1. Immunomääritys vapaalle PAPP-A -proteiinille Isto Leinonen Ohjaajat: FM Saara Wittfooth ja FT Kim Pettersson MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Raskauteen liittyvä plasmaproteiini A eli PAPP-A (engl. pregnancy associated plasma protein A) on sinkkiä sitova metalloproteinaasi, joka on osallisena akuutin sepelvaltimotautikohtauksen synnyssä. Normaalisti prombp-proteiini (engl. proform of eosinophil major basic protein) on sitoutunut PAPP-A -proteiiniin ja näin estää sen toimintaa. Akuutin sepelvaltimokohtauksen yhteydessä verenkiertoon vapautuu PAPP-A -proteiinin vapaata prombp:hen sitoutumatonta muotoa. Työn tarkoituksena oli kehittää immunomääritys vapaalle PAPP-A -proteiinille. Immunomäärityksessä käytetyt vapaan PAPP-A:n tunnistavat vasta-aineet tuotettiin hybridoomasoluissa. Hybridoomasolut saatiin yhdistämällä rekombinanttisella PAPP-A -proteiinilla immunisoitujen hiirten pernasoluja myeloomasolujen kanssa. Vapaalle PAPP- A:lle vasta-aineita tuottavien solulinjojen löytämiseksi, solulinjoja seulottiin käyttäen europium-kelaatilla leimattua PAPP-A -proteiinin vapaata ja prombp:hen sitoutunutta muotoa. Seulotuissa solulinjoissa tuotettiin vasta-aineita, minkä jälkeen tuotetut vasta-aineet puhdistettiin ja leimattiin europium-kelaatilla. Vasta-aineita testattiin aikaerotteiseen fluorometriaan perustuvassa sandwich-tyyppisessä immunomäärityksessä sekä sitojina että jäljittiminä. Parhaat vasta-ainekombinaatiot selvitettiin määrittämällä niiden kyky sitoutua potilaiden seeruminäytteissä olevaan vapaan PAPP-A -proteiinin natiiviin muotoon. Seulotuista hybridoomasolulinjoista yhdeksän solulinjaa olivat sellaisia, jotka tuottivat pelkästään vapaaseen PAPP-A:han sitoutuvaa vasta-ainetta. Parhaan vasta-ainekombinaation analyyttinen herkkyys vapaan PAPP-A:n määrityksessä oli 0,17 miu/l. Kyseinen vastaainekombinaatio oli myös sitomisnopeudeltaan lupaava käytettäväksi nopeissa määrityksissä. Tätä vasta-aineparia käyttämällä saatiin tehtyä herkkä ja spesifinen immunomääritys vapaalle PAPP-A -proteiinille. Asiasanat: vapaa PAPP-A, sepelvaltimotautikohtaus, immunomääritys
2. Troponiiniautovasta-aineiden karakterisointi ja niistä riippumattoman immunomäärityksen kehitys Emilia Engström Ohjaaja: prof. Kim Pettersson MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Sydänspesifistä troponiini I:tä (engl. cardiac Troponin I, ctni) käytetään sydäninfarktin biokemialliseen havainnointiin. Sen on todettu olevan erittäin kudosspesifinen ja herkkä merkkiaine diagnostiikassa. Troponiini-immunomääritystä voivat häiritä ihmisen verenkierrossa olevat troponiiniautovasta-aineet. Tällöin immunomääritys ei havaitse kaikkea näytteessä olevaa troponiinia, jolloin sydäninfarktin diagnosointi saattaa vaikeutua. Troponiiniautovasta-aineiden muodostumisen tarkkaa mekanismia ei tiedetä, mutta mahdollisesti niitä syntyy troponiinipäästöjen seurauksena mm. infarktin, sydänlihaksen tulehdustilojen, sydämen vajaatoiminnan sekä pitkäkestoisen liikuntasuorituksen yhteydessä. Erikoistyön tarkoituksena oli kartoittaa troponiiniautovasta-aineiden vaikutusta sydänspesifiseen troponiini I kompleksiin (antigeeni) sekä kehittää immunomääritys, jota troponiiniautovasta-aineet eivät häiritse. Troponiiniautovasta-aineiden karakterisointi suoritettiin luomalla kilpailevia ctnimäärityksiä analyytin eri epitooppeja vastaan. Määrityksissä troponiiniautovasta-aineet ja europium-leimattu vasta-aine kilpailivat analyyttiin (ctni kompleksi) sitoutumisesta ja mikäli autovasta-aineet vaikuttivat kyseiseen kohtaan analyytissa, mitattu vaste oli normaalinäytettä alhaisempi. Immunomäärityksen kehityksessä käytettiin vastaavaa menetelmää kuin autovasta-aineiden karakterisoinnissa. Tässä kuitenkin keskityttiin löytämään paras yhdistelmä biotinyloituja sitojavasta-aineita. Leimana käytettiin ennestään jo tiedettyä autovasta-aineista riippumatonta vasta-ainetta. Tutkimuksen lopussa analysointiin 66 troponiiniautovasta-ainepositiivista sekä 66 -negatiivista potilasnäytettä 5:llä kehitetyllä määrityksellä. Työssä kehitettiin immunomääritys, jossa autovasta-aineita sisältävän näytteen vasteeksi saatiin 95 % normaalinäytteeseen nähden. Alkuperäisellä, ns. 1. sukupolven määrityksellä, vaste on alle 10 %. Troponiiniautovasta-aineiden karakterisointi potilasnäytteillä on vielä kesken. Asiasanat: sydänspesifinen troponiini I, immunomääritys, troponiiniautovasta-aineet
3. Immunoassay for TATI (Tumour Associated Trypsin Inhibitor) Yvette van der Eijk Supervisors: FM Mari Peltola, FM Riina-Minna Väänänen, Professor Kim Pettersson MOLECULAR BIOTECHNOLOGY AND DIAGNOSTICS Prostate cancer is currently the most common cancer amongst men in Western society; early detection is thus crucial to avoid mortality. Several markers have been investigated, including tumour associated trypsin inhibitor (TATI). The role of TATI in prostate cancer is unclear, but in some other cancers its expression and serum/urine levels increase. The aim of this work was to develop an immunoassay for TATI in order to measure levels of TATI in tissue samples of prostate cancer patients, and study its role in prostate cancer. Impure 6E8 and 11B3 TATI antibodies were purified with affinity chromatography in a protein G column. The 11B3 antibodies were labelled with Europium chelate and the 6E8 antibodies biotinylated before assay. For sample testing, an immunometric assay was used with the streptavidin-biotin system and time-resolved fluorometry was used for detection. Samples from 188 patients were tested; the samples were protein extracts of tissue from radical prostatectomy patients. Purification yield of the 6E8 antibodies was 75.6%. 1.55mg was retrieved, 0.5mg which was successfully biotinylated. The 11B3 solution formed aggregates which were trapped during filtration so only 315μg 11B3 could be recovered from purification. This was labelled to form a 75mg/ml solution. Statistical analysis for the TATI assay results for patient samples is still in progress. Key words: prostate cancer, tumour associated trypsin inhibitor (TATI), immunoassay
