NeuMoDx HBV Quant Test Strip KÄYTTÖOHJEET

Transkriptio

1 REF Rx only HUOMIO: Ei kaupallisesti saatavilla Yhdysvalloissa. V Tarkoitettu NeuMoDx 288- ja NeuMoDx 96 Molecular System -järjestelmillä tehtävää in vitro -diagnostiikkaa varten. i Lisätietoja on NeuMoDx 288 Molecular System -järjestelmän käyttöoppaassa, osanumero Lisätietoja on NeuMoDx 96 Molecular System -järjestelmän käyttöoppaassa, osanumero KÄYTTÖTARKOITUS NeuMoDx HBV Quant Assay on automaattinen nukleiinihappojen in vitro -monistustesti hepatiitti B -viruksen (HBV) DNA:n kvantitointiin ihmisen plasmanäytteissä. NeuMoDx 288 Molecular System- ja NeuMoDx 96 Molecular System -järjestelmissä (NeuMoDx System -järjestelmät) käytettävä NeuMoDx HBV Quant Assay -määritys sisältää DNA:n eristämisen, jossa eristetään kohdenukleiinihappo näytteestä, sekä reaaliaikaisen polymeraasiketjureaktion (polymerase chain reaction, PCR) kohdistamaan erittäin konservoituneisiin sekvensseihin X-proteiinia ja esi-c-proteiinia koodaavalla alueella hepatiitti B:n virusgenomissa. NeuMoDx HBV Quant Assay on tarkoitettu käytettäväksi apuna HBV-infektiota sairastavien potilaiden oikean hoidon määrittämisessä. NeuMoDx HBV Quant Assay -määritystä pitäisi käyttää yhdessä kaikkien kliinisten ja laboratoriolöydösten kanssa oikeanlaisen hoidon ohjaamiseen. Sitä ei ole tarkoitettu käytettäväksi pelkästään diagnosointiin tai veren seulontaan. YHTEENVETO JA SELITYKSET Ihmisen kokoveri kerätään steriileihin verinäyteputkiin, joissa on joko etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA) tai happositraattidekstroosia (acid citrate-dextrose, ACD) antikoagulanttina plasman valmisteluun. Testin valmisteluvaiheessa NeuMoDx System - järjestelmän kanssa yhteensopivassa näyteputkessa oleva plasma asetetaan NeuMoDx System -järjestelmän näyteputkitelineeseen, jotta käsittely voidaan aloittaa. Jokaista näytettä varten 550 µl plasman alikvoottia sekoitetaan NeuMoDx Lysis Buffer 1 -lyysauspuskurin kanssa. NeuMoDx System -järjestelmä suorittaa kaikki vaiheet automaattisesti: se eristää kohdenukleiinihapon, tekee eristetyn DNA:n valmistelut reaaliaikaisen PCR:n monistusvaihetta varten sekä monistaa ja tunnistaa monistamisen tuotteet, jos niitä on näytteessä. (HBV-genomin kohdeosiot erittäin konservoituneella X-proteiinia ja esi-c-proteiinia koodaavalla alueella). NeuMoDx HBV Quant Assay -määritys sisältää DNA-näytteen prosessikontrollin (Sample Process Control 1, SPC1), jolla valvotaan mahdollisia estäviä aineita sekä eristämis- ja monistamisprosessien aikaisia NeuMoDx System -järjestelmän ja reagenssien toimintahäiriöitä. Hepatiitti B -virus (HBV) aiheuttaa hepatiitti B -maksainfektion ja on maailmanlaajuinen terveysongelma. Hepatiitti B voi aiheuttaa joko akuutin maksatulehduksen tai edetä krooniseksi tilaksi, joka johtaa kirroosiin tai maksasyöpään. Kroonisen tilan kehittymisen vaara on pääosin ikään liittyvä; jos virus siirtyy syntymähetkellä, on olemassa yli 90 %:n mahdollisuus, että krooninen tila kehittyy, kun taas aikuisena tartunnan saaneella on 2 6 %:n mahdollisuus kroonisen tilan kehittymisestä 1. HBV tarttuu joko verikontaktissa infektoituneeseen ihmiseen, seksuaalisessa kanssakäymisessä, jaettaessa neuloja infektoituneen henkilön kanssa suonensisäisiä huumeita käytettäessä tai vertikaalisena tartuntana äidiltä vauvalle synnytyksen aikana. Yhdysvalloissa noin ihmisellä on HBV-infektio, ja suurin osa uusista infektiotapauksista aiheutuu seksuaalisesta kanssakäymisestä tai suonensisäisten huumeiden käytöstä 2. Afrikassa ja läntisen Tyynenmeren alueella tiedetään jopa 5 %:n väestöstä olevan infektoitunut. Vuonna 2015 HBV-infektio aiheutti maailmanlaajuisesti kuolemaa, useimmiten kirroosin tai hepatosellulaarisen karsinooman kautta 4. On olemassa rokote, joka 95 %:n tehokkuudella estää HBV-infektion, joten tapauksia diagnosoidaan vähemmän joka vuosi 3. Nykyinen HBV-infektion hoitostandardi on viruslääkehoito, joka edellyttää jatkuvaa seurantaa sen varmistamiseksi, että hoito etenee halutusti. Hoidon seuranta NeuMoDx HBV Quant Assay -määrityksellä voi antaa lääkäreille tarvittavia tietoja HBV-infektiopotilaiden hoitamiseen. MENETELMÄN TOIMINTAPERIAATE NeuMoDx HBV Quant Assay -määrityksessä yhdistyvät automaattinen DNA:n eristys, monistus ja tunnistus reaaliaikaisella PCR:llä. Kokoverinäytteet otetaan EDTA- tai ACD-putkiin plasman valmistelua varten. NeuMoDx System -järjestelmän kanssa yhteensopivassa näyteputkessa oleva plasmanäyte asetetaan näyteputkitelineeseen, joka asetetaan sitten NeuMoDx System -järjestelmään käsittelyä varten. Muita käyttäjän toimia ei tarvita. NeuMoDx System -järjestelmät käyttävät lämmön, lyysausentsyymin ja eristysreagenssien yhdistelmää automaattisessa solujen hajotuksessa, DNA:n eristämisessä ja estäjien poistamisessa. Magneettiset mikropallot tarttuvat vapautuneisiin nukleiinihappoihin. Mikropallot ja niihin sitoutuneet nukleiinihapot siirretään NeuMoDx Cartridge -kasettiin, jossa sitoutumattomat, muut kuin DNA:n osat pestään pois NeuMoDx Wash Reagent -pesureagenssilla ja sitoutunut DNA eluoidaan NeuMoDx Release Reagent -irrotusreagenssilla. Eluoidun DNA:n avulla NeuMoDx System -järjestelmä rehydroi omistusoikeudelliset NeuDry -monistusreagenssit, jotka sisältävät kaikki HBV-spesifisen SPC1-kohteen monistamiseen tarvittavat osat. Kun NeuDry-PCR-reagenssit on valmisteltu, NeuMoDx System -järjestelmä annostelee PCR-ajoa varten valmiin seoksen NeuMoDx Cartridge -kasettiin. Kontrolli- ja kohde-dna-sekvenssit (jos niitä on) monistetaan ja tunnistetaan NeuMoDx-kasetin PCR-kammion alueella. Reaaliaikaisen PCR:n jälkeen amplikoni pysyy NeuMoDx Cartridge -kasetissa, mikä käytännössä poistaa monistamisen jälkeisen kontaminaatioriskin. Sivu 1/ 18

