Enemmän selektiivisyyttä kromatografia-analytiikkaan. Liisa Kanner Waters Corporation 1

Transkriptio

1 UPC 2 UltraPerformance Convergence Chromatography Enemmän selektiivisyyttä kromatografia-analytiikkaan Liisa Kanner 2012 Waters Corporation 1

2 Erilaiset erotustekniikat Gas Chromatography Liquid Chromatography Convergence Chromatography GC HPLC SFC Capillary GC UPLC UPC Waters Corporation 2

3 UltraPerformance Convergence Chromatography Convergence Chromatography on kromatografinen erotustekniikka, joka on vaihtoehtoinen neste- tai kaasukromatografialle. UltraPerformance Convergence Chromatography [UPC 2 ] Alusta asti uudelleen suunniteltu kromatografialaitteisto, jossa eluenttina käytetään hiilidioksidia,co 2. Erotuksen selektiivisyys vastaa normaalifaasierotusta, mutta sopii erinomaisesti myös käänteisfaasitekniikaksi. ACQUITY UPC 2 Laite perustuu UPLC tekniikkaan ja mahdollistaa haastavimmatkin erotukset luotettavasti ja nopeasti Waters Corporation 3

4 Why The Name? Giddings, J.C. (1965) A critical evaluation of the theory of gas chromatography. In Gas Chromatography. 1964, edited by A. Goldup, p Elsevier, Amsterdam In this article Dr. Giddings stated One of the most interesting features of ultra high pressure gas chromatography would be convergence with classical liquid chromatography. Prof. Calvin Giddings ( ) 2012 Waters Corporation 4

5 Näytteenkäsittely Useimmiten näytteenkäsittely koetaan hankalaksi ja kalliiksi ja siitä haluttaisiin päästä niin vähällä kuin mahdollista. Useimmissa näytteenkäsittely prosesseissa päädytään orgaaniseen liuottimeen. neste/neste, Soxhlet, tislaus, haihdutus ja uudelleen liuotus Useat matriisit vaativat orgaanisen liuottimen (geelit, rasvat, öljyt, synteeseissä käytetyt liuottimet) solvents, etc.) image from dyapharma.com image from sefetec.net image from tasnee.com 2012 Waters Corporation 5

6 Näytteeenkäsittely Drying Grinding SFE Soxhlet Extraction Evaporation SPE Distillation Macro Micro Liquid / Liquid 2012 Waters Corporation 6

7 UPC2 Gas Chromatography pyrethroids Convergence Chromatography Reversed-phase LC carbamates STEP 1 SPE Extraction (Florisil) SPE Extraction (Oasis HLB) STEP 2 Elution in hexane/ethyl acetate Direct Analysis on UPC 2 Elution in methanol STEP 3 STEP 4 STEP 5 STEP 6 Evaporate to dryness Reconstitute in cyclohexane Derivatize sample Ready for analysis Convergence Chromatography Eliminate lengthy evaporation and reconstitution steps No need for derivatization Evaporate to dryness Reconstitute in water Ready for analysis 2012 Waters Corporation 7

8 Kromatografiset erotustekniikat Erotus saadaan aikaa lämpötilagradientilla Gas Chromatography GC Hyvä tehokkuus [N] Käytännössä ei ole rajoituksia kolonnin pituuden suhteen Rajoittunut selektiivisyys[α] Vähän vaihtoehtoja stationäärifaasiksi Liquid Chromatography LC Erotus saadaan aikaan liuotingradientilla Hyvä tehokkuus[n] Paine rajoittavana tekijänä Suhteellisen hyvä selektiivisyys [α] Paljon erilaisia muotoja ja stationäärifaaseja: RP, NP, SEC, IEX, affiniteetti, ionipari, HILIC, GPC etc. CC Erotus saadaan aikaan liuotingradientilla Hyvä tehokkuus[n] Eluentin CO2 alhainen viskositeetti mahdollistaa pidemmät kolonnit ja pienemmät partikkelit Convergence Chromatography Hyvä selektiivisyys[α] Paljon erilaisia stationäärifaaseja ja liuotinvaihtoehtoja eluentiksi 2012 Waters Corporation 8

9 Kaasukromatografian kehitys GC Capillary GC Sen jälkeen kun kapillaarikolonnit otettiin käyttöön luvulla, on vain vähä tapahtunut GC maailmassa. Gas Chromatography *2 *3 *1 Vain vähän kehitystä GC-tekniikassa viimeisen 30 vuoden aikana 2012 Waters Corporation *1: image from Restek.com *2: image from teaching.shu.ac.uk *3: image from soils.org 9

