Luennon aiheet: GM-eläimet. Geenimuunnellut hiiret. Alkioiden pakastus. Geenimuunnellut eläimet: miksi ja miten?

Transkriptio

1 Luennon aiheet: GM-eläimet Koe-eläinkurssi Petra Sipilä Geenimuunnellut hiiret Siirtogeeniset eläimet Poistogeeniset eläimet Alkioiden pakastus Terminologiaa Geenimuunnellut eläimet: miksi ja miten? Geenimuunneltu eläin: Eläimen perimää on muokattu ja muokattu perimä siirtyy jälkeläisille Siirtogeeninen (transgenic) eläin: Laajasti käsitettynä: Eläin, jonka yhteen tai useampaan soluun on viety vierasta DNA:ta Suppeampi käsitys: Eläin, jonka perimään on viety vierasta DNA:ta pronukleusinjisoinnilla. Muutos kaikissa soluissa. Terminologiaa Geenimuunnellut eläimet: miksi ja miten? Kloonaus: Valmistetaan eläimestä perimältään identtisiä kopioita Geeniterapia: Viedään perimäainesta, esim. virusvälitteisesti somaattisiin soluihin: ei sukusoluihin, joten perimäaines ei siirry jälkeläisiin Miksi geenimuunneltuja eläimiä käytetään? Soluviljelyn käyttömahdollisuudet geenien toiminnan tutkimuksessa ovat vielä nykyäänkin hyvin rajalliset Soluviljelymenetelmillä ei saada tietoa geenin toiminnan merkityksestä monimutkaisissa fysiologisissa tiloissa, kuten koko elimistössä, eikä soluviljelymalleilla voida simuloida kokonaisten kudos- tai elinjärjestelmien toimintaa Geenimuuntelulla saadaan aikaan täsmämalleja Geenimuunneltujen hiirten sovellutukset (1) Tärkein muuntogeenisten eläinten käyttöalue on Perustutkimus: Geenisäätelyn tutkiminen Uusien toiminnaltaan tuntemattomien geenituotteiden merkitys elimistössä Osittain tunnettujen geenien toiminnan merkitys osana koko elimistön toimintaa. 1

2 Geenimuunneltujen hiirten sovellutukset (2) Tautimallinnus ja lääkekehitys Pyritään geenimuuntelun avulla luomaan hiirelle tila, joka muistuttaa ihmisen sairautta (ns. tautimalli) Tutkitaan mallissa taudin syntymekanismeja ja testataan lääkkeitä Etsitään olemassa oleville lääkkeille täysin uusia indikaatioita eli käyttöaiheita Etsitään sellaisten geenituotteiden, joihin olisi mahdollista kehittää lääke (ns. druggable genes), vaikutuksia elimistöön Etsitään lääkkeiden sivuvaikutuksia Miten geenimuunneltuja hiiriä tuotetaan? Muuntogeenisten hiirten tuottotavat: Mikroinjektio: Geenimuunnos liittyy sattumanvaraisesti johonkin kohtaan perimää -siirtogeenihiiret Targetointi: Geenimuunnos liittyy tarkalleen haluttuun kohtaan perimää esim. poistogeenihiiret Siirtogeeninen hiiri Siirtogeenisen hiiren tuottamisen vaiheet: 1) Rakennetaan uusi geeni rekombinaattitekniikalla Perimään liitetään ylimääräinen uusi geeni, joka useimmiten on rekombinatti-dna-tekniikalla rakennettu fuusiogeeni Siirtogeenisen hiiren tuottamisen vaiheet: 1) Rakennetaan uusi geeni rekombinantti-dna-tekniikalla 2) DNA injektoidaan 1-soluisen alkion esitumaan 3) Injektoidut alkiot siirretään vastaanottajahiirten munanjohtimiin 4) Syntyneet poikaset genotyypataan ja fenotyypataan Siirtogeenin pitää sisältää: Promoottori Rakennegeeni PolyA sekvenssi Mahdollisesti introni Tarkista, että konstruktissasi on Kozak sekvenssi (gccrccatgg), R=adenine or guanine Mieti jo suunnitteluvaiheessa: Kuinka tunnistat siirtogeeniset hiiret Kuinka mittaat siirtogeenin toimintaa Promoter Intron Structural gene (cdna) PolyA Siirtogeenisen hiiren tuottamisen vaiheet: 2) Injisoidaan transgeeni hedelmöittyneeseen munasoluun (in vitro, mikroskoopin alla) Siirtogeenisen hiiren tuottamisen vaiheet: 3) Injektoidut alkiot siirretään vastaanottajahiirten (valeraskaita naaraita) munanjohtimiin GENE 2