4. β 2 -adrenergisen reseptorin ligandimääritys Eija Martikkala Ohjaajat: FT Anita Rozwandowicz, FT Harri Härmä BIOKEMIA G-proteiinikytkentäiset reseptorit ovat laaja ja toiminnallisesti monimuotoinen reseptorien perhe. Ne välittävät solunsisäisiä toimintoja guaniininukleotidia sitovien säätelyproteiinien eli G-proteiinien välityksellä. G-proteiinikytkentäiset reseptorit säätelevät monenlaisia solunsisäisiä prosesseja kuten esimerkiksi maku-, haju- ja näköaistimuksia sekä vasteita solunulkoisiin ärsykkeisiin. Monet sairaudet voidaan yhdistää G-proteiinikytkentäisiin reseptoreihin ja siksi ne ovatkin yksi tärkeimmistä lääketeollisuuden lääkeaineiden suunnittelukohteista. Tutkimuksen tavoitteena oli kehittää uusi europium(iii)-leimattuun ligandiin perustuva menetelmä lääkeyhdisteiden seulontaan G-proteiinikytkentäisillä reseptoreilla käyttäen β 2 -adrenergistä reseptoria mallisysteeminä. Tutkimuksessa käytettiin transfektoituja HEK293 soluja, jotka tuottivat aktiivista β 2 - adrenergistä reseptoria solukalvoihinsa. Kehitetyssä pesumääritysmenetelmässä reseptoriin sitoutuva ligandi leimattiin fluoresoivalla europium(iii) kelaatilla. Kilpailevassa kokosolumäärityksessä leimattu ligandi syrjäytettiin β 2 -adrenergisen reseptorin antagonistilla propranololilla. Kontrollina tutkimuksessa käytettiin myös transfektoimattomia HEK293 soluja. Tutkimuksessa pyrittiin myös kehittämään homogeeninen luminesenssin resonanssienergian siirtoon (LRET) perustuva määritysmenetelmä käyttäen erilaisia donoriakseptoripareja. Heterogeenisen määrityksen olosuhteet optimoitiin ja inhibiitiovakion arvoksi saatiin 45 nm variaation ollessa 1-15% ja signaali-taustasuhteen ollessa 14. Sitoutumisreaktion kinetiikkamittauksissa havaittiin sitoutumisen tapahtuvan viidessä minuuttissa. Nopeasta reaktiokinetiikasta huolimatta heterogeenisessa määrityksessä pesuvaiheet ovat työläitä, aikaa vieviä ja siksi tavoitteena on kehittää määritys homogeeniseksi. Homogeenisen määrityksen kehittäminen jatkuu edelleen. Asiasanat: G-proteiinikytkentäiset reseptorit, β 2 -adrenerginen reseptori, lääkeyhdisteiden seulonta, homogeeninen määritys, heterogeeninen määritys
5. Uuden melanooma-spesifisen CT16-antigeenin määritys seerumista Janne Kulpakko Ohjaajat: FM Noora Ristiniemi, FT Pekka Rappu, prof. Kim Pettersson ja prof. Jyrki Heino BIOKEMIA Länsimaissa yleistyvä aikuisten syöpäsairaus melanooma saa alkunsa ihon melaniinia tuottavista soluista. Ihomelanoomapotilaiden seerumista on löydetty merkkiaineita, joita voidaan pitää ennustetekijöinä. Eräs potentiaalinen merkkiaine on CT-antigeeneihin (engl. cancer-testis antigens) kuuluva CT16-proteiini. Tässä erikoistyössä oli tarkoitus kehittää immunomääritys tämän proteiinin havaitsemiseksi seerumista. CT16-proteiinin havaitsemista varten puhdistettiin ja leimattiin kaneissa tuotettuja vastaaineita europium-kelaatilla ja biotiinilla. Ei-kilpailevassa määrityksessä biotinyloidun vastaaineen tarkoituksena oli kiinnittyneenä kaivon pohjaan siepata näytteen antigeeni, joka puolestaan havaittiin Eu-leimatulla vasta-aineella. Myös kilpailevan määrityksen käyttökelpoisuutta tutkittiin antigeenin havaitsemiseksi. Siinä Eu-leimattu CT16- rekombinanttiproteiini kilpaili näytteen sisältämän CT16:n kanssa sitoutumisesta kaivon pinnalla olevaan vasta-aineeseen. Määritysten optimoinnissa käytettiin rekombinanttitekniikalla tuotettua CT16-proteiinia analyyttinä. Ihmisen melanoomasoluviljelmän lysaatista tehdyt määritykset osoittivat, että määritys havaitsee myös natiivin muodon proteiinista. Ei-kilpailevan määrityksen optimoinnissa päädyttiin 60 µl:n näytetilavuuteen seerumia. Määrityksen mittausalue oli 0,5 20 ng/ml ja seerumiin lisätty rekombinantti-ct16 pystyttiin havaitsemaan määrityksellä (recovery-arvot 95 105 %). Samalla kehitetty kilpaileva määritys osoittautui myös toimivaksi, mutta oli herkkyydeltään huomattavasti heikompi. Kehitetyllä ei-kilpailevalla immunomäärityksellä 15:sta IV vaiheen melanoomapotilaan seerumista löytyi kaksi positiivista näytettä uuden melanooma-antigeenin osalta. Näillä potilailla oli jo laajalle levinneitä metastaaseja. Kahden CT16-positiivisen pitoisuudet olivat noin 1 ja 1,5 nanogrammaa millilitrassa määritettävää seerumia. Tällä menetelmällä ihomelanoomapotilaiden seerumista havaittu CT16 voi osoittautua ennustetekijäksi hoidon seurannassa ja menetelmän käyttökelpoisuutta varhaisemmissa taudin vaiheissa selvitetään vielä. Asiasanat: CT-antigeeni, melanooma, immunomääritys
6. Homogeeninen multiparametrimääritys vapaalle ja kokonais-psa:lle käyttäen terbium(iii)-kelaattia donorina Tuomo Liljenbäck Ohjaajat: Fil. yo Ulla Karhunen ja FM Tiina Kokko MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Homogeeniset immunomääritykset ovat nopeita ja helposti automatisoitavia, mutta useimmat määritykset mittaavat vain yhtä analyyttia kerrallaan. Useampaa ominaisuutta yhdellä kertaa samasta näytteestä mittaava multiparametrimääritys toisi lisätehoa mm. potilasläheiseen diagnostiikkaan. Tässä työssä mallianalyyttina käytettävä prostata-spesifinen antigeeni (PSA) on paras ja käytetyin yksittäinen eturauhassyöpämerkkiaine. PSA:ta esiintyy verenkierrossa vapaassa ja kompleksoituneessa muodossa (yleensä α1-antikymotrypsiinin kanssa). Seerumin korkea kokonais-psa -pitoisuus voi johtua syövän lisäksi eturauhasen hyvänlaatuisesta liikakasvusta. Onkin tärkeää määrittää kokonais-psa:n lisäksi vapaan PSA:n osuus, sillä eturauhasen liikakasvua esiintyy samassa ikäryhmässä jossa eturauhassyöpä on yleistä. Vapaan PSA:n osuus kokonais-psa:sta on pienempi syövän yhteydessä kuin liikakasvussa. Eturauhassyöpä on yleisin länsimaisten miesten syöpä ja toiseksi suurin syöpään liittyvien kuolemien aiheuttaja. Erikoistyössä tavoitteena on kehittää multiparametrimääritys vapaalle ja kokonais-psa:lle homogeenisille määrityksille hyvin soveltuvaa fluoresenssiresonanssienergiansiirtoa (FRET) hyödyntäen. Toimiakseen FRET vaatii lähekkäin (<10 nm) olevan luovuttaja- ja vastaanottajavärin, joiden emissio- ja viritysspektrit ovat osittain päällekkäin. FRET-parin viritysaallonpituus ja emissioaallonpituus ovat kaukana toisistaan, joten määrityksen epäspesifinen tausta jää matalaksi. Tässä työssä luovuttajana käytetään suoraan fluoresoivalla terbium(iii)-kelaatilla leimattua PSA:n tunnistavaa monoklonaalista vasta-ainetta (Mab). Vastaanottajina käytetään Alexa Fluor 680 -värillä leimattua PSA Mabia, joka sitoutuu vapaaseen sekä kompleksoituneeseen PSA:han sekä Alexa Fluor 488:lla leimattua PSA Mabia, joka sitoutuu vain vapaaseen PSA:han. Tähän mennessä työssä on todistettu fluoresenssiresonanssienergiansiirron toimivan vapaalla PSA:lla käyttäen terbium(iii)-kelaatilla leimattua luovuttajaa ja Alexa Fluor 680 -värillä leimattuja vastaanottajia. Vastaanottajavärin signaali kasvaa kummankin vasta-aineen kohdalla PSA:n määrän kasvaessa. Leimattujen vasta-aineiden etäisyydet toisiinsa nähden ovat siis homogeenisen määrityksen kannalta riittävän lyhyet. Jatkossa on tarkoitus optimoida määrityksen herkkyyttä ja tehdä määrityksestä multiparametrinen. Asiasanat: fluoresenssiresonanssienergiansiirto (FRET), PSA, homogeeninen multiparametrimääritys
