KUORIMATERIAALIEN SEKUNDAARISET ANTIMIKROBISET YHDISTEET

Transkriptio

1 KUORIMATERIAALIEN SEKUNDAARISET ANTIMIKROBISET YHDISTEET Niina Saviranta Pro gradu -tutkielma Kasviagrobiotekniikka Soveltavan biotekniikan instituutti Luonnontieteiden ja ympäristötieteiden tiedekunta Kuopion yliopisto Marraskuu 2005

2 KUOPION YLIOPISTO, Luonnontieteiden ja ympäristötieteiden tiedekunta Soveltavan biotekniikan koulutusohjelma, kasviagrobiotekniikan pääaine SAVIRANTA, NIINA, M.M.: Kuorimateriaalien sekundaariset antimikrobiset yhdisteet Pro gradu -tutkielma, 80 s. Pro gradu -tutkielman ohjaajat: dosentti MMT Reijo Karjalainen ja FT Arja Tervahauta Marraskuu 2005 Avainsanat: sekundaarimetaboliayhdisteet, antimikrobisuus, kasvitaudit, fenolit Kasvitaudit aiheuttavat taloudellisesti merkittäviä satotappioita käytössä olevista tehokkaista torjuntamenetelmistä huolimatta. Patogeenit kehittävät jatkuvasti uusia, torjunta-aineille resistenttejä kantoja, eikä torjunta-aineiden kehittely ole yhtä nopeaa. Perinteisillä torjunta-aineilla on myös useita kuluttajan kannalta ei-toivottuja ominaisuuksia, kuten haitallisuus ihmiselle ja hidas hajoaminen luonnossa. Näiden seikkojen vuoksi tutkijat etsivät uusia vaihtoehtoja kasvitautien torjuntaan. Nykyään pyritäänkin löytämään kasvien omiin patogeenintorjuntamekanismeihin perustuvia torjuntamenetelmiä, joiden avulla voitaisiin korvata synteettisiä torjunta-aineita tai ainakin vähentää niiden käyttöä. Useiden kasvien sekundaarimetaboliittien on tutkittu olevan antimikrobisia, ja siksi niiden käyttöä erilaisten kasvitautien torjunnassa tutkitaan. Tärkeän sekundaarimetaboliittien ryhmän muodostavat fenoliset yhdisteet, sillä suuri osa kasvien tuottamista puolustusyhdisteistä on fenoleita tai niiden johdannaisia. Tässä työssä tutkittiin tomaatin (Lycopersicum esculentum), omenan (Malus domestica) Gloster-lajikkeen, karpalon (Vaccinium oxycoccos) ja puolukan (Vaccinium vitis-idaea) kuoriuutteiden antimikrobisia vaikutuksia verkkolaikun (Drechslera teres), kauranlehtilaikun (Drechslera avenae) ja Fusarium avenaceum -sienen kasvuun in vitro sekä karpalon ja puolukan kuoriuutteiden vaikutuksia härmän (Blumeria graminis) kasvuun in vivo. Kuoriuutteiden antimikrobisuutta in vitro testattiin agardiffuusiomenetelmällä, ja in vivo sumuttamalla uutteita vesiliuoksessa kasvien lehdille. Testatuista kuoriuutteista kaikki inhiboivat jossain määrin Drechslera teres- ja Fusarium avenaceum -sienten kasvua karpalon ja puolukan ollessa tehokkaimpia, ja Drechslera avenae -sienen kasvua inhiboivat ainoastaan karpalo ja puolukka. Karpalon ja puolukan kuoriuutteiden tehoa Blumeria graminis -sientä vastaan ei tässä tutkimuksessa kyetty osoittamaan, sillä infektio oli liian voimakas.

3 UNIVERSITY OF KUOPIO, Faculty of Natural and Environmental Sciences Institute of Applied Biotechnology, Plant Agrobiotechnology SAVIRANTA, NIINA, M.M.: Antimicrobial secondary compounds of plant peel materials M.Sc. thesis, 80 p. Supervisors: Reijo Karjalainen, docent, Ph.D., Arja Tervahauta, Ph.D. November 2005 Keywords: secondary metabolites, antimicrobial activity, plant diseases, phenols Plant diseases cause economically significant yield reductions, although many effective methods to prevent these diseases are available. The reason for that are pathogens which continuously develop strains that are resistant to fungicides. Fungicide development is not that fast. Common fungicides have many unwanted properties. They may be harmful to humans or degrade slowly in nature. Because of these circumstances researchers are looking for new alternatives to be used in protecting plants from diseases. Naturally occurring biologically active compounds from plants are being researched to develop more natural fungicides, which could be used to replace synthetic ones or reduce the amount they are used. Many plant secondary metabolites have antimicrobial properties, and their use in preventing plant diseases is under research. Phenolic compounds are one of the most important plant secondary metabolites because many antimicrobial compounds produced by plants are phenolic. In this study the antimicrobial activity of tomato (Lycopersicum esculentum), apple (Malus domestica) variety Gloster, cranberry (Vaccinium oxycoccos) and lingonberry (Vaccinium vitis-idaea) peel materials against three different fungi (Drechslera teres, Drechslera avenae and Fusarium avenaceum) in vitro, and cranberry and lingonberry peel materials against Blumeria graminis in vivo was investigated. Antimicrobial activity in vitro was screened by agar diffusion method and in vivo by spraying water solution of peel material extracts onto plant leaves. All four peel material extracts inhibited the growth of Drechslera teres and Fusarium avenaceum in some level, cranberry and lingonberry being the most effective. Only cranberry and lingonberry inhibited the growth of Drechslera avenae. The effectiveness of cranberry and lingonberry peel extracts against Blumeria graminis could not be proved because of too strong infection.

4 ESIPUHE Tein opinnäytetyöni Kuopion yliopiston soveltavan biotekniikan instituutille kesän ja syksyn 2005 aikana. Työni ohjaajina toimivat dosentti Reijo Karjalainen sekä FT Arja Tervahauta. Kiitos ohjaajilleni neuvoista ja ohjauksesta sekä tutkimuksen että kirjallisen työn aikana. Kiitän myös ekologisen ympäristötieteen laitosta mahdollisuudesta tehdä työni laitoksen tiloissa. Kuopiossa Niina Saviranta

5 SISÄLLYS 1. JOHDANTO Sekundaarimetabolia Sekundaarimetaboliittien esiintymispaikat kasveissa Fenoliset sekundaariyhdisteet Fenolisten yhdisteiden tehtävät ja esiintyminen kasveissa Fenolisten yhdisteiden luokittelu Flavonoidit Fenolihapot Lignaanit ja ligniinit Polymeeriset tanniinit Fenolisten sekundaarimetaboliittien synteesi Sekundaariset terpeeniyhdisteet Alkaloidit Sekundaarimetaboliittien antimikrobisuus Sekundaarimetaboliittien käyttö kasvinsuojelussa Kasviuutteet Sekundaarimetaboliittien terveysvaikutukset Sivuvirrat TUTKIMUKSEN TAVOITTEET MATERIAALIT JA MENETELMÄT Kasvimateriaalin käsittely ja säilytys Kuorimateriaalien uutto ja kokonaisfenolipitoisuuden määritys Tutkitut mikrobit Verkkolaikkua aiheuttava Drechslera teres Kauranlehtilaikkua aiheuttava Drechslera avenae Fusarium avenaceum Härmää aiheuttava Blumeria graminis...38

6 3.4. Antifungaalisuustestit Härmäsienen testaus in vivo Tilastollinen testaus TULOKSET Kokonaisfenolipitoisuuden määritys Kontrollimaljat Kuoriuutemaljat Sienten kasvun inhibitio Verkkolaikkua aiheuttava Drechslera teres Kauranlehtilaikkua aiheuttava Drechslera avenae Fusarium avenaceum Härmäsienen testaus in vivo TULOSTEN TARKASTELU Kuori- ja kasviuutteiden teho eri mikrobien kasvun inhiboijina Kuorimateriaalien kokonaisfenolipitoisuudet Antimikrobisten yhdisteiden hyödyntäminen Kasvitautien torjunta Elintarvikemikrobien torjunta Ihmisten sairauksien ennaltaehkäisy JOHTOPÄÄTÖKSET...65