10 Nestekromatografian kehitys LC UltraPerformance LC [UPLC] Siirtyminen UPLC-tekniikkaan 2004 on muuttanut nestekromatografian suorituskykyä huomattavasti, parantaen resoluutiota, herkkyyttä ja nopeutta Liquid Chromatography ACQUITY UPLC I-Class laitteisto LC erotuksen tehokkuutta (N) on parannettu pienentämällä laitteistojen tilavuutta ja kolonnien partikkelikokoa Plates/meter 500, , , , , , , , ,000 50, % more efficiency than 3.5 µm 70% more efficiency than 1.7 µm 30,000 psi 18,000 psi 130,000 psi 5 µm 3.5 µm 1.7 µm 1.4 µm 1.0 µm Particle Size 2012 Waters Corporation 10

11 SFC:n kehitys SFC UltraPerformance Convergence Chromatography Convergence Chromatography UltraPerformance Convergence Chromatography on SFC laitteiston ja kolonnien kehityksen tulos Waters Corporation Data courtesy of Davy Guillarme, Jean-Luc Veuthey LCAP, University of Geneva, Switzerland 11

12 UPC 2 :n sovellettavuus Nopeat kiraaliset erotukset AU UPC² 0.3 min Nopeat kiraaliset erotukset Koko analyysi prosessi on nopeampi Eluenttien valmistukseen ja näytteenkäsittelyyn kuluva aika on lyhyempi Kolonnien käyttöikä on pidempi Eluenttien kulutus on vähäisempää ja käytettävät eluentit ovat edullisempia Minutes NPLC 11 min A U Minutes Kannattaa siirtyä UPC 2 tekniikkaaan Tulokset vähintään yhtä hyviä kuin perinteisellä NP kromatografialla Analyysiaiaka 1/30 Eluenttien kulutus 1/ µl MeOH vs 10 ml heksaani/etanoli 2012 Waters Corporation 12

13 UPC 2 :n sovellettavuus Korvaa normaalifaasi tekniikan Kun normaalifaasiteknologia korvataan UPC 2 :llä Eluenttien valmistukseen ja näytteenkäsittelyyn kuluu vähemmän aikaa Kolonnien käyttöikä pitenee Eluentikustannukset ovat huomattavasti alhaisemmat ACQUITY UPC² 15 min Cost per run ~ $0.05 Kannattaa siirtyä UPC 2 tekniikkaaan Tulokset vähintään yhtä hyvät Analyysiaika vähnenee ainakin 3:s osaan Kustannukset per analyysi 5.89 $:sta, 5 senttiin Normal Phase HPLC 50 min Cost per run ~ $ AU Minutes 2012 Waters Corporation 13

14 UPC 2 :n monipuoliset käyttömahdollisuudet Non-ionic surfactants Kemianteollisuus A B C D E F G H I Lääkeaineanalytiikka, epäpuhatusmääritykset Paracetamol and impurities 4-hydroxyacetophenone p-nitrophenol 2-hydroxyacetophenone 4-chloroacetanilide acetanilide phenacetin 3-aminophenol paracetamol 2-aminophenol Chiral pesticides Permethrin Ympäristöanalytiikka Elitarvikeanalytiikka Vitamin E isomers 2012 Waters Corporation 14

15 Perustuu UPLC tekniikkaaan Huomattava lisäys selektiivisyyteen kromatografiassa 2012 Waters Corporation 15

16 UPC 2 UPC 2 teknologiassa voidaan hyödyntää kaikkia normaalifaasin selektiivisyys ominaisuuksia Ortogonaalinen käänteisfaasikromatografialle Pääasiallinen eluentti CO 2, ei juurikaan tarvita normaalifaasianalytiikassa käytettäviä haitallisia eluentteja. UPC 2 soveltuu monille yhdistetyypeille 80-85% käänteisfaasilla erotettavista yhdisteistä voidaan erottaa myös UPC 2 :lla Jos yhdiste liukenee orgaanisenn liuottimeen, se sopii analysoitavaksi UPC 2 :lla Useimmat orgaaniset suolat Vahvat orgaaniset hapot ja emäkset Pienet rasvaliukoiset peptidit Poolittomat (esim., vahat ja öljyt ) Sopii erinomaisesti isomeerien stereoisomeerien diastereomeerien ja kiraalisten yhdisteiden erotukseen. Detektoreiksi sopivat: UV, PDA, ELSD, CD, MS, FID 2012 Waters Corporation 16

17 Mitä on superkriittinen neste? Neste/kaasu Lisätään lämpötilaa ja painetta Kriittinen piste Lisätään lämpötilaa ja painetta Superkriitinen neste Korkea diffuusio ja alhainen viskositeetti josta seurauksena nopea ja tehokas kromatografia 2012 Waters Corporation 17

