Proteiinituoton optimointi kuoppalevyllä Johdanto Ennen ison mittakaavan proteiinituottoja kasvatusolosuhteita kannattaa optimoida. Perinteisesti näitä on tehty käsityönä, mutta solukasvatusten seuranta ja optimointi on tehokasta monileimalaskimissa esim. 24-kuoppalevymittakaavassa, jossa kuopan tilavuus on noin 3 ml. Nykyaikaisissa monileimalaskimissa on monien mittausmahdollisuuksien lisäksi usein mahdollisuus mm. lämmitykseen, ravisteluun ja mm. ravintoliuosten lisäämiseen (engl. dispencer) ohjelmallisesti. Selvitä laitteen soveltuvuus esim. ravistelun osalta, koska kaikki mittalaitteet eivät kestä pitkäaikaista, jatkuvaa ravistelua. Seuraavassa esimerkissä on tutkittu antibioottimäärän (ampisilliini) vaikutusta solumäärään ja proteiinituottotasoon E.coli egfptuottokasvatuksessa 24-kuoppalevyllä (kuva 1). Fluoresenssi kuvaa egfp-tuotemäärää ja on merkitty kuvaajassa katkoviivalla ja yhtenäinen viiva on sameus (absorbanssi, A 595 ). Samantyyppisiä optimointikokeita on helppo tarvittaessa järjestää esim. jos tarvitsee selvittää millä kasvatusmediumilla saadaan paras proteiinituotto tai miten lopputulokseen vaikuttaa glukoosilisäys. Solutuoton optimointi ei välttämättä merkitse optimaalista proteiinituottoa. Laboratoriotyö: Proteiinituoton optimointi kuoppalevyillä Kasvata soluja tarvittava määrä Laimenna solut kasvatusliuokseen Pipetoi levylle Säädä laite ja suorita koe Analysoi tulokset 1. Kasvata käytössä olevia soluja tarvittava määrä esim. erlenmayerissa. 2. Laimenna soluja tuoreeseen temperoituun kasvatusliuokseen tarvittava määrä. Hyönteissolut esimerkiksi vaativat tietyn määrän soluja ympärilleen kasvaakseen. Liiallisen laimennoksen seurauksena solut kuolevat. 3. Pipetoi kasvatettuja soluja vakiomäärä jokaiseen kuoppaan. Varmista, että levy soveltuu soluviljelyyn ja on steriili. 4. Ohjelmoi ja säädä laitteen optiot sopiviksi. Huomaa säätää sekoitusnopeus sopivaksi kullekin levytyypille erikseen, etteivät liuokset läiky levyltä laitteeseen. Varmista kuinka paljon voit mittalaitteella ravistella levyä, koska kaikkia mittalaitteita ei ole tarkoitettu jatkuvaan ravisteluun. Kasvata soluja halutuissa olosuhteissa. 5. Siirrä tulokset taulukkolaskentaohjelmaan ja analysoi tulokset. 1
Tulosten käsittely Kuvassa 1 on esimerkkitulokset optimointikokeesta, jossa tutkittiin erilaisten antibioottimäärien 0-2000 µg/ml vaikutusta proteiinituottotasoon. Yhtenäinen viiva merkitsee solutiheyttä ja katkoviiva tuotemäärää. Kuvaajasta voi havaita, että korkein fluoresenssisignaali on saatu antibioottimäärällä 2000 µg/ml. Tuloksissa on melko paljon hajontaa eli koe pitäisi uusia tulosten varmentamiseksi. Kuva 1 Solutiheyden ja fluoresenssin kehittyminen kasvatusajan funktiona egfp-tuottokasvatuksessa E.colissa 2
Tuloslaskenta onnistuu seuraavasti: Esimerkissä käsitellään suurta mittausdataa ja muokataan sitä järkevämpään ja käsiteltävämpään muotoon. Tarkoituksena on nyt piirtää kuvaaja, jossa on esitetty absorbanssi sekä fluoresenssi mahdollisimman selkeästi ajan funktiona. 1. Siirrä raakadata laitteesta tietokoneelle. 2. Esimerkkituloksissa ongelmana ovat mittausajat, esim. solu D3. Mittausaika on nyt muotoa hh:mm:ss:mss (mss = millisekunnit). Valitse solut, jossa on mittausaika ja avaa solun asetuksista (Format cells) number välilehti. Valitse solun kategoriaksi Time ja muuta esitysmuodoksi mm:ss,0. 3
3. Valitse koko kaavioalue (Ctrl + A). Korvaa replace-komennon avulla :000 muotoon,0. Lopputuloksen pitäisi olla seuraavan kuvan tyylinen. Käytetyssä taulukkolaskentaohjelmassa luvut asemoidaan automaattisesti oikealle ja ei-laskettavat solusisällöt vasemmalle. 4. Nyt mittausdatasta voidaan piirtää kuvaaja. Helpointa on tehdä uusi välilehti kuvaajalle ja lisätä kuvaaja sinne. 5. Lisää uusi mittaussarja painamalla tyhjää kaavioaluetta oikealla hiirenklikkauksella ja valitsemalla Select data -> Add. Aukeaa Edit Series-ikkuna. Anna sarjalle nimi ja hae x- ja y-akselien sarjat toiselta välilehdeltä (mittausaika ja absorbanssi). 4
6. Muokkaa sarjan asetuksista Format data series pisteiden tilalle yhtenäinen viiva (solid line) ja aseta viivan asetuksista Smooth line päälle. 7. Lisätään samalla tavalla yksi fluoresenssi-sarja. Muuta samalla kaavion otsikko ja sarjojen otsikot sopivammiksi (esim. absorbanssi ja fluoresenssi). Koska absorbanssi- ja fluoresenssiarvot ovat eri suuruusluokkaa, kannattaa fluoresenssi asettaa toiselle y-akselille. Tämän muutoksen jälkeen tuotos on huomattavasti selkeämpi. 8. Lisää haluamasi sarjat ja muuta niiden asetuksia siten, että kaavio on mahdollisimman helppolukuinen. Akseleiden asetuksia muuttamalla saat siirrettyä absorbanssi- ja fluoresenssikuvaajat erilleen toisistaan. Aseta akseleille otsikot. 5