7. Nanokokoiset up-konvertoivat fosforit reporttereina heterogeenisessa immunomäärityksessä Riikka Arppe Ohjaajat: FM Terhi Rantanen ja FT Tero Soukka MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Up-konvertoivat fosforit (engl. up-converting phosphors, UCP) ovat lantanidi-ioneja sisältäviä epäorgaanisia partikkeleita, joilla on ainutlaatuinen fotoluminesenssiominaisuus: ne virittyvät matalaenergisellä infrapunavalolla ja emittoivat korkeamman energian aallonpituuksilla näkyvää valoa. UCP-partikkeleissa ei itsessään ole biomolekyylien konjugointiin soveltuvia reaktiivisia ryhmiä, joten partikkelien pintaan on adsorboitu polyakryylihappoja (PAA) funktionalisointia varten. Kovalenttisten sidosten puuttuessa pinnoitus voi kuitenkin irrota. Erikoistyön tavoitteena oli kokeilla uudenlaista pinnoituskemiaa silylointia, jossa partikkeli kapseloituu silikapolymeerin sisään. Pinnan muokkaamiseksi reaktioon voidaan lisätä funktionaalisia ryhmiä sisältäviä organosilaaneja. Silylointireaktio tehtiin orgaanisessa mikroemulsiossa. Silikapolymeerin muodostavan monomeerisen TEOS:n (tetraetyyliortosilikaatti) määrä optimoitiin ja sopivimmaksi organosilaaniksi valittiin karboksyylihapporyhmiä sisältävä trietoksisilyylipropyylimaleimidihappo. Silyloinnin optimointivaiheessa UCP-partikkeleiden pintaan konjugoitiin edullista streptavidiinia. Varsinaista sovellusta varten silikapintaan kiinnitettiin TSH:n (engl. thyroid stimulating hormone) tunnistavaa Mab5409-vasta-ainetta ja reportteripartikkeleiden toimivuutta testattiin ei-kilpailevassa heterogeenisessa TSHimmunomäärityksessä. Sitojavasta-aineena käytettiin Mab5404:ää. Määritys tehtiin normaalien mikrotiitterilevyjen lisäksi myös spot-kaivoissa, joissa sitojamolekyylejä on vain pienellä alueella kaivon keskellä. Koska UCP-partikkelit jauhettiin suuremmista kiteistä kuulamyllyllä, oli niiden kokojakauma laaja. Läpäisyelektronimikroskopiakuvien mukaan joukossa oli kuitenkin paljon nanokokoisia (<100 nm) partikkeleita. Silikapintaiset UCP-konjugaatit olivat vesiliukoisia, jolloin partikkeleiden aggregoituminen väheni ja niiden koko pysyi pienenä. Uudella pinnoitusmenetelmällä saavutettiin suurempi sitomiskapasiteetti. Streptavidiinipintaisilla partikkeleilla tehtyjen testien mukaan silikapinnoitus mahdollisti herkemmän määrityksen verrattuna PAA-pinnoitukseen, ja spot-kaivoilla herkkyyttä voitiin yhä parantaa. Vastaainepintaisten partikkeleiden toimivuus osoitettiin TSH-immunomäärityksessä. Asiasanat: up-konvertoivat fosforit, silikapinnoitus, TSH, spot-kaivot
8. Nopea PCR-pohjainen määritys mikrokystiinejä tuottaville sinileville Henna Hautala Ohjaajat: FM Erik Jokisalo, FM Markus Vehniäinen MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Sinileviä eli syanobakteereja esiintyy maailmanlaajuisesti pääosin murto- ja makeissa vesissä, joissa ne olosuhteiden salliessa muodostavat massaesiintymiä. Osa syanobakteereista tuottaa hepatotoksiineja, maksalle myrkyllisiä yhdisteitä, joista mikrokystiinit ovat yleisimpiä. Mikrokystiinit ovat syklisiä heptapeptidejä, joiden rakenteesta muun muassa D- ja β- aminohapot tekevät ainutlaatuisen. Kymmenien toksisuudeltaan vaihtelevien mikrokystiinivariaatioiden pääasiallisia tuottajia ovat Anabaena-, Microcystis- ja Planktothrix-sukujen edustajat. Mikrokystiinien biosynteesi tapahtuu vaiheittain ja on eiribosomaalinen. Kuusi suurta, useita erilaisia aktiivisuuksia sisältävää entsyymiä (McyA-E, McyG) katalysoi suurinta osaa synteesiin tarvittavista reaktioista. Syntetaasigeenit, mcya-j ja mcyt, ovat pääosin hyvin konservoituneita, vaikka operonin kokoonpano vaihteleekin suvuittain hieman. Erikoistyön tavoitteena oli kehittää nopea mcy-operoniin perustuva määritys potentiaalisesti toksisten sinilevien toteamiseksi vesinäytteistä. Tässä työssä mikrokystiinisyntetaasioperoniin kuuluvasta mcyb-geenistä monistettiin 95 emäsparin pituinen alue. Alukepari suunniteltiin siten, että sama geenialue oli mahdollista monistaa sekä Anabaena-, Microcystis- että Planktothrix-sukujen syanobakteereista. Työn kuluessa analysoitiin mikrokystiiniä tuottavia ja sitä tuottamattomia puhdasviljelmä- ja luonnonnäytteitä. PCR-reaktioissa käytettiin joko eristettyä genomista DNA:ta tai solulysaattia. Reaaliaikaista detektiota varten suunniteltiin kullekin suvulle spesifinen koetin, joka leimattiin yhdeksänhampaisella Eu-kelaatilla. Tuotteen monistumista havainnoitiin aikaerotteisen fluoresenssin avulla. McyB-spesifistä alukeparia käyttäen tunnistettiin toksiinia tuottavat syanobakteerikannat kustakin kolmesta kohdesuvusta. Koettimien avulla voitiin lisäksi määrittää suku, johon kukin toksiinia tuottava kanta kuului. Solulysaatin käyttö nopeutti määritystä eristetyn genomisen DNA:n käyttöön verrattuna, ja haluttu tuote saatiin monistumaan kummastakin templaatista. Työssä kehitettiin mikrokystiinisyntetaasioperoniin perustuva eri syanobakteerisuvut spesifisesti tunnistava määritys ja luotiin pohja DNA-eristystä yksinkertaisemmalle ja nopeammalle näytteen esikäsittelymenetelmälle. Asiasanat: PCR, syanobakteerit, mikrokystiini
9. Characterization of Synthetic scfv antibody library Susan Pérez Supervisors : FM Eeva Brockmann, FT Urpo Lammimmäki MOLECULAR BIOTECHNOLOGY AND DIAGNOSTICS The generation of antibody fragments with high specificity and affinity for virtually any antigen is possible using a synthetic antibody library and phage display. In phage display technology, the genetic material coding for recombinant antibody is introduced into a viral genome and expressed at the surface of the viral coat. Antibody phage display is an attractive and powerful alternative to hybridoma technology because it permits direct and rapid selection of antibody-based binding agents having the desired target specificity. Recently, a large human recombinant antibody library consisting of 3,0 x 10 10 clones was generated at the Biotechnology department. The single chain fragment (scfv) library is displayed in filamentous bacteriophage using two different vectors enabling monovalent and polyvalent display formats. The objective of this project is to characterize the synthetic antibody library and to isolate specific binders against protein targets. Random colonies were picked up from the polyvalent antibody library at different stages of library reproduction process. Individual clones were used for production of phage stocks. The clones were sequenced and the binding characteristics of the phage stocks were tested by immunoassay. From the initial phage pool of the polyvalent library 25 % of the selected clones expressed the complete scfv antibody. These clones showed specific binding to the anti-antibody reagent coated microtiter wells and low background binding to other type of surfaces i.e. streptavidin or uncoated wells. The rest 75 % of the clones had frame-shift mutations. The initial phage pool comprising the library was refreshed by infecting new hosts to produce another phage stock. All analyzed clones of the refreshed phage stock presented frame-shift mutants. These mutants produced high background in the immunoassay because of unspecific binding to streptavidin. The refreshment procedure seems to enrich the frame-shift mutants which already are present in relatively high proportion in the original library. Due to the high unspecific binding of frame-shift mutants the selection of specific antibody reagents against various target proteins is probably difficult from the polyvalent library at its current format. The characteristics of the library should be improved by reducing the amount of the frame-shift mutants. On the other hand, the monovalent library (characterized elsewhere) shows more promising characteristics enabling the isolation of specific antibodies in the next phase of this project. Keywords: phage display, synthetic antibody library.