7 7 1. JOHDANTO 1.1. Sekundaarimetabolia Kasveissa tapahtuvaa kemiallisten yhdisteiden synteesiä ja hajotusta kutsutaan metaboliaksi. Metaboliaan osallistuu lukuisia entsyymejä, ja se voidaan jakaa anaboliaan eli synteesiin sekä kataboliaan eli hajotukseen. Tärkeimpien yhdisteiden kuten sokerien, aminohappojen, rasvahappojen, nukleotidien sekä niistä johdettujen polymeerien metaboliareitit eri organismien välillä ovat hyvin samankaltaisia. Tällaista metaboliaa kutsutaan primaarimetaboliaksi, ja sen jatkuvasti tuottamia kasville elintärkeitä yhdisteitä primaarimetaboliiteiksi (Mann 1987). Primaarimetaboliiteilla on kasveissa useita solun jakautumiseen, hengitykseen, yhdisteiden varastointiin ja lisääntymiseen liittyviä tehtäviä (Bourgaud ym. 2001). Sekundaarimetaboliitteja puolestaan tuotetaan vain tietyissä kasvin kehitysvaiheissa tai vasteena ulkopuolisiin stressitekijöihin, ja niiden tuottamiseksi kasvit voivat käyttää useita eri metaboliareittejä. Primaari- ja sekundaarimetabolia ovat kytköksissä toisiinsa, koska sekundaarimetaboliittien lähtöaineina toimivat usein primaarimetabolian tuottamat pienimolekyyliset yhdisteet (Mann 1987). Kasvien sekundaarimetaboliitit jaetaan niiden biosynteesireittien mukaan fenolisiin yhdisteisiin, terpeeneihin ja alkaloideihin (Harborne 1999, ref. Bourgaud ym. 2001) Sekundaarimetaboliittien esiintymispaikat kasveissa Fenolisen yhdisteen sijainti kasvissa riippuu sen tehtävästä ja kemiallisesta luonteesta, kuten vesi- tai rasvaliukoisuudesta. Vesiliukoiset yhdisteet, kuten antosyaniinit, joissa on yksi metyyliryhmä, kerääntyvät usein mm. solun vakuoleihin (Alfenito 1998), kun taas esimerkiksi kahden metyyliryhmän esiintyminen fenolisen yhdisteen rakenteessa saa yhdisteen sijoittumaan solun rasvaliukoisiin osiin kuten lehden pinnan vahakerrokseen (Harborne 1980, ref. Keskitalo, 2001). Fenolisia yhdisteitä on runsaasti kasvien pintasolukoissa ja niiden läheisyydessä (Hirota ym. 1998), joissa niiden tehtävänä on suojata kasvia ulkoisilta uhilta. Eräs merkittävimmistä fenolisten

8 8 yhdisteiden esiintymispaikoista kasveissa ovat soluseinät, joissa fenoliset polymeerit, lignaanit ja ligniinit, toimivat kasvin tukirankana (Davin & Lewis 2000). Sekundaarimetaboliittien esiintyminen vaihtelee eri kasvinosien välillä. Esimerkiksi kukissa fenolisia yhdisteitä on runsaasti, ja lisäksi hedelmien, vihannesten ja mukulakasvien kuorista on löydetty suuria fenoliainepitoisuuksia (Keskitalo 2001). Tavallisesti sekundaarimetaboliitteja tuotetaan kasveissa runsaasti, jos typen saanti on niukkaa, eli luonnonkasveista voidaan löytää suurempia sekundaariainepitoisuuksia kuin lannoitetuilla mailla kasvaneista viljelykasveista. Tämä johtuu siitä, että kun ravinteita on tarjolla runsaasti, yhteytetty hiili käytetään sekundaariyhdisteiden sijaan biomassan tuottamiseen (Holopainen 2001) Fenoliset sekundaariyhdisteet Kasvien fenoliset yhdisteet ovat orgaanisia yhdisteitä. Fenolisella yhdisteellä tarkoitetaan sellaista yhdistettä, jossa aromaattiseen renkaaseen on liittynyt yksi tai useampi hydroksyyliryhmä. Fenolinen hydroksyyliryhmä on hapan. Jos yhdisteessä on useita fenolisia hydroksyylisubstituentteja, kutsutaan sitä polyfenoliksi (Waterman & Mole 1994). Kaikissa korkeammissa kasveissa esiintyy lukuisia erilaisia fenolisia yhdisteitä, ja niiden rakenteet ja pitoisuudet vaihtelevat suuresti. Jopa eri kasvilajikkeiden välillä on havaittu eroja fenolisten yhdisteiden koostumuksissa ja pitoisuuksissa (Keskitalo 2001). Kasvien fenoliset yhdisteet voidaan ryhmitellä useilla eri tavoilla, mutta yleensä ne jaetaan flavonoideihin, fenolihappoihin, lignaaneihin ja polymeerisiin tanniineihin (Puupponen-Pimiä ym a). Taulukossa 1 on esitetty eräitä fenolisia yhdisteitä, niiden esiintymispaikkoja sekä ominaisuuksia.

9 9 Taulukko 1. Fenolisia yhdisteitä, niiden esiintymispaikkoja ja ominaisuuksia Yhdiste Esiintymispaikkoja Ominaisuuksia Kemferoli Parsakaali, tee Inhiboi sienten kasvua Myrisetiini Marjat, omena, sipuli Inhiboi sienten kasvua. Antioksidantti Kversetiini Marjat, omena, sipuli Esiintyy kaikissa kasveissa. Antioksidantti Delfinidiini Marjat, hedelmien kuoret, punaviini Antaa hedelmille värin Katekiini Punaviini, tee Antioksidantti Kahvihappo Oliivit, kahvi, valkoviini Esiintyy kaikissa kasveissa Kanelihappo Tärkeä välituote flavonoidien synteesissä Naringeniini Sitrushedelmien kuoret Harvinainen yhdiste Salisyylihappo Paju Osallistuu kasvien signaalinvälitykseen Resveratroli Marjat, rypäleet, punaviini Tuotetaan vasteena mikrobien hyökkäyksille Fenolisten yhdisteiden tehtävät ja esiintyminen kasveissa Fenolisia yhdisteitä esiintyy kasvien lisäksi myös muilla eliöillä, kuten eläimillä ja mikro-organismeilla, mutta valtaosa niistä on muodostunut kasveissa (Luckner 1990, ref. Keskitalo ym a). Fenoliset yhdisteet esiintyvät kasveissa yksinkertaisina substituoituina fenoleina, pääasiallisesti glykosideinä tai monimutkaisina ja suurina polymerisoituneina molekyyleinä, kuten ligniinit ja tanniinit. Useat fenolihapot taas esiintyvät kiniinihappoon tai glukoosiin esteröityneinä (Puupponen-Pimiä ym a, Keskitalo ym a). Fenoliset yhdisteet voivat olla kasveissa liittyneinä muihin aineenvaihduntatuotteisiin, kuten esimerkiksi proteiineihin tai aminohappoihin, minkä lisäksi niitä on mm. peptideissä ja entsyymeissä, koska ne osallistuvat vedyn sitomiseen. Fenolit ovat reaktiivisia, vesiliukoisia ja usein happamia, ja ne kykenevät sitomaan metalleja. Kasveissa esiintyvät fenolit hapetetaan fenolaasientsyymien avulla monofenoleista difenoleiksi ja edelleen kinoneiksi ja polyfenoleiksi (Keskitalo ym a).