18 UPC 2 tekniikan periaatteet HPLC:n kaltainen erotustekniikka Normaalisti nestekromatogrfaiassa käytettävä heikko eluentti (vesi) on korvattu hiilidioksidilla CO 2 Eluenttina on superkriittinen neste + yksi tai useampia eluenttipareja CO 2 on yleisin superkriittinen eluentti Metanoli on yleisin eluenttipari Erotus on normaalifaasikromatografia kaltainen Substance Critical Temp o C Critical Pressure (bar) Comments Carbon Dioxide Physical state easily changed Water Extreme conditions needed Methanol Extreme temperature needed Ammonia Highly corrosive Freon Environmentally unfriendly Nitrous Oxide Oxidizing agent 2012 Waters Corporation 18

19 Liuottimien valinta Supercritical CO 2 Heikko Vahva Normaali faasi Solvent Pentane, Hexane, Heptane Solvent Strength Eluotropic Value [E o ] Polarity [P ] Xylene Toluene Diethyl ether Dichloromethane Chloroform Acetone Dioxane THF MTBE Ethyl acetate DMSO Acetonitrile Isopropanol Ethanol Methanol Water 10.2 Superkriittinen CO 2, jota käytetään UPC:ssä liukenee kaikkiin eluotrooppisen sarjan liuottimiin, minkä takia on mahdollista käyttää laajaa joukkoa erilaisen selektiivisyyden omaavia eluentteja Normaalifaasi UPC 2 Käänteisfaasi 2012 Waters Corporation 19

20 Stationäärfaasi Selektiivisyys vaihtoehdot Stationary Phase Choices Silica / BEH 2-ethylpyridine Cyano Aminopropyl Diol Normaalifaasi UPC 2 UUPC 2 kromatografia hyödyntää sekä normaali, että käänteisfaasi kromatografian kolonnikemioita, jolloin on käytettävissä laaja selektiivisyysalue Amide PFP Phenyl Käänteisfaasi C 18 < C Waters Corporation 20

21 Selektiivisyytenn vaikuttavat työkalut RP ja NP kromatografiassa Eluentti Pentane, Hexane, Heptane Xylene Toluene Diethyl ether Dichloromethane Chloroform Acetone Dioxane THF MTBE Ethyl acetate DMSO Acetonitrile Isopropanol Ethanol Methanol Normaalifaasi Huomioitava eri liuottimiem mahdollinen liukenemattomuus toisiinsa Käänteisfaasi Kiinteäfaaasi Silica / BEH 2-ethylpyridine Cyano Aminopropyl Diol Amide PFP Phenyl C 18 < C Waters Corporation 21

22 Selektiivisyyten vaikuttavat työkalut UPC 2 kromatografiassa Eluentit Pentane, Hexane, Heptane Xylene Toluene Diethyl ether Dichloromethane Chloroform Acetone Dioxane THF MTBE Ethyl acetate DMSO Acetonitrile Isopropanol Ethanol Methanol UPC 2 Melkein kaikki nestekromatorafiassa käytetttävät liuottimet ja kolonnifaasit Kiinteäfaasi Silica / BEH 2-ethylpyridine Cyano Aminopropyl Diol Amide PFP Phenyl C 18 < C Waters Corporation 22

23 Selektiivisyyten vaikuttavat työkalut UPC 2 kromatografiassa Eluentti Pentane, Hexane, Heptane Xylene Toluene Diethyl ether Dichloromethane Superkriittinen CO 2 Heikko Kiinteäfaasi Silica / BEH 2-ethylpyridine Cyano Chloroform Acetone UPC 2 Aminopropyl Dioxane THF MTBE Ethyl acetate DMSO Acetonitrile Isopropanol Vahva Melkein kaikki nestekromatorafiassa käytetttävät liuottimet ja kolonnifaasit Diol Amide PFP Phenyl Ethanol Methanol Orgaaninen liuotin C 18 < C Waters Corporation 23

24 ACQUITY UPC 2 laitteisto: Enemmän selektiivisyyttä : CSH PFP ACQUITY UPC 2 CSH Fluoro-Phenyl 1.7 µm B C API A U A D (1,2) E F G H : HSS C18 SB ACQUITY UPC 2 HSS C 18 SB 1.7 µm A U A B C D F G E H API A U : BEH HILIC ACQUITY UPC 2 Hybrid 1.7 µm A B C D G E API F* H A U : 2-EP ACQUITY UPC 2 Hybrid 2-EP 1.7 µm A B C G D E API H F Minutes 2012 Waters Corporation 24

