Airi Palva ELINTARVIKEHYGIENIA Suolistomikrobit ja niiden merkitys terveydelle Ihminen muodostaa normaalimikrobistonsa kanssa superorganismin, jossa ihmissoluja on vain 10 %. Iholla ja limakalvoilla elää 10 14 mikrobia, valtaosa ruoansulatuskanavan loppupäässä, jossa ne aineenvaihdunnallisesti aktiivisena, lähinnä bakteereista koostuvana noin 1,5 kilon painoisena solumassana muodostavat monimuotoisen dynaamisen ekosysteemin. Suolistomikrobiston koostumusta on tutkittu toistaiseksi laajimmin nukleiinihappopohjaisilla menetelmillä, ja lajitason monimuotoisuudeksi on arvioitu 1 200 16 000 bakteerifylotyyppiä. Suolistomikrobien tiedetään vaikuttavan ihmisen fysiologiaan, immuunipuolustuksen kehittymiseen, kolonisaatioresistenssiin ja ravitsemukseen. Uudet tutkimusmenetelmät ja globaali tutkimuskenttä ovat kuitenkin paljastamassa suolistomikrobien laajempaa merkitystä terveydelle esimerkiksi mikrobiston muutosten liittymistä tulehduksellisiin suolistosairauksiin, ärtyvän paksusuolen oireyhtymään, paksusuolisyöpään, lihavuuteen ja tyypin 2 diabetekseen. Ensimmäiset kirjalliset viittaukset vuodelta 1907 suolistomikrobien merkitykseen ihmiselle on kirjattu Elias Metchnikoffin nimiin. Hän esitti suolistomikrobien aiheuttavan mädäntymistä, joka johtaa ihmisen elimistön myrkyttymiseen ja sitä kautta seniliteettiin ja eliniän lyhenemiseen. Mädättävien mikrobien syrjäyttämiseksi tai niiden kasvun estämiseksi hän suositteli hapatettuja maitotuotteita, jotka sisältävät maitohappoa tuottavia Lactobacillusbakteereita (Drasar ja Hill 1974). Mikrobiologinen perusta suolistomikrobien ja niiden merkityksen tutkimukselle luotiin kuitenkin vasta 1960- ja 1970-luvuilla, jolloin todennettiin anaerobisen bakteeriston keskeinen osuus suoliston kokonaismikrobistossa, kehitettiin näytteenottomenetelmiä ja anaerobiviljelytekniikoita sekä tutkittiin suolistomikrobien esiintymistä ruoansulatuskanavan eri osissa, mikrobistoon vaikuttavia ympäristötekijöitä sekä mikrobiston aineenvaihdunnallista aktiivisuutta ja mahdollista roolia suolistosairauksissa (Drasar ja Hill 1974). Varsinaisen globaalin renessanssin suolistomikrobien tutkimus on kuitenkin kokenut vasta viime vuo sien aikana. Molekyylibiologisen tiedon nopea lisääntyminen sekä viime vuosien merkittävä uusien ja tehokkaiden tutkimustekniikoiden kehittyminen sekä ns. omiikkojen aikakauden alkaminen ovat luoneet uuden ulottuvuuden suolistomikrobiston kartoitukseen sekä ihmiselimistön ja mikrobien vuorovaikutussuhteiden kokonaisvaltaiseen tutkimiseen (Zoetendal ym. 2006, Li ym. 2008, Turroni ym. 2008). Toistaiseksi laajimmin on tutkittu suolistomikrobien lajikoostumusta (kuva). Viljeltävissä olevia suolistobakteereita on arvioitu olevan noin 440 lajia (Rajilic-Stojanovic ym. 2007). Valtaosa (99,9 %) suolistobakteereista on ehdottomia anaerobeja ja useimmat siksi edelleen viljelymenetelmien ulottumattomissa. Uusin ja kattavin tieto lajikoostumuksesta perustuukin viljelystä riippumattomiin nukleiinihappopohjaisiin menetelmiin, joista erityisesti ribosomaalisten RNA-geenien (rrna-geenien, rrna) sekvensointi antaa pohjaa fylogeneettiselle luokitukselle (luokit- 685 Duodecim 2009;125:685 94
ELINTARVIKEHYGIENIA Viljelymenetelmät Mikrobipopulaatio Lajikoostumus? Toiminnallinen aktiivisuus? Geneettinen potentiaali? Nukleiinihapot RNA Proteiinit Metaboliitit DNA 16S-rRNA-pohjaiset tekniikat Metatranskriptomiikka Metaproteomiikka Metabonomiikka Metagenomiikka Kuva. Suolistomikrobien tutkimuksen keskeiset omiikka -pohjaiset menetelmät bakteeriviljelyn ja 16S-rRNAgeenisekvenssiin perustuvien tekniikoiden ohella. Muokattu Zoetendalin ym. (2008) artikkelista Erwin Zoetendalin ystävällisellä avustuksella. 686 telukategoriat esitetty taulukossa 1). Fyylat edustavat Bacteria domeenin ylintä kategoriaa, fylotyypit (Taulukko 1) puolestaan viittavat 16S-rRNA:n perusteella tehtyyn lajitason luokitukseen. Varsinainen bakteerilajien määritys edellyttää kuitenkin, että kohde on viljeltävissä ja useamman geenitoiminnon suhteen luonnehdittavissa. Viljeltyjen suolistobakteerien osuudeksi on arvioitu 10 50 % 1 000 1 200 fylotyypin kokonaismäärästä (Rajilic-Stojanovic ym. 2007). Bakteerien fylogeneettisen luokituksen lisäksi monet uudet diagnostiset menetelmät, mm. mikrosirut, perustuvat rrna-sekvensseihin. Lähivuosien aikana ihmisen normaalimikrobiston koko genomi-informaatio eli mikrobiomi on tarkoitus avata useiden metagenomiikkahankkeiden myötä. Metatranskriptomiikkaan ja -proteomiikkaan sekä muiden aineenvaihduntatuotteiden meta-analyysiin kehitetyt menetelmät antavat puolestaan syvällisempää tietoa suolistomikrobien aineenvaihdunnallisesta