesifisillä merkkiaineilla nivelrikkoisessa, aseptisessa ja septisessä nivelkalvossa antaisi vihjeen siitä, minkä tyyppisestä irtoamisesta on kyse. Menetelmät Potilaat ja näytteet Viisi nivelkalvon kaltaista kudosnäytettä kerättiin periproteettisesta kudoksesta lonkan totaaliproteesin aseptisen irtoamisen vuoksi suoritetussa revisioleikkauksesta. Bakteeri- ja sieniviljelyt olivat negatiivisia. Kymmenen nivelkalvon kaltaista kudosnäytettä kerättiin periproteettisesta kudoksesta lonkan totaaliproteesin septisen irtoamisen vuoksi suoritetussa revisioleikkauksesta. Viidessä tapauksessa viljelyssä kasvoi Staphylococcus epidermidis, neljässä Propionibacterium acnes ja yhdessä alfa hemolyyttinen streptokokki. Terveiksi kontrolleiksi kerättiin viisi nivelkalvon kudosnäytettä primaarisen nivelrikon vuoksi suoritetuista lonkan totaaliproteesi leikkauksesta. Immunohistopatologia Kudosnäytteet fiksoitiin 30 % formaliiniin, jonka jälkeen suoritettiin dehydraatio etanolissa, kirkastus ksyleenissä ja petaus parafiinissä. Näyteblokeista valmistettiin 5 µm leikkeitä, jotka deparafinisoitiin ja rehydroitiin. Antigeenit paljastettiin käyttäen 10 mm sitraattipuskuria, ph 6.0, Milostone Mega T/T mikroaaltouunissa, 98 C:ssa, 24 minuutin ajan. Solumarkkereiden varsinainen värjäys suoritettiin Tech- Mate Horizon värjäysrobotilla MSIP-protokollan mukaan kun taas TLR 4 ja TLR 9 värjättiin käsin; Ensin endogeeninen peroksidaasi salvattiin käyttäen 3% H2O2 ja epäspesifistä värjäytymistä vähennettiin inkubaatiolla 10% vuohen normaaliseerumissa. Primaari vasta-aineinkubaatio tehtiin yli yön 4 C ja sekundaarivasta-aine inkubaatio 1h huoneenlämmössä. Antigeeni-vasta-ainereaktio visualisoitiin käyttäen avidiini-biotiini-peroksidaasi-kompleksimetodia. Vastavärjäys tehtiin hematoksyleenillä. Jokaisen askelen välissä leikkeet pestiin fysiologisella keittosuolalla. Käyttämämme primaarivasta-aineet olivat: anti-cd3 (T-lymfosyytti) IgG 5 µg/ml, anti-cd20 (B-lymfosyytit) IgG2a 0.7 µg/ml, anti-cd68 (makrofagit) IgG µg/ml, anti-cd138 (plasmasolut) IgG µg/ml, anti-cd163 (makrofagit) IgG1 1:50, anti-neutrofiili elastaasi (neutrofiilit) IgG µg/ ml, anti-hsp47 (fibroblastit) IgG2b 1 µg/ml, anti- TLR 4 IgG 1.3 µg/ml ja anti-tlr 9 IgG 0.5 µg/ml. Vasta-aineista CD3, TLR4 ja TLR9 olivat jäniksen polyklonaalisia anti-humaaneja vasta-aineita, loput hiiren monoklonaalisia anti-humaaneja vasta-aineita. Värjäytyneiden solujen määrä arvioitiin asteikoilla: ei positiivisia soluja (-); satunnaisia positiivisia soluja (±); joitain positiivisia soluja (+); runsaasti positiivisia soluja (++) ja suuri määrä positiivisia soluja (+++). Suomen Ortopedia ja Traumatologia Vol SOT 283