10 10 Fenolisilla yhdisteillä on kasveissa useita tehtäviä. Lignaanit ja ligniinit muodostavat kasvien tukirangan, jonka avulla solu pysyy muodossaan ja kasvi pystyssä. Pintasolukoiden fenoliset yhdisteet taas auttavat kasvia suojautumaan ulkoa tulevilta stressitekijöiltä, kuten UV-valolta, patogeeneiltä, hyönteisiltä ja kasvinsyöjiltä (Keskitalo 2001). Fenolit toimivat myös vuorovaikutustekijöinä kasvin ja ympäristön välillä, ja vuorovaikutus voi olla joko symbioottista, puolustavaa tai houkuttavaa (Keskitalo 2001). Fenoliset yhdisteet osallistuvat mm. symbioosibakteerien houkutteluun juurissa (Coronado ym. 1995). Fenoliset yhdisteet toimivat myös kasvin sisäisinä viestinvälittäjinä kasvihormonien tavoin (Keskitalo 2001), ja esimerkiksi salisyylihapolla on tärkeä rooli kasvin signalointitapahtumissa (Lee ym. 1995). Fenoliset yhdisteet osallistuvat myös kukinnan indusoimiseen (Quattrocchio ym. 1999), ja ne ovat tärkeitä myös siitepölyn elävyyden ja itävyyden ylläpitäjiä (Napoli ym. 1999). Fenolisten yhdisteiden synteesiin vaikuttavat patogeenien hyökkäysten lisäksi erilaiset ympäristötekijät kuten auringonvalo, lämpö ja ilmankosteus sekä kasvien geneettiset ominaisuudet, kasvihormonit ja tarjolla olevat ravinteet (Keskitalo 2001). Tärkeimpiä fenolisten yhdisteiden synteesiin vaikuttavia ympäristötekijöitä ovat valo ja ravinteet (Dixon & Paiva 1995, Keskitalo 2001). Auringonvalo ja matalat lämpötilat lisäävät fenolisten yhdisteiden, erityisesti antosyaniinin määrää kasveissa, kun taas suuret typpipitoisuudet vähentävät niiden kerääntymistä kasviin. Tämän vuoksi mm. luonnonmarjoissa on arveltu olevan enemmän fenolisia yhdisteitä kuin viljellyissä marjoissa (Kähkönen ym. 2001). Auringonvalo ja UV-säteily saavat kasveissa aikaan mm. antosyaniinien, isoflavonoidien ja flavonien muodostumista, kun taas matalat lämpötilat indusoivat antosyaniinien tuottoa (Dixon & Paiva 1995). Kasvin vahingoittuminen puolestaan saa aikaan mm. kumariinin ja ligniinin synteesiä, ja patogeenien hyökkäykset indusoivat kasvin muodostamaan mm. stilbeenejä, kumariineja ja flavanoleja. Maan matala typpipitoisuus johtaa flavonoidien ja isoflavonoidien muodostumiseen kasvissa, kun taas fosfaatin puutteessa syntetisoidaan antosyaniineja ja raudan puutteessa fenolihappoja (Dixon & Paiva 1995).

11 11 Ympäristön aiheuttamat stressit voivat haitata kasvin kasvua ja kehitystä. Stressitekijöiden seurauksena muodostuvia fenolisia yhdisteitä kutsutaan indusoituviksi fenoleiksi (Keskitalo 2001, Dixon & Paiva 1995), mutta yhdisteitä muodostuu myös kasvin normaalin kasvun ja kehityksen aikana, mutta tällöin pitoisuus- ja koostumusmuutosten tapahtuvat hitaammin kuin stressin aikana. Normaalitilanteessa synteesi riippuu yhteyttämisestä ja yhteyttämistuotteiden saatavuudesta. Fenoleiden merkitys kasvin normaalissa kasvussa ja varsinkin erilaisissa stressitilanteissa tulee esille, kun kasvi on vuorovaikutuksessa ympäröivän ekosysteemin kanssa (Keskitalo 2001). Joitakin fenolisia yhdisteitä, kuten kahvihappoa ja kversetiiniä esiintyy useimmissa kasveissa, kuten monissa marjoissa (Häkkinen ym. 1999), mutta valtaosaa yhdisteistä tavataan kuitenkin vain tietyissä kasveissa. Marjoissa, hedelmissä ja vihanneksissa on havaittu olevan runsaasti fenolisia yhdisteitä, mutta niiden pitoisuus ja tyyppi voivat vaihdella. Samoin vaihtelua voi esiintyä saman lajin eri lajikkeiden välillä, ja esimerkiksi tummissa ja vaaleissa hedelmissä on eri määrä antosyaniineja (Keskitalo 2001). Flavonoidipitoisuuteen ja -tyyppiin vaikuttaa myös kasvin kehitysaste, sillä sekundaarimetabolia on usein riippuvainen siitä. Sekundaarimetaboliittien määrä kasvissa kasvaa usein kukintaan saakka, jonka jälkeen pitoisuudet laskevat (Phippen & Simon 1998, ref Keskitalo 2001). Hedelmän kypsymisen edetessä kuorien flavonoidipitoisuus nousee kun taas hedelmänlihassa pitoisuus laskee (Venkitakrishnan ym. 1997, ref Keskitalo 2001). Omenoiden flavonoidipitoisuus riippuu biosynteesireittien eri entsyymien aktiivisuudesta (Lister ym. 1996, ref. Keskitalo 2001) Fenolisten yhdisteiden luokittelu Flavonoidit Flavonoidit ovat kasvien sekundaarimetaboliitteja, ja niitä on löydetty yli 4000 erilaista (Verhoyen ym. 2002). Flavonoidit voidaan jakaa niiden molekyylirakenteen perusteella (Rice-Evans ym. 1996) mm. antosyanidiineihin, flavonoleihin ja flavanoleihin eli

12 12 katekiineihin. Antosyanidiineja ovat mm. syanidiini ja malvidiini, flavonoleja mm. kversetiini ja myrisetiini sekä kemferoli, ja katekiineihin kuuluvat mm. epikatekiini ja gallokatekiini. (Puupponen-Pimiä ym a). Kuvassa 1 on esitetty erilaisten flavonoidien rakennekaavoja. OH OH OH OH OH HO O HO O HO O OH OH OH O OH OH O a. Kversetiini b. Katekiini c. Naringeniini HO OH OH OH HO O OH HO OH O OH OH OH OH O OH O OH d. Kemferoli e. Naringeniinikalkoni f. Delfinidiini Kuva 1. Flavonoidien rakennekaavoja (Puupponen-Pimiä ym a, Zheng & Wang 2003, Aoki ym. 2000). Suuri osa flavonoideista esiintyy lehtien epidermissä, ja niitä on myös hedelmissä ja varsinkin niiden kuorissa, vihanneksissa, pähkinöissä, siemenissä, kaarnassa sekä kukissa (Verhoyen ym. 2002). Suurimmat flavonoidipitoisuudet löytyvät usein kasvien lehdistä ja muista maanpäälisistä osista, sillä flavonoidien synteesiä ei tapahdu ilman valoa (Hyvärinen 2001). Flavonoideja esiintyy useimmissa kasveissa, ja niiden osuus voi olla suuri, ja esimerkiksi kuivatussa vihreässä teessä on flavonoideja noin 30 % painosta. Flavonoideilla on tutkittu olevan erilaisia antimikrobisia vaikutuksia. Flavonoidit voivat olla joko voimakkaan värisiä kuten antosyanidiinit tai värittömiä kuten flavanonit (Keskitalo ym a).

13 13 Flavonoidit ovat polyfenolisia yhdisteitä, ja niiden rakenteelle yhteistä on kaksi bentseenirengasta, A ja B, joita yhdistää kolmen hiiliatomin muodostama yksikkö, C. Jos C-renkaaseen on liittynyt hydroksyyliryhmä, yhdisteet ovat 3-hydroksiflavonoideja kuten flavonoleja, antosyanidiineja tai flavanoleja. Jos taas C-renkaaseen ei ole kiinnittynyt hydroksyyliryhmää, ovat yhdisteet 3-deoksiflavonoideja, kuten flavanoneja tai flavoneja (Keskitalo ym a). Näiden lisäksi flavonoideissa voi esiintyä vaihteleva määrä hydroksyyliryhmiä, sokereita, happiryhmiä ja metyyliryhmiä (Miller 2005). Kuvassa 2 on esitetty flavonoidien ja isoflavonoidien yleiset rakennekaavat O B O A C O O a b Kuva 2. Flavonoidien (a) ja isoflavonoidien (b) yleiset rakennekaavat (Keskitalo ym a). Isoflavonoideissa B-rengas on liittynyt C-renkaan C3-hiileen eikä C2-hiileen kuten flavonoideissa. Isoflavonoideja esiintyy vain osassa kasveista, sillä kaikki kasvit eivät kykene syntetisoimaan niitä. Isoflavonoideja on löydetty yli 800 erilaista, ja niitä ovat esimerkiksi daitseiini ja genisteiini (Keskitalo ym a). Flavonoideilla on kasvissa useita erilaisia tehtäviä. Ne mm. suojaavat kasveja UV-Bsäteilyltä, patogeenien hyökkäyksiltä ja hyönteisiltä sekä toimivat lisäksi signaalimolekyyleinä (Verhoyen ym. 2002). Antosyaniinit toimivat kasveissa väriaineina, ja ne antavat värin mm. marjoille (Puupponen-Pimiä ym a). Ne ovat antosyanidiinien glykosideja, ja antavat punaisen, sinisen ja violetin värin kukille ja hedelmille sekä toimivat hyönteisten houkuttelijoina ja edesauttavat siten kukkien pölytystä (Mann 1987, Keskitalo 2001). Lisäksi siementen ja hedelmien väri auttaa siementen levittämisessä (Holton & Cornish 1995). Antosyaniinien lisäksi myös