10. Liukoisen vaskulaarisen adheesioproteiini-1:n (svap-1) aktiivisuuden määritys seerumista Kristiina Aalto Ohjaajat: FT Mikael Maksimow, dos. Marko Salmi ja prof. Sirpa Jalkanen BIOKEMIA Vaskulaarinen adheesioproteiini-1 (VAP-1) on homodimeerinen 180 kd:n sialoglykoproteiini, jolla on tärkeä rooli leukosyyttien siirtymisessä verisuonista ympäröiviin kudoksiin. Normaalioloissa VAP-1 on varastoituneena mm. endoteelisolujen vesikkeleissä, mutta tulehduksissa se ilmenee endoteelisolujen luminaalisella puolella. VAP-1:llä on pinnallaan epitooppi, jolla se sitoutuu leukosyyttien pinnalla esiintyvään vastinreseptoriin. Sitoutumisen jälkeen VAP-1:n semikarbatsidiherkkä amiinioksidaasiaktiivisuus (SSAOaktiivisuus) edesauttaa leukosyytin siirtymistä alla olevaan kudokseen. Liukoinen VAP-1 (svap-1) muodostuu proteolyyttisellä pilkkoutumisella membraaniin kiinnittyneestä VAP- 1:stä; siksi svap-1 ei eroa ominaisuuksiltaan VAP-1:stä. svap-1:n määrä seerumissa kohoaa mm. diabeteksessa, ja alenee tulehduksellisissa suolistotaudeissa. svap-1 entsyymin aktiivisuus seeruminäytteistä optimoitiin 96-kuoppaisilla mikrotiitterilevyillä. Määritys perustuu entsyymin katalysoimaan reaktioon, jossa primääriset amiinit hapetetaan vastaaviksi aldehydeiksi vetyperoksidin ja ammoniakin vapautuessa. Aktiivisuutta voitiin seurata kytkemällä vetyperoksidin muodostus toiseen entsyymireaktioon, jonka tuloksena syntyi fluoresoivaa molekyyliä, resorufiinia. Fluoresenssin kasvu oli suoraan verrannollinen näytteen SSAO-aktiivisuuteen. Lisäksi svap-1:n pitoisuus seerumissa määritettiin ELISA:lla. Optimoinnin tuloksena svap-1:n aktiivisuusmääritys seerumista on spesifinen, herkkä ja luotettava määritys. Määrityksen spesifisyys todettiin lisäämällä puhdistettua entsyymiä seerumiin, josta oli svap-1 poistettu. Luotettavuus ilmeni intra- ja intervariaatio -testeillä. Määritys saatiin myös miniatyrisoitua 384-levyformaattiin menettämättä määrityksen herkkyyttä. Näin saatiin aikaan tehokkaampi ja pienemmän seerumimäärän vaativa määritys. SSAO-aktiivisuuden huomattiin olevan korkeampaa seerumissa kuin EDTA:lla, sitraatilla tai hepariinilla käsitellyissä plasmoissa. svap:n entsyymiaktiivisuus todettiin myös stabiiliksi; se pysyi muuttumattomana 6 kk:n säilytyksen ajan -20 C:ssa. Lisäksi seerumin SSAOaktiivisuuden todettiin korreloivan svap-pitoisuuden kanssa. Asiasanat: VAP-1, adheesio, SSAO-aktiivisuus, seerumi
11. VAP-1 D386N :n tuotto, puhdistus ja karakterisointi Minna Peippo Ohjaajat: FT Heli Elovaara ja prof. Sirpa Jalkanen BIOKEMIA Toimivalle immuunipuolustukselle on tärkeää, että valkosolut liikkuvat veren ja kudosten välillä. Valkosolujen siirtyminen verestä kudoksiin on monivaiheinen prosessi, jossa toimii useita avustavia molekyylejä kuten adheesioproteiineja, kemokiineja ja ektoentsyymejä. Vaskulaarinen adheesio proteiini-1 (VAP-1) toimii kyseisessä prosessissa hidastaen leukosyyttien pyörimistä ja niiden kiinnittymistä. VAP-1 kuuluu semikarbatsidi sensitiivisiin amino-oksidaaseihin, jotka hapettavat primaarisia amiineja vastaaviksi aldehydeiksi reaktiossa, jossa vapautuu lisäksi vetyperoksidia ja ammoniakkia. VAP-1:n entsyymiaktiivisuus on välttämätöntä valkosolujen kulkeutumisprosessin toimivuuden kannalta. Työssä lähtökohtana oli oletus, että Asp386 kohtaan tehty mutaatio muuttaa entsyymin inaktiiviseksi, mutta ei estä substraatin sitoutumista eikä kofaktorin muodostumista. Substraatti sitoutuu kovalenttisesti kofaktoriin eikä mutaation seurauksena irtoa. Tätä ominaisuutta voitaisiin käyttää luonnollisen substraatin etsimisessä. Työn tarkoituksena oli tuottaa kolmenlaisia VAP-1 D386N mutanttiproteiineja (VAP-1 D386N, VAP-1 D386N+C-His, VAP- 1 D386N+N-His ) nisäkässoluissa ja puhdistaa immunoaffiniteettikromatografialla. Lisäksi tarkoituksena oli määrittää mutanttien entsyymiaktiivisuus ja radioaktiivisesti leimatun synteettisen substraatin sitoutuminen. Mutanttikonstrukteista VAP-1 D386N ja VAP-1 D386N+C-His saatiin transfektoitua nisäkässoluihin ja valmistettua stabiilit tuottosolulinjat. Stabiileissa solulinjoissa oli noin 50% soluista VAP- 1-positiivisia, kun immunovärjättyjen solujen erottelu virtaussytometrillä oli toistettu kolme kertaa. Karakterisoinnit aloitettiin solulysaateista fluoresenssiin perustuvalla aktiivisuusmittauksella, mutta saadut tulokset osoittivat, ettei menetelmä soveltunut tarkoitukseen. Radioaktiivinen aktiivisuusmääritys, jossa mitattiin radioaktiivisen aldehydin muodostumista, toimi hyvin ja tulos osoitti selkeästi mutanttien inaktiivisuuden. Substraatin sitoutumiskokeet tehtiin puhdistetulla proteiinilla. Vain VAP-1 D386N varianttia ehdittiin puhdistamaan. Proteiinia oli kuitenkin liian vähän, jotta olisi voitu luotettavasti mitata substraatin sitoutuminen mutanttiproteiiniin. Asiasanat: VAP-1, SSAO, entsyymiaktiivisuus
12. Making stable S2 cell lines for the expression of different mouse VEGF-C forms, production and purification of these forms and comparison of their bioactivities Jarno Ronkainen Supervisor: PhD Michael Jeltsch MOLECULAR BIOTECHNOLOGY AND DIAGNOSTICS Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) is one of the most specific factors for inducing lymphatic vessel formation which is involved for example in cancer. VEGF-C is used in many experimental mouse models to learn about its effects on tissues. A Ba/F3 cellular assay is used for comparing the bioactivities of different VEGF-C forms. The aim of this study was to make stable insect S2 cell lines for the expression of different mouse VEGF-C forms, producing and purifying these forms and comparing their bioactivities with the human forms. The results aid in the interpretation of other experimental results obtained with the mouse factors versus the human factors. Full-length and proteolytically processed minor and major mature mouse VEGF-C were cloned into pmt-ex expression vector. Mouse VEGFR-3/EpoR and human VEGFR-2/EpoR receptor chimeras were first constructed and then cloned into pef-bos mammalian expression vector. S2 cells were transfected with pmt-ex-mvegf-c-fl, pmt-ex-minormvegf-c and pmt-ex-major-mvegf-c constructs. Ba/F3 cells were transfected with pef- BOS-mVEGFR-3/EpoR and pef-bos-hvegfr-2/epor. S2 cells were grown and induced with CuSO 4. The supernatants were