aktiivisuudesta kompleksisena ekosysteeminä. Tämä luo uusia mahdollisuuksia mikrobiston (bio) kemiallisten terveysvaikutusten sekä elimistön ja mikrobien vuorovaikutusten eli interaktomiikan ja systeemibiologian tutkimiseen sekä uudentyyppisten hoitojen kehittämiseen. Suolistomikrobiston kehittyminen Yksilön normaalimikrobiston kehittyminen alkaa syntymän aikaan, ja siihen vaikuttavat syntymistapa, kontakti äidin mikrobistoon, ympäristö, vastasyntyneen saama ravinto ja geneettiset tekijät. Alatiesynnytyksessä äidin synnytyskanavan ja ulosteen mikrobit pääsevät välittömästi kolonisoimaan vastasyntyneen ihoa ja limakalvoja. Keisarileikkauksella syntyneillä sitä vastoin ensikontaktiin osallistuvat ensisijaisesti ympäristöstä tulevat mikrobit (Kelly ym. 2007). Synnytystavan lisäksi kehittymässä olevan mikrobiston lajikoostumus riippuu imeväisiän ravitsemuksesta. Alateitse syntyneiden A. Palva
Taulukko 1. Bakteerien fylogeneettiset luokituskategoriat. Kategoria Esimerkki Esimerkki Domeeni Bacteria Bacteria Fyyla Actinobacteria Firmicutes Luokka Actinobacteria Gammaproteobacteria Lahko Bifidobacteriales Enterobacteriales Heimo Bifidobacteriaceae Enterobacteriaceae Suku Bifidobacterium Escherichia Laji (~fylotyyppi) Bifidobacterium longum Escherichia coli Alalaji Bifidobacterium longum subsp. infantis ja rintaruokinnalla ravittujen lasten suoliston valtamikrobisto koostuu bifidobakteereista ja Lactobacillus-suvun edustajista ja vähäisemmässä määrin Escherichia coli-, Bacteroides- ja Clostridium-lajeista, kun taas pulloruokaa saavilla lapsilla mm. Clostridium difficilen, E. colin ja Clostridium perfringensin määrät ovat suuremmat kuin rintamaitoa saavilla (Mitsou ym. 2008). Keisarileikkauksella syntyneillä lapsilla ulosteen normaalimikrobisto kehittyy hitaammin ja eroaa ehkä pysyvästi luonnollisella tavalla syntyneiden lasten mikrobistosta (Grönlund ym. 1999). Tällä saattaa olla yhteys lapsuusiän astma- ja allergiariskiin (Kero ym. 2002, Renz- Polster ym. 2005). Elimistön ja mikrobien vuorovaikutusten tarkempi selvittäminen lisäisi tietoa siitä, millaiselle mikrobistolle vastasyntyneiden ja imeväisikäisten olisi edullisinta altistua ja voitaisiinko bakteerihoidolla ohjata limakalvomikrobiston kehittymistä suotuisampaan suuntaan. Seuraava merkittävä normaalimikrobiston suksessio tapahtuu vieroitusvaiheessa ja siirtymisessä kiinteämpään ravintoon, jolloin lapsen suolistomikrobisto alkaa lajikoostumukseltaan ja lajien määrältään vastata aikuisten mikrobistoa. Suolistomikrobiston koostumus Suun limakalvoilta sekä kielen ja hampaiden eri pinnoilta on DNA-menetelmillä löydetty 13 fyylaan jakautuva ja yli 700 fylotyypistä koostuva mikrobisto, joka on huomattavasti monimuotoisempi verrattuna viljeltyihin (Aas ym. 2005). Nielun limakalvolta on kuvattu 152 fylotyyppiä, ja sen mikrobiston on havaittu olevan hyvin samankaltainen ja stabiili usealla eri koehenkilöllä (Andersson ym. 2008). Ruokatorvessa ei ole omaa viljeltävää normaalimikrobistoa, ja mahalaukku on pienen ph-arvon vuoksi lähes steriili. DNA-tekniikat osoittavat kuitenkin, että ruokatorvesta on löydettävissä ainakin 95 eri fylotyyppiä, jotka kuuluvat kuuteen pääfyylaan (Pei ym. 2004). Mahalaukun limakalvon 16S-rRNA-geenikirjastot ovat puolestaan paljastaneet 128-262 eri fylotyyppiä, jotka kuuluvat pääasiassa samoihin fyyliin kuin suun ja ruokatorven mikrobistotkin (Bik ym. 2006, Andersson ym. 2008). Ohutsuolessa ph-arvo suurenee, mutta mm. sappihapot, haimaneste ja suolen peristaltiikka pitävät bakteerien määrän ja lajikoostumuksen vähäisenä. Pohjukaissuolessa bakteereita on suolen sisällön millilitraa kohti noin 10 3 10 4, jejunumissa 10 5 10 7, ileumissa 10 7 10 8, umpisuolessa 10 8 ja koolonissa 10 10 10 11. Ulosteen bakteerimääräksi on arvioitu noin 10 11 10 12 solua grammaa kohti, eli 50 60 % ulostemassasta on bakteerisoluja (Savage 1977). Jejunumin, ileumin, nousevan koolonin ja peräsuolen limakalvobiopsioista tehty 16S-rRNA-geenikirjastovertailu osoitti jejunumin bakteerien monimuotoisuuden vähäisimmäksi: 67 % fylotyypeistä todettiin olevan Streptococcus-suvun jäseniä. Muissa suoliston osissa vallitsevat fylotyypit kuuluivat fyyliin Bacteroidetes ja Firmicutes (taulukko 687 Suolistomikrobit ja niiden merkitys terveydelle