14 14 kalkonit antavat kasville väriä (keltainen), ja niitä esiintyy mm. palkokasvien siemenissä (Keskitalo ym a). Flavonoidit voivat toimia myös makujen, kuten mm. happaman tai kitkerän maun antajina. Esimerkiksi klorogeenihappo antaa maun oluelle ja flavonoidien glykosidit sitrushedelmille, ja myös perunan kitkeryys johtuu fenolisista yhdisteistä. Näiden lisäksi myös useiden yrttien makuun vaikuttavat monet erilaiset fenoliset yhdisteet. Chilipippureille puolestaan maun antavat kapsasiinit ja inkiväärille vanilliinijohdannaiset (Hyvärinen 2001). Fytoaleksiinit ovat pienimolekyylisiä sekundaarimetaboliitteja, joita tuotetaan kasvissa vasteena mikrobien hyökkäyksille. Niiden rakenteet vaihtelevat suuresti, ja eri kasveissa esiintyy erilaisia fytoaleksiineja, mutta niiden toiminta on hyvin samanlaista. Tunnetuimpia fytoaleksiinejä ovat mm. herneen pisatiini, alfalfan glyseoliini, ja medikarpiini sekä resveratroli. Osa fytoaleksiineista, kuten isoflavonoidit glyseoliini ja medikarpiini voidaan luokitella flavonoideiksi. Fytoaleksiineja ei normaalisti esiinny terveessä kasvissa, ja niitä syntyy kun mikrobi tai jokin ympäristötekijä (UV-säteily, raskasmetallit, myrkylliset kemikaalit) vaurioittaa kasvia (Mann 1987, Dakora ym. 1993, Schulze ym. 2005). Fytoaleksiinit toimivat estämällä suurina pitoisuuksina patogeenin kasvua isännässä. Niitä tuotetaan terveessä kasvisolukossa ja niitä kerääntyy vahingoittuneen tai infektoituneen kasvisolukon ympärille. Resveratroli on fytoaleksiini, joka suojaa kasveja useiden eri sienipatogeenien hyökkäyksiltä (Seppänen ym. 2004, Roemer & Mahyar-Roemer 2002). Se vaikeuttaa patogeenin pääsyä kasviin, vaikkei voi inhiboida itiöiden itämistä. Resveratrolin glukosidi piseidi sen sijaan estää sekä itiöiden itämistä että patogeenin pääsyä kasvin sisälle (Schulze ym. 2005). Useiden kasvien lehdistä on löydetty suuria pitoisuuksia resveratrolia, ja pitoisuus korreloi kasvin puolustuskyvyn kanssa (Schouten ym. 2002). Stilbeenit ovat fytoaleksiineja, jotka vaikuttavat kasvihormonien tavoin, ja ne voivat säädellä mm. abskisiinihapon toimintaa (Keskitalo ym a).

15 Fenolihapot Fenolihapot ovat orgaanisia happoja, joiden rakenteelle on yhteistä niiden sisältämä bentseenirengas ja siihen liittyneet useat hydroksyyliryhmät. Kuvassa 3 on esitetty erilaisten fenolihappojen rakennekaavoja. Fenolihapot ovat kasveissa yleisiä, ja ne jaetaan kanelihappoihin ja bentsoehappoihin. Kanelihappoihin kuuluvat mm. kahvihappo ja parakumariinihappo, kun taas bentsoehappoja ovat mm. gallihappo ja p- hydroksibentsoehappo (Puupponen-Pimiä ym a). Gallihappo ja sen dimeerinen muoto ellagihappo ovat yleisiä hydrolysoituvien tanniinien rakenneosia (Waterman & Mole 1999). Kanelihapot esiintyvät kasveissa useimmin yksinkertaisina hydroksikarboksyylihappojen tai glukoosin estereinä, ja bentsoehapot glukosideina. Fenolihapot voivat konjugoitua mm. flavonoidien, alkoholien, hydroksirasvahappojen, sterolien ja glukosidien kanssa (Herrmann 1989). HO COOH COOH COOH OH HO HO a. Salisyylihappo b. Kahvihappo c. p-kumariinihappo OH HO OH COOH CH 3 O COOH O OH HO d. Gallihappo e. Kanelihappo f. Ferulahappo Kuva 3. Fenolihappojen rakennekaavoja (Dixon ja Paiva 1995, Zheng ja Wang 2003). Fenolihapot syntetisoidaan kasvissa fenyylipropanoidireittiä pitkin, jolloin fenyylialaniinista muodostuu kanelihappoa ja siitä edelleen muita fenolihappoja. Useilla fenolihapoilla on todettu olevan antimikrobisia vaikutuksia (Cowan 1999, Binutu ym. 1996, Fujita & Kubo 2002), ja salisyylihapolla on tärkeä rooli kasvin viestinvälityksessä.

16 Lignaanit ja ligniinit Ligniinit ovat fenolisia polymeerejä, joita esiintyy kasvisolujen soluseinissä, ja niitä on löydetty ainoastaan maalla elävistä kasveista. Ligniinit ovat toiseksi yleisin luonnossa esiintyvä polymeeri, ja ne koostuvat koniferyyli-, sinapyyli- tai parakumaryylialkoholista esiintyen kolmiulotteisina heterogeenisinä makromolekyyleinä selluloosaan ja hemiselluloosaan kiinnittyneinä (Keskitalo ym a). Kuvassa 4 on esitetty koniferyylialkoholin, kumaryylialkoholin ja sinapyylialkoholin rakennekaavat. OH OH OH OCH 3 CH 3 O OH OH OH a b c OCH 3 Kuva 4. Koniferyylialkoholin (a), kumaryylialkoholin (b) ja sinapyylialkoholin (c) rakennekaavat (Rouhi ym. 2000). Lignaanien koko ja rakenne vaihtelee, mutta ne ovat yleensä dimeerisiä. Lignaaneja esiintyy useissa kasveissa mm. siementen kuorissa, lehdissä, kukinnoissa, kaarnassa ja juurissa, sekä erityisesti havupuissa (Rouhi ym. 2000, Davin & Lewis 2000). Myös pellavasta on löydetty suuria lignaanipitoisuuksia, ja lignaanin on havaittu sijoittuvan siementen aleuronikerrokseen (Hyvärinen 2001). Lignaanit koostuvat kahdesta toisiinsa liittyneestä fenyylipropanoidiyksiköstä (Keskitalo ym a), ja niitä ovat mm. matairesinoli, enterolaktoni ja kuusen hyrdoksimatairesinoli (Hyvärinen & Taipale 2001, Saarinen ym. 2000). Ligniinit ja lignaanit muodostuvat samoista yksinkertaisista fenolisista lähtöaineista mutta eri reittejä pitkin. Ligniinejä ja lignaaneja muodostuu, kun monolignolit (E)- koniferyylialkoholi, (E)-parakumaryylialkoholi ja (E)-sinapyylialkoholi muodostavat