dialyzed and proteins were purified using Ni 2+ NTA affinity and size exclusion chromatography. Comparative bioactivity analysis was made using human minor mature, major mature, full-length and mouse major mature VEGF-C forms in mouse Ba/F3-R2/EpoR and human Ba/F3-R3/EpoR cell lines. As expected, mouse major mature VEGF-C form activated mouse Ba/F3-R2 cells more effectively than its human counterpart, but with human Ba/F3-R3 cells there was, unexpectedly, no significant difference. Full-length VEGF-C had the lowest activity in both cell lines. The activity levels were considerably lower in mouse Ba/F3-R2 than in human Ba/F3-R3/EpoR cells. Among all forms tested, human minor mature VEGF-C was most active. More tests are needed to find out how active mouse and human VEGF-C forms are in mouse Ba/F3-R3/EpoR and human Ba/F3-R2/EpoR cell lines and how active mouse minor mature and full-length VEGF-C are in all four cell lines. Key words: Vascular endothelial growth factor C, cancer and receptor bioassays
13. Flavoproteiinien katalysoimat angusykliiniantibioottien muokkausreaktiot Streptomyces-maabakteereissa: entsymaattisten hapetusreaktiosyklien vertailu in vitro pga- ja cab-biosynteesiteissä. Pekka Patrikainen Ohjaajat: FM Pauli Kallio ja FT Jarmo Niemi BIOKEMIA Angusykliinit ovat tiettyjen Streptomyces-maabakteerien tuottamia aromaattisia polyketidiyhdisteitä, joiden biosynteesiin liittyviä reaktioita ei vielä tarkasti tunneta. Nämä yhdisteet ovat läheistä sukua muun muassa antibioottina käytettävälle tetrasykliinille sekä sytostaatteina toimiville antrasykliineille, kuten doksorubisiinille ja daunorubisiinille. Myös angusykliineillä on havaittu bioaktiivisia ominaisuuksia, mutta niitä ei ainakaan toistaiseksi ole kliinisessä käytössä. Aromaattisten polyketidien biosynteesiteiden entsymologinen tutkimus on jatkoa pitkän linjan geneettiselle tutkimustyölle, jonka tavoitteena on selvittää uusien bioaktiivisten yhdisteiden kehittelyyn liittyviä mahdollisuuksia ja rajoitteita. Erikoistyössäni tutkin angusykliinien biosynteesiteille tyypillisiä flavoentsyymeitä, jotka katalysoivat peräkkäisiä hiilirungon hapetus-/ muokkausreaktioita. Mallientsyymeinä toimivat angusykliinityypin biosynteesitiestä pga peräisin oleva PgaE (UWM6 hydroksylaasi) ja PgaM (oksygenaasi/reduktaasi). Vertailukohtana käytetään rinnakkaiseen cab- biosynteesitiehen kuuluvia entsyymihomologeja CabE ja CabV. Reaktioiden yksityiskohtaista tutkimista on vaikeuttanut välituotteiden reaktiivisuus, entsyymien väliset vuorovaikutukset sekä eri reaktiovaiheiden lukumäärä. Työn tarkoituksena on selvittää in vitro minkälaisia vuorovaikutuksia ja hapetusmekanismeja näihin peräkkäisiin reaktioihin liittyy. Työni aikana olen tuottanut ja puhdistanut mittauksissa käytettävää substraattia sekä tutkittavia entsyymeitä. Entsyymien toimintaa on selvitetty kvantitatiivisilla ja kvalitatiivisilla spektrofotometrisilla mittauksilla sekä HPLC-analyyseillä. Osittaiset biosynteesitiet pga ja cab on alun perin paikannettu geneettisellä seulontamenetelmällä Streptomyces-kannoista PGA64 ja H021. Biosynteesiteiden lopputuotteita ei tunneta, mutta tutkimuksen kohteena olevien hapetusreaktioihin osallistuvien entsyymien funktiot on selvitetty. Asiasanat: angusykliini, flavoproteiini, hapetusreaktio, Streptomyces
14. Aikaerotteiseen fluorometriaan perustuvan G-proteiinikytkentäisten reseptorien aktivaatiota monitoroivan määrityksen pystyttäminen. Jari-Matti Sirkka Ohjaaja: FT Heini Frang* MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA * PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Wallac Oy, Turku G-proteiineihin kytkeytyneet reseptorit (engl. GPCRs) ovat eliömaailman suurin ja monipuolisin proteiinisuperperhe ja ne ovat kohteena laajalle joukolle erilaisia molekyylejä kuten hormoneja, hermovälittäjäaineita ja kemokiineja. Reseptorin aktivoituessa siihen kytkeytyneen G-proteiinin α-alayksikössä oleva guaniinidifosfaatti (GDP) vaihtuu guaniinitrifosfaatiksi (GTP), jolloin α-alayksikkö voi aktivoida seuraavia kohteita signaalireaktiotiessä. Noin 50 % markkinoilla olevista lääkeaineista vaikuttavat GPCR:ien kautta. Uusien lääkeainekandidaattien tehoseulonta nojaa edelleen pitkälti radioligandeihin perustuvaan määritykseen, ja siksi yksinkertaiselle ei-radioaktiiviselle määritykselle olisi kysyntää. Tutkimuksen ensimmäisenä tavoitteena oli testata erilaisten potentiaalisten GTP:tä sitovien molekyylien ja anti-gα-vasta-aineiden soveltuvuutta määritykseen. Seuraavana tavoitteena oli pystyttää määritys perustuen sammutus- tai energiansiirtoteknologiaan. Työssä karakterisoitiin fosfaattia sitovan molekyylin (PhosTag) ja Apyraasi-entsyymin kykyä sitoa europiumilla leimattua GTP:tä. Työn toisessa osassa testattiin kahdeksan erilaista anti- Gα-vasta-ainetta, joita pyrittiin hyödyntämään energiansiirtomäärityksessä. Vasta-aine leimattiin joko europiumilla tai vastaanottajamolekyylillä parinaan leimattu GTPjohdannainen. Vasta-aineet testattiin lisäksi kontrollimäärityksessä, jossa käytettiin G- proteiiniin sitoutuvaa oligopeptidiä toisena sitojamolekyylinä. Apyraasi-entsyymi osoitti selvää aktiivisuutta sitoa Eu-GTP:tä. Sitojan epäpuhtaus osoittautui kuitenkin liian suureksi ongelmaksi itse määrityksen pystyttämiseen. Määritys voitaisiin mahdollisesti toteuttaa rekombinanttiteknologialla tuotetulla ja puhdistetulla muodolla. Kahdeksasta vasta-aineesta yksi osoitti riittävää aktiivisuutta sitoutua G-proteiinin α- alayksikköön. Vasta-aineen toimivuuden testaus määrityksessä vaatii kuitenkin vielä lisätutkimuksia. Asiasanat: GPCR, GTP, tehoseulonta, aikaerotteinen fluorometria