ELINTARVIKEHYGIENIA Taulukko 2. Ruoansulatuskanavan keskeiset bakteeriryhmät. Ruoansulatuskanavan osa Molekyylibiologiset menetelmät1 Fylotyyppien lukumäärä (ei-viljeltyjä) Valtafyylat (esiintyvyys % tai fylotyyppien lukumäärä) Yleisimmät suvut tai lajit Tutkimus Suu >700 (50 %) Firmicutes Actinobacteria Proteobacteria Bacteroidetes Fusobacteria TM7 Gemella, Granulicatella, Streptococcus, Veillonella Nielu 152 Streptococcus, Prevotella, Actinomyces, Gemella, Rothia, Granulicatella, Haemo philus, Veillonella Ruokatorvi 95 Firmicutes Bacteroides Actinobacteria Proteobacteria Fusobacteria TM7 (ei-viljeltyjä) Streptococcus Prevotella Veillonella Aas ym. 2005 Andersson ym. 2008 Pei ym. 2004 Mahalaukku 128 (50 %) 262 Proteobacteria Firmicutes Actinobacteria Bacteroidetes Fusobacteria TM7 Deferribacteres Deinococcus/Thermus Helicobacter pylori Streptococcus Prevotella Bik ym. 2006 Andersson ym. 2008 Pohjukaissuoli Jejunum Bacteroidetes (27 49 %) Firmicutes (27 47 %) Streptococcus Wang ym. 2005 Hayashi ym. 2005 Ileum Streptococcus, Enterococcus, Lactobacillus, gamma- Proteobacteria, Bacteroides Hayashi ym. 2005 Paksusuoli 395 Firmicutes (301) Bacteroidetes (65) Proteobacteria Actinobacteria Fusobacteria Verrucomicrobia Firmicutes (49 %) Bacteroidetes (23 %) Proteobacteria (21 %) Actinobacteria (5 %) Uloste (10 11 10 12 ) Firmicutes (>80 %, 235) Actinobacteria (14 %) Bacteroidetes (2,5 %) Ruminococcus Clostridium Eubacterium 116S-rRNA-geenin sekvensointiin tai metagenomiikka-aineistoon perustuvat fylotyypit Eckburg ym. 2005 Frank ym. 2007 Andersson ym. 2008 (Delgado ym. 2006, Gill ym. 2006. Li ym. 2008) A. Palva
2) (Wang ym. 2005). Ohutsuolen mikrobiston vähäisempi monimuotoisuus on havaittu myös jejunumin ja ileumin sisällön bakteerianalyysissä, jossa vallitseviksi ryhmiksi havaittiin fakultatiivit anaerobit (taulukko 2) (Hayashi ym. 2005). Paksusuolessa ja ulosteessa mikrobikirjo on jo merkittävästi monimuotoisempi ja erilainen kuin ohutsuolessa. Eckburg ym. (2005) julkaisivat ensimmäisen laajan (lähes 12 000 16S-rRNA-sekvenssiä) mikrobistokartoituksen kolmen terveen henkilön paksusuolen limakalvolta ja ulosteesta. Siinä löytyi 395 fylotyyppiä, ja näistä 62 % oli uusia ja 80 % ei-viljeltyjä. Useimmat löydetyt fylotyypit kuuluivat fyyliin, Firmicutes ja Bacteroidetes, ja muutama fylotyyppi edusti neljää muuta fyylaa (taulukko 2). Frank ym. (2007) ovat tutkineet ohut- ja paksusuolen limakalvon mikrobistoa Crohnin tautia ja haavaista paksusuolen tulehdusta potevien kudosnäytteistä ja verranneet niitä syöpäpotilaiden suolen terveistä kohdista otettuihin näytteisiin. Yhteensä 190 kudosnäytteestä sekvensoitiin yli 15 000 rrna-geeniä. Aiempien tulosten mukaisesti tässäkin aineistossa valtaosa fylotyypeistä kuului neljään fyylaan (taulukko 2) anatomisesta näytteenottokohdasta ja diagnoosista riippumatta. Ulosteen mikrobistoa on tutkittu useissa rrna-sekvensointikartoituksissa (Eckburg ym. 2005, Gill ym. 2006, Andersson ym. 2008, Li ym. 2008). Näistä uusimmassa pyrosekvensointitutkimuksessa (50 000 sekvenssiä) fyylan Firmicutes vallitseva määrä kuuden koehenkilön ulostemikrobistossa vahvisti aiempaa tietoa, mutta fyylan Actinobacteria suurempi osuus ja fyylan Bacteroidetes pienempi osuus poikkeavat merkitsevästi vallitsevasta kuvasta (taulukko 2) (Andersson ym. 2008). Omassa tutkimusryhmässämme olemme fraktioineet tutkittavan DNA:n ennen 16S-geenikirjastojen tekoa G + C pitoisuuden (%) perusteella ja havainneet fylotyyppikirjon lisääntyvän erityisesti suuren G + C pitoisuuden omaavien bakteerien fraktioissa. Niinpä eritoten Actinobacteria-fyylan merkittävä osuus on aiemmissa ulostemikrobistokartoituksissa selvästi aliarvioitu (Krogius-Kurikka ym. 2009). Tähän saakka tehtyjen tutkimusten perusteella ihmisten ruoansulatuskanavasta arvioidaan löytyvän lajitasolla jopa 16 000 eri fylotyyppiä (Frank ym. 2007). Suolistomikrobiston koostumus on paljastunut erittäin dynaamiseksi kokonaisuudeksi, jossa esiintyy suuria eroja eri henkilöiden välillä mm. geneettisen taustan, iän, ravinnon ja terveydentilan vaihtelun takia, mutta myös yksilön mikrobiston koostumuksen ajallinen vaihtelu saattaa olla merkittävää (Zoetendal ym. 2008). Suolistomikrobiston toiminnallinen metagenomiikka ja metabolinen aktiivisuus Ihmisen suoliston sadan biljoonan mikrobin elävän ja aineenvaihdunnallisesti aktiivisen solumassan lajikoostumuksen tunteminen mahdollistaa muutosten diagnostiikan esimerkiksi suoliston häiriötiloissa, probiootti- ja prebiootti-interventioissa sekä terveysvaikutteisten elintarvikkeiden vaikutusten seuraamisessa, mutta syysuhteita se ei paljasta. Metagenomiikka sen sijaan lisää tietoa mikrobiston biodiversiteetistä ja myös mahdollistaa suolistomikrobiston geneettisen potentiaalin analysoinnin ja lopulta yhdistämisen muihin kuvassa 1 mainittuihin omiikkoihin. Johdannossa mainitut laajat metagenomihankkeet ovat kesken, ja saatavilla oleva tieto mikrobiomeista eli yksilön koko suolistomikrobiston genomien muodostumasta kollektiivisesta geenivarannosta