Ekologiset ympäristöongelmat 10. Geeniteknologia
Dna:n ja rna:n käsittely Eristäminen Puhdistaminen Lähetti-rna:t voidaan muuntaa niiden emäsjärjestystä vastaavaksi ns. komplementaariseksi dna:ksi (c-dna)
Dna:n muokkaaminen Katkaisuentsyymit Bakteerien luontainen puolustuskeino Pilkkovat dna:n halutusta kohdasta Liittäjäentsyymit Liittää katkaistut juosteet yhteen Yhdistää myös eri alkuperää olevaa dna:ta
Dna:n ja rna:n tutkimusmenetelmiä PCR = dnan monistaminen Alukkeet, nukleotideja, dna-polymeraasia Hyödynnetään mm. dna:n emäsjärjestyksen selvittämisessä eli sekvensoinnissa ja yksilöiden tunnistuksessa
Dna:n ja rna:n tutkimusmenetelmiä Elektroforeesi Käytetään erimittaisten dna- ja rna-palasten havaitsemiseen Geenin dna:n erojen tutkiminen Sekvensoinnin väline Dna:n hybridisaatio Dna:n juosteiden irrottaminen toisistaan kuumentamalla Koetin: Merkitään leimaamalla fluoresoivalla väriaineella tai radioaktiivisella merkillä Koetin ja tutkittava kohde pariutuvat keskenään
Dna:n ja rna:n tutkimusmenetelmiä Sekvensointi Dna:n emäsjärjestyksen selvittäminen PCR, mukana värileimattuja nukleotideja, jotka päättävät reaktion Dna-pätkät erotellaan pituusjärjestykseen elektroforeesissa
Geenien toiminnan tutkiminen Dna-siru lasista tai muovista valmistettu pieni levy, johon on kiinnitetty DNA-palasia Voidaan tutkia ympäristötekijöiden, ravintoaineiden tai lääkehoitojen vaikutusta geenien toimintaan Voidaan havaita yksilöiden välisiä eroja dna:n emäsjärjestyksessä
DNA-siru: käytännön sovellutukset Mitkä geenit ilmenevät tietyissä soluissa tai kudoksessa? Diagnostiikka: Hyvänlaatuinen vs pahanlaatuinen syöpä Terve vs sairas Lääkkeiden tai hoitojen vaikutus Ei hoidettu vs hoidettu Lääkevaste vs ei vastetta Perustutkimus Kehitysbiologia esim. alkion kehitys, kudoksen tai solujen erilaistuminen
Mikrosirut Yleistä Mitä mikrosirut ovat? Alusta (muovi, pii, kvartsi, lasi tms), johon kiinnitetty tutkittavaksi ja tunnistettavaksi jopa satoja tuhansia tai miljoonia DNA-paloja (tai esim. proteiineja, soluja, kudosta, vasta-aineita, sirna:ta).
