NRF2-TRANSKRIPTIOFAKTORIN VAIKUTUKSET ATEROGENEESIIN

NRF2-TRANSKRIPTIOFAKTORIN VAIKUTUKSET ATEROGENEESIIN Emmi Tapper Tutkielma Lääketieteen koulutusohjelma Itä-Suomen yliopisto Terveystieteiden tiedekunta A.I. Virtanen -instituutti Tammikuu 2013

ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, terveystieteiden tiedekunta Lääketieteen laitos Lääketieteen koulutusohjelma TAPPER, EMMI L.M.: Nrf2-transkriptiofaktorin vaikutukset aterogeneesiin Opinnäytetutkielma, 58 sivua Tutkielman ohjaajat: LT Anna-Liisa Levonen ja FM Anna-Kaisa Ruotsalainen Tammikuu 2013 Avainsanat: ateroskleroosi, Nrf2, CD36, oksidatiivinen stressi, ateroskleroosin hiirimallit Sydän- ja verisuonisairaudet ovat yleisin kuolinsyy länsimaissa, ja ne aiheuttavat lähes puolet työikäisten kuolemista Suomessa. Sepelvaltimotaudin aiheuttaa ateroskleroosi, jonka seurauksena valtimot kovettuvat ja ahtautuvat ja verenvirtaus valtimoissa heikkenee. Ateroskleroosi on valtimon intiman krooninen tulehdussairaus, jota oksidatiivinen stressi edistää. Ateroskleroosin riskitekijöitä ovat muun muassa perintötekijät, rasvainen ruokavalio, plasman korkea kolesterolipitoisuus, etenkin LDL-kolesterolin korkea osuus, sekä tupakointi. Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-related factor-2) on transkriptiofaktori, joka säätelee monien antioksidantti- ja detoksifikaatiogeenien ilmentymistä, ja sen onkin todettu suojaavan monia kudoksia oksidatiivisen stressin aiheuttamilta haitallisilta muutoksilta. Oksidatiivinen stressi on tärkeä tekijä verisuonisairauksien patogeneesissä. On osoitettu, että Nrf2:n yliekspressio vähentää tulehdusta ja oksidatiivista stressiä kanin kaulavaltimossa. Toisaalta Nrf2 edistää ateroskleroosia ApoE -/- -hiiressä. Työn tarkoituksena oli tutkia Nrf2-transkriptiofaktorin vaikutuksia aterogeneesiin käyttäen Nrf2 -/- LDLR -/- -hiirimallia. Hypoteesin mukaan Nrf2:n vaikutukset olisivat ateroskleroosilta suojaavia. Hiirten sydämistä tehtiin leikkeitä aorttaläppätasolta, jossa sijaitsevista ateroskleroottisista leesioista määritettiin pinta-ala ja tutkittiin morfologiaa. Myös leesioiden pinta-alaa koko aortan alueella tarkasteltiin. Tilastotieteellisin menetelmin (kaksisuuntainen t-testi) testattiin, oliko eri hiirikantojen leesioiden aloissa tilastollisesti merkitsevää eroa (p-arvo < 0,05). Asetetusta hypoteesista poiketen Nrf2 näytti edistävän ateroskleroottista prosessia aortan seinämässä lisäten sekä leesioiden pinta-alaa että komplisoituneiden leesioiden osuutta. Lisäksi työssä tutustuttiin ateroskleroosin patogeneesiin ja erilaisiin hiirimalleihin, Nrf2:n tunnettuihin vaikutuksiin kudoksissa sekä oksidatiiviseen stressiin ja valtimoiden anatomiaan.

UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of Health Sciences School of Medicine Medicine TAPPER, EMMI L.M.: The effects of transcription factor Nrf2 on atherogenesis Thesis, 58 pages Tutors: LT Anna-Liisa Levonen, FM Anna-Kaisa Ruotsalainen January 2013 Keywords: atherosclerosis, Nrf2, CD36, oxidative stress, mouse models of atherosclerosis Cardiovascular diseases are the most common cause of death in Western societies accounting for almost 50 per cent of deaths in working age people in Finland. Coronary artery disease is caused by atherosclerosis which causes blockages and reduction of blood flow in arteries. Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of arteries and it is induced by oxidative stress. Risk factors for developing atherosclerosis include, among other causes, genetic factors, fatty diet, elevated levels of cholesterol in plasma (especially high levels LDL-cholesterol) and smoking. Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-related factor-2) is a transcription factor which regulates the expression of many antioxidant and detoxification genes. It has been proven to protect many tissues against harmful changes caused by oxidative stress which is an important factor in the pathogenesis of cardiovascular diseases. It has been shown that the overexpression of Nrf2 reduces inflammation and oxidative stress in the carotid arteries of rabbits. In contrast, Nrf2 induces atherosclerosis in ApoE -/- mouse. The purpose of this study was to investigate the effects of transcription factor Nrf2 on atherogenesis, using the Nrf2-/-LDLR-/- mouse model. The hypothesis was that the effects of Nrf2 would be protective against atherosclerosis. The hearts of the mice were cut from the level of the aortic valve, area of atherosclerotic lesions located in this level was measured and the morphology of the lesions was investigated. Furthermore, the area of lesions in the whole aorta was analyzed. Statistically significant difference between the lesion areas of different mouse strains was evaluated using a two-tailed t-test (p-value < 0,05). Contrary to the proposed hypothesis, Nrf2 seemed to promote the atherosclerotic process in the aortic wall by inducing both the lesion area and the amount of complicated lesions. Pathogenesis and different mouse models of atherosclerosis, known effects of Nrf2 on tissues, oxidative stress and anatomy of arteries were also explored in this study.

LYHENNELUETTELO ABCA1 ATP-binding cassette, subfamily A, member 1 (ATP:iin sitoutuva transportteri, alaryhmä A:n jäsen 1) ABCG1 ATP-binding cassette, subfamily G, member 1 (ATP:iin sitoutuva transportteri, alaryhmä G:n jäsen 1) ApoB Apolipoproteiini B ApoE Apolipoproteiini E ARE antioxidant response element (antioksidanttivaste-elementti) GCLC glutamate-cysteine ligase catalytic subunit (glutamaattikysteiini ligaasin katalyyttinen alayksikkö) GCLM glutamate-cysteine ligase modifier subunit (glutamaattikysteiini ligaasin modifioiva alayksikkö) GSH glutathione (glutationi) GST glutathione S-transferase (glutationi S-transferaasi) HDL high density lipoprotein (korkeatiheyksinen lipoproteiini) HO-1 heme oxygenase-1 (hemioksigenaasi-1) LDL low density lipoprotein (matalatiheyksinen lipoproteiini) LDLR -/- LDL-reseptorin suhteen poistogeeninen Keap1 Kelch-like ECH-associated protein 1 (Kelchin kaltainen ECHassosioitu proteiini 1) MCP-1 monocyte chemotactic protein 1 (monosyyttejä houkutteleva proteiini 1) Nrf2 nuclear factor erythroid 2-related factor-2 (tumafaktori erytroidi 2:een liittyvä faktori 2) Nrf2 -/- Nrf2:n suhteen poistogeeninen Nrf2 -/- LDLR -/- sekä Nrf2:n että LDL-reseptorin suhteen poistogeeninen NQO1 NAD(P)H kinonioksidoreduktaasi oxldl oxidized LDL (hapettunut LDL) PBS Phosphate Buffered Saline (fosfaattipuskuroitu suolaliuos) PFA paraformaldehyde (paraformaldehyde) Prx1 peroxiredoxin-1 ROS reactive oxygen species (hapen reaktiiviset metaboliitit) SR-B1 scavenger receptor B1 (jätereseptori B1)

SISÄLTÖ LYHENNELUETTELO... 4 1 JOHDANTO... 6 2 VALTIMON ANATOMIA... 7 3 ATEROSKLEROOSI... 9 3.1 Riskitekijät... 9 3.2 Aterogeneesi... 10 3.3 Komplikaatiot ja hoito... 14 4 OKSIDATIIVINEN STRESSI... 16 5 NRF2-TRANSKRIPTIOFAKTORI... 17 5.1 Keap1 Nrf2 ARE-signalointi... 17 5.2 Nrf2:n kohdegeenit... 20 5.3 Nrf2 ja aterogeneesi... 21 6 ATEROSKLEROOSIN HIIRIMALLIT... 25 6.1 LDLR-poistogeeniset hiiret... 26 6.2 ApoE-poistogeeniset hiiret... 27 OMA TUTKIMUS... 29 7 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET... 29 8 AINEISTO JA MENETELMÄT... 30 8.1 Hiirimalli... 30 8.2 Ateroskleroosin määritys... 30 8.3 Leesioiden analyysi ja värjäykset... 30 8.3.1 Hematoksyliini eosiini-värjäys... 31 8.3.2 Movat s pentachrome -värjäys... 31 8.3.3 Immunohistokemia... 32 8.3.4 Von Kossa -värjäys... 33 8.4 Plasman kolesteroli- ja triglyseridipitoisuuksien määritys... 33 9 TULOKSET... 35 9.1 Leesioiden ala... 35 9.2 Leesioiden morfologia... 36 9.3 En face -analyysi... 42 9.4 Kolesteroli- ja triglyseridipitoisuudet... 44 10 POHDINTA... 46 11 LÄHDELUETTELO... 50

6 1 JOHDANTO Sydän- ja verisuonitaudit ovat yleisin kuolinsyy niin Suomessa kuin muissakin länsimaissa (Glass & Witztum 2001). Sepelvaltimotauti on tähän ryhmään kuuluva sairaus, joka yleisimmin johtuu valtimoiden kovettumisesta eli ateroskleroosista (Falk 2006). Valtimoiden kovettuminen ja suonten luumenien ahtautuminen voivat päätetapahtuminaan johtaa muun muassa sydänlihaksen tai aivojen infarktiin ja iskemiaan. Ateroskleroosin ympäristöstä johtuvia riskitekijöitä voi ehkäistä terveellisillä elämäntavoilla, joihin kuuluu tupakoimattomuus, liikunta ja terveellinen ruokavalio (Kovanen 2008b). Nämä yhdessä auttavat ehkäisemään ylipainoa ja sokeriaineenvaihdunnan häiriöitä sekä plasman korkeaa kolesterolipitoisuutta. Perinnöllinen taipumus korkeaan LDL- tai matalaan HDLpitoisuuteen on riskitekijä, johon ei itse voi vaikuttaa (Lusis 2000). Ateroskleroosin patogeneesiin (aterogeneesiin) vaikuttaa myös oksidatiivinen stressi, joka yhdessä muiden tekijöiden kanssa aiheuttaa tulehdusreaktion suonen seinämään. Reaktioon liittyy sytokiinien lisääntynyt tuotanto ja makrofaagien vaeltaminen vaurioituneen endoteelin läpi intimaan (Lusis 2000, Libby 2002). Varhaiset leesiot ilmenevät rasvajuosteina valtimoiden seinämässä. Pitkälle edenneet ateroomat ahtauttavat valtimoiden luumenia ja vaikeuttavat veren virtausta. Rasvajuosteita esiintyy riskitekijöistä huolimatta kaikissa väestöissä, mutta juosteiden kehittyminen ateroomiksi on vahvasti sidoksissa riskitekijöihin (Kovanen 2008b). Opinnäytetyössäni tutkin Nrf2 (NF-E2-related factor 2) -transkriptiofaktorin vaikutuksia aterogeneesiin. Aikaisemmista tutkimuksista saatujen tulosten perusteella kyseisellä transkriptiofaktorilla on sekä pro- että antiaterogeenisiä vaikutuksia (Levonen ym. 2007, Sussan ym. 2008, Barajas ym. 2011). Nrf2 suojaa elimistöä oksidatiivisen stressin haitallisilta vaikutuksilta muun muassa lisäämällä monien antioksidanttiproteiinien ja detoksifikaatioentsyymien ilmentymistä (Kobayashi & Yamamoto 2005, Kensler ym. 2007, Kim ym. 2010). Tämän ominaisuuden kautta välittyvät sen mahdolliset ateroskleroosilta suojaavat vaikutukset. Toisaalta Nrf2 indusoi CD36-jätereseptorin ilmentymistä makrofaageissa, mikä johtaa vaahtosolujen muodostumiseen (Ishii ym. 2004). Nrf2:n vaikutuksia tutkittiin Nrf2/LDLR-poistogeenisten hiirten avulla (Nrf2 -/- LDLR -/- ).