2 PCR:n etualuke Fluoresoiva aine TaqMankoetin Sammuttaja Monistetut kohteet tunnistetaan reaaliaikaisesti hydrolyysikoettimien avulla eli TaqMan -tekniikalla, jossa käytetään amplikonikohtaisia fluoresoivia oligonukleotidikoettimen molekyylejä. Polymerisaatio Monistamistesti PCR:n taka-aluke TaqMan-koettimet koostuvat fluoresoivasta aineesta, joka on kovalenttisesti kiinnittynyt oligonukleotidikoettimen 5 -päähän, ja 3 -päässä olevasta sammuttajasta (Kuva 1). Koettimen ollessa ehjä fluoresoivan aineen ja sammuttajamolekyylin läheisyys tukahduttaa fluoresoivan aineen lähettämän fluoresenssin Förster-tyyppisellä energiansiirrolla (Förster Resonance Energy Transfer, FRET). Fluoresenssi Tulos Koettimen irtoaminen ja pilkkominen Fluoresenssi PCR-tuotteet Hajotustuotteet Kuva 1. TaqMan -tekniikan toiminta TaqMan-koettimet on suunniteltu kiinnittymään tietyn alukejoukon monistamalle DNA:n alueelle. Kun Taq DNA -polymeraasi pidentää aluketta ja syntetisoi uuden juosteen, Taq DNA - polymeraasin 5' 3'-eksonukleaasiaktiivisuus hajottaa templaattiin kiinnittyneen koettimen. Koettimen hajoaminen vapauttaa fluoresoivan aineen ja koetin ja sammuttaja erkanevat toisistaan, jolloin FRET:n tukahduttamisvaikutus estyy ja fluoresoivan aineen fluoresenssin tunnistus voi kasvaa. NeuMoDx System -järjestelmän kvantitatiivisessa PCR -laitteessa havaittu fluoresenssisignaali on suoraan verrannollinen vapautuneeseen fluoresoivaan aineeseen ja voi korreloida kohde-dna:n määrän kanssa. Fluoresoivalla aineella leimattu TaqMan -koetin (heräte: 490 nm ja emissio: 521 nm) 5 -päässä ja pimeä sammuttaja 3 -päässä auttavat havaitsemaan HBV:n DNA:n. TaqMan -koetin on leimattu vaihtoehtoisella fluoresoivalla värillä SPC1-prosessikontrollin tunnistusta varten (heräte: 535 nm ja emissio: 556 nm) 5 -päässä ja pimeä sammuttaja 3 -päässä. NeuMoDx System -järjestelmän ohjelmisto valvoo TaqMan-koettimien lähettämää fluoresenssisignaalia jokaisen monistamissyklin lopussa. Monistumisen päätyttyä NeuMoDx System -järjestelmän ohjelmisto analysoi tiedot ja laatii raportin tuloksista (POSITIVE [Positiivinen] / NEGATIVE [Negatiivinen] / INDETERMINATE [Epäselvä] / UNRESOLVED [Ratkaisematon]). Jos tulos on POSITIVE (Positiivinen), NeuMoDx System -järjestelmän ohjelmisto antaa myös näytteeseen tai raportteihin liittyvän kvantitatiivisen arvon, jos laskettu pitoisuus on kvantitointirajojen sisällä. REAGENSSIT/TARVIKKEET Toimitetut materiaalit REF Sisältö Testejä/yksikkö Testejä/pakkaus Kuivatut PCR:n reagenssit, jotka sisältävät HBV-spesifisen TaqMan -koettimen ja alukkeet sekä SPC1-spesifisen TaqMan -koettimen ja alukkeet Tarvittavat NeuMoDx :n reagenssit ja tarvikkeet, jotka eivät sisälly toimitukseen REF Sisältö NeuMoDx Extraction Plate Kuivatut magneettiset mikropallot, lyysausentsyymi ja näytteiden prosessikontrollit NeuMoDx HBV Calibrators Kertakäyttöiset HBV High Calibrator- ja HBV Low Calibrator -setit kalibrointikäyrän validiteetin määrittämiseen NeuMoDx HBV External Controls Kertakäyttöiset positiiviset ja negatiiviset kontrollisetit NeuMoDx HBV Quant Assay -kvantitointimäärityksen päivittäisen validiteetin määrittämiseen NeuMoDx Lysis Buffer NeuMoDx Wash Reagent NeuMoDx Release Reagent NeuMoDx Cartridge Hamilton CO-RE -kärkiä (300 µl), joissa suodatin (toimittaja: NeuMoDx tai Hamilton) Hamilton CO-RE -kärkiä (1000 µl), joissa suodatin (toimittaja: NeuMoDx tai Hamilton) Sivu 2/ 18

3 Muut tarvittavat varusteet ja materiaalit, jotka eivät sisälly toimitukseen NeuMoDx 288 Molecular System -järjestelmä [REF ] tai NeuMoDx 96 Molecular System -järjestelmä [REF ] VAROITUKSET JA VAROTOIMET NeuMoDx HBV Quant Test Strip -testiliuska on tarkoitettu in vitro -diagnostiikkaan vain NeuMoDx System -järjestelmillä. Älä käytä reagensseja tai tarvikkeita viimeisen käyttöpäivämäärän jälkeen. Reagensseja ei saa käyttää, jos suojatiiviste on rikki tai pakkaus on vahingoittunut vastaanotettaessa. Älä käytä tarvikkeita ja reagensseja, jos suojapussi on avautunut tai rikki vastaanotettaessa. Validin testikalibroinnin (jonka generoi NeuMoDx HBV Calibrators -sarjan korkean ja matalan kalibraattorin käsittely) täytyy olla käytettävissä, ennen kuin kliinisistä näytteistä voidaan saada testituloksia. NeuMoDx HBV External Controls [REF ] (ulkoiset kontrollit) on käsiteltävä 24 tunnin välein. Näyteputken minimitilavuus on 1 ml EDTA-/ACD-plasmaa; tätä pienemmät määrät voivat aiheuttaa NeuMoDx System -järjestelmävirheen. HBV-testin tekeminen näytteille, joita on säilytetty väärässä lämpötilassa tai määritettyjä varastointiaikoja pidempään, voi tuottaa epäkelvollinen- tai virheellinen-tuloksia käytettäessä NeuMoDx HBV Quant Test Strip -testiliuskaa. Vältä aina reagenssien ja tarvikkeiden mikrobi- ja deoksiribonukleaasi (DNaasi) -kontaminaatiota. Steriilien DNaasittomien kertakäyttöpipettien käyttö on suositeltavaa. Käytä jokaiselle näytteelle uutta pipettiä. Potilasnäytteiden ja laboratorion kontaminaation välttämiseksi mitään NeuMoDx-kasettia ei saa käsitellä tai purkaa osiin sen jälkeen, kun NeuMoDx System -järjestelmä on sen automaattisesti hävittänyt biovaarallisen jätteen astiaan. Älä koskaan ota NeuMoDx Cartridge -kasetteja takaisin biovaarallisista jätteistä. NeuMoDx Cartridge -kasetti on suunniteltu estämään kontaminaatiota. Kun laboratoriossa tehdään PCR-testejä myös avoimella putkella, on varottava, etteivät NeuMoDx HBV Quant Test Strip -testiliuska, muut testissä tarvittavat tarvikkeet ja reagenssit, suojavarusteet, kuten käsineet ja laboratoriotakit, ja NeuMoDx System -järjestelmä kontaminoidu. NeuMoDx:n reagensseja ja tarvikkeita käsiteltäessä on käytettävä puhtaita, puuterittomia nitriilikäsineitä. Varo, ettet kosketa NeuMoDx Cartridge -kasetin yläpintaa tai NeuMoDx HBV Quant Test Strip -testiliuskan tai NeuMoDx Extraction Plate -eristyslevyn foliotiivistepintaa tai NeuMoDx Lysis Buffer 1 -lyysauspuskurin yläpintaa. Tarvikkeita ja reagensseja käsiteltäessä saa koskea vain sivupintoihin. Reagensseille on saatavissa käyttöturvallisuustiedote (Safety Data Sheet, SDS). Pese kädet huolellisesti testin jälkeen. Älä pipetoi suun avulla. Älä tupakoi äläkä syö tai juo tiloissa, joissa käsitellään näytteitä tai reagensseja. Käsittele näytteitä aina kuten tartuntavaarallisia näytteitä ja noudata laboratorion turvaohjeita: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 4 ja CLSI Document M29-A3. 5 Hävitä käyttämättömät reagenssit ja jäte paikallisten, alueellisten ja kansallisten säädösten mukaisesti. TUOTTEEN SÄILYTYS, KÄSITTELY JA VAKAUS Kaikki NeuMoDx-reagenssit ja -tarvikkeet (lukuun ottamatta ulkoisia kontrolleja ja kalibraattoreita) ovat vakaita sisäpakkauksessa C:n lämpötilassa tuotteen etiketissä ilmoitettuun viimeiseen käyttöpäivään asti. NeuMoDx System -järjestelmän työalustalle asetettu NeuMoDx HBV Quant Test Strip -testiliuska pysyy vakaana 62 vuorokautta. NeuMoDx System -järjestelmän ohjelma pyytää käyttäjää poistamaan järjestelmässä yli 62 vuorokautta käytössä olleet reagenssit, jolloin uudet NeuMoDx HBV Quant Test Strips -testiliuskat on avattava ja lisättävä NeuMoDx System -järjestelmään. NeuMoDx External Control -kontrollit ja NeuMoDx External Calibrator -kalibraattorit on hävitettävä käytön jälkeen. NÄYTTEIDEN KERUU, KULJETUS JA SÄILYTYS 1. Käsittele kaikkia näytteitä, kalibraattoreita ja kontrolleja kuin ne pystyisivät siirtämään eteenpäin tarttuvia taudinaiheuttajia. 2. Älä pakasta kokoverta tai ensisijaisissa putkissa olevia näytteitä. 3. Kokoveri on otettava steriileihin putkiin, joissa käytetään EDTA:ta tai ACD:tä antikoagulanttina. Noudata näytteenottoputken valmistajan ohjeita. 4. Edellä mainituilla laitteilla otetut kokoverinäytteet voidaan säilyttää ja/tai kuljettaa 24 tunnin ajan 2 25 C:ssa ennen plasman valmistelua. Plasman valmistelu on tehtävä valmistajan ohjeiden mukaisesti. 5. Valmisteltuja plasmanäytteitä saa säilyttää 2 8 C:n lämpötilassa enintään 7 vuorokautta ennen testausta ja enintään 8 tuntia huoneenlämmössä. 6. Valmistellut plasmanäytteet voidaan säilyttää < 20 C:ssa enintään 6 kuukautta ennen käsittelyä. Pakastus/sulatus saa tapahtua enintään kaksi (2) kertaa ennen käyttöä. Sivu 3/ 18