3 Tulokset Nivelrikko Nivelrikkoisen nivelkalvon histologisessa tarkastelussa todettiin kudoksen olevan löyhää, hyvin verisuonitettua ja lievästi ödemistä sidekudosta, jossa HSP47 positiiviset fibroblastit olivat pääasiallinen solutyyppi. Myös yksittäisiä CD68 ja CD163 positiivisia monosyyti/makrofageja havaittiin. Joitain hajanaisia CD3 positiivisia T-lymfosyyttejä sekä pieniä CD20 positiivisia B-lymfosyytti joukkoja nähtiin, kun taas yhtään CD138 positiivista plasmasolua ei voitu varmuudella tunnistaa. Niin ikään neutrofiilit olivat harvassa ja enimmäkseen intravaskulaarisia (Taulukko 1). TLR immunovärjäytyvyys keskittyi verisuonten endoteeliin sekä nivelkalvon pintasolukkoon, joskin joitain yksittäisiä TLR positiivisia pyöreitä monosyytti/makrofagin kaltaisia soluja sekä pitkulaisia fibroblastinkaltaisia soluja havaittiin myös nivelkalvon stroomassa (Kuva 1, paneelit A ja B). Perättäisissä leikkeitä tarkastelemalla TLR 4 positiiviset solut todettiin pääsääntöisestä myös TLR 9 positiivisiksi (Taulukko 2). Aseptinen irtoaminen Aseptisen nivelkalvon kaltaisen interfaasikudoksen mikroskooppisessa tarkastelussa todettiin intensiivinen vierasesinereaktio. Suuria CD68 ja CD163 positiivisa monosyyti/makrofagi infitraatteja, vierasesinejättisoluja ja granulomia, sekä solunsisäisiä, fagosytoituja kulumapartikkeleita nähtiin runsaasti (Kuva 1, paneli C). Joitain hajanaisia CD3 postiviivisia T soluja sekä HSP47 positiivisa fibroblasteja nähtiin makrofagi ja Taulukko 1. Solumarkkerivärjäysten vertailu nivelrikon, aseptisen ja septisen nivelkalvon välillä. Huomaa nivelrikon nivelkalvon (OA) soluköyhyys, aseptisen nivelkalvon suuri makrofagiinfiltraatti ja septisen nivelkalvon suuri ja heterogeeninen tulehdussoluinfiltraatti. Gradeeraus: ei positiivisia soluja ei positiivisia soluja (-); satunnaisia positiivisa soluja (±); joitain positiivisa soluja (+); runsaasti positiivisia soluja (++) ja suuri määrä positiivisia soluja (+++). Solumarkkeri OA Aseptic Septic HSP NE CD CD CD 3 ± + ++ CD CD jättisolu infiltraattien seassa. Käytännössä kaikki nähdyt neutrofiilit olivat intravaskulaarisia ja CD20 positiiviset B solut sekä CD138 positiiviset plasmasolut olivat hyvin harvassa (Taulukko 1). TLR immunovärjäytyvyys oli hyvin intensiivistä ja oli keskittynyt monosyytti/makrofagi infiltraatteihin, jotka perättäisiä leikkeitä tarkastellessa todettiin sekä TLR 4, että TLR 9 positiivisiksi (Kuva 1, paneli D). Verisuonten endoteeli sekä nivelkalvon pintasolukko olivat nivelrikon tapaan TLR positiivisia (Taulukko 2). Taulukko 2. TLR 4 ja TLR 9 positiivisten solujen määrän ja lokalisaation vertailu nivelrikon, aseptisen ja septisen nivelkalvon välillä. Nivelrikkoisessa (OA) nivelkalvossa verisuonten endoteeli sekä nivelkalvon pintasolukko vastaavat suurimmasta osasta havaitusta TLR immunoreaktiivisuudesta kun taas aseptisessa ja septisessä nivelkalvossa TLR positiivisuus on keskittynyt eri tulehdussoluihin. Näissä kudoksessa myös endoteeli sekä kudoksen fibroblastit värjäytyvät voimakkaammin, heijastaen mahdollisesti tulehduksen indusoimaa TLR proteinien lisäsynteesiä. Gradeeraus: ei positiivisia soluja (-); satunnaisia positiivisa soluja (±); joitain positiivisa soluja (+); runsaasti positiivisia soluja (++) ja suuri määrä positiivisia soluja (+++). TLR 4 OA Aseptic Septic TLR 9 OA Aseptic Septic Endoteeli Endoteeli Fibroblastit Fibroblastit ± + ++ Neutrofiilit Neutrofiilit Makrofagit Makrofagit Lymfosyytit Lymfosyytit SOT Suomen Ortopedia ja Traumatologia Vol. 31