cdna sirut Sirujen design ja valmistus cdna klooni kirjasto Kloonien monistus ja puhdistus Koettimien spottaus alustaan Valmis cdna siru -koettimet >200 nt Custom Agilent www.microarrays.btk.fi
CLID NAME N15 N6dd* N7(2) N13 N10 N9 S 36 N 100 N2(A) N11 N3 N5cc N1aa N4bb N12 IMAGE:788524 STXBP6 syn -0.18 0.12 0.72 0.21 0.28 0.41-1.78-2.33 0.41-0.14-0.91 0.5 0.08-0.01 IMAGE:49227 STXBP6 syn -0.79 0.3-0.21 0.14 0.56 0.99 0-0.08-0.58 0.77-0.02 0.54 IMAGE:277042 STXBP6 syntaxin binding protein 6 (am 0.54-0.04 0.22 0.55-1.28-1.95 0.56-0.17 0.14-0.64 0.71 0.44 IMAGE:51783 FLJ22283 h 0.22 1.65 0.82 0.76 0.5 0.73 0.75 0.79 0.06 0.51 1.3-0.08-0.51 0.1-0.08 IMAGE:490647 PCOLCE2 p -0.95-0.47-0.54-0.12 0.56-0.56-0.58-1.46-0.72-0.8 0.21-0.21 IMAGE:731106 Homo sapie -0.64 0.56 0.07 0.44-0.04 0.14 0.9 0.81 1.02 1.24 0.38 0.31-0.26 0.09 0.26 IMAGE:2310410 A2LP ataxin -0.02 0.46 1.22 0.9 0.44-0.85-0.03 0.58-1.55-0.82-0.86-0.91 0.01 IMAGE:279569 Homo sapie -1.29-0.36-0.37-0.38-0.61 0.28 1.43 1.92-0.09-0.11-0.17 0.15-0.47-0.42 IMAGE:1665841 ESTs Hs. -0.26 1.72 0.09 0.75 0.57 0.28 0.17-0.09-0.35-0.36-0.52-0.64-0.39-0.12 0.16 IMAGE:858336 KIAA0471 K -0.51 0.04-0.5-0.44-0.48-0.46 0.84 0.33 0.06-0.56-0.29-0.39-0.32 IMAGE:1469378 LOC112703 1.61 1.53 0.9 1.05 0.6 1.16 0.4-0.86-0.04-1.83-0.11-0.56 1.34-2.53 IMAGE:1940317 ESTs Hs. 0.01-0.55-0.13-0.13-1.15 0.28 0.35 0.21 0.46-0.92-0.24-0.93 0.32 IMAGE:773512 ESTs, Weak -0.14 1.68-0.38 0.29 0.12 0.23-1.07 1.23 1.1-0.05 0.46-1.12-0.74-0.09-0.55 IMAGE:308041 PNUTL1 pea -0.41 1.63-0.43-0.31-0.03 0.23 1.85 0.5 0.72 0.47 1.01-0.12-0.71-0.15 IMAGE:810727 Homo sapie -3.01-0.11-0.7-0.28 0.92 1.96 1.35 0.58 0.61 0.18 0.32-0.84 0.52 IMAGE:1910040 NLK nemo-like kinase 0.52-0.07-0.18 0.44 1.1-0.43-0.65 0.02 1.9 1.54 0.49 0.17 0.32-0.49 IMAGE:2316305 CRELD1 cys 0.24 0.92 0.05 0.19 0.71 0.32 0.05-0.29 1.08 0.89 2.1 0.35 0.16 0.13-0.04 IMAGE:730942 DECR2 2,4- -0.36-0.43-0.14-0.44 0.25-0.1-0.37-1 0.17 1.05 1.7 0.29-0.01 0.07-0.06 IMAGE:502663 Homo sapie -0.81-0.84-1.08-1.27-0.8-0.27-0.2-0.38 0.54 IMAGE:1457205 LOC152195 0.14 1.23 0.83 0.05-0.48 0.12 0.72-0.85 0.17 0.9 0.67-0.11-0.18 IMAGE:726658 NME3 non- -0.5-0.37-0.86-0.09-0.2 0.18 0.29 0.61 0.95 0.11 0.34 0.76 0.16 0.17 0.3 IMAGE:840944 EGR1 early 0.91 0.73-1.37-1.59 1.03 2.95 0.96 0.29 2.7 0.71-0.29 2.5 1.01 0.79 1.8 IMAGE:753104 DCT **dop 0.4 0.77-0.84-0.87 