4 a. Jos näytteet on pakastettu, niiden on annettava sulaa kokonaan huoneenlämmössä (15 30 C). Vorteksoi näytteitä, jotta ne jakautuvat tasaisesti. b. Kun pakastetut näytteet sulatetaan, ne on testattava 8 tunnin sisällä, tai pakastamattomia näytteitä saa säilyttää korkeintaan 24 tuntia 2 8 C:ssa. 7. Jos näytteitä kuljetetaan, ne on pakattava ja merkittävä sovellettavien maakohtaisten ja/tai kansainvälisten säädösten mukaisesti. 8. Merkitse näytteet selvästi ja ilmoita, että näytteet ovat HBV-testaukseen. 9. Siirry Testin valmistelut -kohtaan. NeuMoDx HBV Quant Assay -määrityksen käyttöönottoprosessista on esitetty yhteenveto seuraavassa vuokaaviossa [kuva 2]. NEUMODX HBV QUANT ASSAY -MÄÄRITYKSEN KÄYTTÖÖNOTTO Jos NeuMoDx -ohjelmisto niin kehottaa, lisää pyydetyt tarvikkeet Lataa testikohtaiset reagenssit NeuMoDx Lysis Buffer 1 -lyysauspuskuri NeuMoDx HBV Quant Test Strips -testiliuskat Käsittele NeuMoDx HBV Calibrator -kalibraattorit Ovatko kalibraattorit kelvollisia? KYLLÄ Toista 90 päivän välein TAI jos otat käyttöön uuden NeuMoDx HBV Quant Test Strip -testiliuskaerän Käsittele NeuMoDx HBV External Control -kontrollit Ovatko kontrollit kelvollisia? KYLLÄ Toista 24 tunnin välein KÄSITTELE RUTIININOMAISET NÄYTTEET Kuva 2: NeuMoDx HBV Quant Assay -määrityksen käyttöönottotyönkulku Testin valmistelut 1. Kiinnitä näytteen viivakooditarra NeuMoDx System -järjestelmän kanssa yhteensopivaan näyteputkeen. 2. Sekoita näytettä hieman, jotta se jakautuu tasaisesti. 3. Siirrä siirtopipetillä 1 ml plasmaa viivakoodilla merkittyyn näyteputkeen (tytärputkeen). Ole varovainen, ettet siirrä plasmanäytteestä hyytymiä näyteputkeen. Käytä jokaiselle näytteelle eri siirtopipettiä. Tytärputken on oltava yhteensopiva NeuMoDx System -järjestelmän ja käsittelyssä käytettävän näyteputkitelineen kanssa. 32 putken teline: halkaisija mm ja korkeus mm 24 putken teline: halkaisija 14,5 18 mm ja korkeus mm NeuMoDx System -järjestelmän käyttö Sivu 4/ 18

5 Lisätietoja on NeuMoDx 288/96 Molecular System -järjestelmän käyttöoppaassa (osanumerot ja ). 1. Aseta vähintään yhteen NeuMoDx System -järjestelmän testiliuskatelineeseen NeuMoDx HBV Quant Test Strip -testiliuskoja ja lisää testiliuskatelineet NeuMoDx System -järjestelmään kosketusnäytön avulla. 2. Jos NeuMoDx System -järjestelmän ohjelma pyytää lisäämään tarvikkeita, lisää tarvittavat tarvikkeet NeuMoDx System -järjestelmän tarviketelineisiin ja lisää telineet NeuMoDx System -järjestelmään kosketusnäytön avulla. 3. Jos NeuMoDx System -järjestelmän ohjelman näyttöön tulee sitä koskeva kehote, vaihda NeuMoDx Wash Reagent -pesureagenssi ja NeuMoDx Release Reagent -irrotusreagenssi tai tyhjennä esitäyttöjätteen tai biovaarallisen jätteen säiliö tarpeen mukaan. 4. Jos NeuMoDx System -järjestelmän ohjelman näyttöön tulee sitä koskeva kehote, käsittele NeuMoDx HBV Calibrator -kalibraattorit ja/tai NeuMoDx HBV External Control -kontrollit. Lisätietoa kalibraattoreista ja kontrolleista on Tulosten käsitteleminen -osassa. 5. Aseta näyte-/kalibraattori-/kontrolliputket vakiomalliseen 32 putken telineeseen ja varmista, että kaikkien näyteputkien korkit on poistettu. 6. Aseta näyteputkiteline automaattilataimen hyllylle ja lisää teline NeuMoDx System -järjestelmään kosketusnäytön avulla. Tämä käynnistää asetettujen näytteiden pyydettyjen testien käsittelyn. RAJOITUKSET 1. NeuMoDx HBV Quant Test Strip -testiliuskaa voidaan käyttää vain NeuMoDx System -järjestelmissä. 2. NeuMoDx HBV Quant Test Strip -testiliuskan suorituskyky on määritetty kokoverestä valmistettujen, EDTA:ta/ACD:tä antikoagulanttina käyttävien plasmanäytteiden osalta. 3. NeuMoDx HBV Quant Test Strip -testiliuskan käyttöä muiden kliinisten näytetyyppien kanssa ei ole arvioitu, eikä tämän testin suorituskykyominaisuuksia muilla näytetyypeillä tunneta. 4. Koska näytteessä olevien organismien määrä vaikuttaa HBV:n tunnistamiseen, näytteiden oikeanlainen kerääminen, käsittely ja säilytys vaikuttavat tulosten luotettavuuteen. 5. NeuMoDx-kalibraattorit ja ulkoiset kontrollit on käsiteltävä pakkausselosteen ohjeiden ja NeuMoDx System -ohjelman kehotteiden mukaisesti ennen rutiininomaisten kliinisten näytteiden käsittelyä. 6. Näytteiden virheellinen kerääminen, käsittely, säilytys, tekninen virhe tai näyteputkien sekaantuminen voivat aiheuttaa virheellisiä testituloksia. Vääriä negatiivisia testituloksia voidaan saada myös silloin, kun näytteessä olevien organismien määrä on NeuMoDx HBV Quant Assay -määrityksen tunnistusrajan alapuolella. 7. NeuMoDx System -järjestelmän käyttö on tarkoitettu ainoastaan NeuMoDx System -järjestelmän käyttökoulutusta saaneelle henkilöstölle. 8. Jos sekä HBV-kohde että SPC1-kohde eivät monistu, järjestelmä raportoi epäkelvollisen tuloksen (Indeterminate [Epäselvä] tai Unresolved [Ratkaisematon]), ja testi on toistettava. 9. Jos NeuMoDx HBV Quant Assay -määrityksen tulos on Positive (Positiivinen), mutta kvantitointiarvo on kvantitointirajojen ulkopuolella, NeuMoDx System -järjestelmä raportoi, oliko havaittu HBV alle kvantitoinnin alarajan (Lower Limit of Quantitation, LLoQ) vai yli kvantitoinnin ylärajan (Upper Limit of Quantitation, ULoQ). 10. Mikäli havaittu HBV oli alle LLoQ-rajan, määritys voidaan toistaa (tarvittaessa) toisella näytealikvootilla. 11. Mikäli havaittu HBV oli yli ULoQ-rajan, määritys on toistettava laimennetulla näytealikvootilla. HBV-negatiivisen plasman tai Basematrix 53:n laimennus 1:1000 on suositeltavaa. 12. Positiivinen tulos ei välttämättä tarkoita, että näytteessä on elinkelpoisia organismeja. Positiivinen tulos kuitenkin viittaa hepatiitti B -viruksen DNA:n todennäköiseen läsnäoloon. 13. X-proteiinin taiesi-c-alueen deleetio tai mutaatio voivat vaikuttaa havaitsemiseen tai johtaa virheelliseen tulokseen käytettäessä NeuMoDx HBV Quant Test Strip -testiliuskaa. 14. NeuMoDx HBV Quant Assay -määrityksen tuloksia tulisi käyttää kliinisten havaintojen ja muiden lääkärin käytettävissä olevien tietojen ohella. Testiä ei ole tarkoitettu infektion diagnosointiin. 15. Kontaminoitumisen välttäminen edellyttää hyvän laboratoriokäytännön noudattamista, kuten käsineiden käyttämistä aina potilaiden näytteitä käsiteltäessä. TULOSTEN KÄSITTELEMINEN Tuloksia voidaan katsella ja tulostaa NeuMoDx System -järjestelmän kosketusnäytöstä, tulosikkunan Results (Tulokset) -välilehdestä. NeuMoDx System -järjestelmän ohjelma generoi NeuMoDx HBV Quant Assay -määrityksen tulokset automaattisesti käyttämällä ratkaisualgoritmia ja NeuMoDx HBV Assay Definition File (HBV ADF) -tiedoston sisältämiä käsittelyparametreja. NeuMoDx HBV Quant Assay -määrityksen tulos voi olla Negative (Negatiivinen), Positive (Positiivinen) ja ilmoitettu HBV-pitoisuus, Positive above ULoQ (Positiivinen ULoQ-rajan yläpuolella), Positive below LLoQ (Positiivinen LLoQ-rajan alapuolella), Indeterminate (Epäselvä) tai Unresolved (Ratkaisematon) kohteen monistustilan ja näytteen käsittelykontrollin perusteella. Tulokset raportoidaan taulukossa 1 esitetyn ratkaisualgoritmin perusteella. Taulukko 1. NeuMoDx HBV Quant Assay -testin ratkaisualgoritmi Sivu 5/ 18