7 KIRJALLISUUSKATSAUS 2 VALTIMON ANATOMIA Valtimon seinämä muodostuu endoteelisoluista, sileälihassoluista ja soluväliaineesta, joka koostuu elastiinista, kollageenista ja glykosaminoglykaaneista (Mitchell & Schoen 2010). Näiden komponenttien keskinäinen suhde riippuu valtimon koosta. Valtimon seinämästä voidaan erottaa kolme erillistä kerrosta (ks. kuva 2). Sisimpänä ja kosketuksissa virtaavan veren kanssa sijaitsee intima, joka koostuu yksikerroksisesta levyepiteelisolujen muodostamasta endoteelista, tyvikalvosta ja löyhää sidekudosta sisältävästä subendoteelista. Suurissa valtimoissa, joihin lasketaan kuuluvaksi aortan lisäksi sen suuret haarat (a. subclavia, a. carotis communis, a. iliaca communis: ks. kuva 1), voidaan subendoteelista erottaa elastisten säikeiden muodostama lamina elastica interna, joka erottaa intiman seuraavasta kerroksesta, mediasta (Mitchell & Schoen 2010). Mediassa on lähinnä poikittaisia sileälihassoluja, joiden ravinnonsaannista huolehtivat verisuonen sisäiset vasa vasorum - suonet. Aortan ja muiden suurten valtimoiden mediassa on paljon elastisia säikeitä, mikä tekee niistä joustavia ja auttaa niitä tasaamaan sydämen pumppaustyöstä aiheutuvaa painetta. Näitä suonia sanotaankin elastisiksi valtimoiksi tai paineentasaajiksi. Median ulkopintaa rajaa toinen elastinen membraani, lamina elastica externa. Aivan uloimpana verisuonen seinämässä on adventitia, joka kiinnittää valtimon sitä ympäröivään löyhään sidekudokseen. Tämä kerros muodostuu tukikudoksen lisäksi hermosäikeistä ja vasa vasorum -suonista.

8 KUVA 1. Aortta ja sen suuret haarat (muokattu lähteestä Sobotta; Atlas of human anatomy 2009) Aortta on elimistön suurin valtimo. Se saa alkunsa sydämen vasemmasta kammiosta nousevana aorttana, kääntyy vasemmalle muodostaen aortan kaaren ja jatkaa kulkuaan kohti alaraajoja rintaontelossa ja edelleen vatsaontelossa. Aortasta haarautuvat elimistön muut suuret valtimot, jotka vievät verta päähän, yläraajoihin, ruuansulatuselimiin ja munuaisiin. Lopulta aortta haarautuu alaraajoihin verta vieviksi valtimoiksi. KUVA 2. Valtimon läpileikkaus (muokattu lähteestä Mitchell & Schoen 2010) Valtimoista voidaan erottaa kolme erilaista kerrosta. Sisimpänä on intima, jota erottaa keskimmäisenä sijaitsevasta mediasta lamina elastica interna. Uloimpana kerroksena on adventitia, jonka tehtävänä on kiinnittää valtimo sitä ympäröivään sidekudokseen.

9 3 ATEROSKLEROOSI 3.1 RISKITEKIJÄT Ateroskleroosilla on sekä perinnöllisiä että ympäristöstä johtuvia riskitekijöitä, ja tauti kehittyy sitä nopeammin mitä useampia riskitekijöitä henkilöllä on (Lusis 2000). Tärkeimpiä ovat seerumin korkea LDL- (low density lipoprotein) ja matala HDL (high density lipoprotein) -kolesterolipitoisuus, kohonnut verenpaine, tupakointi sekä diabetes (Kovanen 2008b). LDL-kolesterolin suuri pitoisuus seerumissa on ateroskleroosin tärkein riskitekijä. Pitoisuuden ollessa tarpeeksi pieni (0,5 1,5 mmol/l), ei kolesterolia kerry valtimoiden seinämään eikä ateroskleroosia kehity, vaikka henkilöllä olisi paljon muita riskitekijöitä (Kovanen 2008b). Toisaalta taas suuri LDL-pitoisuus johtaa kolesterolin kertymiseen intimaan ja ateroomien syntyyn muiden riskitekijöiden puuttuessakin (Glass & Witztum 2001, Falk 2006). HDL-partikkeleilla on puolestaan antiaterogeenisia vaikutuksia, sillä niiden tehtävänä on kuljettaa valtimon intimaan päässyttä kolesterolia maksaan (Kovanen 2008b, Mitchell & Schoen 2010). Ne suojaavat ateroskleroosilta myös estämällä lipoproteiinien oksidaatiota, jolla on tulehduksellista merkitystä aterogeneesissä (Lusis 2000). Terveelliset elämäntavat auttavat ehkäisemään ympäristöstä johtuvia riskitekijöitä vaikuttamalla edullisesti seerumin kolesterolipitoisuuksiin. Oikea ravitsemus laskee LDLkolesterolipitoisuuksia ja liikunta auttaa lisäämään HDL-kolesterolipitoisuutta (dyslipidemioiden Käypä hoito -suositus, 2009). Ylipainon ja tupakoinnin välttäminen on niin ikään tärkeää. Useissa tutkimuksissa ateroskleroosin periytyvyyden on todettu olevan jopa 50 prosenttia, mutta mikään tietty geeni ei aiheuta sitä (Lusis 2000). Sairastumisen perinnölliseen alttiuteen vaikuttavat kolesterolipitoisuutta ja sokeriaineenvaihduntaa säätelevät geenit. Familiaalista hyperkolesterolemiaa sairastavilla henkilöillä, joilta puuttuu toimiva LDLreseptori, on seerumin LDL-pitoisuus korkea jo lapsena, ja perimän osuus ateroskleroosin kehittymisessä on huomattavan suuri (Glass & Witztum 2001, Vuorio ym. 2010, Neefjes ym. 2011). Tautia aiheuttavan geenin suhteen homotsygootit henkilöt ovat vaarassa sairastua sepelvaltimotautiin ja sydäninfarktiin jo varhaisessa kouluiässä (Kovanen 2008b).

10 Androgeeneilla on havaittu olevan ateroskleroosia edistäviä vaikutuksia ja estrogeeneillä ehkäiseviä, joten miesten riski sairastua on suurempi kuin naisten (Mitchell & Schoen 2010, Creatsa ym. 2011, Kolovou ym. 2011). Lisäksi sairastuvuus suurenee selkeästi ikääntymisen myötä, sillä kolesterolia kertyy ajan kuluessa suonen seinämään yhä enemmän ja aterooman koko kasvaa (Kovanen 2008b). 3.2 ATEROGENEESI Ateroskleroosi on valtimon intiman eli sisäkerroksen krooninen tulehdussairaus, jota muun muassa oksidatiivinen stressi edistää (Lusis 2000, Dreger ym. 2010). Ensimmäinen merkki ateroskleroosin kehittymisestä on vaahtosolujen kertyminen ja rasvajuosteiden muodostuminen valtimoiden seinämiin (Glass & Witztum 2001). Taudin edetessä muodostuu yhä suurempia ateroomia, jotka kalkkeutuvat ja kehittyvät epästabiileiksi plakeiksi. Muodostuneet plakit voivat puolestaan rupturoitua ja aiheuttaa esimerkiksi sydäninfarktin. Sairaus alkaa endoteelin dysfunktiolla ja LDL-kolesterolin kertymisellä valtimoiden intimaan (kuva 3) (Griendling & FitzGerald 2003). LDL-partikkelit joko diffundoituvat subendoteelitilaan passiivisesti endoteelin solujen liitosten läpi tai ne joutuvat sinne transsytoottisten rakkuloiden kuljettamina (Lusis 2000, Kovanen 2008b). Intimassa ei ole imueikä verisuonia, joten päästäkseen jälleen pois intimasta, tulisi LDL-partikkelien päästä takaisin valtimon keskikerrokseen, jossa lähimmät imutiet sijaitsevat. Partikkelien kulkua kuitenkin hidastaa niiden positiivisesti varautuneiden apolipoproteiini B-100 -molekyylien (ApoB-100) vuorovaikutus intiman soluvälitilan negatiivisesti varautuneiden proteoglykaanien kanssa. Näin ne jäävät loukkuun verisuonen intimaan, jossa niitä muokataan (Lusis 2000). Ateroskleroosin kehittymistä ajatellen tärkein modifikaatio on LDLpartikkeleiden oksidaatio, joka tapahtuu endoteelisolujen ja makrofaagien tuottamien hapen reaktiivisten metaboliittien vaikutuksesta (Lusis 2000, Glass & Witztum 2001, Dreger ym. 2010, Silverstein ym. 2010). Näitä metaboliitteja syntyy solujen normaalissa aineenvaihdunnassa, mutta niiden liian korkeat pitoisuudet aiheuttavat oksidatiivista stressiä ja proinflammatoristen reittien aktivoitumista (Dreger ym. 2010). Hapettuneet LDL-

11 partikkelit (oxldl) stimuloivat valtimon endoteelisoluja tuottamaan adheesiomolekyylejä ja kasvutekijöitä, jotka aiheuttavat tulehdusreaktion. Kemotaktiset aineet ja adheesiomolekyylit mahdollistavat monosyyttien pääsyn tulehduspaikalle. Etenkin monosyyttejä kutsuvalla kemotaktisella molekyylillä MCP-1 (monocyte chemotactic protein 1) on tärkeä rooli aterogeneesin inflammaatiossa (Reape & Groot 1999, Lusis 2000). Se kuuluu β- kemokiineihin ja houkuttelee tulehduspaikalle monosyyttejä ja T-soluja (Falk 2006, Mitchell & Schoen 2010). MCP-1 tuotetaan endoteeli- ja sileälihassolujen lisäksi intiman makrofaageissa (Falk 2006). Ihmisen ateroskleroottisissa leesioissa on havaittu MCP-1:n ilmentymisen lisääntymistä (Reape & Groot 1999). Intimassa paikalle kutsutut monosyytit erilaistuvat makrofaageiksi, joiden tehtävänä on estää kolesterolin kertyminen solunulkoiseen tilaan välittämällä kolesterolin siirtymistä muuntuneista LDL-partikkeleista HDL-partikkeleihin. Ne fagosytoivat hapettuneita ja muutoin modifioituneita LDL-kolesterolipartikkeleita jätereseptoriensa (scavengerreseptorit) avulla (Lusis 2000). Näistä reseptoreista tärkeimpiä ovat SR-A (scavenger receptor A) ja CD36, jotka pystyvät yhä tunnistamaan affiniteettinsa normaaleihin LDLreseptoreihin menettäneet muuntuneet LDL-partikkelit (Febbraio ym. 2000, Lusis 2000, Ishii ym. 2004, Silverstein ym. 2010). Jätereseptorien ilmentyminen kasvaa solunsisäisen kolesterolipitoisuuden kasvaessa toisin kuin normaalien reseptorien, joiden ilmentymistä säädellään alaspäin (Falk 2006, Silverstein ym. 2010). Tämä mahdollistaa makrofaagin täyttymisen kolesterolilla, kun kolesterolin normaali poistuminen solusta ei ole tarpeeksi nopeaa sen sisäänottoon verrattuna. Fagosytoidut LDL-partikkelit joutuvat hajotettaviksi lysosomiin, josta kolesteroli kulkeutuu makrofaagin solulimaan. Siellä se esteröityy kolesteroliestereiksi ja muodostaa kolesteroliesteripisaroita johtaen makrofaagien muuttumiseen vaahtosoluiksi, joiden kertyminen näkyy rasvajuosteiden syntymisenä valtimoiden seinämiin. HDL-hiukkaset sitoutuvat makrofaagien solukalvolla oleviin HDL-reseptoreihin, jolloin solulimassa olevaa kolesterolia siirtyy HDL-hiukkaseen (Mitchell & Schoen 2010). Tämän jälkeen ne poistuvat intimasta verenkiertoon median imusuonten kautta. HDLpartikkelit eivät kuitenkaan ehdi poistaa kaikkea LDL-peräistä kolesterolia vaahtosoluista, jotka ajautuvat lopulta apoptoosiin ja vapauttavat sisältämänsä kolesterolin intiman soluvälitilaan (Falk 2006, Mitchell & Schoen 2010).