3 Valeraskas naaras: Mikroinjektiolla DNA liittyy sattumanvaraisesti genomiin -> Tuloksena heterozygootteja poikasia (F0 eli kantaeläimet), joiden kaikissa soluissa on geenimuunnos Naarashiiri paritetaan vasektomoidun koirashiiren kanssa; vaikka munasolu ei hedelmöity, naaraan hormonituotanto vastaa raskaana olevan naaraan hormonituotantoa, jolloin se kykenee toimimaan keinoemona vieraalle alkiolle. 4) Genotyyppaus ja fenotyyppaus Siirtogeenihiirten avulla voidaan tutkia esim.: -Siirtogeeni tunnistetaan syntyvien poikasten perimästä (PCR) - PCR tehdään häntä- (tai korva-) näytteestä eristetystä DNA:sta - Siirtogeenisiksi osoittautuvat kantahiiret käytetään siirtogeeniä ilmentävien hiirilinjojen tuottamiseksi ja muutokset ilmiasussa tutkitaan F1 F0 X WT Geenin ylituoton vaikutuksia hiireen; universaali tai kudos-/soluspesifinen tuotto Transkription säätelyelementtejä eli promoottoreita; raportoijahiiret Dominantisti negatiivisen mutaation vaikutuksia ylituottamalla ko. epänormaalia geeniä Esimerkkejä transgeenihiiristä 1) Ylituottohiiret: Esim. AROM+-hiirimalli, jossa aromataasigeenin universaali ylituotto aiheuttaa korkean estrogeenija matalan androgeenipitoisuuden veressä ja kiveksissä AROM+ -hiiret Geenimuunnos aiheuttaa korkeat estrogeeni- ja alhaiset androgeenitasot Uroshiirillä voimakas fenotyyppi, naaraat normaaleja Kivesfenotyyppi: Keskeytynyt spermatogeneesi (hedelmättömyys) Piilokiveksisyys Leydigin solujen hyperplasia WT Arom+ Li et al., Endocrinology 2001; 142:

4 AROM+ -hiiret Aromataasi-inhibiittori käsittely 4 kk ikäisiä Arom+ uros hiiriä käsiteltiin 6 viikkoa finrozole:lla (10 mg/kg, Hormos Medical Ltd.) Spermatogeneesi käynnistyi uudelleen Leydigin solujen hyperplasia väheni Esimerkkejä siirtogeenilinjoista: 2) Raportoijahiiret Promoter of gene x Promoter of gene x Gene x E1 E2 E3 E4 Reporter gene Li et al., Am J Pathol. 2004; 164: Reporter genes: - galactosidase - Luciferase - EGFP & other fluorescent markers -CAT -others. Raportoijahiiret Valitse sopiva repotterigeeni käyttötarkoituksen mukaan: - Haluatko kvantitoida reportteriproteiinia? - Haluatko paikallistaa repotterin solutasolla? - Haluatko tehdä in vivo kuvantamista? Mikroinjektiotekniikan huonot puolet: Transgeeni liittyy sattumanvaraiseen paikkaan genomissa Liittyminen saattaa aiheuttaa genomissa eitoivottuja muutoksia, jotka vaikuttavat hiiren ilmiasuun Liittymiskohtasaattaa vaikuttaa transgeenin ilmentymiseen Mikroinjektiotekniikan haitat Useimmiten geenikonstruktia liittyy useita kappaleita (ns. kopioluku) Jokainen linja ainutlaatuinen kopioluvun ja integroitumispaikan suhteen; useita linjoja tarvitaan Tehoton tekniikka: 50 alkiota 1 transgeeninen poikanen Poistogeeniset hiiret 4