6 Tulos HBV Näytteen prosessikontrolli (SPC1) Ct Positive (Positiivinen) Positive, above Upper Limit of Quantitation (Positiivinen, kvantitoinnin ylärajan yläpuolella) [ULoQ] (Log10 IU/ml) Positive, below Lower Limit of Quantitation (Positiivinen, alle kvantitoinnin alarajan) [LLoQ] (Log10 IU/ml) Negative (Negatiivinen) Indeterminate (Epäselvä) [2 Ct < 9 AND (JA) EPR 2 AND (JA) EP 1000] TAI [9 Ct 42 AND (JA) EP 1000] Quant > 9,02 Quant < 0,88 N/A (Ei oleellinen) OR (TAI) (2 Ct< 9 AND (JA) EPR < 2) TAI [9 Ct 42 AND (JA) EP 1000] OR (TAI) Ct > 42 N/A (Ei oleellinen) N/A (Ei oleellinen) N/A (Ei oleellinen) 28 Ct 34 AND (JA) EP 2000 NOT AMPLIFIED / System Errors Noted (Ei monistu / Järjestelmävirhe) Testilaskenta Unresolved (Ratkaisematon) NOT AMPLIFIED / No System Errors Noted (Ei monistu / Ei järjestelmävirhettä) EP = End Point Fluorescence ((Päätepisteen fluoresenssi) (perustasokorjauksen jälkeen); EPR = End Point Fluorescence Ratio (Päätepisteen fluoresenssisuhde); Ct = Cycling Threshold (Syklin kynnysarvo); Quant = esiintyneen HBV:n laskettu määrä (Log10 IU/ml). Katso seuraava Testilaskenta. 1. NeuMoDx HBV Quant Assay -määrityksen kvantitointialueella olevien näytteiden osalta lasketaan HBV DNA:n pitoisuusnäytteissä käyttämällä kalibrointia, joka perustuu tallennettuun standardikäyrään/yhtälöön. a. Myös kalibrointikerroin lasketaan käsiteltyjen NeuMoDx HBV Calibrator -kalibraattoreiden tulosten perusteella, jotta voidaan määrittää standardikäyrän validiteetti tietyn NeuMoDx HBV Quant Test Strip -testiliuskaerän osalta tietyssä NeuMoDx System -järjestelmässä. b. Kalibrointikerroin on sisällytetty HBV DNA:n pitoisuuden lopulliseen määritykseen. 2. NeuMoDx HBV Quant Assay -määrityksen tulokset ilmoitetaan arvoina Log10 IU/ml. 3. Tuntemattomien näytteiden saatu kvantitointi on jäljitettävissä Maailman terveysjärjestön (World Health Organization, WHO) 4. kansainväliseen HBV-standardiin. Testin kalibrointi Standardikäyrään (tai yhtälöön) perustuva validi kalibrointi on tarpeen näytteiden HBV DNA:n kvantitoinnissa. Kelvollisten tulosten saaminen edellyttää testikalibroinnin tekemistä NeuMoDx Molecular, Inc. -yhtiön toimittamien ulkoisten kalibraattoreiden avulla. Ulkoiset kalibraattorit 1. NeuMoDx HBV Calibrators -sarja [REF ] sisältää ehjää HBV-virusta laimennettuna Basematrix 53:lla. 2. HBV-kalibraattorisetti on käsiteltävä kunkin uuden NeuMoDx HBV Quant Test Strip -testiliuskaerän yhteydessä tai jos uusi HBV Assay Definition File -määritystiedosto ladataan NeuMoDx System -järjestelmään tai jos nykyinen kalibraattorisetti on validiteettiajan (parhaillaan määritetty 90 päivään) ulkopuolella tai jos NeuMoDx System -järjestelmän ohjelmaa on muokattu. 3. NeuMoDx System -järjestelmäohjelmisto ilmoittaa käyttäjälle, milloin kalibraattorit on käsiteltävä. Tyypillisessä käytössä uutta testiliuskaerää ei voi käyttää testaamiseen, ennen kuin kalibraattorit on käsitelty onnistuneesti. 4. Kalibraation validiteetti määritetään seuraavasti: a) Validiteetin määrittäminen edellyttää kahden kalibraattorin korkean ja matalan käsittelemistä. b) Kelvollisten tulosten generoimista varten ainakin kahden (2) kolmesta (3) replikaatista täytyy tuottaa tuloksia, jotka ovat esimääritettyjen parametrien sisällä. Matalan kalibraattorin nimellinen tavoite on 3,7 Log10 IU/ml ja korkean kalibraattorin nimellinen tavoite 5,7 Log10 IU/ml. c) Kalibraatiokerroin lasketaan kvantitoinnin vinoutuman ottamiseksi huomioon. Tätä kalibrointikerrointa käytetään lopullisen HBVpitoisuuden määrityksessä. Sivu 6/ 18