4 Kuva 1. Tollin kaltaiset reseptorit sekä nivelkalvon solut nivelrikossa sekä lonkan totaaliproteesien aseptisessa irtoamisessa. A- TLR 4 värjäys, nivelrikkoinen nivelkalvo. Nähdään lievästi tulehtunutta ja ödemistä löyhää sidekudosta. Jotkin fibroblastin-kaltaisista soluista (nuolenpäät) sekä monosyytti/makrofagin-kaltaisista soluista (nuolet) ovat TLR 4 positiivisia. Myös verisuonen endoteeli on TLR 4 positiivista. B- TLR 9 värjäys, nivelrikkoinen nivelkalvo. Verisuonten endoteelin sekä strooman fibroblastin- (nuolenpäät) ja monosyytti/makrofagin kaltaisten (nuolet) solujen lisäksi nivelkapselin pintasolukko on TLR positiivista. C- CD 68värjäys, aseptinen nivelkalvon kaltainen interfaasikudos. Nähdään massiivinen makrofagi-infilraatti sekä useita vierasesinejättisoluja (asteriskit). D- TLR 4 värjäys, aseptinen nivelkalvon kaltainen interfaasikudos. Tarkasteltaessa tätä paneli C:n rinnakkaisleikettä, todetaan, että CD68 positiiviset makrofagit ja jättisolut (asteriskit) ovat myös TLR 4 positiivisia. Immunohistokemiallinen värjäys, vastavärjäys hematoksyleenillä. Suurennos 400x. Lyhenteet: bv verisuoni, sl nivelkapselin pintasolukko. Kuva 2. Tollin kaltaiset reseptorit ja nivelkalvon solut lonkan totaaliproteesin infektoituneessa interfaasikudoksessa. A-I Immunohistokemiallisia värjäyksiä septisestä interfaasikudoksen, jota karakterisoi bakteeriviljely positiivisuus sekä löyhän sidekudoksen infiltroituminen erilaisilla tulehdussoluilla. A- CD163 värjäys. Huomaa CD163 positiiviset makrokrofagit (asteriskit) sekä prominentit lymfosyytti infiltraatit. B- TLR 4 värjäys. Tästä panelin A rinnakkaisleikkeestä nähdään, että CD163 positiiviset makrofagit ovat myös TLR 4 positiivisia (asteriskit) ja vastaavat suurimmasta osasta havaitusta TLR 4 immunoreaktiivisuutta tässä kudoksessa. Suurin osa lymfosyyteistä on TLR 4 negatiivisa. Joitain TLR 4 positiivisa fibroblasteja (nuolenpäät) voidaan nähdä. C- TLR 9 värjäys. Tämä paneelien A ja B rinnakkaisleike demonstroi että CD163 ja TLR 4 positiiviset makrofagit ovat myös TLR 9 positiivisa (asteriskit) kun taas lymfosyytit värjäytyvät myös TLR 9 suhteen hyvin heikosti. Fibrolastit ovat heikosti TLR 9 positiivisa (nuolenpäät). D- CD 3 värjäys. Lukuisten CD3 positiivisten lymfosyyttien diffuusi-infiltraatti (osa merkitty nuolilla), nähdään tässä näkökentässä. E- CD20 värjäys. Nodulaarisia, CD20 positiivisten B solujen joukkoja nähtiin diffuusien CD 3 positiivisten T solu kertymien läheisyydessä. F- CD 138 värjäys. Myös joitain CD138 positiivisa plasmasoluja (nuoli) voitiin havaita. G- TLR 4 värjäys. Satunnaisia granulomia nähtiin. Muutamia TLR 4 positiivisa epitelioidi