5 Targetointi eli geenimuunnoksen tuottaminen haluttuun kohtaan genomia -Poistogeenisen hiiren valmistus Hiiren perimästä on tuhottu geeni tai sen toiminnallinen osa, jolloin geenin tuottamaa proteiinia ei synny tai proteiini ei ole toiminnaltaan normaali. Perustuu homologiseen rekombinaatioon, jolloin geenimuunnos voidaan kohdentaa haluttuun kohtaan perimää (targetoitu geenimuunnos) Poistogeenisen hiiren tuottamisen vaiheet: 1) Etsitään internetin tietopankeista genominen klooni (yleensä BAC-klooni), joka sisältää geenin, joka halutaan poistaa; tilataan klooni 2) Kloonataan targetointikonstrukti, joka tuhoaa geenin ja mahdollistaa kaksoisvalikoinnin 3) Transfektoidaan alkion kantasolut ko. DNA-konstruktilla 4) Valitaan solut, joissa on tapahtunut homologinen rekombinaatio ts. DNA on liittynyt haluttuun kohtaan 5) Geenimuunnellut alkion kantasolut siirretään blastokystivaiheen alkioon, ja alkio siirretään vastaanottajahiiren kohtuun 6) Syntyvistä kimeerisistä hiiristä testataan ne, jotka periyttävät geenimuunnoksen 7) Tutkitaan geenimuunnoksen aiheuttamat fysiologiset ja toiminnalliset muutokset Poistogeenisen hiiren tuottamisen vaiheet: 1) Etsitään internetin tietopankeista genominen klooni (yleensä BAC-klooni), joka sisältää geenin, joka halutaan poistaa; tilataan klooni 2) Kloonataan targetointikonstrukti, joka tuhoaa geenin ja mahdollistaa kaksoisselektion Ensembl.org AB2.2. ES cells Tilaa BAC-klooni sähköpostilla, useita tuottajia 2) Targetointikonstruktin kloonaus; Halutun mutaation tekeminen ja (tupla)selektion mahdollistaminen International Knockout Mouse Consortium; Saatavilla targetoituja mutaatioita ja geeni trappeja WT endogenous locus E1 Intron1; bp E2 Targeting construct ATG PGK Neo pa E1 DTA Short homology arm 1700 bp Homologous recombination Long homology arm 7951 bp Targeted locus PGK Neo pa E1 probe 1 probe 2 E2 5

6 Poistogeenisen hiiren tuottamisen vaiheet: 1) Etsitään internetin tietopankeista ja tilataan genominen klooni (yleensä BAC-klooni), joka sisältää geenin, joka halutaan poistaa 2) Kloonataan targetointikonstrukti, joka tuhoaa geenin ja mahdollistaa kaksoisselektion 3) Transfektoidaan alkion kantasolut ko. DNA-konstruktilla 3) Transfektoidaan alkion kantasolut targetointikonstruktilla Alkion kantasolut, ES-solut (embryonal stem cells) ovat pluripotentteja kantasoluja, jotka saadaan blastokystivaiheen alkion sisäsolumassasta. Niitä voidaan kasvattaa in vitro, manipuloida ja siirtää takaisin blastokystialkioon. ES-solut säilyttävät kykynsä erilaistua miksi tahansa elimistön soluksi From Sedivy & Joyner Gene Targeting 1992 Kantasolut voidaan jakaa kolmeen ryhmään: totipotentit, pluripotentit ja multipotentit Totipotentti kantasolu: hedelmöittynyt munasolu: pystyy erilaistumaan elimistön kaikiksi solutyypeiksi, lisäksi istukan soluiksi ja sikiötä ympäröiviksi rakenteiksi Pluripotentti kantasolu: noin kolmen päivän jälkeen, totipotentit solut erilaistuvat blastokystiksi. Blastokysti muodostuu ulkosolukerroksesta, josta erilaistuu istukka ja sikiötä ympäröivät rakenteet sekä sisäsolumassasta, millä on kyky erilastua miksi tahansa elimistön soluksi (ES-solut!) Multipotentit kantasolut: aikuisen kantasolut; Esim luuytimen kantasolut pystyvät erilaistumaan kaikiksi verisoluiksi, mutteivät muiden elinten soluiksi Poistogeenisen hiiren tuottamisen vaiheet: 1) Etsitään internetin tietopankeista ja tilataan genominen klooni (yleensä BAC-klooni), joka sisältää geenin, joka halutaan poistaa 2) Kloonataan targetointikonstrukti, joka tuhoaa geenin ja mahdollistaa kaksoisselektion 3) Transfektoidaan alkion kantasolut ko.dna-konstruktilla 4) Valitaan solut, joissa on tapahtunut homologinen rekombinaatio ts. DNA on liittynyt haluttuun kohtaan 4) Valitaan solut, joissa on tapahtunut homologinen rekombinaatio ts. DNA on liittynyt haluttuun kohtaan Targeting construct Homologous area 1 Homologous area 2 pos.selection neg.selection marker marker X gene of interest X 1) pos.selection marker neg.selection marker 2) pos.selectm arker neg.selection marker pos.selectm 3) arker The Right one!! 6