7 5. Jos toinen tai molemmat kalibraattorit eivät läpäise validiteettitarkistusta, toista hylätyn kalibraattorin käsittely uudella putkella. Mikäli toisen kalibraattorin validiteettia ei pystytä varmistamaan, on mahdollista toistaa vain tämän kalibraattorin testi, koska järjestelmä ei edellytä molempien kalibraattorien ajamista uudelleen. 6. Jos kalibraattorit eivät läpäise validiteettitarkistusta toisellakaan kertaa, ota yhteyttä NeuMoDx Molecular, Inc. -yhtiöön. Laadunvarmistus Paikallisissa säädöksissä määritetään yleensä, että laboratorio vastaa sellaisten kontrollimenetelmien käytöstä, joilla valvotaan koko analysointiprosessin virheettömyyttä ja tarkkuutta. Laboratorion on määritettävä myös kontrollimateriaalien testauksen toistoväli, tyyppi ja määrä käyttämällä muuttamattoman, hyväksytyn testijärjestelmän verifioituja suoritustasotietoja. Ulkoiset kontrollit 1. NeuMoDx Molecular, Inc. toimittaa ulkoiset kontrollimateriaalit, jotka sisältävät ehjää HBV-virusta Basematrix 53:ssa positiivisiin kontrolleihin, NeuMoDx HBV External Control Kit [REF ] -sarjassa. 2. Positiiviset ja negatiiviset ulkoiset kontrollit on käsiteltävä 24 tunnin välein. Jos valideja ulkoisia kontrolleja ei ole olemassa, NeuMoDx System -järjestelmäohjelmisto kehottaa käyttäjää käsittelemään nämä kontrollit, ennen kuin näytteistä voidaan raportoida tuloksia. 3. Jos ulkoisia kontrolleja tarvitaan, nouda ulkoiset kontrollit pakastimesta ja anna putkien sulaa huoneenlämmössä (15 30 C), kunnes niiden sisältö on täysin sulanut. Vorteksoi varovasti homogeenisuuden varmistamiseksi. 4. Aseta positiivisen ja negatiivisen kontrollin putket NeuMoDx System -järjestelmään kosketusnäytön ja automaattilataimen hyllylle asetetun näyteputkitelineen avulla. NeuMoDx System -järjestelmä tunnistaa viivakoodin ja alkaa käsitellä näyteputkia, paitsi jos testissä tarvittavia reagensseja ja tarvikkeita ei ole käytettävissä. 5. NeuMoDx System arvioi ulkoisten kontrollien validiteetin odotetun tuloksen perusteella. Positiivisen kontrollin pitäisi antaa HBV Positive (HBV positiivinen) -tulos ja negatiivisen kontrollin HBV Negative (HBV negatiivinen) -tulos. 6. Ulkoisten kontrollien ristiriitaisia tuloksia on käsiteltävä seuraavasti: a) Jos negatiivisella kontrollinäytteellä on raportissa positiivinen testitulos, näyte voi olla kontaminoitunut. b) Jos positiivisella kontrollinäytteellä on raportissa negatiivinen tulos, reagenssiin tai laitteeseen saattaa liittyä ongelmia. c) Kummassakin tapauksessa validiteettitarkistuksessa hylätyn kontrollin testi on toistettava uusilla NeuMoDx HBV External Control -kontrollien putkilla. d) Jos NeuMoDx HBV External Control -kontrolli tuottaa jatkuvasti negatiivisen tuloksen, ota yhteyttä NeuMoDx-yhtiön asiakaspalveluun. e) Jos negatiivinen NeuMoDx HBV External Control -kontrolli tuottaa jatkuvasti positiivisen tuloksen, yritä poistaa kaikki mahdollisen kontaminaation lähteet ja vaihda KAIKKI reagenssit, ennen kuin otat yhteyttä NeuMoDx-yhtiön asiakaspalveluun. Näytteen käsittelyn (sisäiset) kontrollit Eksogeeninen näytteenkäsittelykontrolli (Sample Processing Control, SPC1) sisältyy NeuMoDx Extraction Plate -eristyslevyyn ja käy läpi koko prosessin nukleiinihappojen eristyksestä reaaliaikaiseen PCR-monistukseen jokaisen näytteen osalta. SPC1-spesifiset alukkeet ja koettimet sisältyvät myös jokaiseen NeuMoDx HBV Quant Test Strip -testiliuskaan, joka mahdollistaa SPC1:n ja kohde-hbv DNA:n (jos sitä on) läsnäolon tunnistuksen moninkertaisen reaaliaikaisen PCR:n avulla. SPC1:n monistuksen tunnistuksen avulla NeuMoDx System -järjestelmä voi valvoa DNA:n eristämisen ja PCR:n monistamisprosessien tehokkuutta. Epäkelvolliset tulokset Jos NeuMoDx System -järjestelmällä tehdystä NeuMoDx HBV Quant Assay -testistä ei saada hyväksyttäviä tuloksia, sen kohdalla lukee raportissa Indeterminate (Epäselvä, IND) tai Unresolved (Ratkaisematon, UNR) virhetyypin mukaan. Raportissa on tuloksena IND (Epäselvä), jos NeuMoDx System -järjestelmä huomaa näytteen käsittelyn aikana järjestelmävirheen. Jos tulos on raportissa IND (Epäselvä), uusintatestausta suositellaan. UNR (Ratkaisematon) -tulos saadaan, jos validia HBV DNA:n tai SPC1:n monistusta ei havaita, mikä osoittaa mahdollisen reagenssin virheen tai inhibiittoreiden läsnäolon. Jos raportissa on UNR (Ratkaisematon) -tulos, uusintatestausta suositellaan ensimmäisenä toimena. Jos uusintatestaus epäonnistuu, laimennetulla näytteellä voidaan lieventää näytteen inhibition vaikutuksia. SUORITUSKYKYOMINAISUUDET Analyyttinen herkkyys havaitsemisraja WHO:n standardin perusteella NeuMoDx HBV Quant Assay -testin analyyttinen herkkyys käytettäessä NeuMoDx HBV Quant Test Strip -testiliuskaa määritettiin testaamalla viisi eri WHO:n 4. kansainvälisen standardin tasoa, ja negatiiviset näytteet seulottiin negatiivisesta ihmisen plasmasta NeuMoDx 288 Molecular System -järjestelmällä ja suppea testipaneeli NeuMoDx 96 Molecular System -järjestelmällä. Tutkimukset tehtiin kolmen (3) päivän aikana useilla NeuMoDx System -järjestelmillä niin, että yhdellä järjestelmällä käsiteltiin 18 replikaattia kullakin tasolla per päivä NeuMoDx 288 Molecular System -järjestelmällä ja 24 replikaattia kullakin tasolla per päivä NeuMoDx 96 Molecular System -järjestelmällä. Yksilöllinen erä koostui seuraavista: NeuMoDx HBV Quant Test Strip -testiliuskaa, NeuMoDx Extraction Plate -eristyslevyä ja NeuMoDx Lysis Buffer 1 -lyysauspuskuria testattiin kussakin NeuMoDx System -järjestelmässä joka päivä. Havaitsemisasteet esitetään taulukko 2. Probit-tyyppisellä analyysillä määritettiin havaitsemisraja (Limit of Detection, LoD) HBV:n genotyypille A [kuva 3]; NeuMoDx HBV Assay -testin havaitsemisraja NeuMoDx 288 Molecular System -järjestelmällä oli 5,2 IU/ml 95 %:n luottamusvälillä (Confidence Interval, CI) 4,1 7,6 IU/ml, mikä vastaa arvoa 0,72 Log10 IU/ml 95 %:n Sivu 7/ 18

8 CI:llä 0,61 0,88 Log10 IU/ml. NeuMoDx HBV Assay -testin LoD NeuMoDx 96 Molecular System -järjestelmässä oli 4,3 IU/ml (0,63 Log10 IU/ml). NeuMoDx HBV Quant Assay -testin väitetty LoD on 6,2 IU/ml eri HBV-genotyypeistä saatujen LoD-tulosten perusteella. Taulukko 2. Näytteiden positiivisten tulosten havaitsemisasteet NeuMoDx HBV Quant Assay -testin LoD-määritystä varten IU/ml NeuMoDx 288 Molecular System NeuMoDx 96 Molecular System Log10 Hyväksyttyjen Positiivisten Hyväksyttyjen Positiivisten (IU/ml) Havaitsemisaste Havaitsemisaste testien määrä määrä testien määrä määrä 20 1, % NA NA NA (Ei oleellinen) (Ei oleellinen) (Ei oleellinen) % % 5 0, % % 2,5 0, % % 1,25 0, % NA NA NA (Ei oleellinen) (Ei oleellinen) (Ei oleellinen) % % 1.2 1,2 1 LoD = 5.2 5,2 IU/mL IU/ml [95 [with %:n 95% Cl of CI (4,1;7,6) of (4.1,7.6) IU/ml] IU/mL] 1.2 1,2 1 LoD LoD = = 4,3 4.3IU/ml IU/mL 0.8 0, ,8 SENSITIVITY HERKKYYS 0.6 0, , ,2 Curve Käyrän FIT sovitus Experimental Kokeellinen Calculated Laskettu LoD LoD Log Log [CONC/mL] [PIT./ml] SENSITIVITY HERKKYYS 0.6 0, ,4 Sigmasovitus Sigmoid Fit 0.2 0,2 Kokeelliset Experimental tiedot Data Laskettu Calculated LoD LoD Log [CONC/mL] [PIT./ml] Kuva 3: Probit-tyyppinen analyysi, jolla määritettiin NeuMoDx HBV Quant Assay -testin LoD NeuMoDx 288 Molecular System -järjestelmässä (vasen) ja NeuMoDx 96 Molecular System -järjestelmässä (oikea) Kvantitointiraja kvantitoinnin alaraja (LLoQ) Kvantitoinnin alarajan määrittämiseksi laskettiin analyyttinen kokonaisvirhe (Total analytical error, TAE) kustakin HBV-kohdetasosta, jonka osoitettiin raportoivan 95 %:n havaitseminen osana LoD-laskentaa. TAE:n määritelmä on seuraava: TAE = vinouma + 2*SD [Westgard-tilasto] Vinouma on lasketun ja odotetun pitoisuuden välinen ero absoluuttisena arvona. SD tarkoittaa näytteen kvantitoidun arvon keskihajontaa. HBV-näytteiden kootut LLoQ-tulokset molemmilla NeuMoDx System -järjestelmillä on esitetty taulukossa 3. Sivu 8/ 18