17 17 dimeerejä, oligomeerejä ja polymeerejä radikaalien kautta fenolisista lähtöaineista (Rouhi ym. 2000). Lignaanit ovat usein dimeerejä, kuten kahdesta koniferyylialkoholista koostuva (+)-pinoresinoli (Kato ym. 1998), ja ligniinit polymeerejä, ja lisäksi lignaaneihin on usein liittynyt jokin sokeri (Keskitalo 2001). Ligniininejä on kasvisolujen soluseinissä mm. johtojänteissä, joissa niiden tehtävänä on toimia tukena ja veden läpäisyesteenä (Whetten & Sederoff 1995). Lignaanit puolestaan osallistuvat kasvin puolustusreaktioihin patogeeneja ja kasvinsyöjiä vastaan, sillä niillä on havaittu olevan mm. antioksidanttisia ja antimikrobiaalisia ominaisuuksia (Dinkova- Kostova ym. 1996) Polymeeriset tanniinit Tanniinit ovat molekyylimassaltaan suuria yhdisteitä. Polymeeriset tanniinit muodostuvat flavonoideista ja fenolihapoista, ja ne jaetaan hydrolysoituviin ja kondensoituviin tanniineihin. Hydrolysoituvat tanniinit ovat joko gallotanniineja tai ellagitanniineja riippuen siitä, mikä happo niiden rakenteessa on. Kondensoituja tanniineja kutsutaan myös proantosyanidiineiksi, ja ne ovat katekiinien oligomeerejä (Puupponen-Pimiä ym a, Keskitalo ym a). Usein kaikkia tanniineja kutsutaan myös polyfenoleiksi, mutta on muistettava, että kaikki polyfenolit eivät ole tanniineja (Waterman & Mole 1999). Proantosyanidiineja esiintyy useissa kasveissa, ja ne ovat polyfenolisia yhdisteitä, useimmiten flavan-3-olimonomeerien oligomeerejä. Yleisimpiä proantosyanidiineja ovat prosyanidiinit, jotka ovat katekiini-, epikatekiini- ja gallihappoesteriketjuja, ja prodelfinidiinit, jotka koostuvat gallokatekiini- ja epigallokatekiinimonomeereistä (Lazarus ym. 1999) Fenolisten sekundaarimetaboliittien synteesi Sekundaarimetabolian kolme tärkeintä lähtöainetta ovat sikimaatti, aminohapot ja asetaatti. Sikimaatista syntetisoidaan useita aromaattisia yhdisteitä kuten aromaattisia

18 18 aminohappoja, kanelihappoa, lignaaneja ja polyfenoleita. Aminohapot toimivat alkaloidien lähtöaineina, ja asetaatista syntetisoidaan mm. polyfenoleja ja terpeenejä (Mann 1987). Kuvassa 5 on esitetty sikimaatti- ja fenyylipropanoidireiteillä muodostuvien fenolisten yhdisteiden biosynteesireitit pääpiirteittäin. Glukoosi ja muut 4-7-hiiliset sokerit Glykolyysi Fosfoenolipyruvaatti (PEP) Erytroosi-4-fosfaatti Pentoosifosfaattireitti Sikimaatti Korismaatti Hydrolysoituvat tanniinit Tryptofaani Fenyylialaniini PAL Tyrosiini Salisyylihappo Kumariinit Isoflavanonit Isoflavonit trans-kanelihappo para-kumariinihappo Kalkoni Flavanonit Flavonit Kahvihappo Ferulahappo Sinappihappo Fytoaleksiinit Flavonolit Dihydroksiflavonolit Flavan-3,4-diolit (Katekiini) Antosyaniinit Kondensoituneet tanniinit Kuva 5. Sikimaatti- ja fenyylipropanoidireiteillä muodostuvien fenolisten yhdisteiden biosynteesireitit pääpiirteittäin (Muokattu Dixon & Paiva 1995, Mann, 1987, Verhoyen ym. 2002, Ju ym. 1997)

19 19 Sikimaattireitiltä saadaan runsaasti erilaisia aromaattisia yhdisteitä kuten aromaattisia aminohappoja, joista tärkeimpänä fenyylialaniini johdoksineen. Useat näistä yhdisteistä ovat polyfenoleja. Sikimaattireitti on tärkeä korkeammissa kasveissa, koska reitiltä saadaan mm. kasvien soluseinien tarvitsemia ligniinejä (Mann 1987). Sikimaattisynteesiin käytetään noin 20 % kasvien yhteyttämistä hiilihydraateista, ja sikimaatin syntetisoiminen kasvissa on edellytys fenolisten yhdisteiden muodostumiselle (Keskitalo 2001). Lähtöaineina sikimaattireitillä toimivat fosfoenoyylipyruvaatti (PEP) ja erytroosi-4- fosfaatti (Waterman & Mole 1994), joista ensimmäinen saadaan glukoosista glykolyysin avulla ja jälkimmäinen glukoosista pentoosifosfaattireittiä pitkin. Molemmat lähtöaineet ovat sokerien primaarimetabolian (fotosynteesi, hiilen assimilaatio) tuotteita. Lähtöaineista muodostuu sikimaatti ja edelleen korismaatti. Korismaatista voidaan syntetisoida tryptofaania pelkistämällä ja lisäämällä aminoryhmä tai tyrosiinia prefenaatin kautta pelkistävän aminaation, dekarboksylaation ja aromatisaation avulla. Samoin prefenaatin kautta korismaatista voidaan syntetisoida fenyylialaniinia (Dixon & Paiva 1995). Fenyylialaniinista muodostuu aminoryhmän poiston avulla, PAL:n (fenyylialaniiniammoniakkilyaasi) katalysoimana (Dixon & Paiva 1995) transkanelihappoa ja siitä para-kumariinihappoa happea lisäämällä (Michal 1999). Synteesireitti fenyylialaniinista para-kumariinihappoon saakka kuuluu nk. yleiseen fenyylipropanoidisynteesiin, jossa muodostuneita yhdisteitä käytetään lähtöaineina erilaisissa jatkosynteeseissä. PAL on keskeinen säätelyentsyymi, jonka tehtävänä on ohjata aminohapoista muodostuneiden lähtöaineiden saatavuutta jatkosynteeseihin ja vaikuttaa siten kaikkien fenolisten yhdisteiden synteesiin (Keskitalo 2001). Transkanelihaposta voidaan syntetisoida bentsoehapon kautta salisyylihappoa (Dixon & Paiva 1995, Keskitalo 2001). Trans-kanelihaposta syntetisoidaan C4H-entsyymin avulla para-kumariinihappoa, josta saadaan hapen lisäyksellä kahvihappoa (Mann 1987). Kahvihaposta muodostuu ferulahappoa, josta syntyy edelleen joko koniferyylialkoholia tai sinappihappoa. Sinappihaposta saatava sinapyylialkoholi toimii koniferyylialkoholin ja parakumariinista muodostuvat para-kumaryylialkoholin tavoin ligniinien ja lignaanien

20 20 rakenneosina (Michal 1999). Kuvassa 6 on esitetty ligniinien ja lignaanien biosynteesireitit pääpiirteittäin. Monolignoneista, kuten kumarolista, ferulolista ja sinapolista syntyy radikaaleja, jotka polymerisoituvat ja siten muodostuu ligniiniä ja lignaania. Lignaanit, kuten (+)-pinoresinoli koostuvat koniferyylialkoholista, kun taas ligniinisynteesiin käytetään myös kumariinihappojen alkoholeja (Keskitalo 2001). Lignaanisynteesireitin isoformiset entsyymit (+)-pinoresinoli/(+)-larisiresinolireduktaasi muuttavat pinoresinolin larisiresinoliksi, joten entsyymit säätelevät tuotteiden muodostumista pinoresinolista eteenpäin (Dinkova-Kostova ym. 1996) Kumaraatista erkanee myös stilbeenien synteesireitti (Michal 1999). para-kumariinihappo para-kumaryylialkoholi Kahvihappo Kaffyylialkoholi Ligniinit Ferulahappo Koniferyylialkoholi Lignaanit Sinappihappo Sinapyylialkoholi Kuva 6. Ligniinien ja lignaanien biosynteesireitit pääpiirteittäin (Muokattu Michal 1999, Dixon & Paiva 1995). Para-kumariinihaposta voidaan syntetisoidan myös kumariinia, ja kahvihaposta kinonihappoa lisäämällä klorogeenihappoa (Dixon & Paiva 1995). Näissä muokkauksissa tapahtuu aromaattisia hydroksylaatioita ja metylaatioita sekä sivuketjujen muokkausta (Waterman & Mole 1994). Vapaat fenolihapot eivät yleensä keräänny suurina määrinä kasviin, vaan ne konjugoituvat sokerien, soluseinän hiilihydraattien tai orgaanisten happojen kanssa (Dixon & Paiva 1995). Para-kumariinihappoon lisätään koentsyymi-a, ja tämä yhdiste kondensoituu kolmen C 2 -yksikön eli asetaatin kanssa muodostaen kalkoneita (Dixon & Paiva 1995). Tässä yhdistyvät siten sikimaatti- ja asetaattireitit (Waterman & Mole 1994). Kalkonit, kuten tetrahydroksikalkoni, isomerisoituvat spontaanisti flavanoneiksi. Flavanonit ovat kasveissa melko harvinaisia (esim. naringeniini greipin kuoressa), ja niistä syntetisoidaan flavoneita ja happea lisäämällä dihydroksiflavonoleja. Näistä puolestaan