on vielä rajallista. Laajin metagenomiikkatutkimus on tehty 13 eri-ikäisen (3 kk 45 v) japanilaisen ulostemikrobeista (Kurokawa ym. 2007). Mittavan sekvenssiaineiston (662 548 geeniennustetta) analyysin keskeisiä yleishuomioita olivat seuraavat: Aikuisten ja imeväisikäisten mikrobiomit ovat erilaisia. Vauvojen näytteiden geenivaranto viittaa suolistomikrobiston olevan elämän alkuvaiheessa epästabiilimpi, dynaamisempi ja adaptoituvampi kuin aikuisilla. Geenisisällön vertailu yksittäisiin genomisekvensseihin paljasti aikuisten mikrobiomeissa 237 rikastunutta proteiinia koodittavaa geeniklusteria, kun taas vastaavia yliedustuneita geeniperheitä oli vähemmän vauvojen mikrobiomeissa. Kyseiset geeniperheet liittyivät bakteerien erilaiseen 689 Suolistomikrobit ja niiden merkitys terveydelle
ELINTARVIKEHYGIENIA 690 YDINASIAT 88Suolistomikrobisto koostuu pääasiassa bakteereista ja ylittää yli kymmenkertaisesti ihmisen elimistön omien solujen määrän. 88Suolistomikrobiston lajien monimuotoisuus, perimävaranto ja toiminnallinen kapasiteetti ovat vasta paljastumassa uusien tutkimustekniikoiden myötä. 88Suolistomikrobistolla ja sen aineenvaihdunnallisella aktiivisuudella on merkittävä vaikutus ihmisen terveyteen. 88Suolimikrobiston tasapainon häiriintyminen saattaa liittyä useisiin elimistön sairaustiloihin. 88Lisääntyvä tieto suolistomikrobiston toiminnasta edistää uusien kohdespesifisten hoitomenetelmien kehittämistä. ravinnonhankintaan, sopeutumiseen suolistoympäristöön sekä molempia osapuolia hyödyttävän symbioosin luomiseen isäntäelimistön kanssa, joten kyseisiä geenejä voidaan pitää aikuisen ja imeväisikäisten mikrobistojen ydingeenivarantona. Yllättävä huomio oli liikkuvien geneettisten elementtien (Tn1549-tyypin transposonit, konjugatiiviset elementit) rikastuneisuus, joka viittaa suolistomikrobiston keskeiseen rooliin horisontaalisessa geenivaihdossa ja merkittävänä tekijänä bakteerilääkeresistenssigeenien varastona ja levittäjänä. Transkriptomiikkaa eli geenien ilmentymistä lähetti-rna-tasolla mittavaa analytiikkaa on sovellettu jonkin verran yksittäisiin bakteerilajeihin, mutta koko suolistomikrobiomin metatranskriptomiikka on vielä kehitysvaiheessa. Sama koskee proteiinitason analytiikkaa. Toistaiseksi on julkaistu vasta kaksi metaproteomiikkatutkimusta suolistomikrobiomista. Klaassens ym. (2007) havaitsivat kahden eri-ikäisen vauvan ulostemikrobistojen eroavan toisistaan sekä koostumukseltaan että proteiiniprofiililtaan ja totesivat lähinnä bifidobakteeriperäisiä profiilimuutoksia ajan funktiona kaksiulotteisella geelielektroforeesilla ja massaspektrometrialla. Verberkmoes ym. (2008) ovat julkaisseet ulosteproteiineista toistaiseksi laajimman analyysin, joka perustuu massaspektrometriaan ja kohdentamattomaan metaproteomiikkaan. He tunnistivat tuhansia proteiineja vertaamalla analysoituja peptidejä metagenomisekvenssikirjastoihin. Kyseinen tutkimus paljasti mm. bakteerien translaatioon, energiantuottoon ja hiilihydraattimetaboliaan liittyvien proteiinien määrän suuremmaksi kuin metagenomiikan avulla oli ennustettavissa. Siinä tunnistettiin myös elimistön immuunivasteproteiineja ja aiemmin tuntemattomia elimistön ja mikrobien vuorovaikutukseen liittyviä proteiineja. Metabolomiikka kuvaa kaikkia sisäsyntyisiä pienimolekyylipainoisia (alle 1 kda) komponentteja, joita voidaan tunnistaa erilaisilla spektroskooppisilla menetelmillä kompleksisista biologisista näytteistä, kuten virtsasta ja plasmasta. Metabonomiikka-käsite tarkoittaa puolestaan yksilön tai populaation lääkehoidon tai muun intervention aikaansaaman globaalin ja dynaamisen metabolisen vasteen kvantitatiivista määrittämistä ajallisten systeemisten muutosten ymmärtämiseksi (Holmes ym. 2008, Nicholson ja Lindon 2008). Suuritehoista 1 H-magneettispektroskopiaa hyödyntävää metabolomiikkaa yhdistettynä tilastollisiin monimuuttujamenetelmiin on alettu soveltaa myös ulosteen aineenvaihduntatuotteiden määrittämiseen, mikä mahdollistaa ei-invasiivisen tavan tutkia elimistön ja suolistomikrobiston monimuotoista vuorovaikutusta. Se tuottaa paljon uutta tietoa metaboliaprofiilimuutoksista mm. suolistosairauksissa ja edistää diagnostisten biomarkkerien (Saric ym. 2008) ja jopa yksilötason hoitojen kehittämistä (Holmes ym. 2008). Marchesin ym. (2007) tutkimus on ensimmäisiä osoituksia siitä, että uloste-ekstraktien (faecal water) metabonomiikalla voidaan erotella tulehduksellisia suolistosairauksia toisistaan ja terve suolisto sairaasta. Terveisiin verrattuna Crohnin tautia ja haavaista paksusuolitulehdusta potevilla havaittiin imeytymishäiriöön liittyviä muutoksia sekä useita koostumuseroja bakteeriperäisissä metaboliiteissa (mm. voihapon, asetaatin, metyyliamiinin ja A. Palva