9 TAVOITEPIT. IU/ml TAVOITEPIT. Log10 IU/ml Taulukko 3. LLoQ-tulokset sekä vinouma ja TAE kustakin testatusta tasosta. NeuMoDx 288 Molecular System Keskimääräinen pit. Log10 IU/ml SD Vinouma TAE 20 1, % 1,29 0,23 0,16 0,63 Havaitsemisaste NA (Ei oleellinen) Havaitsemisaste NeuMoDx 96 Molecular System Keskimääräinen pit. SD Vinouma TAE Log10 IU/ml NA NA (Ei NA (Ei (Ei oleellinen) oleellinen) oleellinen) 10 1,00 99 % 1,07 0,25 0,20 0, % 0,97 0,28-0,03 0,60 5 0,70 91 % 0,89 0,35 0,34 1,04 96 % 0,86 0,32 0,17 0,81 2,5 0,40 90 % 0,75 0,44 0,51 1,39 93 % 0,85 0,45 0,45 1,34 1,25 0,10 68 % 0,73 0,41 0,68 1,50 NA (Ei oleellinen) NA (Ei oleellinen) NA (Ei oleellinen) NA (Ei oleellinen) Matalin tavoitetaso, jolla > 95 %:n havaitseminen saavutetaan JA TAE on 1,0, on kvantitoinnin alaraja (LLoQ). LLoQ on 4. kansainvälisen WHO:n standardin mukaan NeuMoDx 288 Molecular System -järjestelmässä 5,5 IU/mL (0,74 Log10 IU/ml) ja NeuMoDx 96 Molecular System -järjestelmässä 4,3 IU/ml (0,63 log 10 IU/ml). Kaikkien genotyyppien testauksen perusteella NeuMoDx HBV Quant Assay -määrityksen väitetty LLoQ on 7,6 IU/ml (0,88 Log10 IU/ml). LoD ja LLoQ HBV-genotyypeissä LoD määritettiin alun perin genotyypille A (4. WHO:n kansainvälinen standardi) ja sen jälkeen lisätestausta tehtiin määritetyn LoD:n ympärillä käyttämällä kaikkia muita seitsemää (7) genotyyppiä. 36 replikaattia tasoilla, jotka vastasivat 2 X, 1 X ja 0,5 X 95 %:n CI:tä LoD:n ylärajasta (~7 IU/ml), testattiin NeuMoDx HBV Quant Assay -määrityksellä. Kunkin genotyypin positiivisten tulosten prosenttiaste kullakin testatulla tasolla lisättiin taulukkoon ja arvojen avulla laskettiin LoD Probit-tyyppisellä analyysillä. Lisäksi laskettiin analyyttinen kokonaisvirhe näillä tasoilla. Matalin taso 95 %:n positiivisten tulosten tunnistuksella ja lasketun TAE:n ollessa 1,0 katsottiin jälleen genotyypin LLoQ-arvoksi. Taulukko 4. Testatut HBV-genotyypit NA (Ei oleellinen) NA (Ei oleellinen) GENOTYYPPI LoD [Log10IU/ml] LLoQ [Log10IU/ml] Genotyyppi A 5,2 5,2 Genotyyppi B 6,2 6,2 Genotyyppi C 3,5 6,2 Genotyyppi D 5,2 5,7 Genotyyppi E 3,5 3,5 Genotyyppi F 5,1 6,2 Genotyyppi G 3,5 3,5 Genotyyppi H 5,2 7,6 Kvantitoinnin ylärajan (ULoQ) lineaarisuus ja määritys Genotyyppi A:ta käytettiin muiden genotyyppien edustajana tässä tutkimuksessa. HBV-näytteiden 11 tasoa (testipaneeli) käsiteltiin kuudella (6) replikaatilla kullakin tasolla kahdessa (2) NeuMoDx System -järjestelmässä ja kolmella (3) kriittisten reagenssien erällä, jotta katettaisiin 8 Log10 -tunnistusaluetta sekä lähes kriittiset lääketieteelliset päätöspisteet. Testipaneeli koostui HBV-positiivisesta kliinisestä näytteestä, jota oli laimennettu esiseulotulla ja yhdistetyllä HBV-negatiivisella plasmanäytteellä. Jäljitettävyys WHO:n 4. kansainväliseen standardiin määritettiin paralleelianalyysillä ennen lineaarisuustutkimuksen tekemistä. NeuMoDx HBV Quant Assay -määrityksen samanveroisuus osoitettiin erittäin korkeasti korreloivilla suorituskykytuloksilla NeuMoDx 288 Molecular System- ja NeuMoDx 96 Molecular System -järjestelmässä. Sivu 9/ 18

10 Tavoitepit. (IU/ml) Taulukko 5. NeuMoDx HBV Quant Assay -määrityksen lineaarisuus (arvoitu genotyypillä A) Tavoitepit. (Log10 IU/ml) Keskim. pit. (Log10 IU/ml) Keskihajonta Vinouma Ennustettu lineaarisovitus Poikkeama epälineaarisesta sovituksesta 1,05E+09 9,02 8,99 0,08 0,06 9,02-0,04 1,05E+08 8,02 8,05 0,07 0,05 8,02 0,03 1,05E+07 7,02 7,05 0,07 0,06 7,02 0,04 1,05E+06 6,02 6,05 0,05 0,05 6,02 0,03 1,05E+05 5,02 5,04 0,05 0,04 5,02 0,00 2,82E+04* 4,45 4,43 0,07 0,05 4,45-0,01 1,05E+04 4,02 3,99 0,09 0,05 4,02-0,02 2,82E+03* 3,45 3,41 0,07 0,06 3,45-0,03 1,05E+03 3,02 3,00 0,04 0,04 3,02-0,03 1,05E+02 2,02 1,99 0,11 0,09 2,02-0,01 1,05E+01 1,02 1,09 0,29 0,23 1,02 0,06 *Lähellä lääketieteellisiä päätöspisteitä NeuMoDx HBV Quant Assay -määrityksen osalta osoitettiin sen kyky kvantifioida HBV:tä 8 Log10 -lineaarialueella poikkeamalla ± 0,22 Log10 IU/ml. Enimmäispoikkeama hieman paremmasta epälineaarisen regression sovituksesta oli 0,06 Log10 IU/ml. Kvantitoinnin yläraja (Upper Limit of Quantitation, ULoQ) määritettiin myös tämän tutkimuksen tietojen perusteella, ja arvoksi tuli 9,02 Log10 IU/ml. NeuMoDx HBV Assay -määrityksen pitoisuus [Log 10 IU/mL] NeuMoDx HBV Assay -määrityksen lineaarisuus y = 1x + 1E-06 R² = 0, Odotettu pitoisuus [Log 10 IU/mL] Kuva 4: NeuMoDx HBV Quant Assay -määrityksen lineaarinen alue. x = Expected Quantitation (odotettu kvantitointi), y = NeuMoDx Quantitation (järjestelmän kvantitointi) Eri genotyyppien lineaarisuus NeuMoDx HBV Assay -määrityksen lineaarisuutta HBV-genotyyppien osalta plasmanäytteissä tutkittiin testaamalla ainakin neljä (4) erilaista pitoisuutta kutakin HBV-genotyyppiä, jotka oli valmistettu yhdistetystä HBV-negatiivisesta plasmasta. Tässä tutkimuksessa käytetyt testatut HBV -tavoitetasot olivat riippuvaisia lähdenäytteen pitoisuudesta ja sen vuoksi ne olivat erilaisia eri genotyyppien osalta. Kukin genotyyppi testattiin kuudella (6) replikaatilla per taso. Sivu 10/ 18

11 Taulukko 6: NeuMoDx HBV Quant Assay -määrityksen lineaarisuus eri genotyypeissä Genotyyppi Lineaarisuusyhtälö y = NeuMoDx HBV Assay -määrityksen kvantitointi R 2 x = odotettu kvantitointi A y = 1x + 1E-06 0,9977 B y = 1,0129x 0,0964 0,9975 C y = 1,0250x 0,0898 0,998 D y = 1,0379x 0,0896 0,9975 E y = 1,0182x 0,096 0,9956 F y = 0,9736x + 0,276 0,9906 G y = 1,0547x 0,0835 0, NeuMoDx HBV Assay -määrityksen pitoisuus [Log 10 IU/mL] HBV-vertailumäärityksen pitoisuus [Log 10 IU/mL] Lineaarinen Linear (Genotype (genotyyppi A) A) Lineaarinen Linear (Genotype (genotyyppi B) B) Lineaarinen Linear (Genotype (genotyyppi C) C) Lineaarinen Linear (Genotype (genotyyppi D) D) Lineaarinen Linear (Genotype (genotyyppi E) E) Lineaarinen Linear (Genotype (genotyyppi F) F) Lineaarinen Linear (Genotype (genotyyppi G) G) Kuva 5: NeuMoDx HBV Quant Assay -määrityksen lineaarisuus eri genotyypeissä Analyyttinen spesifisyys ja ristireaktiivisuus Analyyttinen spesifisyys määritettiin seulomalla 32:n yleisesti veri-/plasmanäytteistä löytyvän organismin sekä fylogeneettisesti HBV:n kaltaisten lajien ristireaktiviteetti. Organismit valmisteltiin 4 6 organismin ryhmissä ja testattiin suurella pitoisuudella. Testatut organismit esitetään taulukossa 7. Ristireaktiviteettia ei havaittu testattujen organismien osalta, mikä vahvisti NeuMoDx HBV Quant Assay -määrityksen 100 prosentin analyyttisen spesifisyyden. Sivu 11/ 18