12 KUVA 3. Aterogeneesi (muokattu lähteestä Mitchell & Schoen 2010) Muun muassa hyperlipidemia ja hypertensio johtavat valtimon endoteelin vaurioon ja dysfunktioon. LDL-partikkelit tunkeutuvat intimaan, jossa niitä modifioidaan. Hapettuneet LDL-partikkelit ja sytokiinit kutsuvat tulehduspaikalle lisää monosyyttejä, jotka erilaistuvat makrofaageiksi ja fagosytoivat hapettuneita LDL-molekyylejä muuttuen lopulta vaahtosoluiksi. Vaahtosolut ajautuvat apoptoosiin ja vapauttavat sisältämänsä lipidit solunulkoiseen tilaan. Sileät lihassolut jakaantuvat ja kulkeutuvat kohti intimaa pyrkien vahvistamaan heikentynyttä intimaa erittämällä ympärilleen kollageenia. HDL-molekyylit kuljettavat kolesterolia pois valtimon seinämästä kohti maksaa. Aterogeneesin edetessä valtimon intimaan alkaa muodostua aterooma. Makrofaagien toimintakapasiteetti ylittyy, kun ne eivät enää pysty siirtämään kolesterolia LDLhiukkasista HDL-hiukkasiin. Tämän seurauksena LDL-hiukkasista peräisin olevaa lipidiä alkaa kertyä soluvälitilaan ja aterooman lipidiytimen muodostuminen intiman pohjakerrokseen käynnistyy. Ydin koostuu pienistä pääasiassa elastiinisäikeiden välissä olevista lipidipisaroista, joista osa on peräisin apoptoosiin ajautuneista vaahtosoluista. Ydintä kutsutaan tämän vuoksi myös nekroottiseksi ytimeksi. Rasvapisaroiden määrä kasvaa jatkuvasti, sillä HDL-partikkelit eivät kykene poistamaan kolesterolia tehokkaasti lipidipisarois-

13 ta. Ytimen koon kasvaminen aiheuttaa ympärillä olevan kudoksen rakenteen tuhoutumista ja intiman heikentymistä, jota valtimon seinämän sileälihassolut pyrkivät kompensoimaan erittämällä ympärilleen kollageenia (Lusis 2000, Libby 2002, Falk 2006, Kovanen 2008b). Soluväliaineen määrän lisääntyminen muodostaa ateroomaa vahvistavan sidekudoskaton nekroottisen ytimen päälle, ja leesiota aletaan kutsua fibroateroomaksi (Kovanen 2008b). Sileälihassolut vahvistavat intimaa edelleen jakautumalla ja kulkeutumalla sitä kohti (kuva 3) (Lusis 2000, Glass & Witztum 2001, Falk 2006,). Sekä kollageenin muodostusta että sileälihassolujen jakautumista ja kulkeutumista aiheuttavat makrofaagien ja T-solujen erittämät sytokiinit ja kasvutekijät (Lusis 2000). Fibroateroomia ei esiinny alle 30-vuotiailla, mutta tätä vanhemmilla esiintymistiheys suurenee nopeasti iän myötä (Kovanen 2008b). Ateroomia ja fibroateroomia kutsutaan yhteisnimellä ateroskleroottisiksi plakeiksi. Plakin stabiiliuden määrää kollageenikaton paksuus ja nekroottisen ytimen koko (Lusis 2000, Glass & Witztum 2001, Owen ym. 2011). Ohut sidekudoskatto ja tulehdussolujen (lymfosyytit ja makrofaagit) runsas määrä ytimessä altistavat repeämille. Repeämä eli ruptuura taas voi johtaa trombiin ja sydän- tai aivoinfarktiin. Plakki, jossa on paksu sidekudoskatto, vähän tulehdussoluja ja pieni lipidiydin, on stabiilimpi. Pitkälle edenneessä ateroskleroosissa plakit alkavat kalkkeutua. Tämä tarkoittaa kalsiumfosfaatin kertymistä ateroomaan samaan tapaan kuin luun muodostuksen yhteydessä (Lusis 2000, Falk 2006, Kovanen 2008b). Kalkkeutumisen kliininen merkitys on vielä epäselvä. Sen voidaan ajatella olevan elimistön tapa stabiloida plakkia, mutta toisaalta kollageenikaton kalkkeutuminen voi lisätä repeämisvaaraa. Kalkkeutuminen lisääntyy iän myötä, ja se on merkki pitkälle edenneestä ateroskleroosista. Toinen komplisoituneiden plakkien merkki on kolesterolikiteiden (kolesterolimonohydraatti) muodostuminen makrofaageihin (Small 1988, Tangirala ym. 1994). Varhaisissa leesioissa kolesteroli on pääasiassa kolesteroliesteripisaroina makrofaagien solulimassa. Plakkien kehittyessä alkaa makrofaageissa kuitenkin esiintyä yhä enemmän kolesterolikiteitä. Kiteet muodostuvat lysosomeissa kolesteroliestereiden hydrolyysin seurauksena (Tangirala ym. 1994). Nämä kiteet ovat veteen liukenemattomia ja hyvin pysyviä rakenteita. Plakkien kehityttyä tähän vaiheeseen on muutoksia hankala enää korjata.

14 Ateroskleroosia tutkiessa on muistettava, että ihmisen ja hiiren aterogeneesissä on eroavaisuuksia. Hiirillä kuten ihmisilläkin aterogeneesi on multifokaalinen prosessi, mutta leesioiden kehittymispaikoissa on eroja (Bentzon & Falk 2010). Ihmisillä leesioita kehittyy koko sepelvaltimoiden alueelle haaraumat mukaan lukien. Hiirillä taas leesiot kehittyvät sepelvaltimoiden proksimaalisiin osiin sekä pienempiin intramyokardiaalisiin segmentteihin, mutta niiden välinen alue ja sepelvaltimoiden haarat ovat yleensä turvassa sairauden kehittymiseltä. Plakkien morfologiassa on myös eroja, sillä ihmisen ja hiiren valtimoiden rakenne eroaa hieman toisistaan. Ihmisen terveidenkin valtimoiden intimassa on sileälihassoluja ja tukikudosta, ja intima voi tietyillä alueilla paksuuntua normaalitilanteessakin (adaptiivinen paksuuntuminen). Hiirillä intima on puolestaan aina hyvin ohut ja koostuu ainoastaan endoteelisolukerroksesta. Näiden erojen myötä ihmisen ateroskleroottisissa plakeissa on hiiren leesioihin verrattuna enemmän sileälihassoluja ja tukikudosta jo taudin varhaisessa vaiheessa. Ihmisellä esiintyykin usein plakkeja, jotka koostuvat lähes kokonaan fibroottisista muutoksista ateromatoottisen komponentin ollessa pieni tai puuttuessa kokonaan. Hiirillä tällaiset plakit ovat epätyypillisiä. Niillä ei myöskään yleensä esiinny kliinisiä komplikaatioita (ks. luku 3.3 Komplikaatiot ja hoito), sillä plakin ruptuura ja tromboosi ovat harvinaisia tapahtumia. Tämä rajoittaa hiirimallien käyttöä ihmisen ateroskleroosin tutkimisessa, mitä käsittelen myöhemmin luvussa 6 Ateroskleroosin hiirimallit. 3.3 KOMPLIKAATIOT JA HOITO Komplisoituneet leesiot johtavat lopulta ateroskleroosin kliinisiin manifestaatioihin, joita esiintyy sepelvaltimoiden lisäksi etenkin aivovaltimoissa ja alaraajojen suurissa valtimoissa (perifeerinen valtimotauti eli PAD) (Libby 2002, Mostaza ym. 2009, Kervinen 2011a). Komplikaatiot riippuvat ahtautuneen suonen sijainnista. Plakin aiheuttama valtimon ahtautuminen vaikeuttaa verenkiertoa ja johtaa hapenpuutteeseen kohdekudoksessa. Tämä ilmenee kipuna. Jos potilaalla on havaittu ateroskleroosia jossain elimistön valtimossa, on sitä todennäköisesti myös muissa verisuonissa. Tästä johtuen komplikaatioilla on selkeä yhteys toisiinsa, ja esimerkiksi sydäninfarktin sairastaneella henkilöllä on suuri riski saada myöhemmin aivoinfarkti (Mostaza ym. 2009).

15 Yleinen ja henkeä uhkaava ateroskleroosin komplikaatio on ateroskleroottisen plakin repeämisen (ruptuuran) aiheuttama trombi, joka voi tukkia suonen joko osittain tai kokonaan ja aiheuttaa iskemiaa alueella, jota verisuoni ravitsee (Falk ym. 1995, Kovanen 2008a). Ruptuuroille alttiita alueita ateroskleroottisissa plakeissa ovat erityisesti niiden reuna-alueet eli hartiat (Glass & Witztum 2001, Kovanen 2008a). Ruptuuran seurauksena syntynyt tuore trombi voi tukkia suonen joko syntypaikallaan tai lähteä liikkeelle verenkierron mukana ja tukkia distaalisemman ja ohuemman haaran, jolloin sitä kutsutaan emboliaksi (Owen ym. 2011). Sepelvaltimoiden osittainen ahtauma ilmenee rintakipuna (angina pectoris), joka pahenee rasituksessa (Kervinen 2011b). Täysin tukkeutunut suoni aiheuttaa iskemian ja kivun lisäksi kuoliota sydänlihaksessa (akuutti myokardiaalinen infarkti) (Libby 2002). Kaulavaltimossa tai nikamavaltimossa sijaitsevan plakin repeämisen seurauksena syntynyt trombi voi aiheuttaa embolisaation, joka johtaa aivoverisuonen tukokseen ja ohimenevään aivoverenkierron häiriöön (TIA-kohtaus) tai aivoinfarktiin (Adams 2009). Alaraajassa sijaitseva valtimoa ahtauttava plakki voi puolestaan aiheuttaa potilaalle kipua pohkeeseen ja kivusta johtuvan klaudikaatio- eli katkokävelyoireen, kun alaraajan lihakset kärsivät iskemiasta (Lepäntalo 2011). Aterooma ei ainoastaan ahtauta luumenia vaan myös heikentää valtimon mediakerrosta, mikä voi johtaa aneurysman syntyyn (Golledge & Norman 2010). Ateroskleroosin komplikaatioiden hoidossa otetaan huomioon sekä antitromboottinen, anti-iskeeminen että kajoava hoito (Airaksinen 2008, Lepojärvi & Werkkala 2008, Ylitalo ym. 2008). Antitromboottisen hoidon (asetyylisalisyylihappo, klopidogreeli, varfariini) tavoitteena on estää hyytymien syntyminen ja embolisaatio. Anti-iskeeminen hoito (nitraatit, beetasalpaajat, kalsiuminestäjät) laajentaa ahtautuneita sepelvaltimoita ja helpottaa angina pectoris -oireita. Merkittävästi ahtautuneet tai kokonaan tukossa olevat suonet voidaan tarpeen vaatiessa avata tai ohittaa kajoavalla hoidolla (revaskularisaatio pallolaajennuksella tai ohitusleikkauksella) (Lepojärvi & Werkkala 2008, Ylitalo ym. 2008). Lääkehoidon lisäksi on tärkeää vaikuttaa ateroskleroosin vaaratekijöihin myönteisesti elämäntapoja muuttamalla sekä hoitaa korkea verenpaine, dyslipidemia ja diabetes asianmukaisesti (Airaksinen 2008).