0.63 2.01 2.03 1.23 2.66 0.46-0.94 1.93 0.33 0.05 2.05 IMAGE:753162 TBC1D4 TB -0.27-0.84-0.62-0.68-0.16-0.46 1.32 1.55 0.15 0.16-0.03 0.48-0.02-0.05 0.64 IMAGE:68818 PP3856 sim -0.54 0.44 0.07-0.15-0.11 0.44 0.18 0.04-0.96-0.16-0.07 0.57-0.9 IMAGE:435953 ITPR3 inosi -0.34 0.14 0.17 0.22-0.22-0.04 0.04 0.32 0.05-0.14 0.58 1.17-0.22-0.12-0.44 IMAGE:771261 NSD1 nucle 0.24 0.86 0.48 0.7 0.54 0.23-0.5-0.28 0.12-0.57-0.51 0.04-0.4 IMAGE:431632 RABL4 RAB 0.01 0.23 0.9 0.26 0.49 0.23 1-0.48 0-1.13-1.1-0.31-0.4 0.07-0.25 IMAGE:302974 AI66 0.22 0.58 0.14-0.19-0.36 3.49 0.37-0.4-0.54-0.26-0.43-0.88-2.03 IMAGE:34966 ESTs Hs. 0.2 0.37 0.62 0.37 0.75-1.23 0.74 0.09-0.05-0.62 IMAGE:51015 Homo sapie 0.72 0.9 0.92 1.6 1.07 1.33 1.73 1.71 1.1-0.24 0.37 0.82 0.29 0.92 IMAGE:33028 LOC144100 0.28 1.28 0.55 0.57 0.26-0.05 0.82 0.77 1.02 0.75 1.21 0.46 0.28 IMAGE:325128 LPXN leupa 0.25-0.56-0.18-0.3-0.26 0.16 0.68 0.29 1.24 0.91 0.46 1.26 0.98 1.19 1.28 IMAGE:2030430 AI49-0.31 0.32-0.05-0.9 0.28 0.61-1.35-1.1-0.51 0.56 2.51 1.4 1.02 0.62 0.01 IMAGE:213682 **ESTs H -0.79-0.53-1.01-0.64-0.6-0.35-0.27-0.29 0.02-0.23-0.81-0.8-0.67 *mitoch. cont. IMAG *mitoch. co 0.16-0.2-0.08 0.07-0.23 0.2-0.06 0.21 1.01-0.1-0.31 0.18 *mitoch. cont. IMAG *mitoch. co -0.24-0.17 0.03-0.31-0.45 0.08-0.53-0.12 0.31 0.58 0.52-0.06-0.33-0.41-0.19 *mitoch. cont. IMAG *mitoch. co 0.28 0.4 0.35 0.57-0.01 0.13-0.54 0.21 1 0.51 0.59 0.59 0.28-0.22 0.08 IMAGE:1569263 ESTs Hs. 0.03 0.36 0.32 0.62 0.44 0.4 0.57 0.65 1.05 0.67 1.42 0.76 0.51 0.15 0.17 *mitoch. cont. IMAG *mitoch. cont. 0.49 0.36 0.62 0.56 0.57 0.34 0.46 1.15 0.84 1.11 0.76 0.44 0.29 *mitoch. cont. IMAG *mitoch. co -0.14-0.14-0.22-0.37-0.5 0.14-0.37-0.06 0.42 1.02 0.86 0.3-0.03-0.22-0.12 *mitoch. cont. IMAG *mitoch. co 0.08-0.08 0-0.22-0.13 0.37-0.17 0.14 0.97 0.89 1.38 0.8 0.34-0.02 0.31 IMAGE:1859075 EST Hs.1 0.45 0.96 0.28 0.56 0.28 1.09 1.17-1.23 2.45 1.26 0.87 1.38 0.58 IMAGE:1700436 ERK8 extra 0.75 1.78 1.56 0.9 0.51 0.55 0.95 1.36 0.59 0.6-0.27 1.53 IMAGE:1455603 FLJ12428 h 0.75-0.21-0.45 0.03-0.56 0.28 0.46 1.41 1.14-0.26-0.44 0.91 0.51-0.14 IMAGE:143332 NPY1R neu 0.36-0.31 0.6 0.58 1.05-0.42-2.25-2.49 2.04 0.57 1.71-0.3 1.7 0.28 IMAGE:1700429 GFRA1 GDN -2.63 1.04-0.62 0.26-1.14-0.45-0.56 0.05 1.09 0.48 0.19 1.4 0.48 IMAGE:1554430 Homo sapie -0.21 0.14 0.11-0.95 0.43 0.55 1.05 0.73 0.51 1.2 