25 UPC 2 kromatografia: Lisää selektiivisyyttä haastaviin erotuksiin Superkriitinen CO 2 Heikko Stationary Phase Silica / BEH Rasvaliukoiset vitamiinit 2-ethylpyridine Cyano % Orgaaninen Aminopropyl Diol Amide PFP Orgaaninen liuotin Vahva Phenyl C 18 < C Waters Corporation 25

26 UPC 2 kromatografia: Rasvaliukoiset vitamiinit 1.04 α-tocopherol Vitamin E isomers ACQUITY UPC 2 BEH Analyysiaika nopeampi verrattuna käänteis- ja normaalifaasierotuksin UPC 2 sopii hyvin erilaislle valmisteille AU γ-tocopherol o Öljypohjaisille, jauhoille ja tableteille δ-tocopherol Näyte voidaan injektoida suoraan uutttoliuoksessa 0.26 β-tocopherol Minutes AU Vitamin A acetate Vitamin A palmitate ACQUITY UPC 2 HSS C 18 SB retinol AU 0.50 trans-vitamin A palmitate AU ACQUITY UPC 2 HSS C 18 SB Vitamin D3 cholecalciferol Minutes Waters Corporation Minutes Minutes cis-vitamin A palmitate Vitamin D3 cholecalciferol

27 UPC 2 kromatografia: Lisää selektiivisyyttä haastaviin erotuksiin Superkriittine n CO 2 Heikko Kiinteäfaasi Silica / BEH 2-ethylpyridine Cyano % Orgaaninen Lipidit Aminopropyl Diol Amide PFP Orgaaninen liuotin Vahva Phenyl C 18 < C Waters Corporation 27

28 UPC 2 kromatografia: Pooliset ja neutraalit lipidit Neutraalit ja pooliset lipidit UPC 2 :lla voidaan yhdellä menetelemällä erottaa eri lipidiryhmiä, kun GC.llä ja RPLC.llä voidaan erottaa vain yksi ryhmä kerrellaan Hyvä erotuskyky sekä ryhmien välille, että piikeille ryhmän sisällä Selektiivinen monille biologisille uutteille PC TAG PE SM LPC TAG: Triacylglycerides PE: Phosphotidylethanolamine PC: Phosphotidylcholine SM: Sphynogomyelin LPC: Lysophosphotidylcholine 2012 Waters Corporation 28

29 UPC 2 kromatografia: Neutraalit lipidit ESI- FFA TAG mix ESI+ CE mix All mix 2012 Waters Corporation 29

30 Lisää selektiivisyyttä haastaviin erotuksiin luonnontuotteiden analyyseissä Superkriittinen CO 2 heikko Kiinteäfaasi Silica / BEH 2-ethylpyridine Cyano % Orgaaninen Luonnontuotteet Aminopropyl Diol Amide PFP Orgaaninen liuotin Vahva Phenyl C 18 < C Waters Corporation 30

31 UPC 2 kromatografia: Luonnontuotteet Anthemis nobilis (kamomilla) Kamomilla Luonnontuotteiden määritys on erityisen hankalaa johtuen näytteiden monimutkaisuudesta Usein tarvitaan ortogonaalinen erotus, jotta voidaan varmistaa näytteen karakterisointi Näytteiden uuttoliuokset on injektoitavissa sellaisenaan UPC 2 kolonniin AU apigenin-7-o-glucoside 2. chamaemeloside 3. apigenin Minutes 2012 Waters Corporation 31

32 UPC 2 kromatografia: Luonnontuotteet 1.6x x10 6 UPC 2 MS tekniikalla analysoitu käyttäen sekä LC että SFC tekniikkaa Intensity 8.0x10 5 * XIC of m/z=475 UPC 2 tekniikalla löytyi uusi isobaarinen komponentti 4.0x Minutes UPLC joka puuttuu UPLC-RP kromatogrammista Intensity Waters Corporation 32 Minutes

33 Binolin kiraalinen erotus 0.06 NPLC Rs=1.67 AU Experimental Conditions AU UPC 2 Rs= Minutes 2012 Waters Corporation 33

34 Edut kiraalisessa UPC² erotuksessa BINOLin enantiomeerien erotus alle 2:n minuutin Waters ACQUITY UPC² laitteistolla UPC² on 9 kertaa nopeampi kuin NPLC Ympäristön kannalta parempi vaihtoehto Ei tarvita heksaania Paljon pienemmät analyysikustannukset $2.85/analyysi NPLC :llä vs. $0.08/analyysi for UPC²:lla o Nopeampi o CO 2 ja metanoli ovat halpoja liuottimia 2012 Waters Corporation 34