16 4 OKSIDATIIVINEN STRESSI Oksidatiivinen stressi tarkoittaa hapen reaktiivisten metaboliittien (ROS, engl. reactive oxygen species) solunsisäisten pitoisuuksien nousua (Huang ym. 2000, Dreger ym. 2010). Hapen metaboliitteja syntyy solun normaalissa toiminnassa, mutta pitoisuuksien nousu voi aiheutua solun altistumisesta erilaisille ulkoisille tekijöille (kemikaalit ja fysikaaliset tekijät, kuten ionisoiva säteily, raskasmetallit, tulehdusta aiheuttavat sytokiinit tai vierasaineet) (Kaspar ym. 2009, Lu 2009). Tärkeimpinä hapen reaktiivisina metaboliitteina voidaan pitää typpioksidia (NO), superoksidia (O - 2 ) ja peroksinitraattia (ONOO - ) (Griendling & FitzGerald 2003). Superoksidi ja peroksinitraatti ovat erittäin sytotoksisia, ja ne voivat vaurioittaa solun sisäisiä molekyylejä ja rakenteita, kuten DNA:ta, lipidejä ja proteiineja. Typpioksidilla puolestaan on elimistön kannalta positiivisiakin vaikutuksia, sillä se laajentaa verisuonia (Loscalzo & Welch 1995). Tätä ominaisuutta käytetään hyväksi esimerkiksi sepelvaltimotautikohtauksen hoitoon kehitetyissä lääkkeissä (Parker & Parker 1998). Hapen reaktiivisten metaboliittien aiheuttamat vauriot voivat johtaa moniin patologisiin muutoksiin, joista mainittakoon syöpä, ateroskleroosi, neurodegeneratiiviset sairaudet ja krooniset tulehdukset (Huang ym. 2000, Griendling & FitzGerald 2003, Kensler ym. 2007). Oksidatiivisella stressillä on roolinsa myös diabeteksen synnyssä (Kobayashi & Yamamoto 2005). Elimistöllä on kuitenkin keinoja suojautua oksidatiivista stressiä vastaan. Nämä elimistön puolustusmekanismit voidaan jakaa neljään kategoriaan: hapetuspelkistysreaktiot, nukleofiilin liittäminen elektrofiiliin, transportterit ja tiolia sisältävät molekyylit (Kensler ym. 2007). Elimistön hapetus-pelkistysreaktioita katalysoivat usein sytokromi P450-entsyymit. Nukleofiilejä, kuten glutationia, elektrofiileihin liittävistä entsyymeistä mainittakoon esimerkkinä glutationi S-transferaasi (Lu 2009). Transportterit kuljettavat toksisia metaboliitteja ulos solusta ja tiolia sisältävät molekyylit ylläpitävät pelkistäviä olosuhteita solun sisällä. Nrf2-transkriptiofaktori on tärkeässä asemassa solun suojautumisessa oksidatiivista stressiä vastaan, sillä se säätelee useiden puolustusmekanismeissa tarvittavien entsyymien ilmentymistä.

17 5 NRF2-TRANSKRIPTIOFAKTORI Nrf2 on transkriptiofaktori, joka on avainasemassa solujen puolustautumisessa oksidatiivisia ja elektrofiilisia tekijöitä vastaan (Kobayashi & Yamamoto 2005, Kensler ym. 2007, Kim ym. 2010). Se kuuluu bzip-transkriptiofaktoreiden (basic region-leucine zipper) Cap n Collar-perheeseen, ja sen on havaittu säätelevän monia antioksidantti- ja detoksifikaatiogeenejä ja sitä kautta suojaavan kudoksia oksidatiivisen stressin ja elektrofiilisten vierasaineiden aiheuttamilta haitallisilta muutoksilta (Huang ym. 2000, Lee ym. 2005, Pi ym. 2010). Nrf2:lla on todettu olevan muun muassa anti-inflammatorisia ja antikarsinogeenisia sekä neuroneita suojaavia vaikutuksia (Kobayashi & Yamamoto 2005). Nrf2 ilmentyy voimakkaasti kudoksissa, jotka ovat mukana vierasaineiden metaboliassa (Pi ym. 2010). Näitä kudoksia ovat muun muassa maksa ja munuaiset. Sen on havaittu suojaavan monia muitakin kudoksia, kuten keuhkoja, ihoa, ruuansulatuskanavaa, retinan epiteeliä, punasoluja, pernaa ja aivoja muun muassa karsinogeneesiltä ja neurodegeneratiivisten sairauksien kehittymiseltä (Lee ym. 2005, Kensler ym. 2007). Nrf2:lla näyttäisi olevan myös autoimmuunisairauksilta suojaavia ominaisuuksia (Lee ym. 2005, Kim ym. 2010). 5.1 KEAP1 NRF2 ARE-SIGNALOINTI Nrf2:n aktiivisuutta säädellään posttranskriptionaalisesti. Keap1-proteiini (Kelch-like ECHassociated protein 1) toimii solulimassa Nrf2:n spesifisenä negatiivisena säätelijänä (Itoh ym. 1999, Huang ym. 2000, Kensler ym. 2007). Stressittömässä normaalitilanteessa Keap1 sitoutuu Kelch-domeenillaan Nrf2:n aminoterminaaliseen Neh2-domeeniin pitäen Nrf2:n solulimassa ja aiheuttaen sen hajotuksen ubikitiini proteasomi-reitin kautta (Itoh ym. 1999, Kobayashi & Yamamoto 2005, Kensler ym. 2007, Taguchi ym. 2011, Kansanen ym. 2012). Yhteen Nrf2-molekyyliin on sitoutuneena kaksi Keap1-molekyyliä (kuva 4). Keap1 muodostaa Cullin 3 -proteiinin (Cul3) kanssa ubikitiini E3 -ligaasin, jonka tehtävänä on liittää Nrf2:een ubikitiinia (Taguchi ym. 2011, Kansanen ym. 2012). Keap1 toimii entsyymissä adaptoriproteiinina. Ubikitinaation seurauksena Nrf2 ohjautuu hajotettavaksi proteasomeihin. Lisäksi Keap1 on vuorovaikutuksessa solun tukirangan aktiinisäikeiden kanssa pitääkseen Nrf2:n lokalisoituneena solulimaan (Kensler ym. 2007, Kaspar ym. 2009,

18 Kansanen ym. 2012). Oksidatiivisen stressin ja elektrofiilisten aineiden vaikutuksesta Keap1:n reaktiivisissa kysteiinitähteissä tapahtuu muutoksia, jotka muuttavat sen konformaatiota ja aiheuttavat sen inaktivoitumisen (Taguchi ym. 2011, Kansanen ym. 2012). Tämän seurauksena Keap1:n sitoutuminen Nrf2:een heikentyy, ubikitiinin liittäminen Nrf2:een häiriintyy, sen proteasomaalinen hajotus estyy ja se kulkeutuu tumaan. Tumassa Nrf2 heterodimerisoituu pienten Maf-proteiinien (small Maf) kanssa. Muodostunut kompleksi sitoutuu kohdegeenin antioksidanttivaste-elementtialueeseen (ARE- eli antioxidant response element -alue), joka aktivoi monien antioksidanttiproteiinien ja faasin II detoksifikaatioentsyymien geenien luentaa (Chen ym. 2006, Kaspar ym. 2009). ARE-alue sijaitsee näiden geenien promoottorialueella (Lee ym. 2005). Nrf2-transkriptiofaktorin sitoutuminen ARE-tekijään oksidatiivisen stressin seurauksena johtaa suojaavien geenien induktioon.

KUVA 4. Keap1 Nrf2 ARE-signalointi (muokattu lähteestä Kansanen ym. 2012) A. Keap1:n ja Nrf2:n domeenirakenne B. Yksi Nrf2-molekyyli sitoutuu kahteen Keap1-molekyyliin, jotka muodostavat Cul3:n kanssa ubikitiini E3 -ligaasin. C. Normaalitilassa ubikitiini E3 -ligaasi liittää Nrf2:een ubikitiinia ja se hajotetaan proteasomeissa. D. Elektrofiilien ja oksidatiivisen stressin vaikutuksesta Keap1:n kysteiinitähteissä tapahtuu muutoksia, minkä seurauksena Nrf2 aktivoituu ja kulkeutuu tumaan. E. Nrf2 heterodimerisoituu pienten Maf-proteiinien kanssa ja sitoutuu kohdegeeniensä AREsekvenssialueeseen. Tämän seurauksena näiden geenien luenta aktivoituu ja solu puolustautuu oksidatiivista stressiä vastaan. 19

20 5.2 NRF2:N KOHDEGEENIT Kuten aiemmin mainittu, Nrf2 säätelee monia antioksidatiivisia proteiineja sekä faasin II detoksifikaatioentsyymejä koodaavia geenejä (Itoh ym. 1997, Kobayashi & Yamamoto 2005). Nrf2:n kohdegeenit osallistuvat muun muassa glutationisynteesiin, hapen reaktiivisten metaboliittien eliminaatioon, vierasaineiden detoksifikaatioon sekä eräisiin kuljetustehtäviin (Taguchi ym. 2011). Geenien ilmentyminen kasvaa voimakkaasti elektrofiilien tai oksidatiivisen stressin seurauksena. Vierasaineiden detoksifikaatioon osallistuvat entsyymit muuttavat reaktiivisia elektrofiilejä vähemmän toksisiksi ja helpommin eritettäviksi metaboliiteiksi. Näihin entsyymeihin kuuluvat esimerkiksi glutationi S-transferaasi (GST) ja NAD(P)H kinonioksidoreduktaasi (NQO1) (Itoh ym. 1997, Kobayashi & Yamamoto 2005, Chen ym. 2006, Taguchi ym. 2011). GST katalysoi reaktioita, joissa elektrofiili liitetään glutationiin (GSH). GSH on tärkeä vierasaineiden ja niiden metaboliittien detoksifikaatiosta vastaava intrasellulaarinen peptidi (Lu 2009). Sen synteesiä katalysoi glutamaatti-kysteiini ligaasi -niminen entsyymi, joka koostuu kahdesta alayksiköstä: katalyyttisestä (GCLC) ja modifioivasta (GCLM). Sekä GST:n että GCLC:n ja GCLM:n ekspressiota säädellään Nrf2 ARE-välitteisesti (Bea ym. 2003, Kobayashi & Yamamoto 2005, Lu 2009, Taguchi ym. 2011). Ekspressio indusoituu oksidatiivisen stressin seurauksena (Lu 2009). Myös NQO1:tä koodaava geeni indusoituu voimakkaasti Nrf2:n säätelemänä (Itoh ym. 1997, Dinkova-Kostova & Talalay 2010). Antioksidatiivisia hapen reaktiivisten metaboliittien eliminaatioon osallistuvia proteiineja ovat esimerkiksi hemioksigenaasi-1 (HO-1) ja peroxiredoxin-1 (Prx1) (Kim ym. 2007, Paine ym. 2010,). HO-1 hajottaa proinflammatorista vapaata hemiä hiilimonoksidiksi, raudaksi ja biliverdiiniksi, josta syntetisoidaan bilirubiinia (Martin ym. 2004, Paine ym. 2010). Nrf2 indusoi HO-1:n ilmentymistä oksidatiivisen stressin seurauksena. Prx1 puolestaan detoksifioi peroksideja (Kim ym. 2007). Se sisältää katalyyttisessä kohdassaan kysteiiniä ja kuuluu 2-Cys Prx -perheeseen. Ilmentyminen indusoituu Nrf2-välitteisesti hypoksian seurauksena.

