Syvien biosfäärien geomikrobiologia - Molekyylibiologiset monitorointimenetelmät, GEOMOL

Koko: px

Aloita esitys sivulta:

Download "Syvien biosfäärien geomikrobiologia - Molekyylibiologiset monitorointimenetelmät, GEOMOL"

Mauno Rantanen
8 vuotta sitten
Katselukertoja:

1 Syvien biosfäärien geomikrobiologia - Molekyylibiologiset monitorointimenetelmät, GEOMOL KYT seminaari Merja Itävaara

2 Projektin tausta Miksi geomikrobiologiaa tutkitaan? Loppusijoitusalueen hydrogeokemiallinen ja mikrobiologinen karakterisointi 1996 lähtien (P. Pitkänen, K. Pedersen, ) everything is everywhere mikrobeja on löytynyt kaikista tutkituista kohteista solua/ml Mikrobit voi liuottaa tai saostaa mineraaleja Hajottaa orgaanista ainesta (loppusijoitustilan) Muodostaa kaasuja Biokorroosiota 2

3 Mikrobilajistojen tunnistaminen mitä mikrobit tekee? Mikrobiekologia tutkii mikrobien ja ympäristön vuorovaikutusta 99% mikrobeista tuntemattomia, eivät kasva ravintoalustoilla 3

4 GEOMOL projektin tavoitteet Kehittää näytteenottotekniikoita molekyylimikrobiologisiin tutkimuksiin molekyylibiologisia monitorointimenetelmiä geomikrobiologisten prosessien tutkimiseen biokorroosiota aiheuttavien mikrobien tutkimusmenetelmiä Tuottaa tietoa ydinjätteiden loppusijoituksen riskinarviointiin ja mallintamisen tueksi 4

geomikrobiologisten prosessien tutkimiseen biokorroosiota aiheuttavien mikrobien

5 BIOGEOkemia syvällä kallioperässä VTT/BEL- Molekyylibiologia, biokemialliset prosessit GTK - Näytteenotto, redoxprosessit Redox -reaktiot O 2 - NO 3 Mn 4+ Fe SO 4 CO 2 Kaasut H 2, C0 2, CH 4 Ravinteet Mikrobiryhmät Mikrobireaktiot aerobiset bakteerit anaerobiset bakteerit mangaanin pelkistäjät raudan pelkistajät sulfaatin pelkistäjät metanogeenit Molekyylibiologiset menetelmät Mikrobilajisto analyysit Toiminnalliset geenit Kvantitatiivinen analyysi Edustava näyte Mikrobit vedessä ja pinnoilla Mikrobireaktiot mallinnukseen Kallio-pohjavesisysteemin biokemiallisten prosessien laatu, laajuus ja merkitys 5

raudan pelkistajät sulfaatin pelkistäjät metanogeenit Molekyylibiologiset menetelmät Mikrobilajisto analyysit Toiminnalliset geenit Kvantitatiivinen

6 FYLOGENETIIKKA Tutkii eri organismien välisiä sukulaisuussuhteita eukaryootti (eukaryote) =Aitotumallinen prokaryootti (prokaryote)= Esitumallinen 6

7 Mikrobien tunnistaminen molekyylibiologisin menetelmin Ympäristönäyte Solujen rikkominen Wellplate Microarray Platform 96-well microplate Proteiinien, humuksen poistaminen PCR-DGGE Kokonais DNA tai RNA Mikrosiru Geeni fragmentit PCR (polymeraasi ketjureaktio) Kloonikirjastot Fylogeneetti nen puu Sekvenointi Geenipankit 7

humuksen poistaminen PCR-DGGE Kokonais DNA tai RNA Mikrosiru Geeni fragmentit

8 SRB mikrobit sulfaatinpelkistäjät kuparin biokorroosiossa merkittävin mikrobiryhmä Anaerobinen uraanin pelkistyminen tai hapettuminen (Desulfovibrio sp.) U (VI) U (IV) soluble Anaerobinen oksidaatio ja orgaanisen aineksen biohajoaminen (Desultomaculatum sp.) Anaerobinen metaanin hapettaminen CH 4 + S0 2-4 HS - + HCO H 2 0 Autotrooffisia lajeja, jotka fiksoivat C0 2 acetaatti + SO H + 2CO 2 + H 2 S + 2H 2 O 8

) U (VI) U (IV) soluble Anaerobinen oksidaatio ja orgaanisen aineksen biohajoaminen (Desultomaculatum sp.

9 Toiminnalliset geenit syväreikätutkimuksissa Geenit säätelevät toimintoja esim. sulfaatinpelkistyminen, metaanin muodostuminen, typen fiksaatio, biohajoaminen GEENIT mrna rrna entsyymejä TOIMINTA Sulfiittireduktaasi geeni (dsrab)= sulfaatinpelkistymisessä Metanogeenien toiminta (mcra geeni) 9

biohajoaminen GEENIT mrna rrna entsyymejä TOIMINTA Sulfiittireduktaasi

10 Sulfaatin pelkistäjien tunnistaminen toiminnallisen geenin kautta 2[H] Sulfate + ATP ATP-Sulfurylase PPI Adenosine-5 - Phosphosulfate APS-Reductase AMP Sulfite Dissimilatory Sulfite Reductase Sulfide Design of specific primers for a 1.9 kb dsrab fragment 10

Phosphosulfate APS-Reductase AMP Sulfite Dissimilatory Sulfite

11 Tutkimuskohteet Tuloksia: PALMOTTU: 1. Palmottu Nummi-Pusula -Useita näytteenottoja -Näytteenoton kehittäminen -uraania pelkistäviä mikrobeja - Paljon sulfaatin pelkistäjiä -Aerobiset olosuhteet -Geokemia muuttunut 2. Olkiluoto; -Onkalo, -Kenttänäytteet; 170m-500 m, PAVE 3. Outokumpu: syväkairareikä 2.5 km - 2 näytteenottoja; 2007, OUTOI 16S sekvenointi, 16S kloonikirjastot, dsrb- DGGE -OUTOII Olkiluoto lajisto: -Laaja diversiteetti (16S kloonikirjastot tehty) - Pieni pitoisuus sulf. Pelkistäjiä (Geofunc) (- Metagenomiikka, totaalisekvenointi) 11

-Aerobiset olosuhteet -Geokemia muuttunut 2. Olkiluoto; -Onkalo, -Kenttänäytteet; 170m-500 m, PAVE 3. Outokumpu: syväkairareikä 2.