trimetyyliamiinin pienentyneitä pitoisuuksia), ja aineenvaihduntaprofiilien erot olivat merkittävimpiä Crohnin tautia potevilla. Scanlan ym. (2008) puolestaan osoittivat 16S-rRNA-geenija metabonomiikka-analyysien perusteella suolistomikrobiston lisääntyneen epästabiilisuuden, erityisesti alaryhmien Clostridium leptum ja C. coccoides lisääntyneen diversiteetin sekä eriytyneen metabonomian paksusuolisyöpä- ja polyyppipotilailla terveisiin verrattuna. Useat metabolomiikkatutkimukset ovat osoittaneet, ettei suolistomikrobiston vaikutus rajoitu pelkästään ruoansulatuskanavaan, vaan bakteerien monet aineenvaihduntatuotteet absorboituvat verenkiertoon ja leviävät elimistöön (Salonen ym. 2009). Metabonomiikka muihin metatason analyysimenetelmiin ja matemaattiseen mallinnukseen yhdistettynä on avaamassa uuden systeemibiologisen tarkasteluikkunan elimistön ja mikrobien yhteismetabolian ja muiden vuorovaikutusmekanismien sekä niihin vaikuttavien eri ympäristötekijöiden (mm. ravinto, lääkkeet) tutkimiselle. Suolistomikrobit ja terveys Suolistomikrobien vaikutus elimistön fysiologiaan, immuunipuolustuksen kehittymiseen, kolonisaatioresistenssin muodostumiseen ja elimistön omilla entsyymeillä hajoamattomien ravintokomponenttien (kuitu, resistentit tärkkelys- ja proteiinijäänteet) hyväksikäyttöön on tiedetty jo kauan. Kuitenkin vasta viime vuosina suolistomikrobien merkitys terveydelle on alkanut paljastua koko laajuudessaan. Erityisesti elimistön omien solujen määrän noin kymmenkertaisesti ylittävä paksusuolen bioaktiivinen mikrobisto on tässä suhteessa avainasemassa. Paksusuolen mikrobit pilkkovat hajoamatta jääneitä ravinnon ainesosia, metaboloivat lääkeaineita, tuottavat vitamiineja (mm. foolihappoa, biotiinia ja K-vitamiinia) ja bioaktiivisia yhdisteitä, jotka säätelevät suolen kehittymistä ja vaikuttavat elimistön energiatasapainoon ja homeostaasin ylläpitoon. Hajoamattomasta ruokajätteestä mikrobit tuottavat mm. vetyä, metaania ja epiteelisolujen ensisijaisia energialähteitä lyhytketjuisia rasvahappoja, joista esimerkiksi voihapon tiedetään myös vähentävän kasvainten muodostumista. Limakalvon homeostaasi on riippuvainen suolistomikrobien ja elimistön jatkuvasta kommunikoinnista immuunipuolustuksen ja epiteelisolujen Tollin kaltaisten reseptoreiden (Toll-like receptors, TLR) välityksellä. Nor- maalibakteeris- ton monet solurakenteet ja erittyvät metaboliitit vaikuttavat suoraan limakalvon immuunipuolustuksen solujen kypsymiseen Crohnin tautia potevilla havaittiin imeytymishäiriöön liittyviä muutoksia sekä useita koostumuseroja bakteeriperäisissä metaboliiteissa ja omaavat ei-tulehduksellisia ominaisuuksia. Puolustusjärjestelmistä on löydetty mekanismeja, joilla se erottaa elimistön omat bakteerit patogeeneista. Epiteelisolujen lisäksi dendriittisolut ovat tärkeä suolistobakteereita tunnistava ja patogeeneista erotteleva solutyyppi (Marchesi ja Shanahan 2007, O Keefe 2008). Normaalimikrobiston tunnettujen, elimistön homeostaasia ylläpitävien vaikutusten lisäksi uusin tutkimustieto on paljastamassa suolistomikrobien liittyvän merkittävästi myös suoleen rajoittuviin ja systeemisiin sairaustiloihin potilaan geneettisen taustan ja muiden mahdollisten ympäristötekijöiden ohella. Edellä on jo viitattu muuttuneeseen suolistomikrobistoon ja sen aineenvaihdunnallisiin muutoksiin tulehduksellisissa suolistosairauksissa (Crohnin tauti ja haavainen paksusuolitulehdus) (Sartor 2008). Tosin näissä tiloissa mikrobiston muutosten ja taudin kehittymisen syysuhteista ei vielä voida tehdä yksiselitteisiä päätelmiä. Sama koskee myös kansantaloudellisesti hyvin merkittävää ärtyvän paksusuolen oireyhtymää (IBS), jonka eri alatyyppeissä (ripuli, ummetus, ja niiden sekamuoto) on osoitettu esiintyvän tilastollisesti merkitseviä muutoksia suolistomikrobiston koostumuksessa (Kassinen ym. 2007). Merkille pantavaa on, että IBS-oireita voidaan jonkin verran helpottaa joillakin probioottiseoksilla, jotka mahdollisesti vaikuttavat suolistomikrobistoonkin (Parkes ym. 2008). 691 Suolistomikrobit ja niiden merkitys terveydelle