0.38 0.67 0.29 0.43 0.44 IMAGE:1877592 TRPS1 trich -0.13-0.2 0.18 0.43 0.64 0.48 1.41-0.43 0.73 1.3 0.68 1.1 0.97 0.7 0.78 IMAGE:1709786 TRPS1 trich -2.07-0.48-0.62-0.54-0.65 0.17 0.67 0.57 2.26 1.25 0.76 0.84-0.91 IMAGE:810671 FLJ22269 h -0.59 1.61 0.3-0.05-0.1 0.3 0.75 0.41-0.81 0.31 1.2 1.32 0.94 0.92-0.94 IMAGE:292219 IF **I factor (complement) Hs.36602-0.44 0.34 0.14 0.15 0.38 1.19 0.72 1.06 0.94 0.57 0.78 0.25 IMAGE:289057 HT021 HT0 0.92 0.99 0.89 0.59 0.88 0.9-0.99-1.92 0.35-0.1-0.03 0.67 0.15 0.45 0.38 IMAGE:285728 ESTs, Weak -0.77 0.22 0.38 0.29-0.77-0.25 1.03 0.47 1.37 1.04 0.4 0.26 0.95 IMAGE:841141 TMEPAI tra -0.67-0.55-0.79-1.18-0.31 0.09 0.65-0.89 0.28 0.41-0.12-0.34-0.28-0.43-0.22 IMAGE:511233 TMEPAI tra -0.65 0.09-0.68-0.4-0.21 0.67-0.69 0.11 0.31 0.01-0.39-0.25-0.62-0.4 IMAGE:809824 TMEPAI tra -2.01 0.38-0.28-0.43-0.08 2.28-0.36 0.29 0.22-0.24-0.02-0.83-0.09 IMAGE:452635 FLJ21144 h -0.31 0.29-0.61-0.54-1.12-0.01-1.61 0.16-0.61 0.22 0.14 0.1 0.31-0.77 IMAGE:342211 LOC129642-0.74 0.09-0.38-0.91-0.63-0.09-0.64-0.32-0.37-0.63-0.69 IMAGE:35807 R460-0.5 0.65-0.98-1.01-0.31-0.48 0.64-0.45 0.21-0.49-0.35 0.37-0.26-0.29-0.59 IMAGE:2138030 KCNS3 pota -0.26 0.7 0.61 0.38-0.53-0.21 0-0.21-0.12 0.33 IMAGE:307050 PPARGC1 p 0.54 1.48 0.97 1.19 0.83 1.32 0.16 1.31 0.99 0.92 0.28-1.63 0.37-1.28 IMAGE:110903 ESTs, Weakly similar to PRO0478 prote 0.64 0.27-0.34-0.15 0.36 2.02 0.55 0.36-0.14-0.36-0.87 IMAGE:491244 C14orf58 chromosome 14 1.69 1.41 1.61 1.12 0.07-0.25 1.77-1 0.31 0.86 0.34 0.29 IMAGE:1911408 REC8 Rec8p -0.04 4.08 1.67 1.79 1.1 0.32-0.21-0.26-0.96-1.22-0.67 0.32 IMAGE:198855 DDX17 DEA -0.1-0.23-0.07 0.69 0.25-0.18 0.87 1.06-0.1-0.42-0.53-1.91 1.36 IMAGE:417404 ACINUS ap -1.57-0.55 0.05 0.31-0.31-0.64 1.1 1.08-0.47-0.56-0.56-1.77 0.68 IMAGE:1860940 KIAA1273 K -1.97-1.3 0.28-1.23-1.06-0.64-0.44-0.35-0.73-0.73-1.25-0.06 IMAGE:127860 TRN2 karyo -0.59 0.29 0.84 0.5-0.3-0.31-0.94-2.99 0.35 0.43-0.14-0.3-0.22-0.63 0.95 IMAGE:290057 FLJ14525 h 1.13 2.07 2.19 1.77 1.13 0.08-0.44-1.42-0.9-0.38 0.34-0.5 IMAGE:124090 WDR22 WD 0.17 1.48 1.07 1.04 0.96-0.03 0.09-0.26-1.16-0.65-0.32-0.49 0.56 IMAGE:1705636 WDR22 WD 0.71 2.32 1.6 2.43 1.11-0.19-0.93-1.35 0.22-0.24-1.93-0.7-0.3-0.24 0.96 1292175 WDR22 WD 0.63 1 1.56 1.94 1.33 0.02-0.09-0.17-0.82-0.29-0.49-0.25 0.29 IMAGE:1687138 HIST1H2AM 0.68 1.2 1.21 0.06 0.68 