7 Soluviljelyssä: Jäljelle jääneistä soluista etsitään oikeat =skriinaus solu, johon konstrukti ei ole integroitunut solu, johon konstrukti on integroitunut sattumanvaraisesti solu, jossa on tapahtunut homologinen rekombinaatio Positiivinen selektio (esim. neomysin) Negatiivinen selektio (esim. gansikloviiri) Yleensä :n poimitun kloonin joukossa vähintään 3 positiivista kloonia, homologinen rekombinaatio harvinainen tapahtuma! Negatiivinen valikointi lisää 5-10 kertaisesti positiivisten kloonien osuutta Aluksi kaikki kloonit tutkitaan PCR:llä PCR-positiiviset kloonit varmistetaan genomisella Southernilla Positiivisisissakin klooneissa vain toinen alleeli tuhoutunut eli ES-solut geenimuuntelun jälkeen heterozygootteja! gene of interest pos.selectm arker Poistogeenisen hiiren tuottamisen vaiheet: 1) Etsitään internetin tietopankeista ja tilataan genominen klooni (yleensä BAC-klooni), joka sisältää geenin, joka halutaan poistaa 2) Kloonataan targetointikonstrukti, joka tuhoaa geenin ja mahdollistaa kaksoisselektion 3) Transfektoidaan alkion kantasolut ko.dna-konstruktilla 4) Valitaan solut, joissa on tapahtunut homologinen rekombinaatio ts. DNA on liittynyt haluttuun kohtaan 5) Geenimuunnellut alkion kantasolut siirretään blastokystivaiheen alkioon, ja alkio siirretään vastaanottajahiiren kohtuun ES-solut, joissa on tapahtunut homologinen rekombinaatio, injektoidaan blastokystiin Normal C57BL/6 Blastocyst (black) Valikointi turkkivärin perusteella ICM ES cells 129/SvJ (agouti) agouti black 7

8 Poikaset ovat kimeerisiä hiiriä Kimeeristen hiirten tuotto Vaihtoehtoinen tapa; geenimuunnellut ES-solut aggregoidaan morula-vaiheen alkioiden kanssa Black mouse - no apparent ES cell contribution Chimeric founder - strong ES cell contribution Chimeric founder - weaker ES cell contribution Poistogeenisen hiiren tuottamisen vaiheet: 1) Etsitään internetin tietopankeista ja tilataan genominen klooni (yleensä BAC-klooni), joka sisältää geenin, joka halutaan poistaa 2) Kloonataan targetointikonstrukti, joka tuhoaa geenin ja mahdollistaa kaksoisselektion 3) Transfektoidaan alkion kantasolut ko.dna-konstruktilla 4) Valitaan solut, joissa on tapahtunut homologinen rekombinaatio ts. DNA on liittynyt haluttuun kohtaan 5) Geenimuunnellut alkion kantasolut siirretään blastokystivaiheen alkioon, ja alkio siirretään vastaanottajahiiren kohtuun 6) Syntyvistä kimeerisistä hiiristä testataan ne, jotka periyttävät geenimuunnoksen 7) Tutkitaan geenimuunnoksen aiheuttamat fysiologiset ja toiminnalliset muutokset sukusolut: Poikasten paritusstrategia- siirtyykö geenimuunnos jälkeläisiin? - kimeerinen hiiri X villityypin musta B6-hiiri ruskea ruskea musta - ES /+ B6 + ES /+ B6 + B6 /+ B6 + + Paritusstrategia homozygoottien tuottamiseen X tm/+ B6 tm/+ B6 Geenien ilmenemisen säätely eläinmalleissa; konditionaaliset ja indusoituvat mallit tm/tm tm/+ B6 + B6 /+ B6 25% 50% 25% 8