15. DNA-leimauksen haasteet arraycgh analytiikassa Katja Laurila Ohjaajat: FM Hanna-Mari Raussi * ja FM Pia Ollikka * BIOKEMIA * PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Wallac Oy, Turku Perinteinen kromosomitutkimus perustuu G-raitavärjäykseen ja Fluoresenssi in Situ Hybridisaatioon (FISH). Näiden menetelmien erottelukyky on rajallinen ja pieniä muutoksia kromosomeissa ei pystytä havainnoimaan, lisäksi menetelmät ovat myös työläitä suorittaa. Viime vuosina DNA-siruilla tehtävä vertaileva genominen hybridisaatio eli arraycgh (acgh) testit ovat yleistyneet kromosomitutkimuksessa. acgh mahdollistaa nopean, koko genomin kattavan seulonnan, jonka erottelukyky määräytyy sirulle kiinnitettyjen DNAkoettimien pituuden ja koetinten välisen genomisen etäisyyden mukaan. Menetelmässä verrataan potilaan DNA:ta genomiltaan normaalin ihmisen DNA:han. DNA:t leimataan eri fluoroforeilla, jonka jälkeen ne hybridisoidaan sirulle. DNA-sirusta tulevat fluoresenssisignaalit muutetaan numeeriseen muotoon fluoresenssisuhteiksi, ja erityinen analyysiohjelma muuntaa tuloksen kromosomitasolle. Sikiöseulonnan haasteena on usein lähtömateriaalin vähyys ja yleensä tutkittavaa DNA:ta joudutaan monistamaan. Koko genomin monistusmenetelmiä (Whole Genome Amplification, WGA) on useita, ja ne eroavat tuottavuuden, monistustasaisuuden sekä tuotteen koon suhteen. Menetelmällä pyritään tuottamaan DNA:ta mahdollisimman helposti ja laadukkaasti. ArrayCGH analytiikassa on tärkeää, että DNA leimaantuu hyvin ja tasaisesti. DNA:n leimaus voidaan suorittaa joko entsymaattisesti tai suoraan. Entsymaattisessa leimauksessa käytetään nukleotideja, joihin on liitetty fluoresoiva molekyyli. Leimatut nukleotidit liitetään DNAketjuun monistusreaktiossa käyttäen apuna DNA-polymeraasia sekä satunnaisalukkeita. Suoraleimauksessa DNA:han liitetään fluoresoiva molekyyli platinakompleksin avulla. Suoraleiman pitäisi olla stabiili ja sitoutua mahdollisimman tehokkaasti DNA:han. Työn tarkoituksena oli nopeuttaa ja parantaa DNA:n leimausta acgh testeihin. Työssäni vertailin suoraa sekä kemiallista leimausta, ja leimausta WGA-reaktiossa. Alustavien tulosten mukaan suoraleimauksessa leimausprosentti on parempi kuin entsymaattisessa leimauksessa ja DNA-näyte on paremmin analysoitavissa. Suoraleimaukseen käytettävä DNA-määrä on kuitenkin suurempi kuin entsymaattisessa leimauksessa, jolloin tarvitaan WGA ennen leimausta. DNA-näytteen määrä vaikuttaa siten leimaustavan valintaan. Asiasanat: arraycgh, Whole Genome Amplification (WGA)
16. Development of a Printed Enzyme Electrode Pauliina Saurus Supervisor: Dr. Maria Smolander MOLECULAR BIOTECHNOLOGY AND DIAGNOSTICS Enzyme-based biosensors and biofuel cells are being used in an increasing number of clinical, environmental, agricultural, and biotechnological applications. Biofuel cells based on electrochemical transducers and enzyme-based biosensors utilizing screen-printed carbon electrodes have been of particular interests because of their advantages, such as high sensitivity, rapid response, relatively simple instrumentation and high specificity. In recent work, the goal was to incorporate the biocatalyst into the conducting matrix, ensure the electron transfer and maintain the enzymatic activity in the printed layer using bacterial pyrroloquinoline quinine (PQQ) dependent dehydrogenases which are particulary suitable for biofuel cell application, since they are oxygen insensitive and the redox-cofactor PQQ remains tightly bound to the enzyme. Preliminariliy tests were carried out with three different PQQ-dependent dehydrogenases; aldose dehydrogenase (ALDH) from Gluconobacter oxydans, methanol dehydrogenase (MDH) from Methylobacterium extorquens and fructose dehydrogenase (FDH) from Gluconobacter industrius. ALDH was purified in a purification procedure consisting of extraction of the crude cell homogenate and its clarification with chromatographic purification. The properties of ALDH, MDH and FDH in the printed bioanode were optimized by varying the non-conductive and conductive ink compositions, electron transfer mediators and storage stability. ALDH and FDH were also cross linked. Enzyme electrodes were tested for the maintenance of electrochemical performance. In the final phase the bioanode was tested in a printed fuel cell construction using laccase-based cathode. Results demonstrate that the dry printed layers maintained their enzymatic activity for several weeks. The reproducibility of the ink electrodes was good and the ink electrodes showed also good fuel-cell performance in tentative tests. Keywords: dehydrogenases, electrochemical, biofuel cells, electrodes
17. α2β1-integriinin klusteroitumisen ja internalisaation mekanismit Jonna Leinonen FM Pasi Kankaanpää, FM Anna-Brita Öst, prof. Jyrki Heino BIOKEMIA Integriinit muodostavat proteiiniperheen, joka toimii solujen ja soluväliaineen kiinnittymisessä ja on tärkeä signaloinnissa. Integriinit ovat tärkeitä useissa fysiologisissa ja patologisissa tilanteissa, esimerkiksi yksilönkehityksessä ja syövässä. Integriinit koostuvat toisiinsa ei-kovalenttisesti sitoutuneista α- ja β-alayksiköistä. α2β1-integriini on nisäkkäissä tärkein kollageenireseptori ja välittää esimerkiksi epiteeli- ja mesenkymaalisolujen sitoutumista kollageeniin. Aktivoituessaan α2β1-integriinit kasautuvat yhteen (klusteroituvat) ja kulkeutuvat sisälle soluun. α2β1-integriinit liikkuvat lateraalisesti todennäköisesti aktiinisäikeitä pitkin ja internalisoituvat kaveoliinipositiivisiin rakenteisiin. Klusteroituminen ja internalisaatio saadaan aikaan myös vasta-aineiden avulla. Erikoistyössäni tutkin joidenkin solutukirankaan ja α2β1-integriiniin mahdollisesti liittyvien proteiinien merkitystä integriinin toiminnalle. Klusteroitumista ja internalisaatiota seurattiin käyttämällä fluoroforilla leimattuja vasta-aineita ja sekä elävien että fiksoitujen α2- integriinillä transfektoitujen SAOS-2 -solujen 3D/4D-konfokaalimikroskopiaa. Myosiini IIa:n ja T-plastiinin merkitystä integriinin toiminnalle tutkittiin mm. myosiini II -inhibiittoreiden ja T-plastiini-siRNA:n avulla. Kaveoliini 1:n sijaintia solussa integriinien klusteroitumisen aikana tutkittiin transfektoimalla solut kaveoliini 1-GFP:llä (green fluorescent protein). Kuvaaineisto analysoitiin BioImageXD-ohjelmalla segmentoimalla integriiniklusterit ja tarkastelemalla niiden erilaisia parametrejä sekä kolokalisaatiota muiden proteiinien kanssa. Konfokaalimikroskopian lisäksi tehtiin mm. migraatio- ja invaasiokokeita. Tulokseni osoittivat, että myosiini II:n inhibointi ei estänyt integriinien klusteroitumista, mutta se vaikutti niiden liikkumiseen. T-plastiinin taas havaittiin siirtyvän integriinikasautumien alueelle klusteroinnin aikana, kuitenkin myosiini II:sta riippumatta. Kaveoliini 1:n aiemmin vain visuaalisesti havaittu kolokalisaatio integriiniklustereiden kanssa saatiin vahvistettua kvantitatiivisesti, mutta integriinin sijoittuminen kaveoliini 1 - positiivisille alueille oli melko hidasta. Kaikki kolme proteiinia liittyvät todennäköisesti jollain tavalla α2β1-integriinin klusteroitumiseen ja internalisaatioon, mutta mekanismien tarkemmaksi selvittämiseksi tarvitaan paljon lisää tutkimuksia. Useita uusia kokeita onkin jo aloitettu, ja monien jo tehtyjen kokeiden tulosten analysointi on vielä kesken. Asiasanat: α2β1-integriini, klusteroituminen, internalisaatio