21 Edellä mainittujen detoksifikaatioentsyymien ja antioksidatiivisten proteiinien lisäksi Nrf2 säätelee joidenkin lämpöshokkiproteiinien, adheesiomolekyylien ja proteasomien alayksiköiden ilmentymistä (Kensler ym. 2007). Proteasomit ja lämpöshokkiproteiinit ovat osa proteasomaalista hajotusreittiä, joka tuhoaa muun muassa oksidatiivisen stressin seurauksena syntyneitä ja soluun kertyneitä epänormaaleja proteiineja. Huonontunut hajotuskapasiteetti liittyy useisiin neurodegeneratiivisiin sairauksiin, kuten Alzheimerin ja Parkinsonin tauteihin. Nrf2 säätelee mahdollisesti myös joidenkin muiden transkriptiofaktoreiden ilmentymistä sekä toimii vuorovaikutuksessa niiden kanssa. Nrf2 ei olekaan ainoa edellä mainittujen geenien ilmentymistä kontrolloiva tekijä, vaan useat transkriptiofaktorit toimivat yhteistyössä keskenään. Vuorovaikutusta on kuvattu muun muassa Nrf2:n ja NF-κB:n (nuclear factor kappab) välillä niiden vaikuttaessa adheesiomolekyylien ja glutationihomeostaasin säätelyyn (Kensler ym. 2007). Myös makrofaagien CD36-jätereseptoria koodaava geeni kuuluu niiden geenien joukkoon, joita Nrf2:n lisäksi säätelevät lukuisat muutkin tekijät (Ishii ym. 2004). 5.3 NRF2 JA ATEROGENEESI Valtimonseinämän inflammaatio, jota oksidatiivisen stressi lisää, on osa ateroskleroosiprosessin etenemistä (Dreger ym. 2010). Tulehduksellisten vaikutustensa ohella oksidatiivinen stressi aktivoi Nrf2:ta, joka yhdessä solun muiden suojamekanismien kanssa vähentää tulehdusta (Kensler ym. 2007, Kaspar ym. 2009). Tämän perusteella voidaan olettaa Nrf2:lla olevan ateroskleroosilta suojaavia vaikutuksia. Tutkimustulokset kuitenkin osoittavat, että Nrf2:lla on paitsi suojaavia myös haitallisia vaikutuksia. Verisuonten sileiden lihassolujen jakautuminen ja kulkeutuminen intimaan ovat tärkeitä tapahtumia ateroskleroottisen leesion komplisoitumisessa. Reaktiiviset happiradikaalit, joita sileät lihassolut itse tuottavat, edistävät näitä tapahtumia (Levonen ym. 2007). On havaittu, että Nrf2 vähentää sileiden lihassolujen jakautumista kanin kaulavaltimossa. Vaikutus johtuu osin Nrf2-välitteisestä HO-1:n ilmentymisen lisääntymisestä. HO-1 suojaa soluja happiradikaaleilta, ja sen katalysoimien reaktioiden lopputuotteiden on osoitettu

22 inhiboivan verisuonten sileiden lihassolujen kasvua in vitro (Otterbein ym. 2003, Nakao ym. 2005, Ollinger ym. 2005). Nrf2 suojaa aterogeneesiltä myös ehkäisemällä tulehdusta valtimon seinämässä (Zakkar ym. 2009). Nrf2 lisää antioksidantti- ja detoksifikaatiogeenien ilmentymistä vähentäen näin oksidatiivisesta stressistä johtuvaa tulehdusta. Signalointiketju käynnistyy oxldl:n vaikutuksesta ja suojaa soluja oksidatiiviselta stressiltä sekä in vitro että in vivo (Bea ym. 2003, Anwar ym. 2005). Hapettuneiden fosfolipidien on oxldl:n lisäksi havaittu aktivoivan Nrf2:ta (Jyrkkänen ym. 2008). Toinen Nrf2:n tulehdusta ehkäisevä vaikutus on monosyyttien vähentynyt hakeutuminen tulehduspaikalle. Tämä johtuu Nrf2:n yliekspression aiheuttamasta soluadheesiomolekyyli VCAM-1:n (vascular cell adhesion molecule) vähentyneestä ilmentymisestä (Levonen ym. 2007). VCAM-1:n ilmentymisen vähentyminen laskee monosyyttien adheesiota endoteelisoluihin, mikä puolestaan osaltaan vähentää tulehdusta. Niin ikään monosyyttejä houkuttelevan proteiinin MCP-1:n ilmentyminen laskee Nrf2:n vaikutuksesta (Chen ym. 2006, Barajas ym. 2011). Suojaavista vaikutuksistaan huolimatta Nrf2 lisää ateroskleroosia ApoE-poistogeenisillä hiirillä (Sussan ym. 2008, Barajas ym. 2011, Freigang ym. 2011). Nrf2:n proaterogeeniset ominaisuudet näyttäisivät osittain johtuvan sen vaikutuksista makrofaagien joidenkin solukalvoreseptoreiden ilmentymiseen (Barajas ym. 2011). Näitä reseptoreja ovat muun muassa jätereseptorina toimiva CD36 sekä kolesterolin käänteiseen kuljetukseen kudoksista maksaan osallistuvat SR-B1 (scavenger receptor B1) ja ABCG1 (ATP-binding cassette, subfamily G, member 1). Reseptorien ilmentymiseen kohdistuvien vaikutusten seurauksena Nrf2 lisää lipidien kertymistä makrofaageihin mutta toisaalta myös kolesterolin ulosvirtaus makrofaageista on lisääntynyt (Barajas ym. 2011). Lisääntynyt lipidien kertyminen selittyy osin CD36-induktiolla, sillä Nrf2 lisää CD36:n ilmentymistä makrofaagien solukalvolla hapettuneen LDL:n vaikutuksesta (Sussan ym. 2008, Barajas ym. 2011, Freigang ym. 2011). Nrf2:n puutteen myötä solut, joissa on vähemmän CD36-jätereseptoria, eivät kykene ottamaan modifioitunutta LDL:a sisäänsä yhtä tehokkaasti kuin solut, joissa jätereseptori ilmenee normaalisti (Ishii ym. 2004, Sussan ym. 2008). Nämä solut eivät myöskään pääse kehittymään vaahtosoluiksi ja siten edelleen suuremmiksi leesioiksi. CD36-

23 puutos näyttäisikin olevan voimakas antiaterogeeninen tekijä, sillä vaahtosolujen muodostuksen lisäksi lipidien kertyminen on samoin vähentynyt merkittävästi CD36 -/- -hiirillä (Ishii ym. 2004). Nrf2 kuitenkin vähentää toisen jätereseptorin, SR-A:n, ilmentymistä makrofaageissa, mikä ei voi selittää lisääntynyttä lipidien kertymistä (Barajas ym. 2011). Kolesterolin lisääntynyttä ulosvirtausta makrofaageista selittää Nrf2-välitteinen siirtäjäproteiini ABCG1:n ilmentymisen lisääntyminen makrofaagien solukalvolla (Barajas ym. 2011). ABCG1 toimii kolesterolin käänteiskuljetuksessa välittäen soluliman fosfolipidien ja kolesterolin siirtymistä makrofaageista vastaanottajille, kuten apoe:lle (Imaizumi 2011). Toinen vastaava siirtäjäproteiini on ABCA1 (ATP-binding cassette, subfamily A, member 1), jonka ilmentymiseen Nrf2:lla ei kuitenkaan ole vaikutusta (Barajas ym. 2011). Myös jätereseptori SR-B1 on mukana kolesterolin käänteiskuljetuksessa, ja Nrf2 näyttäisi lisäävän tämänkin reseptorin ilmentymistä makrofaageissa (Rigotti ym. 2003, Barajas ym. 2011). Kaikesta huolimatta Nrf2 +/+ -makrofaageihin kertyy enemmän lipidejä kuin Nrf2 -/- - makrofaageihin, joten Nrf2-välitteisellä CD36-induktiolla näyttäisi olevan enemmän merkitystä kuin ABCG1:n ja SR-B1:n ilmentymisen lisääntymisellä (Barajas ym. 2011). Vaikka Nrf2 suojaa oksidatiivisen stressin aiheuttamalta tulehdukselta, sen on kuitenkin havaittu lisäävän sytokiini interleukiini-1 (Il-1) -välitteistä tulehdusta in vivo (Freigang ym. 2011). Il-1 on proinflammatorinen interleukiini, jolla on monia proaterogeenisiä ominaisuuksia. Se lisää endoteelisolujen adheesiomolekyylien ilmentymistä sekä verisuonen sileiden lihassolujen jakautumista. Myös kemokiinien ja sytokiininen tuotanto lisääntyy. Verisuonissa ilmenevien paikallisten vaikutusten ohella Nrf2:lla näyttäisi olevan lipidimetaboliaan liittyviä systeemisiä vaikutuksia (Huang ym. 2010, Pi ym. 2010, Barajas ym. 2011, Chartoumpekis ym. 2011). Tästäkin on kuitenkin eriäviä tuloksia tutkimusryhmien kesken, sillä esimerkiksi Freigangin ryhmässä eri genotyypeillä ei havaittu toisistaan eroavia lipoproteiiniprofiileja (Freigang ym. 2011). Sussanin ryhmässä puolestaan Nrf2:n puutteen havaittiin suurentavan seerumin triglyseridipitoisuuksia ApoE -/- -hiirillä (Sussan ym. 2008). He eivät havainneet tutkimuksissaan eroa LDL- tai totaalikolesterolipitoisuuksissa toisin kuin Barajasin ryhmä, joka havaitsi Nrf2-puutteen laskevan plasman kokonaiskolesterolipitoisuutta etenkin uroshiirillä (Barajas ym. 2011). Eri tutkimusryhmien toisistaan

24 eroavia tuloksia voi selittää erilaisten dieettien käyttö. Sussanin ja Freigangin ryhmät käyttivät dieettejä, joissa on korkea rasva- ja kolesterolipitoisuus (Sussanin ryhmässä aterogeeninen TD.94059 ja Freigangin ryhmässä D12107C) (Sussan ym. 2008, Freigang ym. 2011). Barajasin ryhmä puolestaan käytti Harlan-Tekladin valmistamaa rehudieettiä (Barajas ym. 2011). Nrf2:lla on myös useita metabolisia vaikutuksia maksassa ja valkeassa rasvakudoksessa (Huang ym. 2010). Lisäksi rasvadieetin on havaittu mahdollisesti vaikuttavan Nrf2-hiirten fenotyyppiin (Pi ym. 2010, Chartoumpekis ym. 2011).