0.36-0.61-2.7-1.52-0.92-0.77-0.06-0.3 0.39-1.08 IMAGE:283919 HIST1H2AC 0.35 1.24 1.22 0.25 0.37 0.31-1.11-1.75-1.12-0.13-1.03-0.2-0.22 0.44-0.39 IMAGE:488964 HIST2H2AA 1.45 1.88 1.78 1.43 1.75 1.42-1.36-1.57-1.4 0.29 0.14 0.57-0.08 1.24-1.15 IMAGE:1941410 LOC92558 0.31 0.7 1.21 1.16 1.14 1.05-2.55-1.77 1.78-0.57-0.08-0.18 0.87-0.16 IMAGE:859253 SEPT3 sept 0.51 2.5 1.67 1.1 0.61 0.83-1.82-0.77-1.12-0.79-0.8-0.08-1.24 IMAGE:587268 ESTs, Weak -0.13 1.18 0.63 0.48 0.58 0.02-0.39-0.83 0.37-0.98-0.19-0.29 0.05-1.42 IMAGE:1868027 Homo sapie -0.67 1.89 0.65 1.44 1.15 0.36-0.45-0.09 0.15-1.9 0.5 IMAGE:308478 Homo sapie 0.65 1.6 0.76 0.64 0.48 1.24 0.83 1.29 0.98 1.35-0.35 0.17-0.18 0.07-0.09 IMAGE:454190 ESTs Hs. 0.51 4.01-0.27 0.08-0.25-1.19-0.24 0.48-0.29-1.32-0.3-0.88-1.62 IMAGE:1640707 SMARCA2 S 0.61 1.34 1.4 1.86 1.09-0.37-1.24-0.54 0.22-0.44-0.4-0.23 0.34-0.26 0.87 IMAGE:240148 MLL3 myelo 0.05-0.25-0.07 0.96-0.86-1.11-0.57-0.05-0.62-0.19-0.95-0.19 0.25-0.55 0.74 IMAGE:135713 CYP19 cyto 0.63 0.13-0.12-0.13 0.36-0.16-3.05 1.45-0.08 0.21 0.12 0.23-0.2 0.17 IMAGE:503760 ESTs Hs. 0.34 0.45 0.98 0.62 0.28-0.22-1.1 0.34-0.16-0.11 0.46 0.17 0.12 0.04 IMAGE:127970 ESTs, Weak 1.11 1.92 1.05 1.02 0.94 0.33-0.01-0.63-0.34-0.37 0 0.28 0.03 IMAGE:1420873 FLJ20591 e 0.15 1.26 0.71 0.88 0.67 0.63-1.6-1.5 0.04 0.29 0.16 0.75-1.09 IMAGE:32146 ESTs Hs. 0.18 1.55 1.38 1.31 0.97 0.25-0.43 0.29-0.01-0.57-0.13 0.17 IMAGE:24918 PIP5K1B ph 0.93 1.79 1.15 1.45 1.55 1.04-0.98 0.22 0.22 0.1 0.01 0.16 0.99 0.22 0.82 IMAGE:1609836 GLUL gluta 1.59 2.14 1.86 1.95 1.59 1.36-1.02-0.81 0.28 1.59-0.83 0.73-0.25 0.75 0.55 IMAGE:230100 RANBP2L1 1.26 2.06 1.61 2.03 1.29 0.46 1.6-0.9 0.38 0.45-1.2-0.54-0.35 0.19 0.17 cdna sirut Geeniekspressio analyysi Experimental procedure Patient A Patient B Gene 1: B > A Gene 2: B < A Gene 3: B = A Gene 4: absent Bioinformatics Cy5 Cy3
Geeninsiirto GMO = muuntogeeninen eliö Siirtogeeninen eliö: siirretty uuden ominaisuuden aiheuttava geeni Poistogeeninen eliö: eliöön siirretty geenirakenne, joka estää eliön oman geenin toiminnan
BI5 III Biotekniikan sovelluksia 6.Geeninsiirrolla tuotetaan uudenlaisia eliöitä
BI5 III Biotekniikan sovelluksia 6.Geeninsiirrolla tuotetaan uudenlaisia eliöitä
BI5 III Biotekniikan sovelluksia 6.Geeninsiirrolla tuotetaan uudenlaisia eliöitä