21 21 saadaan flavonoleja ja flavan-3,4-diolien kautta antosyaniineja ja katekiineja. Katekiinit kuten esimerkiksi (+)-katekiini ovat proantosyaniidien eli kondensoituneiden tanniinien rakenneosia yhdessä flavan-3,4-diolin kanssa. Hydrolysoituvat tanniinit puolestaan ovat gallihapon ja glukoosin johdannaisia (Mann 1987). Fenolisten yhdisteiden synteesi tapahtuu pääasiallisesti ns. fenyylipropanoidireittiä, jonka lähtöaineena on fenylialaniini (Aoki ym. 2000). Reitin välivaiheita kutsutaan fenyylipropanoideiksi, ja ne ovat kaikki muodostuneet fenyylialaniinista kanelihapon ja parakumariinihapon kautta (Dixon & Paiva 1995, Keskitalo ym a). Kun fenyylipropanoideja hapetetaan, niiden sivuketju lyhenee, ja lopulta jäljelle jää salisyylihappoa (Michal 1999). Flavonoidit ovat suuri fenolisten sekundaarimetaboliittien ryhmä, ja niiden perusrunko on 15-hiilinen (Mann 1987). Fenolisten yhdisteiden biosynteesireitin tärkein entsyymi on PAL, jonka lisäksi on löydetty lukuisia muita synteesin säätelyyn osallistuvia entsyymejä (Keskitalo 2001). Fenolisten yhdisteiden synteesi tapahtuu solulimassa tai endoplastisella retikulumilla, missä sijaitsevat myös synteesireitin tärkeimmät entsyymit. Esimerkiksi PAL-entsyymiä on löydetty solulimasta ja mikrosomeista (Rasmussen & Dixon 1999) Sekundaariset terpeeniyhdisteet Terpeenit ovat kasveissa esiintyviä rasvaliukoisia isopreenijohdannaisia, jotka muodostuvat toisiinsa liittyneistä viiden hiiliatomin muodostamista isopreeni- eli 2- metyylibutadieeniyksiköistä. Terpeenit voidaan jakaa mono-, seskvi-, di- ja triterpeeneihin niiden rakenteen perusteella (Waterman & Mole 1994). Monoterpeenien perusrunko koostuu kahdesta isopreniyksiköstä, kun taas seskviterpeeneissä näitä yksiköitä on kolme, diterpeeneissä neljä ja triterpeeneissä kuusi (Linnala & Keskitalo 2001). Erilaisia terpenoideja on löydetty kasveista yli (McGarvey & Croteau 1995). Terpenoidien rakenteet vaihtelevat suuresti, ja terpeenejä löytyy sekä primaari- että sekundaarimetaboliittien joukosta. Mono-, di- ja seskviterpeenit ovat sekundaarisia terpenoidiyhdisteitä, kun taas mm. sterolit ja karotenoidit ovat primaarisia terpenoideja. Primäärisiä terpenoideja esiintyy lähes kaikissa kasveissa, mutta sekundaarisia vain

22 22 osassa kasveista (Keskitalo ym b, Chappell 1995). Terpeenejä on mm. kasvien aromaattisissa, haihtuvissa öljyissä yhdessä muiden yhdisteiden kuten flavonoidien kanssa. Normaalisti haihtuvien yhdisteiden osuus kuivapainosta on vain noin 1 %, ja erilaisia terpeenejä voi esiintyä kasvissa lajista riippuen kahdesta satoihin (Linnala & Keskitalo 2001). Monoterpeenejä on sekä avoketjuisia että yhdestä tai kahdesta rengasrakenteesta koostuvia. Seskviterpeenit puolestaan ovat avoketjuisia tai syklisiä hiilivetyjä, alkoholeja tai ketoneita. Yleisimpiä sekundaarimetabolian terpeeniyhdisteitä ovat monoterpeenit kamferi, karvakroli, mentoli, karvoni sekä α- ja β-pineeni, seskviterpeeni β-farnesaani sekä diterpeenit retinaali ja kauraani (Keskitalo ym b). Terpeenien synteesiin ja siten niiden määrään kasvissa vaikuttavat useat ympäristötekijät kuten valon voimakkuus ja laatu sekä valojakson pituus ja lämpötila. Valon voimakkuus voi joko vähentää tai lisätä haihtuvien öljyjen pitoisuutta kasvissa kasvilajista riippuen. Esimerkiksi timjamin (Li ym. 1996, ref. Linnala & Keskitalo 2001) ja tillin (Hälvä ym. 1992, ref. Linnala & Keskitalo 2001) öljypitoisuus laskivat heikossa valossa, kun taas salvian öljypitoisuus (Li ym. 1996, ref. Linnala & Keskitalo 2001) oli korkeampi samoissa valaistusolosuhteissa. Lisäksi valon voimakkuus voi vaikuttaa haihtuvien öljyjen koostumukseen (Li ym. 1996, ref. Linnala & Keskitalo 2001). Myös valon aallonpituus vaikuttaa kasvien terpeenipitoisuuksiin, ja eri kasvilajeilla eri valolaadut saavat aikaan maksimaalisen terpeenien muodostumisen (Linnala & Keskitalo 2001). Useilla kasveilla pitkä valojakso lisää haituvien öljyjen, kuten monoterpeenien pitoisuutta (Dragar & Menary 1994, ref. Linnala & Keskitalo 2001). Tämä lisäksi valojakso voi vaikuttaa öljyn koostumukseen siten, että eripituiset valojaksot saavat aikaan erilaisten terpeenien muodostumista (Linnala & Keskitalo 2001). Lämpötilan kohoaminen aiheuttaa monilla kasveilla terpeenien muodostumisen lisääntymistä (Bernath ym. 1991, ref Linnala & Keskitalo 2001, Hälvä ym. 1993, ref. Linnala & Keskitalo 2001), ja lämpötilalla on vaikutuksia myös haihtuvien öljyjen koostumukseen. Lämpötilan vaikutukset riippuvat kuitenkin usein valojakson pituudesta (Linnala & Keskitalo 2001). Myös monet ympäristöstressit kuten hyönteisvioitukset käynnistävät