makrofagaja on merkitty (asteriskit). H- TLR 4 värjäys. Laaja TLR 4 positiivisten neutrofiilien infiltraatio nekroottisen kudoksen ja soludebriksen joukossa. I- Negatiivinen värjäyskontrolli. Panelin G granuloman värjäys jäniksen normaali IgG:llä. Immunohistokemiallinen värjäys, vastavärjäys hematoksyleenillä. Suurennos 400x. Lyhenteet: ma - makrofagi infiltraatti, ly lymfosyytti infiltraatti, ne neutrofiili infiltraati, nt nekroottista kudosta. Suomen Ortopedia ja Traumatologia Vol SOT 285

5 Septinen irtoaminen Histologiset näytteet infektoituneista nivelkalvon kaltaisista interfaasikudoksista olivat edellä mainittuja monimuotoisempia. Suuria nekroottisia ja fibroottisia alueita todettiin joissain näytteissä, kun taas toiset näytteet koostuivat löyhästä sidekudoksesta, jossa nähtiin voimakas tulehdusreaktio sekä runsaasti erilaisia solupopulaatioita. Aseptisten näytteiden tapaan, suuria mutta alueittaisia CD68 ja CD163 positiivisia monosyytti/makrofagi infiltraatteja (Kuva 2, paneeli A) sekä satunnaisia vierasesinejättisoluja ja granulomia nähtiin (Kuva 2, paneli G), samoin solunsisäisiä kulumapartikkelikertymiä. Suuria neutrofiilikertymiä nähtiin nyt myös kudoksen stroomassa (Kuva 2, paneli H). Suuria määriä diffuusisti sijoittuneita CD3 positiivisia T soluja havaittiin (Kuva 2, paneli D), kuten myös nodulaarisia CD20 positiivisa B solu kertymiä (Kuva 2, paneeli E). Jotkut B soluista olivat aktivoituneet myös CD138 positiivisiksi plasmasoluiksi, joita nähtiin etenkin B solu kertymien yhteydessä (Taulukko 1; Kuva 2, paneli F). Intensiivinen TLR immunovärjäytyvyys nähtiin etenkin monosyytti/makrofagi kertymissä, mutta myös neutrofiileissä ja verisuonten endoteelissä. Tarkasteltaessa perättäisiä leikkeitä em. Solut vaikuttivat sekä TLR 4 että TLR 9 positiivisilta (Taulukko 2; Kuva 2, paneelit B, C, G ja H). Pohdinta Nivelrikkoisessa nivelkalvossa TLR:iä löytyi pääasiassa verisuonten endoteelistä ja nivelkapselin pintasolukosta. Lukuunottamatta näitä epiteliaalisia kudosksia, vain muutamia TLR positiivisia makrofagin tai fibroblastin kaltaisia soluja nähtiin nivelkalvon stroomassa. Tunnistettaessa ja torjuttaessa niveleen pyrkiviä patogeenejä ovat epiteliialiset kudokset luonnollisesti strategisesti kriittisissä paikoissa ja havaittu TLR profiili edustaakin todennäköisesti terveenkin nivelkalvon ensilinjan puolustusta hematogeenisiä tai intra-artikulaarisia patogeenejä vastaan. Koska TLR aktivaatio on olennaista sekä luonnollisen, että adaptiivisen immuniteetin käynnistymistä on näiden reseptoreiden runsas esiintyvyys epiteliaalisissa kudoksissa helppo ymmärtää. Aseptisessa nivelkalvossa yleisin solutyyppi oli TLR positiivinen monosyytti/makrofagi. Laajalti on hyväksytty, että totaaliproteesien aseptinen irtoaminen johtuu pääasiassa implantin liukupinnoilta (yleensä metalli-uhmw polyetyleeni) irtoavista kulumapartikkelista (14). Jokainen otettu askel johtaa yli 105 polyetyleeni