Eläinkokeet Eläinkokeiden tekemiseen vaaditaan aina lupa, jonka myöntää valtakunnallinen eläinkoelautakunta (ELLA) 3R-periaate: Korvaaminen (Replacement): Jos eläinkokeelle on olemassa luotettava vaihtoehto, sitä on käytettävä eläinkokeen sijasta. Vähentäminen (Reduction): Eläinkokeissa tulee käyttää niin vähän eläimiä kuin mahdollista. Parantaminen (Refinement): Eläimille aiheutuva kärsimys ja muut haitat on pidettävä mahdollisimman pienenä. Eläinkokeissa käytetään usein mallieliöitä, joiden toiminta tunnetaan muita eliöitä tarkemmin. Mallieliöitä käyttämällä voidaan tehdä johtopäätöksiä myös eliölle läheistä sukua olevista lajeista. (esim. hiiri ihminen) BI5 III Biotekniikan sovelluksia 6.Geeninsiirrolla tuotetaan uudenlaisia eliöitä
Geenin kloonaus = geenin eristäminen, liittäminen vektoriin ja lisääminen kasvatussolussa Vektori on dna:n tai geenin siirtotyökalu esim. bakteerin tai hiivan plasmidi BI5 III Biotekniikan sovelluksia 6.Geeninsiirrolla tuotetaan uudenlaisia eliöitä
Dna- ja geenikirjastot Dna-kirjasto = dna-jaksojen kokoelma Genominen kirjasto: sisältää dna-jaksot, jotka on liitetty vektoreihin. Vektorit on siirretty isäntäsoluihin. C-dna eli geenikirjasto: lähetti-rna:t, jotka muutettu c-dna:ksi ja tallennettu vektoreihin.
Geeninsiirtomenetelmiä Transformaatio Plasmidien siirto bakteerisoluun Bakteerit ottavat itse sisäänsä vapaan dna:n liuoksesta Geeninsiirto kasvisoluun Agrobakteerin Ti-plasmidin avulla Geenipyssy Yksisirkkaiset kasvit Sähköimpulssit Kemiallinen käsittely
Geeninsiirtomenetelmiä Geenin siirto eläinsoluun Mikroinjektio Siirtogeenin tai vektorissa (usein virusvektori) olevan dna:n ruiskutus munasoluun Siirto alkion kantasolujen viljelmään
Käytännön sovelluksia
Siirtogeeniset valkuaisainetehtaat Valkuaisaineiden tuotto muuntogeenisissä eläimissä ja kasveissa Kasveilla valkuaisaineentuotanto kaikissa solukoissa Eläimillä juuri tietyssä kudoksessa
Siirtogeeniset valkuaisainetehtaat
Kloonaus Klooni on saman perimän omaavien eliöiden tai solujen joukko luonnollinen tapa: identtiset kaksoset tai perunan mukulat osittain keinotekoinen tapa: alkioiden halkaisu tai solukkoviljely keinotekoinen tapa: tumansiirto, haploidiajalostus tehdään arvokkaiden yksilöiden lisäämiseksi ja yhtenäisen tuotannon saavuttamiseksi
Terapeuttinen kloonaus = alkiosta otetaan soluja kasvatetaan kantasoluja kudoksia Reproduktiivinen kloonaus = tumansiirto, sijaiskohtu