9 Konditionaaliset tai kudosspesifiset poistogeenihiiret Ongelma perinteisissä poistogeenimalleissa on, se että mutatoitu geeni inaktivoidaan KAIKISSA kudoksissa/soluissa -lox -teknologia (1) (vaihtoehtoisesti Flp-frt) paikka-spesifinen rekombinaasi entsyymi P1 faagista. 1) Tunnistaa 34bp DNA sekvenssinloxp = Tämä voi johtaa kuolemaan alkionkehityksen aikana Sekundaariset vaikutukset voivat peittää primaarisia vaikutuksia vaikeuttaa johtopäätösten tekemistä mutaation vaikutusmekanismeista 2) Liittää yhteen kaksi LoxP kohtaa ja poistaa niiden välissä sijaitsevan sekvenssin -lox -teknologia (2) Riippuen käytettyjen loxp-kohtien suunnasta, rekombinaasi voi katalysoida myös inversion. insert 1) Tunnistaa 34bp DNA sekvenssinloxp = 2) Katalysoi LoxP-kohtien välisen alueen inversion -loxp -Teknologia (3) Vaatii kaksi hiirilinjaa 1) Hiirilinja, jossa loxp kohdat on sijoitettu poistettavan alueen molemmin puolin. Tällöin geeniä sanotaan floksatuksi. GENE 2) Siirto- tai poistogeeninen hiirilinja, joka ilmentää CRE:tä kudosspesifisen tai indusoituvan promoottorin alla insert tissue specific or inducible promoter CRE cdna -rekombinaatiolla voidaan: Tehdä kudos/solu-spesifisiä poistogeenisiä hiirimalleja -loxp periaatteet Esimerkki: geeni ilmenee aivoissa, selkäytimessä, silmässä ja haimassa Aktivoida geenejä (poistamalla esim. Stop-kasetti) Tehdä indusoitavia poistogeenisiä, esim. tamoksifeeni Tehdä pistemutaatioita Muokata kromosomeja (esim. Inversiot) Perinteinen poistogeeninen hiiri kuolee aivo- ja selkäydinongelmien takia Kiinnostuksen kohteena on haiman toiminta 9

10 -loxp periaatteet 3.Risteytetään hiirilinjoja muutama sukupolvi, jotta saadaan + flox/flox homotsygooteja 1. Tehdään floksattu hiirimalli targetoimalla - LoxP -kohdatympäröivät tutkittavaa geeniä jokaisen solun perimässä 2. Tehdään siirto- tai poistogeeninenhiirimalli, joka ilmentää CRE:tä haimaspesifisen promoottorin alla. flox/flox x flox/flox Geeni tuhotaan vain haimassa! Multipurpose Allele (Knockout-first) Indusoituvat mallit (1) Geenien ilmenemisen indusointiin in vivo on kaksi menetelmää - Tetrasykliini; Tet-On ja Tet-Off ja - Tamoksifeeni; ER/4-OHT Testa et al., Genesis Indusoituvat mallit: Tamoksifeeni (2) Hyödyntää estrogeenireseptorin ligandin sitoutumiskohtaa ja samalla säätelee viereisen alueen toimintaa Mutatoitu ligandin sitoutumiskohta (ERT): sitoutuu tamoksifeeniin, joka on estrogeeni antagonisti, suuremmalla affiniteetilla kuin endogeeniset estrogeenit Indusoituvat mallit: Tamoksifeeni (3) Paikka-spesifinen rekombinaatio yhdistettynä indusoituvaan malliin (Paikan ja ajan kontrollointi) ERt fuusioproteiini -ERT fuusioproteiini siirtyy tumaan tamoksifeenikäsittelyn seurauksena mahdollistaen välitteisen rekombinaation Heart specif. Promoter ERt PolyA Voi aiheuttaa toksisuus ongelmia 10