12 OUTOKUMPU SYVÄREIKÄ TUTKIMUS/ MIKROBIOLOGISET tutkimukset 2.5 km syvyys - näytteenotto km - näytteenotto km Näytteenotossa: 8 tutkijaa 2-3 vrk:tta 12

13 GTK:n ja VTT:n tutkijat Outokummussa elokuussa

14 Outokumpu II Epifluoresenssimikroskooppikuva Elävyysvärjäys 14

15 15

16 Outo II (elok. 2008), Outokumpu syväkairareikä m 16

17 m Deep borehole Outokumpu II näytteenotto 2008, SEM skanning elektronimikroskooppikuvat 2350 m 17

18 TEM, transmissio elektronimikroskooppikuva 2 km 350 m, Outokumpu 18

19 Mikrobitiheys n solua/ml Outokumpu tuloksia Suurin osa mikrobeista kuolleita: elävyysvärjäys, SEM DNA eristyksessä tulee hyvin vähän DNA:ta, RNA:ta ei tehty, koska solut kuolleita Fylogeneettinen vertailu osoitti että Outo I ja OUTO II näytteenottokerroilla saatiin samankaltaiset päälajistot 16Skloonikirjastot: eri syvyydessä lajisto vaihtelee selvästi Hydrogenofaga sp, syvällä Clostridium sp lajeja ja sulfaatinpelkistäjiä päälajeina Sulfaatinpelkistäjiä syvällä enemmän Jatkoa Biotekniikan Instituutissa 454 supersekvenaattori, lajisto info 7 syvyydeltä Outo II näytteestä Sulfaatinpelkistäjien diversiteetti dsrb-dgge 19

solut kuolleita Fylogeneettinen vertailu osoitti että Outo I ja OUTO II näytteenottokerroilla saatiin samankaltaiset päälajistot 16Skloonikirjastot: eri

20 OUTOI OUTOII Amplikonisekvensointiin: OUTOII m m m m m m m Päämikrobilajiston profiilit PCR- DGGE menetelmällä 20

21 Olkiluoto tuloksia PAVE näytteenottimen steriloinnin tehokkuutta selvitetty DNA näytteiden kannalta Elävyysvärjäykset n. puolet kuolleita, joissakin näytteissä enemmän Sulfaatinpelkistäjiä kaikissa näytteissä, määrät vähäiset, eri lajeja eri näytteissä Onkalossa: Desulfovibrio sp., Desulfobacter, Desulfobulbus sp., Synthrophobacter sp., OL-KR8: Desulfobacterium autorophicum, Desulfomicrobium sp., Desulfobulbus sp. OL-KR42 Desulfobulbus sp. eri lajeja Jatkossa tehdään 2 näytteen totaalisekvenointi Biotekniikan Instituutissa Tavoitteena on sekvenssianalyysien valossa myös verrata Olkiluodon eri kairareikien mikrobilajistoa. 21

22 Koko projektin aikataulu Projektin yleistavoitteiden mukainen aikataulu esitetty vuosittaisena viiden vuoden kokonaisuutena State of the Art Sekvenssitieto, geenipankit Syvän biosfäärin mikrobigeenien kloonaus, erityisesti korrodoivat 4. Sekvenssitiedon tutkiminen, uusien alukkeiden suunnittelu syvän biosfäärin mikrobien tunnistamiseen:srb, metanogeenit Geomikrobisto, redox ja geokemia; DGGE, kvantitatiivinen PCR(Geofunc, Posiva Metagenomiikka mikrobien funktionaalisuuden karakterisoinnissa (Metageno, Tekes) Bioinformatiikka sekvenssitiedon analysoinnissa Geomikrobiologiset prosessit; geokemia, redox, pelkistys prosessit, monitorointimenetelmien validointi Raportointi

23 Geomikrobiologian tiimi: Mari Nyyssönen, Aura Nousiainen, Marjo Öster, Anu Kapanen, Merja Itävaara Yhteistyö Ilmo Kukkonen, Lasse Ahonen, GTK Geological Survey of Finland Anne Lehtinen, Mia Ylä-Mella Posiva Oy Petteri Pitkänen, VTT Lars Paulin, Petri Auvinen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki sekvenointi Jarno Tuimala, CSC, tieteellinen laskenta Kari Lounatmaa, SEM, TEM Gerard Muyzer,University of Delft - microbial ecology Juho Rousu, Bioinformatics, University of Helsinki - computational analysis 23

Samankaltaiset tiedostot

Kaasut ja biogeokemian prosessit kallioperässä (KABIO)

Kaasut ja biogeokemian prosessit kallioperässä (KABIO) Ilmo Kukkonen & Lasse Ahonen Geologian tutkimuskeskus, Espoo KYT2010 Seminaari 26.9.2008 Helsinki 1 Kaasut ja biogeokemian prosessit kallioperässä