partikkelin muodostumiseen (15). Kudokseen rekrytoidut makrofagit fagosytoivat näitä partikkeleita ja reagoivat huonosti sulavaan materiaan erittämällä monia tulehdusvälittyjäaineita, jotka puolestaan stimuloivat kudoksen stroman soluja (osteoblasteja, fibroblasteja) ilmentämään RANK ligandia, voimakasta osteoklastogeenista kasvutekijää, joka todennäköisesti on vastuussa aseptisen irtoamisen yhteydessä kudoksissa nähdystä kasvaneesta osteoklasti- ja jättisolumuodostuksesta sekä viimekädessä osetolyysistä (16, 17). Tämän partikkelitaudin lisäksi viimevuosina on pohdittu vähäoireisten bakteeri-infektioiden sekä proteesin tai kulumapartikkeleiden pintaan kiinnittyvien bakteerijäänteiden mahdollista osuutta tekonivelen irtoamisessa (13, 18, 19). Koska aseptisessa nivelkalvossa oli runsaasti TLR positiivisia makrofageja, se lienee hyvin reaktiivista kudosta näitä TLR ligandeja kohtaan. Eroksi aseptisesti irtoavasta implantista, septisessä nivelkalvossa oli runsaasti erilaisia valkosoluja myös lymfosyytti- ja neutrofiilikertymiä. Huomattava on, että neutrofiilit elävät kudoksissa vain 1-3 päivää (20). Siksi niiden läsnäolo periproteettisessa kudoksessa viittaa käynnissä olevaan bakteeri-infektioon ja uusien solujen jatkuvaan rekrytointiin nivelkalvoon. Riittävän suuria neutrofiilikertymiä onkin aiemmin pidetty septisen irtoamisen histopatologisena merkkinä (21). Tutkimustulostemme mukaan myös imusolukertymät voivat viitata bakteerien osuuteen irtoamisessa. Septisessä nivelkalvossa oli siis myös T- ja B-solukertymiä sekä vasta-aineita tuottavia plasmasoluja. Osa nähdyistä lymfosyyteistä edustanee pitkäikäisiä muistisoluja, jotka jäävät partioimaan nivelkalvoon ja ovat valmiita reagoimaan kroonisen infektion aktivoitumiseen. Lymfosyyttien läsnäolo viittaa myös siihen, että bakteerit eivät jakaudu eksponentiaalisesti vaan piilottelevat implantin pinnalle syntyneessä biofilmissä. Johtuen biofilmin bakteerien matalasta metabolisesta asteesta sekä monien molekyylien huonosta pääsystä matriksiin, ovat biofilmit hyvin resistenttejä sekä immuunijärjestelmää että antibiootteja vastaan ja ovat myös hankalia osoittaa tavanomaisella bakteeriviljelyllä (4). Johtopäätöksenä todetaan, että banaankärpäseltä perityvät Tollin kaltaiset reseptorit voivat antaa uuden työkalun tekonivelten irtoamisen diagnostiikkaan ja aseptisen ja septisen irtoamisen erotusdiagnostiikkaan. 286 SOT Suomen Ortopedia ja Traumatologia Vol. 31

6 Kiitos Kiitämme Bioanalyyttikko Eija Kailaa ja Erkki Hännistä teknisestä avusta. Ortopedian ja Traumatologian tutkimussäätiö, evo, Sigrid Juseliuksen säätiö, Finska Läkaresällskapet, Wilhelm och Else Stockmannin säätiö, Invalidisäätiö ja TEKES ovat rahoittaneet tutkimusta. Kirjallisuus: 1. Goodman SB: Wear particles, periprosthetic osteolysis and the immune system. Biomaterials. 