23 23 haihtuvien yhdisteiden synteesin kasvissa, ja monia näistä yhdisteistä ei tavata lainkaan terveessä ja vahingoittumattomassa kasvissa (Holopainen 2001). Haihtuvat öljyt osallistuvat kasvissa mm. hyönteisten houkuttelemiseen ja tuholaisilta puolustautumiseen, minkä lisäksi niillä on todettu olevan antimikrobisia vaikutuksia. (Keskitalo ym b). Havupuiden pihka-aineet muodostuvat mono- ja diterpeeneistä (hartsihapoista), ja ne auttavat kasvia puolustautumaan tuhohyönteisiä vastaan (Phillips & Croteau 1999). Monoterpeenit toimivat kasveissa mm. kukkien hajuaineina pölyttäjiä houkutellen, hyönteisten syöntiä ja munintaa estävinä yhdisteinä tai myrkkyinä kuten pyretroideina (hyönteismyrkkyjen pyretriini). Seskviterpeenit puolestaan toimivat syönnin estäjinä vaikuttaen proteiineja hajottavien entsyymien toimintaan, ja myös triterpeenien ryhmään kuuluu useita syöntiä estäviä yhdisteitä, kuten saponiinit ja limonoidit (Holopainen 2001). Timjamin, mäkimeiramin ja kyntelin haihtuvien öljyjen monoterpeenien ja fenolisten monoterpeenien on tutkittu estävän sienten ja muiden mikrobien kasvua, ja tärkeimpiin vaikuttaviin aineisiin kuului mm. karvakroli (Chorianopoulos ym. 2004). Piparmintun haihtuvista öljyistä on löydetty mm. mentolia, ja myös nämä öljyt inhiboivat erilaisten kasvipatogeenien kasvua (Işcan ym. 2002). Japaninsetrin haihtuvien öljyjen on puolestaan tutkittu sisältävän δ-kadineenia, isoledeeniä ja γ-muuroleeniä, joilla on havaittu olevan useiden patogeenisten sienten kasvua estävä vaikutus (Cheng ym. 2005). Myös sipulin ja valkosipulin haihtuvien öljyjen on havaittu olevan antimikrobisia (Benkeblia 2004). Terpeenien synteesi tapahtuu asetaatin kautta. Kuvassa 7 on esitetty isopreenisynteesi ja sekundaaristen terpeeniyhdisteiden synteesi pääpiirteittäin. Glukoosista saadaan glykolyysillä fosfoenoyylipyruvaattia, josta tehdään pyruvaattia ja siitä edelleen asetyyli-koentsyymi A:ta. Kolmen asetyyli-koa:n kondensaation ja HMGreduktaasientsyymin avulla saadaan mevalonaattia, josta puolestaan voidaan syntetisoida isopentenyylipyrofosfaattia (IPP) fosforylaation ja karboksylaation avulla. Viisihiilinen IPP on isoprenoidien muodostumisen perusyksikkö (Linnana & Keskitalo 2001), joka toimii isomeerinsä dimetyyliallyylipyrofosfaatin (DMAPP) kanssa geranyylipyrofosfaatin rakennusaineina. Kymmenhiilinen geranyylipyrofosfaatti muodostuu IPP:n ja DMAPP:n kondensoituessa. Siitä saadaan edelleen isoprenoideja,

24 24 kuten erilaisia terpeeniyhdisteitä ja niistä edelleen steroideja kuten kolesterolia (Mann 1987). Mevalonaattireitin lisäksi kasveista on löydetty myös toinen IPP:n muodostumisreitti, jossa IPP:tä muodostuu 1-deoksiksyloosi-5-fosfaatista (Bouvier ym. 1998). DMAPP:stä muodostuu ergotalkaloideja ja geranyylipyrofosdaatista monoterpeenejä kuten limonenia ja α-pineniä. Näiden lisäksi geranyylipyrofosfaatista voidaan syntetisoida yhden IPP-yksikön lisäämisellä viisitoistahiilinen farnesyylipyrofosfaatti ja siitä seskviterpeenejä kuten farnesolia. Farnesylpyrofosfaatti voi muuttua ketjunpidennyksen kautta myös 20-hiliseksi geranyyligeranyylipyrofosfaatiksi, josta muodostuu diterpeenejä kuten fytolia ja kaurihappoa, tai se voi toimia triterpeenisynteesin lähtöaineena (Linnala & Keskitalo 2001). Mono- seskvi- ja diterpeenejä kutsutaan sekundaarisiksi terpeeniyhdisteiksi (Michal 1999). Mevalonaatti/terpeenireitti syntetisoi vain pienen osan fenolisista sekundaarimetaboliiteista (Waterman & Mole 1994). Mevalonaattireitti ja isoprenoidireitti ovat toistensa synonyymejä, ja nykyisin käytetään jälkimmäistä (Chappell 1995). Isopentenyylipyrofosfaatin synteesi tapahtuu sytoplasmassa, josta IPP kuljetetaan eri organelleihin sen mukaan, mikä lopputuote on kyseessä. Mono- ja seskviterpeenejä tuotetaan usein sytoplasmassa, mutta myös plastideissa voi tapahtua niiden synteesiä (Hugueney ym. 1996). Syntetisoidut mono- ja sekskviterpeenit kuljetetaan usein ulos solusta, sillä ne voivat olla liian suurina pitoisuuksina solulle myrkyllisiä (Linnala & Keskitalo 2001).

25 25 Glukoosi Asetyyli-KoA Pyruvaatti Mevalonaatti 1-deoksiksyloosi-5-fosfaatti Isopentenyyli pyrofosfaatti (IPP) Dimetyyliallyylipyrofosfaatti (DMAPP) Geranyylipyrofosfaatti Monoterpeenit Farnesyylipyrofosfaatti Seskviterpeenit Geranyyligeranyylipyrofosfaatti Diterpeenit Kuva 7. Isopreenisynteesi ja sekundaaristen terpeeniyhdisteiden synteesi pääpiirteittäin (Muokattu Michal 1999) Alkaloidit Alkaloidit ovat heterosyklisiä, emäksisiä typpiyhdisteitä (Waterman & Mole 1994). Useat alkaloidit ovat myrkyllisiä tai pahan makuisia, ja toimivat siksi kasvinsyöjien karkottajina. Alkaloidit voidaan jakaa niiden rakenteen perusteella suoraketjuisten ja syklisten aminohappojen johdannaisiin, ja useimmat alkaloidit ovat ornitiini-, lysiini-, fenyylialaniini-, tyrosiini- tai tryptofaanijohdannaisia, ja kaikki nämä ovat L- konfiguraatiossa (Mann 1987). Suoraketjuisista ornitiinista ja lysiinistä muodostuneet alkaloidit jaetaan pyrrolidiini-, piperidiini-, pyrrolitsidiini-, kinolitsidiini- ja pyridiinialkaloideihin, ja näitä ovat mm. hygriini, lupiniini ja nikotiini. Syklisistä fenyylialaniinista ja tyrosiinista muodostuneet alkaloidit puolestaan jaetaan yksinkertaisiin monosyklisiin yhdisteisiin, isokinoliineihin, bentsyylikinoliineihin ja Amaryllidaceae-alkaloideihin, joista tunnetuimpia ovat mm.

26 26 efedriini, meskaliini ja morfiini. Syklisestä tryptofaanista muodostuneet alkaloidit jaetaan yksinkertaisiin, pienillä muokkauksilla syntyneisiin alkaloideihin sekä alkaloideihin, jotka ovat muodostuneet tryptofaanista ja mevalonaatista. Isoprenoidikinoneja saadaan sikimaatin ja mevalonaatin yhdistyessä, ja myös kolesterolista voidaan syntetisoida alkaloideja (Mann 1987). Kuvassa 8 on esitetty alkaloidien synteesireitti pääpiirteittäin. Erilaisia alkaloideja on löydetty yli 7000 (Waterman & Mole 1994), ja niitä tuottavat korkeammat kasvit. Myös kolkisiini ja taksoli ovat tunnettuja alkaloideja (Herbert 2001). Hiilihydraattimetabolia Sitruunahappokierto Glukoosi Sikimaatti Alifaattiset aminohapot Aromaattiset aminohapot Alkaloidit Kuva 8. Alkaloidien synteesireitti pääpiirteittäin (Muokattu Mann 1987) Diterpenoidialkaloideilla on havaittu olevan antimikrobisia ominaisuuksia, ja glykoalkaloidilla voi olla HIV-infektiota inhiboivia ominaisuuksia. Alkaloidit voivat vuorovaikuttaa DNA:n kanssa, ja niiden vaikutusmekanismi perustunee juuri tähän (Cowan 1999). Glykoalkaloideja on löydetty mm. perunasta ja tomaatista. α- ja dehydrotomatiini osallistuvat puolustautumiseen kasvipatogeeneiltä (Friedman 2002). Kuvassa 9 on esitetty α-tomatiinin rakennekaava. H 3 C H CH 3 H O N H CH 3 CH 3 H H H H R H Kuva 9. α-tomatiinin rakennekaava (Friedman 2002).