ELINTARVIKEHYGIENIA 692 Kolorektaalisyöpään liittyvä epidemiologinen ja kokeellinen todistusaineisto viittaa ruokavalion merkitykseen sairauden kehittymisessä, jos- Lihan karsinogeenisuus saattaa johtua mm. aminohappoihin sitoutuneesta runsaasta rikkimäärästä sa erityisinä riskitekijöinä pidetään runsaslihaista ja -rasvaista sekä vähähiilihydraattista ruokavaliota (O Keefe 2008). Koska suolistomikrobit osallistuvat merkittävästi ravintojätteen muokkaamiseen, ruokavalion indusoimissa syöpätapauksissa suolistomikrobien roolia ei voitane jättää huomiotta. Mahdollinen mikrobiaktiivisuuksiin liittyvä mekanismi saattaa olla haitallisten mikrobiryhmien valtaanpääsy. Esimerkiksi lihan karsinogeenisuus saattaa johtua mm. aminohappoihin sitoutuneesta runsaasta rikkimäärästä, joka edistää rikkiä pelkistävien bakteerien (mm. Desulfovibrio vulgaris) kasvua ja haitallisen rikkivedyn muodostumista sekä samalla metanogeenisten bakteerien syrjäytymistä kilpailussa vapaasta vedystä. Rikkivety puolestaan haittaa sytokromioksidaasia, vähentää voihapon käyttöä, estää limanmuodostusta ja DNA:n metylaatiota sekä vaikuttaa genotoksisesti muodostamalla vapaita radikaaleja. Ruokavalion suuri rasvapitoisuus puolestaan stimuloi primaarin sappihapon koolihapon enterohepaattista kiertoa, jossa osa koolihaposta voi epätäydellisen imeytymisen johdosta kulkeutua paksusuoleen ja muuntua 7α-dehydroksyloivien bakteerien vaikutuksesta kokarsinogeenina tunnetuksi deoksikoolihapoksi. Toisaalta runsaslihaiseen ja -rasvaiseen ruokavalioon ja niiden mikrobiaktiivisuusseurauksiin liittyviä haittavaikutuksia voidaan vähentää lisäämällä dieettiin samanaikaisesti huonosti hajoavaa tärkkelystä ja vihreitä kasviksia sekä sappihappojen mutageenisuutta heikentäviä Lactobacillus-bakteereita (O Keefe 2008). Suoliston sairauksien ja häiriötilojen lisäksi suolistomikrobisto on liitetty systeemisiin tiloihin, kuten lihavuuteen, tyypin 2 diabetekseen ja jopa autismiin (Parracho ym. 2005). Lihavuuden ja suolistomikrobien välisistä riippuvuuksista Jeffrey Gordonin ryhmä on tuottanut viime vuosina merkittävää uutta tietoa leptiinigeenin suhteen mutatoitujen homotsygoottisten hiirten avulla ja koehenkilöiden ravitsemusinterventioilla. Ryhmän keskeiset hvainnot ovat seuraavat (Marchesi ja Shanahan 2007): Suolistomikrobisto lisää monosakkaridien imeytymistä suolesta ja indusoi hepaattista lipogeneesiä sekä rasvan kerääntymistä rasvasoluihin. Niinpä lihavan yksilön mikrobit voivat irrottaa ravinnosta enemmän rasvaa ja tuoda se paremmin elimistön saataville kuin laihan yksilön mikrobit vastaavasta ravinnosta. Lihavuus liittyy muuttuneeseen suolistomikrobistoon: ulosteen 16S-rRNA-geenisekvensointi on osoittanut 50 % vähemmän Bacteroidetes-fyylan bakteereja ja vastaavasti lisääntynyttä Firmicutes-määrää lihavilla hiirillä laihoihin verrattuna ilman ruoan kulutuksessa havaittavaa eroa. Sama on todennettu ihmisillä, kuten myös laihduttamisen firmikuuttien määrää vähentävä ja bakteroideksia lisäävä vaikutus. Lihavien ja laihojen hiirten umpisuolen mikrobiomin sekvensointikartoitus on vahvistanut edelleen Firmicutes-Bacteroidetes-suhteen merkitystä. Lihavien mikrobiomin on havaittu lisäksi rikastuneen vaikeasti hajoavia polysakkarideja pilkkovien entsyymien geeneillä. Lyhytketjuisten rasvahappojen kvantifiointi puolestaan on osoittanut fermentaation päätuotteiden, voihapon ja asetaatin määrien olevan lihavien hiirten umpisuolessa suurempia kuin laihoilla hiirillä. Ulosteen jäännösenergiamäärän kvantifiointi on vahvistanut lihavien ulosteen energiamäärän pienemmäksi. Lisäksi ryhmä on osoittanut, että lihavien hiirten umpisuolen mikrobiston siirto mikrobivapaisiin hiiriin lisää niiden rasvapitoisuutta enemmän kuin laihojen hiirten mikrobiston siirto ruoan kulutuksen pysyessä samana (Marchesi ja Shanahan 2007). Lihavuuden tavoin tyypin 2 diabetekseen liitetään nykytiedon valossa ihmisen perimän, ruokavalion ja passiivisten liikuntatottumusten ohella yhtenä mahdollisena lisätekijänä suolistomikrobisto (Cani ja Delzenne 2007). Tyypin 2 diabetekseen ja lihavuuteen liittyy läheisesti vähäinen tulehdus mahdollisena vasteena runsasrasvaiseen ruokavalioon. Suoliston gramnegatiivisten bakteerien lipopolysakkaridin A. Palva
(LPS) eli endotoksiinin on ajateltu olevan eräs tätä tulehdutusta lietsova tekijä. Gramnegatiivisten bakteerien hajotessa suolistossa vapautuva LPS imeytyy epiteelin läpi ja kulkeutuu kohdekudoksiin. LPS laukaisee tulehdusta edistävien sytokiinien erittymisen sitoutuessaan CD14/TLR4-kompleksiin immuunipuolustuksen solujen pinnalle. Runsasrasvaisen ruokavalion on kokeellisesti osoitettu muuttavan hiiren suolistomikrobiston pääkoostumusta siten, että bifidobakteerien, Eubacterium rectale / Clostridium coccoides ryhmän ja Bacteroides-suvun bakteerien määrät pienenevät ja gramnegatiivisten ja grampositiivisten suhde kasvaa. Lisäksi plasman LPS:n määrä, elimistön rasvamassa, painoindeksi ja maksan triglyseridipitoisuus suurenevat ja samoin diabetes ja tulehdustila pahenevat. CD14-mutanttihiirillä, joilta LPS-reseptori puuttuu, vastaavaa metabolista oireyhtymää ei saada muodostumaan runsasrasvaisella