25 6 ATEROSKLEROOSIN HIIRIMALLIT Niin ateroskleroosin kuin muidenkin kardiovaskulaaristen sairauksien patofysiologiaan vaikuttavat merkittävästi monet geneettiset ja ympäristöstä johtuvat tekijät (Zaragoza ym. 2011). Siksi tietylle sairaudelle on vaikea kehittää yhtä yksittäistä kaikki riskitekijät huomioivaa eläinmallia. Täydellisesti ihmisen taudinkuvaa vastaavaa mallia ei olekaan onnistuttu luomaan, ja toistaiseksi on tyydyttävä malleihin, jotka antavat tietoa vain yhdestä näkökulmasta. Ateroskleroosin tutkimista eläimillä vaikeuttaa muun muassa niiden ihmisestä poikkeava lipoproteiiniprofiili (Kobayashi ym. 2011). Ihmisellä apob-48 on pääasiallisin apolipoproteiini eksogeenisia ruuasta peräisin olevia lipidejä kuljettavissa kylomikroneissa ja niiden jäänteissä (Véniant ym. 1998, Kobayashi ym. 2011). ApoB-100 puolestaan ilmentyy VLDL-, IDL- ja LDL-partikkeleissa, jotka ovat maksan tuottamia endogeenisia lipoproteiinipartikkeleita. ApoB-100 on käytännössä LDL-partikkeleiden ainoa proteiinikomponentti ja mahdollistaa näiden lipoproteiinihiukkasten sitoutumisen LDL-reseptoriin (Véniant ym. 1998). Hiirillä taas sekä ekso- että endogeeniset lipoproteiinit sisältävät vain apob-48:aa (Kobayashi ym. 2011). Tämä johtuu tietyn entsyymin esiintymisestä näiden eläinten maksassa. Ihmisellä tämä apob-48:aa editoiva entsyymi esiintyy vain ohutsuolessa, eikä maksassa tuotetuissa lipoproteiineissa näin ollen ole apob-48:aa. ApoB-48:n ansiosta lipoproteiinipartikkeleita voidaan poistaa plasmasta muidenkin kuin LDL-reseptoreiden välityksellä, minkä seurauksena hiirten apob-48:aa sisältävät VLDL-partikkelit poistuvat verenkierrosta nopeasti (Sanan ym. 1998, Jawien ym. 2004, Kobayashi ym. 2011). Tästä johtuen niiden plasman LDL-konsentraatio on huomattavasti ihmisen lukemia pienempi, ja suurin osa niiden plasman kokonaiskolesterolista on HDL-kolesterolia (Jawien ym. 2004, Kobayashi ym. 2011). Tämän lisäksi hiiriltä ja rotilta puuttuu kolesteroliesteritransferaasiproteiinin (CETP) aktiivisuus plasmasta, kun taas ihmisille tällä proteiinilla on tärkeä merkitys. CETP on entsyymi, joka siirtää kolesteroliestereitä HDL-partikkeleista VLDL- ja LDL-partikkeleihin (Jawien ym. 2004). Kaneilla lipoproteiiniprofiili on lähempänä ihmistä, sillä niilläkin apob-48:aa

26 editoiva entsyymi esiintyy ainoastaan ohutsuolessa, ja myös niille CETP on tärkeä proteiini (Kobayashi ym. 2011). Erilaisesta lipoproteiiniprofiilista huolimatta hiiret ovat osoittautuneet hyvin käyttökelpoisiksi ateroskleroosin molekulaaristen mekanismien tutkimisessa (Zaragoza ym. 2011). Hiirten suosiota selittää osin se, että niiden genomista on paljon tietoa ja sitä on helppo manipuloida (Jawien ym. 2004, Whitman 2004, Getz & Reardon 2006). Hiirten nopea lisääntyminen on eduksi uusien genotyyppien kehittelyssä. Lisäksi ne ovat pienen kokonsa vuoksi edullisempia kuin suuremmat eläimet ja niiden ylläpitokustannukset jäävät pienemmiksi (Whitman 2004). Tämä mahdollistaa useamman tutkimuseläimen käytön, mikä puolestaan johtaa parempaan tilastolliseen luotettavuuteen. Koska hiirille ei normaalisti kehity ateroskleroottisia leesioita, on kehitetty poisto- ja transgeenisiä hiirikantoja mallintamaan aterogeneesiä (Getz & Reardon 2006). Geenimanipulaation päämääränä on lipoproteiinimetabolian ja -säätelyn muokkaaminen tautimallin kaltaiseksi. Ateroskleroosin mallintamisessa käytetyimpiä ovat hiiret, joilta on poistettu LDL-reseptori (LDLR -/- -hiiret) tai apolipoproteiini E (ApoE -/- -hiiret) (Zaragoza ym. 2011). Muita hiirimalleja ovat mm. transgeeniset hiiret, jotka tuottavat maksassaan ihmisen apob-100:aa, sekä transgeeniset ihmisen eri apoe-isomuotoja ilmentävät hiiret (Daugherty 2002, Jawien ym. 2004). On myös huomattava, että eri hiirikannoilla on toisistaan poikkeavia ominaisuuksia (Daugherty 2002, Getz & Reardon 2006). Useimmat hiirikannat ovat suhteellisen resistenttejä ateroskleroosille, vaikka niiden lipoproteiiniprofiilia olisi muokattu ateroskleroosia edistävään suuntaan. C57BL/6-taustaiset hiiret kehittävät ateroskleroosin helpommin kuin muihin kantoihin kuuluvat, ja siksi ne ovatkin laajimmin tutkimuskäytössä (Daugherty 2002, Whitman 2004, Getz & Reardon 2006). 6.1 LDLR-POISTOGEENISET HIIRET LDLR -/- -hiirillä voidaan tutkia familiaarisen hyperkolesterolemian vaikutuksia (Zaragoza ym. 2011). Koska näiltä hiiriltä puuttuu LDL-reseptori, on VLDL- ja LDL-partikkeleiden puhdistuminen verestä hidastunut. Tämän seurauksena hiirten plasman LDLkolesterolipitoisuus kohoaa, ja niille kehittyy normaalia helpommin ateroskleroosi

27 (Véniant ym. 1998, Zaragoza ym. 2011). Ateroskleroosin kehittymistä voidaan nopeuttaa ruokkimalla hiiriä rasvaisella rehulla (rasvaa 42 %), jossa on paljon kolesterolia (Getz & Reardon 2006, Zaragoza ym. 2011). Graavimpi malli saadaan risteyttämällä LDLR -/- -hiiri johonkin toiseen ateroskleroosin mallintamiseen käytettyyn hiirikantaan. Esimerkkinä mainittakoon LDLR -/- ApoE -/- -hiiri, jolta on poistettu sekä LDLR- että apoe-geeni. Tällaiselle genotyypille kehittyy vakava hyperlipidemia ja ateroskleroosi jopa tavallisella rehulla ruokittuna. LDLR -/- -hiiri voidaan risteyttää muidenkin poistogeenisten hiirten kanssa, jolloin voidaan tutkia tietyn yksittäisen geenin vaikutuksia ateroskleroosiin. On kehitetty myös hiirimalleja, jossa LDLR -/- -hiiri on risteytetty joko ihmisen apob-100:a ilmentävään transgeeniseen hiirikantaan (LDLR -/- Tg(apoB +/+ )), tai apob-48-poistogeeniseen kantaan, joka niin ikään ilmentää vain apob-100:aa (LDLR -/- ApoB 100/100 tai LDLR -/- ApoB48 -/- ) (Linton ym. 1993, Sanan ym. 1998, Véniant ym. 2001, Daugherty 2002, Jawien ym. 2004). LDLR -/- ApoB 100/100 -hiirillä lipoproteiinipartikkeleiden puhdistuma plasmasta on entisestään hidastunut apob48:n puuttumisen myötä, mikä johtaa kohonneeseen plasman kolesterolipitoisuuteen (Linton ym. 1993, Véniant ym. 2001). Suurin osa kolesterolista on LDLkolesterolia, mikä vastaa hyvin tilannetta ihmisen verenkierrossa (Sanan ym. 1998, Véniant ym. 1998, 2000, Jawien ym. 2004). LDLR -/- ApoB 100/100 -hiirillä on paitsi korkeampi plasman LDL-pitoisuus myös enemmän ateroskleroottisia leesioita kuin LDLR -/- -hiirillä. Leesiot kehittyvät jopa vähärasvaisella dieetillä toisin kuin LDLR -/- -hiirillä, jotka vaativat leesioiden kehittymiseen runsasrasvaisen dieetin (Sanan ym. 1998). 6.2 APOE-POISTOGEENISET HIIRET ApoE:tä tuotetaan monissa kudoksissa maksa ja valtimonseinämä mukaan lukien (Getz & Reardon 2009). Se ilmentyy lähinnä adiposyyteissä, mutta myös makrofaageissa, joissa se toimii osana kolesterolin käänteiskuljetusta makrofaageista HDL-partikkeleihin (Mahley ym. 2006, Getz & Reardon 2009). ApoE -/- -hiiret ovat laajimmin käytettyjä malleja ateroskleroosin tutkimisessa, ja niillä havaittiin ensimmäisenä ihmisen leesioiden kehittymistä vastaava prosessi (Zaragoza ym. 2011). Näiden hiirten plasman kolesterolipitoisuudet ovat merkittävästi kohonneet, koska VLDL-partikkeleiden puhdistuminen verestä on häiriintynyt. Normaalillakin ruokavaliolla oleville hiirille kehittyy laajoja leesioita koko aortan

28 alueelle. Leesiot kehittyvät ensin aortan juureen, sitten aortan kaareen ja sen suuriin haaroihin (truncus brachiocephalicus, a. carotis communis sin. ja a. subclavia sin.), ja lopulta sepelvaltimoihin. ApoE -/- -hiirten leesioiden muodostuksen kronologiset tapahtumat vastaavat hyvin suurempien eläimien ja ihmisten leesioiden kehittymistä. ApoE -/- -hiiret ovat käyttökelpoisia myös ateroskleroosiin vaikuttavien lääkkeiden tutkimisessa, ja muun muassa statiineja onkin tutkittu näillä hiirillä. ApoE -/- -hiirille ei kuitenkaan kehity ateroskleroottisen plakin ruptuuraa tai tromboosia. Tämä rajoittaa hiirimallin käyttöä, koska ruptuura ja tromboosi ovat ihmisen ateroskleroosin vakavia pääkomplikaatioita. Toiseksi ongelmaksi muodostuu ApoE -/- -hiirten ihmisestä poikkeava lipidiprofiili, mikä tekee mallista epäfysiologisen. ApoE -/- -hiirten plasman kokonaiskolesterolipitoisuus on huomattavasti korkeampi kuin villityypin hiirillä, mutta hyperkolesterolemia on seurausta lähinnä VLDLpartikkelien ja kylomikronien jäänteiden pitoisuuksien kohoamisesta (McNeill ym. 2010, Imaizumi 2011). Ihmisillä hyperkolesterolemian taustalla on puolestaan plasman korkea LDL-pitoisuus.

29 OMA TUTKIMUS 7 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET Syventävien opintojeni tavoitteena oli tutkia Nrf2-transkriptiofaktorin vaikutuksia aterogeneesiin LDLR -/- -hiirillä määrittämällä hiirten ateroskleroottisten leesioiden pinta-aloja aorttaläppätasolla. Lisäksi tutkittiin leesioiden morfologiaa ja komplisoituneiden plakkien kehittymistä erilaisten immunohistokemiallisten värjäysten avulla. Mielenkiinnon kohteena olivat myös Nrf2:n mahdolliset vaikutukset hiirten lipidimetaboliaan, mitä selvitettiin hiirten lopetusverinäytteistä määritettyjen kolesteroli- ja triglyseridipitoisuuksien avulla. Hypoteesina oli, että Nrf2 suojaisi ateroskleroosin kehittymiseltä indusoimalla antioksidantti- ja detoksifikaatiogeenien ilmentymistä oksidatiivisen stressin seurauksena. Samoin oletettiin, että Nrf2:n suojaavan vaikutuksen puuttuessa hiirille kehittyy komplisoituneempia leesioita.