27 Sekundaarimetaboliittien antimikrobisuus Sienet ovat riippuvaisia kasveista, koska ne eivät kykene itse fotosynteesiin. Kasvit tarjoavat sienille sekä hiiltä että energiaa. Suuri osa sienistä on sapprofyyttejä, jotka elävät kuolleessa kasvimateriaalissa ja hajottavat kasvien yhdisteitä ja vapauttavat siten ravinteita elävien kasvien käyttöön. Osa sienistä elää mykoritsoissa tai endofyytteinä, ja myös tämä on kasville hyödyllistä. Vain pieni osa sienistä on kasveille patogeenisiä. Jotta patogeeni voi tunkeutua kasvisolukkoon ja aiheuttaa infektion, sen on kyettävä kiertämään kasvin puolustusjärjestelmät. Näitä ovat mm. mekaaniset esteet kuten kasvin pinnan kutikula ja kemialliset esteet kuten itiöiden itämistä ja siiteputken kasvua estävät yhdisteet. Nämä kuuluvat ns. konstitutiiviseen puolustukseen, joka on jatkuvasti läsnä. Konstitutiiviset yhdisteet muodostuvat siis jo ennen infektiota, ja niiden tehtävänä on estää tai hidastaa patogeenin pääsyä kasvisolukkoon (Grayer & Kokobun 2001). Jos mikroilmasto on oikeanlainen, kun sieni-itiöt laskeutuvat kasvin pinnalle, itiöt itävät, mikäli kasvi ei voi sitä estää. Kasvi puolustautuu epidermiksen läpäisseitä patogeenejä vastaan vahvistamalla soluseinää, tuottamalla antifungaalisia kemikaaleja ja käynnistämällä systeemisen hankitun resistenssin (SAR) ja ohjelmoidun solukuoleman (hypersensitiivinen reaktio). Tämän saavat aikaan vaurioituneissa soluissa muodostuvat reaktiiviset happilajit, jotka siirtyvät terveisiin soluihin ja stimuloivat niissä erilaisten puolustusmekanismien aktivoitumista. Antifungaalisten kemikaalien tuotto ainoastaan patogeenin läsnä ollessa säästää kasvin hiili- ja energiavarastoja, sillä näiden yhdisteiden tuottaminen vie resursseja kasvin muilta toiminnoilta. Tätä kutsutaan indusoituvaksi puolustukseksi (Grayer & Kokobun 2001). Kasvien fenolisten yhdisteiden on havaittu estävän sienten, bakteerien ja virusten kasvua, ja ne muodostavat tärkeimmän yhdisteryhmän, jonka avulla kasvit puolustautuvat ulkoisia stressitekijöitä vastaan (Tiilikkala 2003). Flavonoidien on havaittu estävän useiden mikrobien kasvua, ja niiden vaikutusmekanismi perustuu niiden kykyyn muodostaa komplekseja solun ulkopuolisten ja liukoisten proteiinien sekä bakteerin soluseinän kanssa. Hyvin lipofiiliset flavonoidit voivat myös hajottaa mikrobien membraaneja ja estää siten niiden toimintaa (Mattila & Kumpulainen 2001). Fenolisten yhdisteiden on havaittu myös inhiboivat mikrobien entsyymitoimintaa. Yhdisteiden antimikrobisuuteen vaikuttaa niiden hydroksyyliryhmien lukumäärä ja

28 28 sijainti. Tutkimuksissa on havaittu runsaasti hydroksyyliryhmiä sisältävien yhdisteiden olevan antimikrobisia, mutta myös päinvastaisia tuloksia on saatu (Cowan 1999). Sienet tarvitsevat normaaliin metaboliaansa pieniä määriä (3-5 µg/ml) fenoleita, mutta suuret konsentraatiot (20 µg/ml) ovat niille myrkyllisiä (Mohapotra ym. 2000, ref. Tripathi & Dubey 2004) Sekundaarimetaboliittien käyttö kasvinsuojelussa Erilaiset kasvipatogeenit ja erityisesti sienitaudit aiheuttavat satotappioita käytössä olevista torjuntakeinoista huolimatta (Maor & Shirasu 2005). Laajalti käytössä olevat kemialliset torjunta-aineet ovat tehokkaita, mutta usein patogeenit kykenevät kehittämään resistenssin kemikaaleja vastaan. Lisäksi torjunta-aineet saattavat olla ihmisille haitallisia, jos ne säilyvät kasvissa kauan, ja myös niiden ympäristöriskit huolestuttavat kuluttajia. Muun muassa näiden seikkojen vuoksi on pyritty kehittämään vaihtoehtoisia torjunta-aineita, joiden vaikuttavat aineet ovat peräisin luonnosta (Tiilikkala 2002). Jo yli 10000:lla kasvien sekundaarimetaboliitilla on havaittu olevan patogeenien kasvua estäviä vaikutuksia, ja tutkimusten edetessä määrän on arvioitu nousevan jopa :een. Kasveista peräisin olevat bioaktiiviset yhdisteet ovat luonnossa hajoavia, ja useimmat niistä ovat ihmiselle myrkyttömiä (Beye 1978, ref. Tripathi & Dubey 2004). Kasvitautien torjunnassa pyritään hyödyntämään kemiallisten fungisidien sijaan yhä enemmän kasvien itsensä sisältämiä, bioaktiivisia yhdisteitä (Tripathi & Dubey 2004). Kasvien tärkeimpiä keinoja puolustautua sieni-, bakteeri- ja viruspatogeenejä vastaan ovat fenoliset yhdisteet (Tiilikkala 2002), mutta myös terpeeniyhdisteillä on todettu olevan antifungaalisia vaikutuksia (Tripathi & Dubey 2004). Kasvien taudinkestävyys paranee, kun niihin ruiskutetaan elisitoreja, jotka käynnistävät kasvien omat puolustusreaktiot. Tunnetuin elisitori on salisyylihappo, joka aktivoi useita kasvin puolustusmolekyylejä, jotka saavat aikaan taudinkestävyyden parantumista. Elisitorikäsittelyt aktivoivat kasvin puolustusjärjestelmän usein hyvin nopeasti (Karjalainen ym. 2002).

29 29 Fenolisia yhdisteitä voidaan käyttää sienten torjuntaan biotekniikassa useilla tavoilla. Niitä voidaan lisätä mm. ruiskuttamalla kasvien pinnalle erilaisten kantaja-aineiden kanssa tai sekoittamalla yhdisteitä kasvualustaan, ja niillä voidaan myös pinnoittaa siemeniä. Tällöin fenoliset yhdisteet toimivat perinteisten torjunta-aineiden tavoin sienitauteja vastaan. Siirtogeenitekniikka tarjoaa uusia mahdollisuuksia; luonnollisia puolustusyhdisteitä koodaavia geenejä voidaan siirtää transgeeniseen kasviin, ja oikeaan promoottoriin yhdistettynä saadaan puolustusyhdiste ekspressoitumaan tarvittavana pitoisuutena juuri siinä kasvinosassa, johon patogeeni tyypillisesti hyökkää. Näin kasvi saadaan itse puolustamaan itseään sienipatogeenejä vastaan Kasviuutteet Useilla kasviuutteilla on havaittu olevan sienten kasvua estäviä vaikutuksia. Inhibition määrään vaikuttavat sekä patogeeni, uutettu kasvi että uuttamiseen käytetty orgaaninen liuotin. Esimerkiksi Chenopodium procerum -kasvin dikloorimetaaniuutoksen on havaittu sisältävän mm. pygmoli -seskviterpeeniä ja dihydrowogoniini -flavononia, jotka estävät Cladosporium cucumerinum -sienen kasvua (Bergeron ym. 1995, ref Tripathi & Dubet 2004). Greipistä eristetty 7-geranoksikumariini puolestaan inhiboi P. italicum- ja P. digitatum -sienten kasvua (Angioni ym. 1998), ja Acacia nilotica -kasvin sitosterolia, α-amyriinia, naringeniini-5-metyylieetteriä, kemferolia, kemferoli-3-oramnosidia ja myrisitiini-3-o-ramnosidia sisältävä metanoliuutos esti P. italicum - sienen kasvua (Tripathi ym. 2002, ref. Tripathi & Dubet 2004). Mustikan ja puolukan lehtien asetoniuutosten on havaittu olevan antifungaalisia verkkolaikkua aiheuttavaa Drechslera teres -sientä vastaan, ja myös kurkuman metanoliuutoksella on samanlaisia vaikutuksia (Renfors 2003). Puna-apilan juuren metanoliuutos estää myös Drechslera teres -sienen kasvua (Vänninen 2005) Sekundaarimetaboliittien terveysvaikutukset Runsaan kasvisten, marjojen ja hedelmien käytön on tutkittu ehkäisevän useiden sairauksien, kuten syövän ja sydänsairauksien riskiä (Sun ym. 2002) sekä pienentävän