2007;28: Goodman SB, Gómez Barrena E, Takagi M, Konttinen YT: Biocompatibility of total joint replacements: A review. J Biomed Mater Res A. Published Online First: 28 May doi: /jbm.a Nelson CL, McLaren AC, McLaren SG, Johnson JW, Smeltzer MS: Is aseptic loosening truly aseptic? Clin Orthop Relat Res. 2005;437: Dunne WM Jr: Bacterial adhesion: seen any good biofilms lately? Clin Microbiol Rev. 2002;15: Trampuz A, Piper KE, Jacobson MJ, Hanssen AD, Unni KK, Osmon DR, ym: Sonication of removed hip and knee prostheses for diagnosis of infection. N Engl J Med. 2007;357: Esteban J, Gomez-Barrena E, Cordero J, Martín-de- Hijas NZ, Kinnari TJ, Fernandez-Roblas R: Evaluation of quantitative analysis of cultures from sonicated retrieved orthopedic implants in diagnosis of orthopedic infection. J Clin Microbiol. 2008;46: Matzinger P: The danger model: a renewed sense of self. Science. 2002;296: Akira S, Uematsu S, Takeuchi O: Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 2006;124: Miyake K: Innate immune sensing of pathogens and danger signals by cell surface Toll-like receptors. Semin Immunol. 2007;19: Martinon F, Pétrilli V, Mayor A, Tardivel A, Tschopp J: Goutassociated uric acid crystals activate the NALP3 inflammasome. Nature. 2006;440: Bianchi ME: DAMPs, PAMPs and alarmins: all we need to know about danger. J Leukoc Biol. 2007;81: Takagi M, Tamaki Y, Hasegawa H, Takakubo Y, Konttinen L, Tiainen VM, ym: Toll-like receptors in the interface membrane around loosening total hip replacement implants. J Biomed Mater Res A. 2007;81: Nalepka JL, Lee MJ, Kraay MJ, Marcus RE, Goldberg VM, Chen X, ym: Lipopolysaccharide found in aseptic loosening of patients with inflammatory arthritis. Clin Orthop Relat Res. 2006;451: Holt G, Murnaghan C, Reilly J, Meek RM: The biology of aseptic osteolysis. Clin Orthop Relat Res. 2007;460: Shanbhag AS, Jacobs JJ, Glant TT, Gilbert JL, Black J, Galante JO: Composition and morphology of wear debris in failed uncemented total hip replacement. J Bone Joint Surg Br. 1994;76-B: Mandelin J, Li TF, Liljeström M, Kroon ME, Hanemaaijer R, Santavirta S, ym: Imbalance of RANKL/RANK/OPG system in interface tissue in loosening of total hip replacement. J Bone Joint Surg Br. 2003;85-B: Purdue PE, Koulouvaris P, Potter HG, Nestor BJ, Sculco TP: The cellular and molecular biology of periprosthetic osteolysis. Clin Orthop Relat Res. 2007;454: Ragab AA, Van De Motter R, Lavish SA, Goldberg VM, Ninomiya JT, Carlin CR, ym: Measurement and removal of adherent endotoxin from titanium particles and implant surfaces. J Orthop Res. 1999;17: Greenfield EM, Bi Y, Ragab AA, Goldberg VM, Nalepka JL, Seabold JM: Does endotoxin contribute to aseptic loosening of orthopedic implants? J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2005;72: Bainton DF: Neutrophil granules. Brit J Haematol. 1975;29: Athanasou NA, Pandey R, de Steiger R, Crook D, Smith PM: Diagnosis of infection by frozen section during revision arthroplasty. J Bone Joint Surg Br. 1995;77-B: Suomen Ortopedia ja Traumatologia Vol SOT 287