18. Rac1 α2β1-integriinien signaloinnissa Maria Salmela FM Johanna Jokinen ja prof. Jyrki Heino BIOKEMIA α2β1-integriinit ovat solukalvolla olevia adheesioreseptoreita, jotka sitouduttuaan ligandeihinsa, kuten tyypin I kollageeniin, osallistuvat solusignalointiin. Integriinit välittävät signaaleja muun muassa solun kasvuun, erilaistumiseen ja migraatioon liittyen, ja ovat näin ollen tärkeitä esimerkiksi syövän leviämisessä. α2β1-integriinit sijaitsevat solukalvolla niin kutsutuilla lipidilautoilla, jotka sisältävät runsaasti kolesterolia. Kollageeni aktivoi integriinisignalointireittiä sekä integriinialayksiköiden konformaatiomuutoksen kautta että tuomalla useita integriinejä lähekkäin klustereiksi. Alkaessaan muodostaa klustereita integriinit liikkuvat solukalvolla aktiinisäikeitä pitkin pois lipidilautoilta, ja lopulta integriinit internalisoidaan solun sisälle. α2β1-integriinien klusteroitumisen on osoitettu aktivoivan p38 MAP-kinaasia, mutta tämän signaalireitin yksityiskohtia ei vielä tunneta. Pieni Rho GTPaasi Rac1 kuuluu erääseen p38 MAPK aktivointireittiin, ja valittiin tutkimuksen kohteeksi, koska aktivoiduttuaan sen tiedetään sitoutuvan solukalvolle lipidilautoille α2β1-integriinien läheisyyteen. Työssä käytettiin ihmisen osteosarkoomasoluja, jotka ilmentävät pinnallaan α2β1-integriiniä (Saosα2). Solukalvon kolesteroli poistettiin metyyli-β-syklodekstriinillä. Integriiniklusterit muodostettiin vasta-aineilla. Kolesterolin poiston vaikutusta integriinien klusteroitumiseen tutkittiin konfokaalimikroskopialla. Rac1 vaimennettiin Saosα2-soluista sirna interferenssillä, ja interferenssin tehokkuus varmistettiin western -analyysillä sekä virtaussytometrillä. p38 MAPK:n aktivaatiota klusteroinnin jälkeen, ja Rac1 sirna interferenssin vaikutusta siihen, tutkittiin virtaussytometrillä. Konfokaalimikroskopialla havaittiin, että solukalvon kolesterolin poiston jälkeen α2β1- integriinit muodostavat pienempiä klustereita. Virtaussytometrillä osoitettiin kolesterolin poiston yllättäen nostavan klusteroinnilla aktivoidun p38 MAPK:n määrää. Kolesterolin poisto saattaa vaikuttaa integriinien klusteroitumisen lisäksi niiden internalisaatioon, ja siten vaikuttaa α2β1-integriinisignalointireitin aktivoitumiseen. Rac1 sirna interferenssin olosuhteet optimoitiin työn aikana. Työssä saatiin viitteitä siitä, että Rac1 sirna interferenssi estää p38 MAPK:n aktivaatiota. Jatkossa on tarkoituksena mitata suoraan Rac1:n aktivoitumista klusteroinnin jälkeen. Asiasanat: α2β1-integriini, signalointi, Rac1, p38 MAP-kinaasi
19. Ihmisen α 2 β 1 -integriinin solunulkoisen osan tuotto Baculoviruksen avulla Mika Remes Ohjaajat: dos. Jarmo Käpylä, prof. Jyrki Heino BIOKEMIA Integriinit ovat solukalvon läpäiseviä tarttumareseptoreja, jotka välittävät solujen vuorovaikutuksia ympäristöönsä ja toisiin soluihin. Ne ovat olennaisia elimistön normaalissa toiminnassa, kuten solujen kasvussa, liikkumisessa ja erilaistumisen säätelyssä, mutta ne ovat myöskin osallisina monissa patologisissa tiloissa, kuten tulehduksessa, haavan paranemisessa ja etäpesäkkeiden muodostumisessa. Ne ovat heterodimeerisiä proteiineja koostuen α- ja β- alayksiköistä. Tämän erikoistyön tarkoituksena oli suunnitella ja toteuttaa α 2 β 1 -integriinin solunulkoisen osan tuotto ja puhdistus hyönteissoluissa. Solukalvon läpäisevä transmembraaninen osa ja solunsisäinen sytoplasminen osa korvataan Fos-Jun leusiinivetoketjulla. Näin saadaan huonosti liukoinen proteiini liukoiseksi häiritsemättä α- ja β- alayksiköiden välttämätöntä vuorovaikutusta. Tällöin α 2 β 1 :n interaktio- ja sitoutumiskokeet helpottuisivat merkittävästi. α 2 - ja β 1 -alayksiköihin liitettävät häntäosat syntetisoitiin PCR:llä. Häntäosiin suunniteltiin Fos/Jun alueiden lisäksi tunnituskohdat proteaasille ja kahdelle tagille valmiin proteiinin puhdistusta ja muokkausta varten. α 2 - ja β 1 -alayksiköt kloonattiin PCR:llä, ja syntetisoidut hännät liitettiin niihin Splicing by overlap extension (SOE) PCR:llä. Valmiit insertit liitettiin FastBac- baculoviruksen tuottovektoriin ligaatiolla. Tuottovektorilla transfektoidaan hyönteissolut proteiinin tuottoa ja puhdistusta varten yhteistyössä Jyväskylän Yliopiston biotekniikan osaston kanssa. Häntäosien syntetisointi sekä α 2 - ja β 1 -alayksiköiden kloonaus onnistui ongelmitta. Alayksiköiden yhdistäminen häntäosiinsa ja niiden siirto tuottovektoriin osoittautui erittäin haasteelliseksi. Eri menetelmistä ja niiden laajoista soveltamisista huolimatta vain β 1 - alayksikön siirto häntäosansa kanssa tuottovektoriin on onnistunut. Asiasanat: α 2 β 1 integriini, ektodomeeni, baculovirus, SOE PCR,
20. Uuden melanooma-antigeeni CT16:n interaktiopartnerit Eveliina Aro Ohjaajat: FT Pekka Rappu ja prof. Jyrki Heino BIOKEMIA Cancer/testis-antigeenit ovat immunogeenisiä proteiineja, joita koodaavat geenit ekspressoituvat normaalisti vain ihmisen sukusoluissa mutta joita esiintyy myös useissa syöpätyypeissä kuten melanoomassa. Cancer/testis-antigeenien biologista funktiota ei ole vielä täysin selvitetty joitakin poikkeuksia lukuunottamatta, mutta niitä on alettu käyttää hyväksi terapeuttisten syöpärokotteiden kohteina, ja ne ovat myös potentiaalisia biomarkkereita. Cancer/testis-antigeenejä on identifioitu jo yli 70 perhettä, joista osa sisältää useita jäseniä. Cancer/testis-antigeenit voidaan jakaa kahteen ryhmään: X-kromosomin koodaamiin CT-X-antigeeneihin sekä autosomeissa sijaitseviin ei-ct-x-antigeeneihin. X- kromosomin geeneistä 10 % kuuluu CT-X-perheeseen. CT16 kuuluu uuteen PAGE cancer/testis -antigeeniperheeseen ja se on löydetty ainoastaan kiveksestä ja syöpäkudoksesta. CT16 cancer/testis -antigeenia on löydetty mm. melanoomasta, keuhkosyövästä ja rintasyövästä. Sen on myös todettu ekspressoituvan useassa syöpäsolulinjassa. CT16 kuuluu