12 Taulukko 7. Analyyttisen spesifisyyden osoittamiseen käytetyt patogeenit ristireaktiviteetti Adenovirus 2 Dengue V1 Hepatiitti A HPV 16 Ilheus (ILHV) Keltakuume Adenovirus 5 Dengue V2 Hepatiitti C HPV 18 Influenssa A Zikavirus Banzivirus Dengue V3 Ihmisen herpesvirus 6a HSV1 Parvo B19 BK-virus Dengue V4 Ihmisen herpesvirus 8 HSV 2 Rubella Sytomegalovirus Epstein-Barr-virus HIV 1 HTLV 1 St. Louisin enkefaliitti VZV Vacciniavirus HIV 2 HTLV 2 Länsi-Niilin virus Häiritsevät aineet - kommensaaliset organismit NeuMoDx HBV Quant Assay tutkittiin häiriöiden varalta, kun näytteessä oli ei-kohdeorganismeja, käyttämällä samoja organismiryhmiä kuin analyyttisen spesifisyyden testausta varten. Organismit testattiin joko yksittäin tai yhdistettynä 4 6 organismin ryhmiin seulotussa HBV -negatiivisessa plasmassa, johon oli lisätty HBV-kontrolleja pitoisuutena 3,7 Log10 IU/ml. Merkittäviä häiriöitä ei havaittu näiden kommensaaliorganismien läsnäollessa, minkä osoitti minimaalinen kvantitointipoikkeama kontrollinäytteistä, joissa häiritseviä aineita ei ollut. Taulukko 8. Häiriötestaus kommensaaliorganismit Keskimääräinen pitoisuus Log10 IU/ml Vinouma Log10 IU/ml Ryhmä 1 [BK-virus, Cytomegalovirus, Epstein Barr -virus, 3,51 0,10 ihmisen herpesvirus 6a, ihmisen herpesvirus 8] Ryhmä 2 [Adenovirus 2, Adenovirus 5, Dengue V2, Dengue 3,38 0,22 V3, Dengue V4] Ryhmä 3 [Parvo B19, HTLV 1, HTLV 2, Ilheus (ILHV), 3,62 0,06 Keltakuume, Zikavirus] Ryhmä 4 [HPV 16, HPV 18, HSV 1, HSV 2, Dengue V1] 3,57 0,04 Ryhmä 5 [St Louisin enkefaliitti, VZV, Vacciniavirus, 3,57 0,03 Länsi-Niilin virus] HAV 3,58 0,05 Banzivirus 3,41 0,19 HIV-1 3,47 0,15 HIV-2 3,56 0,05 Rubella 3,16 0,44 Influenssa A 3,60 0,03 HCV 3,58 0,04 Häiritsevät aineet endogeeniset ja eksogeeniset aineet NeuMoDx HBV Quant Test Strip -testiliuskan suorituskyky arvioitiin sellaisten eksogeenisten ja endogeenisten häiritsevien aineiden läsnäollessa, joita tyypillisesti löytyy kliinisistä HBV-plasmanäytteistä. Näitä olivat esimerkiksi epänormaalin suuret pitoisuudet veren komponentteja sekä yleiset antiviruslääkkeet, jotka on luokiteltu taulukossa 9. Oheisessa taulukossa 10 luetellut kaikki endogeeniset ja eksogeeniset aineet lisättiin seulottuun HBV-negatiiviseen ihmisen plasmaan, johon oli lisätty 3,7 Log10 IU/ml, ja tietoja seurattiin häiriöiden varalta. Lisäksi hepatiitti B -infektioon liittyvät yleiset sairaustilat testattiin plasmasta mahdollisten häiriöiden varalta. Sivu 12/ 18

13 Taulukko 9. Häiriöiden testaus eksogeeniset aineet (lääkeluokitukset) Ryhmä Lääke Luokitus Tsidovudiini (ZDV) Sakinaviiri Ritonaviiri Klaritromysiini Interferoni alfa-2a Interferonialfa-2b Abakaviirisulfaatti Amprenaviiri Ribaviriini Entekaviiri Fluoksetiini Valasykloviirihydrokloridi Tenofoviiridisoproksiili Lamivudiini Gansikloviiri Valgansikloviiri Nevirapiini Efavirentsi Lopinaviiri Enfuvirtidi Siprofloksasiini Paroksetiini Adefoviiri (dipivoksiili) Atsitromysiini Indinaviirisulfaatti Sertraliini Käänteistranskriptaasin estäjä HIV-proteaasinestäjä HIV-proteaasinestäjä Antibiootti Immuunimodulaattori Immuunimodulaattori Käänteistranskriptaasin estäjä Proteaasin estäjä Immuunimodulaattori HBV-antivirus SSRI-masennuslääke Antiviruslääke HBV-/HIV-antiviruslääke HBV-/HIV-antiviruslääke CMV-antiviruslääke CMV-antiviruslääke Käänteistranskriptaasin estäjä Käänteistranskriptaasin estäjä Proteaasin estäjä HIV-fuusion estäjä Antibiootti SSRI-masennuslääke Antiviruslääke Antibiootti HIV-proteaasinestäjä SSRI-masennuslääke Sivu 13/ 18

14 Taulukko 10. Häiritsevien aineiden testaus eksogeeniset ja endogeeniset aineet Endogeeninen Keskimääräinen pit. Log10 IU/ml Vinouma Log10 IU/ml Hemoglobiini 3,50 0,20 Triglyseridit 3,51 0,09 Bilirubiini 3,56 0,13 Albumiini 3,51 0,17 Eksogeeniset (lääkkeet) Keskimääräinen pit. Log10 IU/ml Vinouma Log10 IU/ml Ryhmä 1: Tsidovudiini (ZDV), sakinaviiri, ritonaviiri, klaritromysiini, interferoni alfa- 2a, interferoni alfa-2b 3,58 0,08 Ryhmä 2: Abakaviirisulfaatti, amprenaviiri, ribaviriini, entekaviiri, fluoksetiini, valasykloviirihydrokloridi 3,56 0,04 Ryhmä 3: Tenofoviiridisoproksiili, lamivudiini, gansikloviiri, valgansikloviiri, nevirapiini 3,59 0,06 Ryhmä 4: Efavirentsi, lopinaviiri, enfuvirtidi, siprofloksasiini, paroksetiini, 3,60 0,07 Ryhmä 5: Adefoviiri (dipivoksiili), atsitromysiini, indinaviirisulfaatti, sertraliini 3,56 0,19 Sairaustila Keskimääräinen pit. Log10 IU/ml Vinouma Log10 IU/ml Antinukleaarivasta-aine (ANA) 3,61 0,10 Systeeminen Lupus Erythematosus (SLE) 3,63 0,10 Nivelreuma (RA) 3,57 0,09 HCV-vasta-aineet 3,58 0,07 HBV-vasta-aineet 3,64 0,11 Alkoholikirroosi 3,68 0,15 Reumatekijä (RF) 3,63 0,10 Ei-alkoholiperäinen steatohepatiitti (NASH) 3,49 0,06 Laboratorion tarkkuus NeuMoDx HBV Quant Test Strip -testiliuskan tarkkuus määritettiin testaamalla 8-osainen paneeli HBV-näytteitä, jotka kattoivat genotyypit A ja C, käyttämällä kolmea NeuMoDx System -järjestelmää 12 päivänä. Ajon, päivän ja järjestelmän sisäiset tarkkuudet luokiteltiin ja keskihajonta yhteensä oli 0,22 Log10 IU/ml. Käyttäjien välistä tarkkuutta ei luokiteltu, koska käyttäjällä ei ole merkittävää roolia näytteiden käsittelemisessä NeuMoDx System -järjestelmällä. Taulukko 11. Laboratorion sisäisen tarkkuuden tutkimustulokset PANEELIN OSA TAVOITEPIT. [Log10 IU/ml] KESKIM. PIT. [Log10 IU/ml] N Vinouma SD ajon sisällä Päivän SD:n sisällä Järjestelmän SD:n sisällä SD yhteensä Genotyyppi A Genotyyppi C 7,75 7, ,14 0,06 0,07 0,07 0,07 5,75 5, ,11 0,07 0,10 0,10 0,10 3,75 3, ,11 0,11 0,13 0,15 0,15 1,75 1, ,23 0,16 0,22 0,22 0,22 6,27 6, ,10 0,08 0,09 0,10 0,10 4,27 4, ,08 0,08 0,10 0,10 0,10 3,27 3, ,09 0,08 0,12 0,12 0,12 2,27 2, ,12 0,12 0,15 0,16 0,16 Erienvälinen uusittavuus NeuMoDx HBV Quant Test Strip -testiliuskan erienvälinen uusittavuus määritettiin käyttämällä kolmea eri avainreagenssierää NeuMoDx Lysis Buffer 1 -lyysauspuskuria, NeuMoDx Extraction Plate -eristyslevyä ja NeuMoDx HBV Quant Test Strip -testiliuskaa. Suorituskyky arvioitiin HBV-genotyyppien A ja C 8-osaisella paneelilla. Testaus tehtiin käyttämällä kolmea reagenssierää kolmessa NeuMoDx System -järjestelmässä kuutena (6) päivänä. Erien sisäinen ja erienvälinen variaatio analysoitiin. Enimmäisvinouma oli yhteensä 0,12 Log10IU/ml ja enimmäiskeskihajonta yhteensä 0,24 Log10 IU/ml. Merkittävää eroa ei havaittu suorituskyvyssä erien välillä, sillä kaikkien paneelin osien kvantitointi oli toleranssimääritysten sisällä. Sivu 14/ 18