30 8 AINEISTO JA MENETELMÄT 8.1 HIIRIMALLI Tätä työtä varten Nrf2 -/- -hiiret oli risteytetty LDLR -/- -hiiriin, joille kehittyy ateroskleroosi plasman korkean totaalikolesterolin vuoksi (Véniant ym. 1998). Kontrollihiirinä käytettiin LDLR -/- -hiiriä. Hiirille syötettiin rasvarehua (Harlan-Teklad 88137 Western Diet, jossa energiasta 42 % saadaan rasvasta) 6 tai 12 viikon ajan. 6 viikon aikana hiirille kehittyi varhaisia ateroskleroottisia leesioita. 12 viikkoa rasvadieetillä olleita hiiriä puolestaan käytettiin mallintamaan komplisoituneiden leesioiden kehittymistä. 8.2 ATEROSKLEROOSIN MÄÄRITYS En face -analyysin avulla tarkastellaan aortan leesioiden pinta-alaa suhteutettuna aortan seinämän kokonaispinta-alaan. Aortan ympäriltä poistettiin ylimääräinen kudos ja adventitia, minkä jälkeen ne leikattiin pitkittäin auki aina bifurkaatioon asti. Tämän jälkeen aortta levitettiin auki ja kiinnitettiin alustaan neuloilla värjäystä varten. Aorttaa huuhdottiin ensin 70 % etanolissa, minkä jälkeen sitä inkuboitiin Sudan IV -väriliuoksessa (5 g Sudan IV, 500 ml 70 % EtOH, 500 ml 100 % EtOH). Lopuksi aorttaa huuhdottiin vielä 70 % etanolilla ylimääräisen värin poistamiseksi, ja hetki juoksevan veden alla. Värjätyt aortat kuvattiin ja kuvat analysoitiin Analysis-ohjelmalla. 8.3 LEESIOIDEN ANALYYSI JA VÄRJÄYKSET Hiirten sydämet fiksoitiin 1 % paraformaldehydissä (PFA) noin 24 tunnin ajan kudosten hajoamisprosessin pysäyttämiseksi. Sen jälkeen niitä säilytettiin 1 x Phosphate Buffered Saline -liuoksessa (PBS). Sydämistä leikattiin kärki pois, minkä jälkeen ne prosessoitiin veden poistamiseksi (nouseva etanolisarja, ksyleeni ja parafiini). Prosessoinnin jälkeen sydämet valettiin parafiiniin tyvi ylöspäin. Valetuista sydämistä leikattiin 5 µm:n paksuisia leikkeitä aorttaläppätasolta.

31 8.3.1 HEMATOKSYLIINI EOSIINI-VÄRJÄYS Aorttaläppätason leikkeitä inkuboitiin ksyleenissä parafiinin poistamiseksi ja tämän jälkeen laskevassa etanolisarjassa (100 % ja 96 % etanoli). Tämän jälkeen lasit upotettiin hematoksyliiniin (Delafieldin hematoksyliini). Värjäyksen jälkeen laseja pestiin juoksevan veden alla ja inkuboitiin diffausliuoksessa (1 % HCl 70 % etanolissa) värin kirkastamiseksi, minkä jälkeen ne värjättiin eosiinilla. Lasit huuhdeltiin 96 % etanolissa, mitä seurasi nouseva etanolisarja (96 % ja 100 % etanoli) veden poistamiseksi. Viimeisenä laseja inkuboitiin vielä ksyleenissä. Värjäyksen jälkeen lasit peitattiin Permountilla. Lasit kuvattiin Olympus AX70 -mikroskoopilla ja niistä määritettiin leesioiden pinta-alan prosentuaalinen osuus aortan luumenista aorttaläppätasolla. 8.3.2 MOVAT S PENTACHROME -VÄRJÄYS 12 viikkoa rasvadieetillä olleiden Nrf2 -/- LDLR -/- -hiirten sekä näiden LDLR -/- -kontrollihiirten aorttaläppätason leikkeistä tehtiin MOVAT-värjäys (Movat s pentachrome) nekroosialuiden määrittämiseksi. 6 viikkoa rasvadieetillä olleiden hiirten leikkeitä ei värjätty, koska niissä leesiot ovat vielä hyvin varhaisessa vaiheessa eikä niissä juuri ole nekroosialueita. MOVAT-värjäys on perusvärjäys, joka värjää tumat ja elastiset säikeet mustiksi, lihakset punaiseksi, kollageeni- ja retikuliinisäikeet keltaiseksi, fibrinoidin ja fibriinin tummanpunaiseksi ja muut soluväliaineen soluttomat komponentit ja musiinin siniseksi. Jokaisesta sydämestä valittiin yksi lasi värjättäväksi. Parafiini poistettiin inkuboimalla laseja ksyleenissä, mitä seurasi nouseva etanolisarja (100 %, 96 %, 70 % ja 50 % etanoli) veden lisäämiseksi. Tämän jälkeen laseja inkuboitiin Weigertin liuoksessa. Lasit huuhdeltiin juoksevalla vedellä ja inkuboitiin Crocein scarlet/acid fuchsin -liuoksessa (Stock Crocein Scarlet: Crocein Scarlet MOO 3b 1,0 g, tislattu H 2 O 99,5 ml; Stock Acid Fuchsin: Acid Fuchsin 0,1 g, tislattu H 2 O 99,5 ml, Conc. Glacial Acetic Acid; näistä yhdistettiin värjäyksessä käytetty liuos: Stock Crocein Scarlet 40 ml, Stock Acid Fuchsin 10 ml). Ylimääräinen väri huuhdeltiin pois juoksevalla vedellä. Seuraavaksi laseja inkuboitiin 5 % fosfovolframihappoliuoksessa (Phosphotungstic Acid 5,0 g, tislattu H 2 O 100 ml) ja 1 % Glacial Acetic Acid - liuoksessa (Conc. Glacia Acetic Acid 1,0 ml, tislattu H 2 O 99,0 ml). Happojen jälkeen laseja värjättiin 1 % Alcian Blue -värissä (Alcian blu 8gx 1 g, 3 % Clacial Acetic Acid 100 ml). Yli-

32 määräinen väri huuhdeltiin jälleen pois juoksevalla vedellä, minkä jälkeen laseja inkuboitiin absoluuttisessa etanolissa ja sahramiliuoksessa (sahramia 6,0 g, absoluuttista etanolia 100 ml). Sahramin jälkeen lasit käytettiin absoluuttisessa etanolissa ja lopuksi niitä inkuboitiin ksyleenissä. Tämän jälkeen lasit peitattiin. Valmiista laseista määritettiin leesioissa olevien nekroosialueiden pinta-alojen prosentuaalinen osuus leesioiden yhteispintaalasta. 8.3.3 IMMUNOHISTOKEMIA Immunohistokemiallisia värjäyksiä tehtiin kahta erilaista: MMQ (hiiren makrofaagit) ja CD36 (vaahtosolujen jätereseptorit). MMQ-värjätyistä leikkeistä analysoitiin vaahtosolujen alan prosentuaalinen osuus leesioiden kokonaispinta-alasta. CD36-värjäyksellä puolestaan määritettiin leesioiden CD36-positiivisten solujen prosentuaalinen pinta-ala. Molemmissa värjäyksissä käytettiin samaa menetelmää. CD36-värjäyksessä käytetty primaarivasta-aine oli Anti-SCARB1 (Sigma-Aldrich). MMQ-värjäyksessä primaarivasta-aineena käytettiin anti-mouse macrophage -vasta-ainetta (Accurate Chemicals). Värjäyksissä käytettiin samaa sekundaarivasta-ainetta (goat anti-rabbit, valmistajana Vector). Laseja inkuboitiin ensin ksyleenissä parafiinin poistamiseksi. Ksyleeniä seurasi laskeva etanolisarja (100 %, 95 %, 70 % ja 50 % etanoli), jossa leikkeisiin lisättiin vettä. Etanolisarjan jälkeen laseja huuhdeltiin 1 x PBS-liuoksessa. Tämän jälkeen niitä inkuboitiin 0,25 % Triton X-liuoksessa ja 3 % vetyperoksidissa. Blokkaukseen käytettiin 10 % vuohen seerumia, koska sekundaarivasta-aineet oli valmistettu vuohessa. Blokkauksen tarkoituksena on poistaa epäspesifiset sitoutumiskohdat primaarivasta-aineelta. Blokkausliuoksen annettiin vaikuttaa yön yli +4 asteessa kosteuskammiossa. Blokkauksen jälkeen kanissa valmistetun primaarivasta-aineen annettiin vaikuttaa kosteuskammiossa tunnin ajan. Primaarivasta-aineet laimennettiin DAKO-laimenteeseen taustan vähentämiseksi. Leikkeet huuhdeltiin PBS:lla ennen inkubointia biotinyloidussa sekundaarivasta-aineessa. Antirabbit sekundaarivasta-aine sitoutuu kanissa tuotettuun primaarivasta-aineeseen. Vastaaine sai vaikuttaa kosteuskammiossa 30 minuutin ajan, minkä jälkeen lasit huuhdeltiin PBS:lla sitoutumattoman vasta-aineen poistamiseksi. Seuraavassa vaiheessa Avidin-HRP

33 step ABC (Avidin-Biotin Complex) -liuoksen annettiin vaikuttaa 30 minuuttia, minkä aikana liuoksen avidiini-biotiini-peroksidaasikompleksit sitoutuivat sekundaarivasta-aineen biotiiniin. Jälleen seurasi huuhtelu PBS:ssä. Huuhtelun jälkeen leikkeitä inkuboitiin DABliuoksessa (diaminobenzidine). DAB toimii substraattina sekundaarivasta-aineeseen sitoutuneen avidiini-biotiini-peroksidaasikompleksin peroksidaasille, ja reaktio on nähtävissä leikkeessä tapahtuvana värimuutoksena. Reaktio pysäytettiin veteen. Laseille vaihdettiin puhdas mq-vesi, ja niitä inkuboitiin muutama minuutti. Veden jälkeen leikkeitä taustavärjättiin hematoksyliinissä (Harrisin hematoksyliini), minkä jälkeen ne huuhdeltiin juoksevan veden alla. Huuhtelua seurasi nouseva etanolisarja (50 %, 70 %, 95 % ja 100 % etanoli) ja inkubointi ksyleenissä. Lasit peitattiin Permountilla. 8.3.4 VON KOSSA -VÄRJÄYS Von Kossa -värjäyksen tarkoituksena oli tuoda esiin leesioiden nekroosialueiden kalkkeumia. Värjäys tehtiin Movat-värjäyksen tapaan 12 viikkoa rasvadieetillä olleiden hiirten aorttaläppätason leikkeistä, ja sen avulla voitiin tutkia, onko Nrf2 -/- LDLR -/- -hiirten leesioissa enemmän kalkkeutuneita alueita kuin LDLR -/- -hiirten leesioissa. Laseja inkuboitiin ensin ksyleenissä parafiinin poistamiseksi ja sitten veden lisäämiseksi laskevassa etanolisarjassa (100 %, 95 %, 70 % ja 50 % etanoli) ja lopulta vedessä. Tämän jälkeen lasit asetettiin UVvalon alle 5 % hopeanitraattiliuokseen noin tunnin ajaksi. Hopeanitraatti huuhdeltiin pois vedellä, minkä jälkeen laseja inkuboitiin 5 % natriumtiosulfaatissa ja ne taustavärjättiin van Gieson -värillä. Leikkeet kuivattiin nousevassa etanolisarjassa (50 %, 70 %, 95 % ja 100 % etanoli) ja lopuksi niitä inkuboitiin ksyleenissä. Peittaus tapahtui Permountilla. Värjäyksen tuloksena kalkkeuma-alueet näkyivät mustana ja muu kudos punaisena. 8.4 PLASMAN KOLESTEROLI- JA TRIGLYSERIDIPITOISUUKSIEN MÄÄRITYS Rasvadieetillä olleiden LDLR -/- - ja Nrf2 -/- LDLR -/- -hiirten lopetusverinäytteistä määritettiin plasman kolesteroli- ja triglyseridipitoisuudet ennen dieettiä sekä 6 ja 12 viikon dieetin jälkeen, jotta saatiin selville, vaikuttaako Nrf2-hiirten lipidimetaboliaan. Koska suuret kolesteroli- ja triglyseridipitoisuudet edistävät aterogeneesiä, on tärkeää tietää, muuttaako

34 Nrf2 näitä pitoisuuksia. Kolesterolimääritys tehtiin Cholesterol FS - ja triglyseridimääritys Triglyseride FS -kitillä (valmistaja Diasys). 96-kuoppalevyn kuoppiin laitettiin 2 µl plasmaa ja 200 µl valmista kitin reagenssia. Näiden lisäksi tehtiin viisi standardinäytettä, joihin laitettiin 1 µl, 2 µl, 3 µl, 4 µl tai 5 µl standardiliuosta (kolesterolimäärityksessä standardinäytteen pitoisuus 5,17 mmol/l ja triglyseridimäärityksessä 2,3 mmol/l) ja 200 µl reagenssia. Standardinäytteiden absorbanssien avulla saatiin määritettyä standardisuora, josta varsinaisten näytteiden kolesteroli- ja triglyseridipitoisuudet luettiin. Lisäksi kahteen kuoppaan laitettiin vain reagenssia. Nämä kuopat toimivat negatiivisina kontrolleina. Jokaisesta plasmanäytteestä ja standardista tehtiin kaksi rinnakkaista näytettä. Näistä rinnakkaisista näytteistä laskettiin absorbanssin keskiarvo ja pitoisuus määritettiin absorbanssin perusteella standardisuoralta.