CT-X-antigeeneihin. Tämän erikoistyön tarkoituksena oli etsiä interaktiopartnereita CT16 cancer/testis - antigeenille käyttäen immobilisoituja GST-CT16- sekä Snap-tag-CT16-fuusioproteiineja. SK-MEL-2- ja WM-266-4-melanoomasolulinjoista eristetyt tuma- ja sytosoliset fraktiot inkuboitiin immobilisoitujen fuusioproteiinien kanssa ja puhdistettiin interaktiopartnerien löytämiseksi. Puhdistetut fraktiot eroteltiin SDS-PAGElla ja värjättiin hopealla. Lisäksi Western-analyysiä käytettiin CT16:n lokalisaation määrittämiseksi. CT16 lokalisoitiin sekä tumaan että sytosoliin Western-analyysin avulla. Immobilisoitua GST-CT16-fuusioproteiinia käyttämällä löydettiin WM-266-4-melanoomasolulinjasta muutamia mahdollisia interaktiopartnereita, joita ei vielä kuitenkaan ole saatu tunnistettua. SK-MEL-2-melanoomasolulinjaa käytettäessä potentiaalisia CT16:n kanssa interaktoivia proteiinena löytyi geeliltä vähemmän. Tämä saatoi johtua siitä, että SK-MEL-2-solujen endogeeninen CT16 oli jo sitonut sen kanssa interaktoivat proteiinit itseensä. Kokeet immobilisoidulla Snap-tag-CT16-fuusioproteiinilla ovat vielä työn alla. Asiasanat: cancer/testis antigeeni, CT16
21. Fosforylaation vaikutus unikon sppaasien p26.1a ja p26.1b aktiivisuuteen Kati Kemppainen Ohjaajat: FM Anssi Malinen ja prof. Reijo Lahti BIOKEMIA Itseinkompatibiliteetti (engl. self-incompatibility, SI) on kukkivien kasvien yleisin itsehedelmöitystä estävä mekanismi. Unikon siitepölyssä yksi SI-vasteen seuraus on kahden liukoisen epäorgaanisen pyrofosfataasin (sppaasin), p26.1a:n ja p26.1b:n, fosforylaatio. Fosforylaation on havaittu inhiboivan p26.1a:n ja p26.1b:n aktiivisuutta, mikä on mielenkiintoista kahdesta syystä: ensinnäkin se lisää ymmärrystä SI-vasteen toiminnasta ja toisaalta on ensimmäinen esimerkki fosforylaatiolla säädellyistä sppaaseista eukaryooteissa. p26.1a:n ja p26.1b:n geenit on kloonattu, mutta niitä fosforyloivan kinaasin/kinaasien ei. Sen sijaan on havaittu, että lituruohon kinaasi CPK34 fosforyloi kummankin sppaasin. Erikoistyön tarkoituksena oli selvittää CPK34-fosforylaation vaikutus sppaasi-aktiivisuuteen, varmistaa unikossa havaitun fosforylaation inhiboiva vaikutus sekä testata mahdollisista fosforylaatiokohdista mutatoitujen p26.1a-varianttien fosforyloitumista. p26.1a-6 His ja sen variantit, p26.1b-6 His ja GST-CPK34-6 His tuotettiin E. colissa ja puhdistettiin käyttäen affiniteettikromatografiaa ja geelisuodatusta. Kokeissa, joissa tarvittiin unikon omaa kinaasia, käytettiin unikon siitepölystä eristettyä liukoisten proteiinien seosta. SPPaasien fosforylaation tutkimiseksi tehtiin leimausreaktioita, joissa CPK34:n tai siitepölyproteiinien toisena substraattina käytettiin radioaktiivista AT 32 P:tä sisältävää ATPseosta. Reaktioseoksista ajettiin näytteitä SDS-PAGE-geeleille, joista radioaktiiviset proteiinit havainnoitiin autoradiografiafilmin avulla. SPPaasit leikattiin geeliltä ja niiden radioaktiivisuus mitattiin nestetuikelaskurilla fosforylaatiotason selvittämiseksi. Fosforylaation vaikutusta aktiivisuuteen testattiin mittaamalla fosforylaatioreaktioseoksesta sppaasi-aktiivisuus laitteella, joka havainnoi pyrofosfaatin hydrolyysiä fosfaatiksi. Siitepölyn proteiiniseoksella saavutetut sppaasien fosforylaatiotasot olivat niin alhaisia (<1%), että mahdollinen vaikutus aktiivisuuteen oli mahdoton havaita. CPK34:llä p26.1a:sta saatiin fosforyloitua parhaimmillaan 57% ja p26.1b:stä 31%, mutta hydrolyysimittauksissa ei havaittu sppaasi-aktiivisuuden laskua fosforylaation seurauksena. P26.1a-variantit fosforyloituivat sekä CPK34:llä että siitepölyn proteiiniseoksella, joten mutatoidut aminohapot eivät tämän perusteella ole etsittyjä fosforylaatiokohtia. Asiasanat: itseinkompatibiliteetti, p26.1a, p26.1b, CPK34
22. Metastaasin säätelijäproteiinin h-prunen entsymaattinen karakterisointi Katja Koivula Ohjaajat: FT Marko Tammenkoski ja prof. Reijo Lahti BIOKEMIA Ihmisen prune-entsyymi (h-prune) on noin 50 kda:n kokoinen proteiini, joka kuuluu samaan fosfoesteraasien entsyymiperheeseen muun muassa hiivan eksopolyfosfataasin (scppx) ja perheen II epäorgaanisen pyrofosfataasin kanssa. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet h-prunen olevan fosfodiesteraasi (PDE), joka hydrolysoi 3, 5 -syklisen nukleotidin vastaavaksi 5 -nukleotidimonofosfaatiksi. H-prunen on myös todettu ylituottuvan esimerkiksi rinta- ja mahasyövässä, jolloin kasvain muodostaa helpommin etäpesäkkeitä. Tämä saattaa osittain aiheutua h-prunen entsyymiaktiivisuudesta mutta myös h-prunen kyvystä muodostaa proteiinikompleksi tunnetun metastaasin estäjän, nm23-h1:n, kanssa. H-prunen ylituottumista voidaan pitää syövän biologisena markkerina ja h-prunen aktiivisuuden inhiboiminen spesifisillä lääkkeillä saattaa estää etäpesäkkeiden muodostumisen. Erikoistyön tavoitteena oli h-prunen entsymaattinen karakterisointi. H-prunen aktiivisen keskuksen aminohappoja muokattiin kohdennetulla mutageneesillä vastaamaan sen lähisukulaisen, scppx:n, aktiivista keskusta. Variantit tuotettiin Escherichia colin Rosetta 2- tuottokannassa ja puhdistettiin metalliaffiniteetti- ja geelisuodatuskromatografialla. H-prunen villityypin ja varianttien aktiivisuus määritettiin erilaisten substraattien ja metalliionikofaktoreiden kanssa. Lisäksi nm23-h1-proteiinin vaikutus h-prunen aktiivisuuteen selvitettiin. Aktiivisen keskuksen mutaatiot laskivat h-prunen aktiivisuutta merkittävästi lukuun ottamatta yhtä varianttia, jonka aktiivisuus nousi mutaation seurauksena. H-prune hydrolysoi tehokkaasti lyhytketjuisia polyfosfaatteja kuten epäorgaanista tripolyfosfaattia ja nukleosidi 5 -tetrafosfaatteja mutta pitkäketjuisten polyfosfaattien ( 25 fosfaattialayksikköä ketjussa) hydrolyysi tapahtuu hitaasti. Pyrofosfaatti ja nm23-h1 puolestaan inhiboivat h-prunea. Tulosten perusteella h-prune on eksopolyfosfataasi, sillä sen ekso-aktiivisuus on 3500- kertainen aiemmin ilmoitettuun PDE-aktiivisuuteen verrattuna. H-prune saattaa aiheuttaa syövän metastaasin joko hydrolysoimalla pitkäketjuisia polyfosfaatteja, jotka normaalisti estävät syövän metastaasia ja indusoivat syöpäsolujen apoptoosia, tai sitoutumalla nm23-h1- proteiiniin, jolloin h-prune estää sen antimetastaattisen vaikutuksen. Asiasanat: h-prune, eksopolyfosfataasi, pitkäketjuiset polyfosfaatit, nm23-h1