15 Taulukko 12. Erienvälisen toistettavuustutkimuksen tulokset PANEELIN OSA Genotyyppi A Genotyyppi C TAVOITEPIT. [Log10 IU/ml] KESKIM. PIT. [Log10 IU/ml] N Vinouma SD erän sisällä SD ERIEN välillä SD yhteensä 8,02 7, ,03 0,15 0,09 0,17 6,02 5, ,06 0,17 0,06 0,18 4,02 3, ,12 0,14 0,09 0,17 2,02 1, ,10 0,21 0,12 0,24 6,27 6, ,05 0,06 0,08 0,10 4,27 4, ,04 0,22 0,09 0,24 3,27 3, ,03 0,20 0,07 0,21 2,27 2, ,05 0,13 0,13 0,18 Kontrollin teho NeuMoDx HBV Quant Assay -määritykseen sisältyneen SPC1:n tehokkuus prosessivaiheen virheiden raportoinnissa tai NeuMoDx HBV Quant Assay -määrityksen suorituskykyyn vaikuttava inhibitio arvioitiin käyttämällä kahta yleistä HBV-genotyyppiä (A ja C). Testatut olosuhteet vastasivat prosessin kriittisten vaiheiden epäonnistumisia, joita voi tapahtua näytteenkäsittelyn aikana ja joita NeuMoDx System -järjestelmän toimintaa valvovat anturit eivät välttämättä havaitse. SPC1:n tehokkuus arvioitiin simuloimalla tällaiset virheolosuhteet. Prosessin epätehokkuuksia, joilla oli haitallinen vaikutus HBV:n havaitsemiseen/kvantitointiin, heijasti SPC1-kohteen suorituskyky (inhibiittorin läsnäolo ja Wash -vaiheen puute). Olosuhteissa, joissa vaikutusta SPC1:n monistukseen ei esiintynyt, HBV-kohteen osoitettiin monistuvan kontrollinäytteiden raportoidun kvantitoinnin 0,2 Log10 IU/ml sisällä. Taulukko 13. Näytteen prosessikontrollin tehokkuus Prosessin vaiheen Näytteen prosessikontrollin HBV-kohteen monistustila Määritystulos testattu virhe monistustila Presence of Inhibitor (Inhibiittorin läsnäolo) No Wash Delivered (Pesua ei tehty) No Wash Blowout (Ei pesun tyhjennystä) Not Amplified (Ei monistettu) Not Amplified (Ei monistettu) Amplified (Monistettu) Not Amplified (Ei monistettu) Not Amplified (El monistettu) Amplified (Monistettu) Unresolved (Ratkaisematon) Unresolved (Ratkaisematon) Positive with Quantitation within 0.2 Log10 IU/mL of Control (Positiivinen ja kontrollin kvantitointi arvon 0,2 Log10 IU/ml sisällä) Ristikontaminaatio NeuMoDx HBV Quant Assay -määrityksen ristikontaminaatioaste määritettiin testaamalla kolme HBV-näyteryhmää, jotka sisälsivät vaihtelevasti erittäin positiivisia ja negatiivisia näytteitä. Tämä sisälsi yhteensä 144 normaalin, HBV-negatiivisen ihmisen EDTA-plasmanäytteen replikaattia ja 144 korkean titterin HBV-näytereplikaattia, joiden konsentraatio oli 8,0 Log10 IU/ml. Kaikki 144 replikaattia negatiivisista näytteistä olivat negatiivisia, mikä tuotti ristikontaminaatioasteen 0 %. Näytematriisin ekvivalenssi Testaus tehtiin vastaavien HBV-tulosten määrittämiseksi, kun näyte oli otettu sekä etyleenidiamiinitetraetikkahappoputkiin (EDTA-putki) ja happositraattidekstroosiputkiin (acid citrate dextrose, ACD-putki). Lisäksi määritettiin tuoreiden ja pakastettujen näytteiden välinen vastaavuus. 40 yksittäistä luovuttajaa haettiin BioIVT:ltä, biologisten näytteiden toimittajalta. Näytteet oli otettu sekä EDTA- että ACD-näyteputkiin. Näitä vastaavia näytteitä säilytettiin 4 C:ssa, ja ne lähetettiin pakastamattomina testauslaitokseen. Saapumisen jälkeen niihin lisättiin neljä (4) HBVtasoa ja niiden vastaavuus testattiin. Näytteisiin lisättiin joko HBV-genotyyppiä A tai HBV-genotyyppiä C. Alkulisäyksen ja testauksen jälkeen näytteet pakastettiin vähintään 24 tunniksi. Tämän pakastevarastointijakson jälkeen näytteet sulatettiin ja testattiin uudelleen. Tuoreiden ja pakastettujen näytteiden sekä EDTA- ja sitraattinäytteiden tulosten vastaavuutta verrattiin regressioanalyysillä. Nämä tiedot osoittavat erinomaista vastaavuutta tuoreiden ja pakastettujen näytteiden sekä EDTA- ja ACD-näytteiden välillä. Taulukko 14. Regressioanalyysi näytteen vastaavuustuloksista Parametri [hyväksyntäkriteerit] Tuore vs. pakastettu ACD vs. K2EDTA Kulmakerroin [0,9 1,1] 1,002 0,996 Leikkauspiste [< 0,5] -0,031 0,018 Määrityskerroin [R 2 > 0,95] 0,995 0,993 Sivu 15/ 18

16 Näytteen stabiliteetti HBV-negatiivisiin EDTA-plasmanäytteisiin lisättiin ehjää HBV-virusta 3,7 Log10 IU:ta/ml ja näytteet tutkittiin kolmena eri ajankohtana välittömästi (aika 0), neljän (4) tunnin jälkeen NeuMoDx System -järjestelmässä ja kahdeksan (8) tunnin jälkeen NeuMoDx System -järjestelmässä. Merkittävää eroa suorituskyvyssä ei havaittu, mikä osoitti, että enintään 8 tunnin säilytys NeuMoDx System -järjestelmässä on hyväksyttävää. Samanlainen testaus tehtiin myös plasmalle, jota säilytettiin laboratorion jääkaapissa (lämpötilassa 2 8 C) enintään 7 päivää ennen testausta, ja merkittävää eroa suorituskyvyssä ei havaittu. Lopuksi testattiin plasmanäytteet, joita säilytettiin 18 C:n lämpötilassa enintään 6 kuukautta ennen käsittelyä, ja niissä ei esiintynyt merkittäviä eroja verrattuna tuoreisiin näytteisiin. Pakastus-sulatusjakso toistettiin, eikä siinä esiintynyt suorituskykymuutoksia kahden (2) pakastus-/sulatusjakson jälkeen. Menetelmän korrelaatio NeuMoDx HBV Quant Assay -määrityksen kvalitatiivinen ja kvantitatiivinen suorituskyky arvioitiin vertaamalla FDA:n hyväksymään / CE-hyväksyttyyn vertailumääritykseen testaamalla laimentamattomia kliinisiä näytteitä HBV-infektoituneilta potilailta. Testaus tehtiin sisäisesti NeuMoDx-yhtiön tiloissa yksöissokkoutetulla tutkimuksella, jossa käytettiin kolmesta (3) erillisestä vertailulaboratoriosta saatuja kliinisiä näytteitä. Yhteensä 308 HBVpositiivisen ja -negatiivisen näytteen tulokset kerättiin kvalitatiiviseen analyysiin, jotta voitiin laskea NeuMoDx HBV Quant Assay -määrityksen kliininen herkkyys ja spesifisyys. Kvalitatiivinen analyysi tehtiin niin, että alle LLoQ-arvon olevat positiiviset näytteet otettiin mukaan ja ilman niitä, koska näin heikosti positiivisten näytteiden luokitus voi vaihdella testien välillä. Yhteensä 97 HBV-positiivista kliinistä näytettä molempien testien yhteisellä lineaarisella alueella käytettiin pohjana lineaarisen regression luomisessa kvantitatiivisen suorituskyvyn määrittämistä varten. Erinomaisen herkkyyden ja spesifisyyden lisäksi NeuMoDx HBV Quant Test Strip -testiliuskalla oli erinomainen kvantitatiivinen korrelaatio vertailumäärityksen kanssa. Näiden tulosten perusteella NeuMoDx HBV Quant Assay -määrityksen herkkyyden arvioitiin olevan 100 % (CI 96,4 100 %) ja spesifisyyden 95,6 % (CI 91,9 97,7 %). Nämä 95 %:n luottamusvälit laskettiin käyttämällä 95 %:n pisteen luottamusvälimenetelmää julkaisun EP12-A2, User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance, Approved Guideline, Vol 28, No 3, mukaisesti. 6 Taulukko 15. NeuMoDx HBV Quant Assay -määrityksen kliinisen herkkyyden ja spesifisyyden metriikka NeuMoDx 288 Molecular System -järjestelmällä Vertailumääritys (POS) Vertailumääritys (NEG) YHTEENSÄ NeuMoDx HBV Quant Assay -määritys (POS) NeuMoDx HBV Quant Assay -määritys (NEG) YHTEENSÄ HERKKYYS = 100 % 95 %:n CI (96,4 100 %) SPESIFISYYS = 95,6 % 95 %:n CI (91,9 97,7 %) Taulukko 16. NeuMoDx HBV Quant Assay -määrityksen kliininen herkkyys ja spesifisyys NeuMoDx 288 Molecular System - järjestelmällä, kun näytteet < LLoQ oli jätetty pois Vertailumääritys (POS) Vertailumääritys (NEG) YHTEENSÄ NeuMoDx HBV Quant Assay -määritys (POS) NeuMoDx HBV Quant Assay -määritys (NEG) YHTEENSÄ HERKKYYS = 100 % 95 %:n CI (96,3 100 %) SPESIFISYYS = 97,5 % 95 %:n CI (94,3 98,9 %) Sivu 16/ 18