35 Pienet partikkelit kiraalisissa erotuksissa AU Warfarin UPC² IB3 ( mm, 3 µm) 15% methanol 3 ml/min 120 bar Total analysis time: 18 s Minutes Perustuu ACQUITY laitteistoon UPC² systeemin tilavuus on n. 66 µl UPC² systeemin dispersio on n. 25 µl 2 ml/min virtauksella o ACQUITY UPLC : dispersio on n.16 µl o Alliance :n dispersio on 40 µl Pienempi dispersio UPC²:lla vähentää vyöhykkeen leviämistä AU 0.30 NPLC AD-H ( mm, 5 µm) 70/30 hexane/ethanol 1 ml/min Nopeampi erotus vähentää kustannuksia huomattavasti Minutes 2012 Waters Corporation 35

36 Enantiomeeri-epäpuhtaudenepäpuhtauden määritys UPC²:lla AU 0.20 R S R S =7.28 O OH (R) O OH (S) Minutes O Benzyl Mandelate O AU R S Minutes Analyte Benzyl mandelate Isomer R- S- Retention t R (min) Std. Dev % RSD Peak area Peak area (µv*sec) Std. Dev % RSD Waters Corporation 36

37 Parempi kvantitointi R- ja S-benzyl mandelaatin enantiomeerit n. 1,5 minuutissa Waters ACQUITY UPC² laitteistolla Erinomainen toistettavuus < 0.23% RSD retentiolle < 0.5% RSD piikin pinta-alalle Parempi detektointi herkkyys mahdollistaa 0.02 prosenttisen enantiomeeri epäpuhtauden määrityksen Parempi pumppu Laite suunniteltu siten, että paineenvaihtelu on melkein olematon Detektorissa hyvä lämpötilakontrolli o Vähemmän altis ympäristön lämpötilan muutoksille Injektioventtiili erikoisesti UPC²:een suunniteltu, koska pulssin oltava mahdollisimman pieni 2012 Waters Corporation 37

38 R, S-methamfetamiinien erotus UPC 2 menetelmällä Kiraalinen erotus 5:ssä minuutissa Rs= Huomattavasti nopeampi kuin GC tai CE A U Minutes Optimoitu metamfetamiinin UPC 2 ckromatogrammi 1: S-MA 2: R-MA 2012 Waters Corporation 38

39 Methamfetamiinin ja sen lähtöaineiden erotus AU R/S enentiomeerisuhde antaa arvokasta tietoa metamfetamiinin lähtöaineista, maantieteellisestä alkuperästä sekä valmistuksen tasosta. R, S-enantiomeerien ja kahden yleisen lähtöaineen erotus 6:ssa minuutissa Minutes UPC 2 UV kromatogrammi 1: S-MA 2: R-MA 3: (1S,2S)-pseudoephedrine 4: (1R, 2S)-ephedrine Waters Corporation 39

40 UPC 2 Sovelluksia Pharmaceutical Food/Env Chemical Materials Clinical Chiral drugs Transfer from USP methods Fat-soluble vitamins Lipid analysis Achiral impurity analysis Chiral pesticides Explosives OLEDs Azo dyes Non-ionic surfactants Polymer additives Drugs of abuse Vitamin D metabolites Carotenoids Positional isomers Steroids Extractables and leachables Reaction monitoring Library screening DMPK/Bioanalysis Natural products Metabolomics Glycerides PAH Lubricants Steroids 2012 Waters Corporation 40

41 ACQUITY UPC² System 2012 Waters Corporation 41

42 Yhteenvetona ACQUITY UPC 2 teknologia käyttää kompressoitua hiilidioksidia (CO 2 ) pääasiallisena eluenttina ja sopii hyvin sekä rutiini, että monimutkaisempiin analyyseihin, etenkin näytteisiin jonka komponentit edustavat laajaa poolisuusaluetta. UPC 2 tarjoaa erinomaisen työkalun perinteisten LC ja GC tekniikoiden tilalle/rinnalle UPC 2 tekniikka perustuu luotettavaan UPLC teknologiaan. UPC 2 tarjoaa poikkeuksellisen paljon mahdollisuuksia selektiivisyyden lisäämiseksi ja näin ollen se soveltuu monille erilaiselle yhdistetyypeille 80-85% yhdisteistä, joita analysoisaan RPLC tekniikalla voidaan analysoida UPC 2 -tekniikalla Mikä tahansa yhdiste, joka liukenee orgaaniseen liuottimeen sopii analysoitavaksi UPC 2 -tekniikalla Waters Corporation 42

43 ACQUITY UPC 2 System 2012 Waters Corporation 43