ruokavaliolla. Näitä tuloksia vahvistavat havainnot, että leptiinimutanttihiirillä plasman LPS-pitoisuus on suurentunut ja polymyksiini B-hoidon aikaansaama gramnegatiivisten bakteerien kuoleminen vähentävät veren LPS-pitoisuutta ja maksan rasvoittumista. Ihmisillä tehdyt epidemiologiset tutkimukset viittaavat samaan. Runsasrasvainen ruokavalio johtaa terveillä suurempaan endotoksemiaan riippumatta muista makroravinteista (proteiinit tai hiilihydraatit). Lisäksi plasman LPS-pitoisuus on diabetesta sairastavilla merkitsevästi suurempi kuin painoindeksin, sukupuolen ja iän suhteen vakioiduilla terveillä koehenkilöillä. Samoin insuliinipitoisuuden paastoarvo korreloi merkitsevästi LPS-pitoisuuden kanssa ei-diabeetikoilla. Nämä havainnot viittaavat siihen, että suolistomikrobeilla ja LPS:llä on mahdollinen rooli lihavuuteen liittyvän tyypin 2 diabeteksen patogeneesissä ja luonnollisen immuunipuolustuksen vasteissa (Cani ja Delzenne 2007). Lopuksi Ihminen ja pääasiassa paksusuoleen sijoittuva mikrobisto ovat läpikäyneet miljoonien vuosien yhteisevoluution. Tätä evolutiivista superorganismia ovat muovanneet ja edelleen muovaavat sekä elimistöön että mikrobeihin kohdistuvat moninaiset valintapaineet (Ley ym. 2006), joista esimerkiksi ruokavaliolla, (mikrobi)lääkkeillä ja muilla ympäristötekijöillä on keskeinen merkitys. Elimistön ja suolistomikrobien väistämätön yhteiselo biologisten puolustusjärjestelmien ristitulessa lienee perusluonteeltaan muotoutunut evoluution aikana pääasiassa molempia osapuolia hyödyttäväksi ja molempien tasapainoa ylläpitäväksi. Nykyihmisen nopeasti muuttuneet elintavat ovat kuitenkin luoneet uudenlaisia valintapaineita, jotka vaikuttavat paitsi suoraan elimistöön myös mikrobiston koostumuksen, metabolisen aktiivisuuden ja aineenvaihduntatuotteiden muuttumiseen. Tämä puolestaan saattaa muuttaa elimistön ja mikrobien vuorovaikutuksia haitalliseen suuntaan. Lisääntyvä tieto suolistomikrobiston liittymisestä useisiin suoliston ja koko elimistön sairauksiin ja häiriö tiloihin kertonee juuri tästä tasapainon järkkymisestä. Toisaalta olemme vasta ottamassa uusien tutkimustekniikoiden avulla ensiaskeleita elimistön ja mikrobien vuorovaikutusten syvällisempään ymmärtämiseen. Todellisten syysuhteiden paljastaminen vaatii siten vielä merkittävästi lisää perustutkimusta. Summary Intestinal microorganisms and their significance for health The normal microbiota and man form a superorganism, in which only 10% are human cells. The skin and mucous membranes support 10 14 living microbes, mainly at the end of the gastrointestinal tract, forming a 1.5-kg cell mass ecosystem mainly consisting of bacteria. Investigations of the intestinal microbiota have yielded an estimated biodiversity of 1 200 16 000 bacterial phylotypes. They are known to affect physiology, development of immune defense, colonization resistance and nutrition. Changes in microbial population can be associated with inflammatory bowel diseases, irritable bowel syndrome, colorectal cancer, obesity and type 2 diabetes. 693 Suolistomikrobit ja niiden merkitys terveydelle
Kirjallisuutta Aas AJ, Paster BJ, Stokes LN, Olsen I, Dewhirst, Floyd E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J Clin Microbiol 2005;43:5721 32. Andersson AF, Lindberg M, Jakobsson H, Bäckhed F, Nyrén P, Engstrand L. Comparative analysis of human gut microbiota by barcoded pyrosequencing. PLoS ONE 2008;3:e2836. Bik EM, Eckburg PB, Gill SR, ym. Molecular analysis of the bacterial microbiota in the human stomach. Proc Natl Acad Sci U S A 2006;103:732 7. Cani PD, Delzenne NM. Gut microflora as a target for energy and metabolic homeostasis. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 2007;10:729 34. Delgado S, Suárez A, Mayo B. Identification of dominant bacteria in feces and colonic mucosa from healthy Spanish adults by culturing and 16S rdna sequence analysis. Dig Dis Sci 2006;51:744 51. Drasar BS, Hill MJ. Human intestinal flora. Lontoo: Academic Press 1974. Eckburg PB, Bik EM, Bernstein CN, ym. Diversity of the human intestinal microbial flora. Science 2005;308:1635 8. Frank DN, St Amand AL, Feldman RA, Boedeker EC, Harpaz N, Pace NR. Molecular-phylogenetic characterization of microbial community imbalances in human inflammatory bowel diseases. Proc Natl Acad Sci U S A 2007;104:13780 5. Gill SR, Pop M, Deboy RT, ym. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science 2006;312:1355 9. Grönlund MM, Lehtonen OP, Eerola E, Kero P. Fecal microflora in healthy infants born by different methods of delivery: permanent changes in intestinal flora after caesarean delivery. J Pediatr Gastroenterol Nutr 1999;28:19 25. Hayashi H, Takahashi R, Nishi T, Sakamoto M, Benno Y. Molecular analysis of jejunal, ileal, caecal and rectosigmoid human colonic microbiota using 16S rrna gene libraries and terminal restriction fragment length polymorphism. J Med Microbiol 2005;54:1093 101. Holmes E, Wilson ID, Nicholson JK. Metabolic phenotyping in health and disease. Cell 2008;134:714 7. Kassinen A, Krogius-Kurikka L, Mäkivuokko H, ym. The GI microbiotas of irritable bowel syndrome patients differ significantly from healthy control subjects. Gastroenterology 2007;133:24 33. Kelly D, King T, Aminov R. Importance of microbial colonization of the gut in early life to the development of immunity. Mutation Research 2007;622:58 69. Kero J, Gissler M, Grönlund MM, ym. Mode of delivery and asthma is there a connection? Pediatric Res 2002;52:6 10. Klaassens ES, de Vos WM,Vaughan EE. Metaproteomics approach to study the functionality of the microbiota in the human infant gastrointestinal tract. Appl Environ Microbiol 2007;73:1388 92. Krogius-Kurikka LK, Kassinen AH, Paulin LG, ym. Sequnce analysis of percent G+C fraction libraries of human faecal bacterial DNA reveals a high number of Actinobacteria. BMC Microbiology 2009; [käsikirjoitus arvioitavana]. Kurokawa K, Itoh T, Kuwahara T, ym. Comparative metagenomics revealed commonly enriched gene sets in human gut microbiomes. DNA Res 2007;14:169 81. Ley RE, Peterson DA, Gordon Ji. Ecological and evolutionary forces shaping microbial diversity in the human intestine. Cell 2006;124:837 48. Li M, Wang B, Zhang M, ym. Symbiotic gut microbes modulate human metabolic phenotypes. Proc Natl Acad Sci USA 2008;105:2117 22. Marchesi JR, Holmes E, Khan F, ym. Rapid and noninvasive metabonomic characterization of inflammatory bowel disease. J Proteome Res 2007;6:546 51. Marchesi J, Shanahan F. The normal intestinal microbiota. Curr Opin Inf Dis 2007;20:508 13. Mitsou EK, Kirtzalidou E, Oikonomou I, Liosis G, Kyriacou A. Fecal microflora of Greek healthy neonates. Anaerobe 2008;14:94 101. Nicholson JK, Lindon JC. Metabonomics. Nature 2008;455:1054 6. O Keefe SJD. Nutrition and colonic health: the critical role of the microbiota. Curr Opin Gastroenterol 2008;24:51 8. Parkes GC, Brostoff J, Whelan K, Sanderson JD. Gastrointestinal microbiota in irritable bowel syndrome: their role in its pathogenesis and treatment. Am J Gastroenterol 2008;103:1 11. Parracho HMRT, Bingham MO, Gibson GR, McCartney AL. Differences between the gut microflora of children with autistic spectrum disorders and that of healthy children. J Med Microbiol 2005;54:987 91. Pei Z, Bini EJ, Yang L, Zhou M, Francois F, Blaser MJ. Bacterial biota in the human esophagus. Proc Natl Acad Sci U S A 2004;101:4250 5. Rajilic-Stojanovic M, Smidt H, de Vos WM. Diversity of the human gastrointestinal tract microbiota revisited. Environ Microbiol 2007;9:2125 36. Renz-Polster H, David MR, Buist AS, ym. Caesarean section delivery and the risk of allergic disorders in childhood. Clin Exp Allergy 2005;35:1466 72. Salonen A, Palva A, de Vos WM. Microbial functionality in the human intestinal tract. Review. Frontiers in Bioscience 2009. Special issue Genetics and genomics of probiotic bacteria. Painossa. Saric J, Wang Y, Li J, ym. Species variation in the fecal metanolome gives insight into differential gastrintestinal function. J Proteome Res 2008;7:352 60. Sartor RB. Microbial influences in inflammatory bowel diseases. Gastroenterology 2008;134:577 94. Savage DC. Microbial ecology of the gastrointestinal tract. Annu Rev Microbiol 1977;31:107 33. Scanlan PD, Shanahan F, Clune Y, ym. Culture-independent analysis of the gut microbiota in colorectal cancer and polyposis. Environ Microbiol 2008;10:789 98. Turroni F, Ribbera A, Foroni E, van Sinderen D, Ventura M. Human gut microbiota and bifidobacteria: from composition to functionality. Antonie van Leeuwenhoek 2008;94:35 50. Verberkmoes NC, Russell AL, Shah M ym. Shotgun metaproteomics of the human distal gut micrbiota. ISME J 2008;30:1 11. Wang M, Ahrne S, Jeppsson B, Molin G. Comparison of bacterial diversity along the human intestinal tract by direct cloning and sequencing of 16S rrna genes. FEMS Microbiol Ecol 2005;54:219 31. Zoetendal EG, Vaughan E, de Vos WM. A microbial world within us. Mol Microbiol 2006;59:1639 50. Zoetendal EG, Rajilic-Stojanovic M, de Vos WM. High-throughput diversity and functionality analysis of the gastrointestinal tract microbiota. Gut 2008;57:1605 15. AIRI PALVA, professori Eläinlääketieteellinen tiedekunta PL 66, 00014 Helsingin yliopisto 694 Sidonnaisuudet: Kirjoittajalla ei ole sidonnaisuuksia