11 Indusoituvat mallit: Tamoksifeeni (4) ERt fuusioproteiinia tuotetaan kudos-spesifisen promoottorin ohjaamana, mutta se pysyy sytoplasmassa (ei pääse tumaan ilman ligandia) Heart-specific ERt Indusoituvat mallit: Tamoksifeeni (5) Indusointi Tamoksifeenillä; yl. kerta annos riittää, voidaan antaa IP injektiolla tai ruuan/veden mukana Heart-specific ERt E1 E2 E3 E1 E2 E3 E1 E3 -ERt -ERt -ERt Mouse Genome Informatics (MGI); Datapankki floksatuista ja hiirimalleista Vaihtoehtoinen menetelmä KO eläinten tuottoon (muut lajit kuin hiiri); Zinc-Finger Nucleases (ZFN) & Transcription activator-like element nucleases (TALEN) ZFN ja TALEN teknologiat poistogeenisten eläinten (rottien) luomiseen (1) ZFNt ja TALENt ovat muokattuja DNA:han sitoutuvia proteiineja, jotka mahdollistavat genomin targetoidut muokkauksetkatkaisemalla DNA:n kaksoisjuosteen spesifioidusta paikasta. Kaksoisjuosteen katkoksetkäynnistävät solun oman DNA:n korjausprosessit; homologisenrekombinaation ja Non-Homologous End Joining (NHEJ). Kun solu käyttää NHEJ-mekanismiakorjaukseen, syntyvät kopiontivirheet aiheuttavat ko. DNA-kohtaan mutaation. ZFN ja TALEN teknologiat poistogeenisten eläinten (rottien) luomiseen (2) Teknologioiden hyödyt: Ei laji rajoituksia Ei vaadi olemassa olevia ES-solulinjoja Nopea menetelmä Vain 3-6 kk poistogeeniseneläimen luomiseen Periytyvä geenimuunnos Universaali työkalu Toimii sekä solulinjoissa, että eläimissä Mahdollistaa nopean siirtymisen proof-of-concept -kokeista eläimiin 11

12 Siirto- vs. poistogeeniset Pronukleusinjisointi hedelmöittyneeseen munasoluun DNA integroituu satunnaiseen kohtaan genomia Kopioluku vaihtelee Kantoja tarvitaan useita geenimuunnoksen tutkimiseen Siirto- vs. poistogeeniset DNA transformoidaan ES-soluihin Solut, jotka ovat läpikäyneet homologisen rekombinaation injisoidaan 4 päiväiseen alkioon blastokystiin Targetoitu muunnos Geenimuunnoksen vaikutuksia voidaan tutkia yhdellä hiirilinjalla KYSYTTÄVÄÄ? Alkioiden pakastus: Miksi? Turvallisuus: Erilaiset taudit ja onnettomuudet voivat vaarantaa kallisarvoiset hiirikannat. Kannat voidaan elvyttää pakastetuista alkioista Taloudellisuus: Säästää huomattavasti tilaa, pidemmän päälle edullinen tapa säilyttää hiirikantoja, jotka eivät nyt ole käytössä Tieteelliset edut: Sukupolvesta toiseen jatkuvan siitostuksen mukana seuraa myös spontaaneja mutaatioita. Pakastetut alkiot säilyvät geneettisesti muuttumattomina Alkioiden pakastus: Miten? Alkiot, 2-8-soluvaiheisia, kerätään superovuloiduista, uroksen kanssa paritetuista naaraista Munanjohtimet kerätään ja alkiot huuhdellaan, Parhaannäköiset alkiot pakastetaan propanolimediumissa nestetyppeen ns. oljissa Kantariippuvaista; HY:ssa käytetään FVB/N- ja C57Bl-taustaisia; sekä erilaisia hybridejä Rutiinisti pakastetaan alkiota; arviolta 90% alkioista pitäisi selvitä sulatuksesta 12

13 Kiitos! 13