METABOLISTEN SAIRAUKSIEN ANALYTIIKAN JÄRJESTÄMINEN NORDLAB OULUSSA Marja-Kaisa Koivula Sairaalakemisti, FT, dosentti
Esityksen sisältö Johdanto Kromatografiset menetelmät Entsymaattinen määritysmenetelmä Alihankinta 2
Metabolisten sairauksien analytiikan haasteita Aineenvaihduntasairaudet hyvin harvinaisia Runsas määrä erilaisia yksittäisiä tauteja, joiden luonne on toisistaan poikkeava Monessa taudissa on eri muotoja. Haastavat tautimuodot tulevat usein esiin vauvana tai lapsena, lievemmät löytyvät tavallisesti myöhemmin. Synnynnäinen aineenvaihduntasairauden epäily Kehitysviivästymät, taantumat Metabolinen kriisi 3
Metabolinen kriisi B -Laktaat B -Pyruv fp-nh4-ion P -ATCH S -Keto-O fs-ffa fs-insu P -Gluk P -ALAT P -CK P -Cl P -Aminoh P -TT-INR P -Lihep5 S -Korsol cb-vekaas2 B -AsylKar B -OHButVT U -Näyte U -Keto-O U -Orgah-O U -Aminoh S -Karni 4
Kromatografiset menetelmät
Kromatografiset menetelmät Ohutlevykromatografia (TLC) oligosakkaridit Aminohappoanalysaattori LC-MS/MS aminohapot asyylikarnitiinit orotaatti GC-MS orgaaniset hapot / /
Ohutlevykerroskromatografia (TLC, Thin Layer Chromatography) Mitä TLC eli ohutlevykromatografia on? Ohuen levyn pinnalla suoritettava kromatografinen menetelmä Tutkittava seos liikkuu huokoisessa aineessa liuottimen avulla. Eri aineet kulkeutuvat eri tavoin ja tapahtuu erottumista. nopea, yksinkertainen ja edullinen analyyttinen menetelmä 7
Mitä TLC:n ajamiseen tarvitaan? TLC-levy eluentti ajoastia näytteiden applikointi: ohut lasikapillaari täplien visualisointikeino 1. UV-valo tai 2. levyn värjäys jodilla tai 3. värjäysreagenssilla (resorsinolireagenssilla) 8
TLC 9 / 29.4.2015 / Esityksen nimi ja esittäjä
TLC: U -Oligs-O 1. 2. 3. 1. Potilasnäyte 2. AGU-kontrolli 3. Salla-kontrolli U- Oligs-O: Aspartylglukosaminuria -> AGU- tauti? U- Aminohapot Geenitesti: AGU-taudin valtamutaatio AGA-geenin pistemutaatio c.488g>c / /
TLC: U -Oligs-O 1. 2. 3. 1. AGU-kontrolli 2. Salla-kontrolli 3. Potilasnäyte U- Oligs-O: Siaalihapon eritys korostunutta -> Sallan tauti? Geenitesti: Sallan taudin valtamutaatio SLC17A5 c.115c>t / /
Erndim: Educational oligosaccarides kit 1. 2. 3. 4. 5. 1. GM1 2. GM2 3. Pompe 4. AGU 5. Schindler / /
Erndim: Educational oligosaccarides kit / /
Aminohappoanalysaattori 14
Aminohappoanalysaattori ioninvaihto-nestekromatografia (HPLC) ph-gradientti automaattinen näytteensyöttäjä kolonniuuni fotometrinen detektori ninhydridivärjäys (kolonnin jälkeen) kvantitatiivinen menetelmä keksitty vuonna 1958 ja Nobelin palkinto 1972 kansainväliset standardit, reagenssit ja kolonnit potilasnäytteen / / esikäsittely tärkeää
Aminohappoanalysaattori 16
Aminohappoanalysaattori 17
Mitä ninhydridi tekee? 570 nm Imino acids 18 440 nm
Aminohappoanalysaattori Integrointi tarkistetaan tulosraportti Laboratoriolääkäri antaa tuloksesta lausunnon. 19 / 29.4.2015 / Marja-Kaisa Koivula
LC-MS/MS LC MS/MS 20
LC-MS/MS 21
LC-MS/MS 22
LC-MS/MS 23
LC-MS/MS: aminohapot Glysiini Methyl-D3 24
LC-MS/MS: aminohapot Glutamiini Tarkoitus on saada samanlainen potilasraportti kuin aiemmin. 25
LC-MS/MS vs. aminohappoanalysaattori LC-MS/MS riippumattomuus reagenssivalmistajista (näytteiden esikäsittely yksinkertaistuu) analyysiajat lyhenevät LC-MS/MS:ssa kaksi erotteludimensiota HPLC:n retentioaika MS/MS fragmentaatio Johtavat suureen spesifisyyteen. Matriisiefekti 26
LC-MS/MS: asyylikarnitiinit, orotaatti Menetelmäkehitys kesken Puhdasaineita vaikea saada 27
LC-MS/MS-metodiikan rajoituksia Matriisiefekti = matriisin ionisaatiosupressio Herkkyysrajat Ionisaatiota ei tapahdu tai tuoteionia ei muodostu. Liikkuvan faasin, lisäaineiden ja virtausnopeuden rajoitukset Sopivien deuteroitujen sisäisten standardien saatavuus 28
GC-MS: Shimadzu QP-2010 SE 29
GC-MS Datan käsittelyä helpottavat MS-kirjastot. 30
GC-MS: orgaaniset hapot (MCAD) 31 / / 29.4.2015 Marja-Kaisa Koivula
GC-MS: orgaaniset hapot (MCAD) 32 / / 29.4.2015
GC-MS: orgaaniset hapot (terve) Kvalitatiivisen tunnistuksen lisäksi eräiden orgaanisten happojen selektiivinen taulukko 33 / / 29.4.2015
Entsymaattinen määritysmenetelmä
Vapaat rasvahapot (fs-ffa) 35
Vapaat rasvahapot (fs-ffa) 36
Alihankinta
Alihankinta Vastasyntyneiden seulonta Happamat hydrolaasit Mukopolysakkaridit Orotaatti Asyylikarnitiinit Karnitiini Muita erityistutkimuksia / /
Yhteenveto
Yhteenveto Haasteellista erityisanalytiikkaa Esikäsittely käsityötä Itse tehdyt menetelmät (in house) Tuloksista annetaan lausunto. Samasta sairaudesta eri variaatioita. Osa alihankitaan ulkomailta. Vastasyntyneiden seulonnan positiiviset löydökset pitää varmistaa ja hoitoa seurata. 40 / 29.4.2015 / Esityksen nimi ja esittäjä
41