35 9 TULOKSET 9.1 LEESIOIDEN ALA HE-värjätyistä leikkeistä määritettiin leesioiden prosentuaalinen pinta-ala aortan luumenin alasta. 6 viikkoa rasvadieetillä olleilla LDLR -/- -uroshiirillä havaittiin enemmän leesioita kuin Nrf2 -/- LDLR -/- -hiirillä (12 % vs. 7 %, p < 0,05, kuva 5A). Naarashiirilläkin trendi oli samansuuntainen (18 % vs. 12 %, p = 0,086). 12 viikon rasvadieetin jälkeen Nrf2 lisäsi leesioiden alaa molemmilla sukupuolilla (urokset: 29 % vs. 18 %, p < 0,01; naaraat 37 % vs. 31 %, p < 0,01, kuva 5B). A. B. * * * naaras naaras * uros uros A. LDLR -/- Nrf2 -/- LDLR -/- B. LDLR -/- Nrf2 -/- LDLR -/- KUVA 5. Leesioiden ala aorttaläppätasolla A. 6 viikkoa rasvadieetillä olleilla hiirillä Nrf2 lisäsi urosten leesioiden prosentuaalista pinta-alaa aorttaläppätasolla. Naarailla oli havaittavissa samansuuntainen trendi. B. 12 viikkoa rasvadieetillä olleilla hiirillä Nrf2 lisäsi leesioiden pinta-alaa molemmilla sukupuolilla. Leesioita on merkitty tähdellä (*).

36 9.2 LEESIOIDEN MORFOLOGIA MMQ- ja CD36-värjäykset sekä MOVAT-värjäys tehtiin leesioiden morfologian tutkimiseksi. Saadut tulokset korreloivat hyvin HE-värjäyksellä määritettyihin leesioiden pintaaloihin. MOVAT-värjäys tehtiin vain 12 viikkoa rasvadieetillä olleille hiirille, koska 6 viikkoa rasvarehua syöneillä hiirillä leesiot koostuivat lähes yksinomaan vaahtosoluista, eikä nekroottisia aloja näin ollen ollut mieltä värjätä. MOVAT-värjäyksellä saatiin hyvin esiin leesioiden nekroosialat, mutta selkeää eroa LDLR -/- - ja Nrf2 -/- LDLR -/- -hiirten välillä ei saatu kummallakaan sukupuolella (urokset: p = 0,096; naaraat: p = 0,879, kuva 6A). Uroksilla on kuitenkin havaittavissa trendi, jossa Nrf2:n puute vähentää nekroottista alaa kontrollihiiriin verrattuna (kontrollihiiret 35 % vs. Nrf2 -/- LDLR -/- -hiiret 21 %, kuva 6A ja 6C). Von Kossa -värjäyksellä haluttiin vielä tuoda esiin pitkälle edenneiden komplisoituneiden leesioiden kalkkeumaa (kuva 7). A. B. * LDLR -/- 10x C. Nrf2 -/- LDLR -/- 10x * * LDLR -/- 10x * Nrf2 -/- LDLR -/- 10x * nekroosia KUVA 6. Leesioiden nekroottinen ala 12 viikkoa rasvadieetillä olleiden hiirten aorttaläppätasolla A. MOVAT-värjäyksen avulla määritettiin leesioiden nekroottisen alan prosentuaalinen osuus koko leesion alasta aorttaläppätasolla. B. Ylhäällä kuva LDLR -/- - ja alhaalla Nrf2 -/- LDLR -/- -naarashiiren aorttaläppätasolta. 10 x suurennoksessa nekroosialoja on merkitty tähdellä (*). C. Vastaavat kuvat uroshiirten aorttaläppätasolta. Ylhäällä LDLR -/- - ja alhaalla Nrf2 -/- LDLR -/- -hiiri.

37 * * KUVA 7. Leesioiden kalkkeumaa aorttaläppätasolla Von Kossa -värjäys tehtiin 12 viikkoa rasvadieetillä olleiden hiirten leikkeille pitkälle edenneiden leesioiden kalkkeutumien osoittamiseksi. Kalkkeumat ovat värjäytyneet mustiksi, ja niitä on osoitettu tähdellä (*) 20-kertaisessa suurennoksessa (oikealla). Esimerkkikuvat ovat LDLR -/- -naarashiirten aorttaläppätasolta. MMQ-värjäyksessä 6 viikkoa rasvadieetillä olleiden naaraskontrollihiirten leesioiden makrofaagipinta-ala oli pienempi kuin Nrf2 -/- LDLR -/- -hiirten (72 % vs. 92 %, p < 0,05, kuva 8A, kuva 9A ja 9B). Uroksilla tulos oli samansuuntainen (86 % vs. 96 %, p = 0,104, kuva 9C ja 9D). 12 viikon rasvadieetin jälkeen sekä uros- että naarashiirillä Nrf2:n poistaminen lisäsi makrofaagien prosentuaalista alaa leesioissa (urokset: 26 % vs. 73 %, p < 0,001; naaraat: 25 % vs. 44 %, p < 0,01, kuva 8B ja kuva 10).

38 A. B. KUVA 8. Makrofaagivärjäys vaahtosolujen osoittamiseksi aorttaläppätason leikkeistä A. 6 viikon rasvadieetti. Naarashiirillä Nrf2 vähensi leesioiden makrofaagien prosentuaalista pinta-alaa. Uroksilla oli havaittavissa samansuuntainen trendi. B. 12 viikon rasvadieetillä Nrf2 vähensi makrofaagien osuutta leesioissa molemmilla sukupuolilla.

39 A. * B. 20x * 20x C. * D. 20x * 20x KUVA 9. Makrofaagivärjäys 6 viikkoa rasvadieetillä olleiden hiirten aorttaläppätasolta Värjäytyneet makrofaagit erottuvat ympäristöään ruskeampina. 20 x suurennoksessa vaahtosoluja on osoitettu tähdellä (*). A. LDLR -/- naaras. B. Nrf2 -/- LDLR -/- naaras. C. LDLR -/- uros D. Nrf2 -/- LDLR -/- uros

40 A. * B. 20x * 20x C. D. 20x * 20x KUVA 10. Makrofaagivärjäys 12 viikkoa rasvadieetillä olleiden hiirten aorttaläppätasolta Värjäytyneet makrofaagit erottuvat ympäristöään ruskeampina. 20 x suurennoksessa vaahtosoluja on osoitettu tähdellä (*). A. LDLR -/- naaras B. Nrf2 -/- LDLR -/- naaras C. LDLR -/- uros D. Nrf2 -/- LDLR -/- uros

41 CD36-värjäyksellä selvitettiin, vaikuttaako Nrf2 CD36-positiivisten solujen määrään leesioissa. Värjäys tehtiin 12 viikkoa rasvadieetillä olleille hiirille. Naarashiirillä Nrf2 vähensi leesioiden CD36-positiivisten solujen prosentuaalista pinta-alaa (LDLR -/- -hiiret 24 % vs. Nrf2 -/- LDLR -/- -hiiret 31 %, p < 0,05, kuva 11A ja 11B). Uroshiirillä tulos oli samansuuntainen (28 % vs. 52 %, p = 0,056, kuva 11A ja 11C). A. B. * CD36 positiivisia soluja * C. * LDLR -/- 20x LDLR -/- 20x * * Nrf2 -/- LDLR -/- 20x Nrf2 -/- LDLR -/- 20x KUVA 11. CD36-positiivisten solujen osuus 12 viikkoa rasvadieetillä olleiden hiirten aorttaläppätason leesioissa A. CD36-positiivisten solujen prosentuaalista osuutta 12 viikkoa rasvadieetillä olleiden hiirten leesioissa määritettiin immunohistokemiallisen CD36-värjäyksen avulla. B. Kuva naarashiirten aorttaläppätasolta. Ylhäällä kontrollihiiri ja alhaalla Nrf2 -/- LDLR -/- -hiiri. Oikealla on 20 x suurennos, jossa CD36-positiivisia soluja on merkitty tähdellä (*). C. Vastaava kuva uroshiirten läppätasolta.

42 9.3 EN FACE -ANALYYSI 6 viikon rasvadieetin jälkeen erot eri hiirikantojen aortan seinämän leesioiden prosentuaalisessa pinta-alassa olivat hyvin pieniä, eikä Nrf2:lla näin ollen ollut käytännön vaikutusta leesioiden syntyyn (urokset: LDLR -/- 0,6 % vs. Nrf2 -/- LDLR -/- 0,3 %, p = 0,141; naaraat: 0,9 % vs. 1,3 %, p = 0,463, kuva 12A sekä kuva 13B ja 13C). 12 viikon dieetin jälkeen Nrf2 lisäsi leesioiden alaa uroksilla (4,6 % vs. 1,3 %, p < 0,001), mutta ei niin selkeästi naarailla, vaikkakin samansuuntainen trendi oli havaittavissa (2,9 % vs. 2,0 %, p = 0,177) (kuva 12B sekä kuva 13D ja 13E). Leesiot lokalisoituivat suurimmaksi osaksi aortan kaareen (kuva 13). Yksittäisiä leesioita oli myös rinta- ja vatsa-aortan puolella. A. B. KUVA 12. Leesioiden pinta-alojen osuus koko aortan seinämän alasta A. Leesioiden prosentuaaliset pinta-alat aortan seinämässä 6 viikon rasvadieetin jälkeen. B. Leesioiden pinta-alat aortan seinämässä 12 viikon rasvadieetin jälkeen.

43 A. B. LDLR -/- naaras Nrf2 -/- LDLR -/- naaras C. Rasvadieetti 6 vk LDLR -/- uros Nrf2 -/- LDLR -/- uros Rasvadieetti 6 vk D. LDLR -/- naaras E. Nrf2 -/- LDLR -/- naaras Rasvadieetti 12 vk LDLR -/- uros Nrf2 -/- LDLR -/- uros Rasvadieetti 12 vk KUVA 13. Ateroskleroottiset leesiot aortan seinämässä Punaiseksi värjäytyneitä leesioita on osoitettu nuolilla. Suurin osa leesioista lokalisoitui aortan kaareen, mutta 12 viikkoa rasvadieetillä olleilla hiirillä leesioita oli myös rinta- ja vatsa-aortan puolella. A. Puhdas aortta, jossa ei ole leesioita. B. 6 viikkoa rasvadieetillä olleiden naaraiden aortat. C. 6 viikkoa rasvadieetillä olleiden urosten aortat. D. 12 viikkoa rasvadieetillä olleiden naaraiden aortat. E. 12 viikkoa rasvadieetillä olleiden urosten aortat.