Veikko Sorsa: PERINNÖLLISYYSTIETEEN HISTORIAA V 1 V GEENITEORIA, NUKLEIINIHAPPOTUTKIMUS, GENEETTINEN KOODI A Nukleiini, kromatiini, perinnöllisyys, proteiinigeeniteoria Jo 1880-luvulla syntyi hypoteesi, että Friedrich Miescherin 1869 löytämä nukleiini ja tumista löydetty kromatiini, joka kromosomeja muodostaen jakautuu tasan mitoosissa, olivat samaa ainesta ja tärkeitä perinnöllisyys-ilmiöissä (Zacharias, Wilson ym.). Nukleiinihappotutkimus jatkui Tübingenissä Hoppe-Seylerin laboratoriossa (Altmann, Kossel, ym.) ja sittemmin muualla mm. USA:ssa (Levene ym.) Nukleiinihappojen fosfaattisokeri-emäs rakenne selvitettiin, samoin DNA:n ja RNA:n erot. Nukleotidien 3-5 -liittymisen varmistivat vasta 1952 D.M.Brown & A. Todd. 1920-luvulla ja 30-luvun alussa vakiintui neljän erilaisen nukleotidin rengasmalli (tetranukleotidi-malli), koska näytteissä kaikki neljä emästä oli aina läsnä. DNA:n mahdollinen osuus geenien rakenteessa alkoi horjua, kun lamppuharjakromosomien geenitoimintaa ilmentävät loopit eivät värjäytyneet Feulgenilla, ja DNA:n molekyylikoko uskottiin liian pieneksi. Proteiinit näyttivät paremmin sopivan geenien perusmaterialiksi GEENI-->ENTSYYMI-->rektiovaihe -kaavassa). B Transformaatio ja todisteet lineaarisesta rakenteesta in ryhmän (Columbiayliopisto, NY) uudet tulokset (1950) puriinien ja pyrimidiinien sekä adeniini-tymiini parien ja toisaalta guaniinisytosiini parien yhtäsuuresta määrästä DNA-näytteissä kaikki viittasivat parirakenteeseen. Lineaaristen mallien suunnittelu alkoi monella taholla 1950- luvun alussa, mutta DNA:n varsinainen rakennetutkimus oli taka-alalla ja geneetikkojen kiinnostus aiheeseen oli proteiinigeeniteorian vuoksi lähes olematon. Kristallografit ja biokemistit taas eivät olleet kiinnostuneet geeneistä. Rosalind (Rosy) Franklin Friedrich Miescher Transformaatiokokeet 1928-44 Griffith--- Avery et al.) ja viruskokeet 1952 Hershey, Chase) osoittivat vakuuttavasti DNA:n olevan ainoa yhdiste, joka tarvitaan perinnöllisyyden välittymiseen. DNA:n lankamainen muoto, suuri pituus ja molek. paino sekä emästen sijainti lähekkäin ja jonossa (William Astbury ja Florence Bell 1938), kaikki viittasivat lankamaiseen rakenteeseen. Samoin Drosophilakokeissa saadut havainnot geenien sisällä tapahtuvasta cross-overista antoivat kuvan lineaarisesta organisaatioista. C Todisteet parirakenteesta Geeniparit, kromosomiparit, kromosomien kahdentuminen ja halkeaminen jakautuessaan kaikki viittasivat geneettisen materiaalin kaksoisrakenteeseen. Erwin Chargaff Linus Pauling
Veikko Sorsa: PERINNÖLLISYYSTIETEEN HISTORIAA V 2 D Kaksoiskierre DNA:n röntgen-diffraktiotutkimus (kristallografia) oli keskittynyt vain muutamiin paikkoihin. Aktiivisin ryhmä - Leedsin yliopiston Bill Astburyn ohella - toimi John T. Randall in johdolla Lontoon Kings Collegessa: Tähän kuuluivat mm. Maurice Wilkins, Rosalind Franklin, Aaron Klug, Raymond Gosling, A.R. Stokes ja H.R. Wilson. Ryhmä pyrki saamaan mahdollisimman hyviä diffraktiokuvia DNA-kiteistä, mutta ei ollut vielä kiinnostunut uudesta rakennemallista. James Dewey Watson (s.1928), alunperin lintuharrastaja, postgraduate Bloomingtonissa, Indianan yliopistossa, varsinaisesti Salvador Lurian oppilas. Mutta Fernandus Payne, Herrmann J. Muller ja Tracy Sonneborn saivat Watsonin innostumaan genetiikasta, ja sittemmin fageista väitellyt vasta 22 vuotias tri, saapui Eurooppaan 1950 syksyllä, aluksi opettajansa Salvador Lurian suosituksesta Kööpenhaminaan biokemisti Herman Kalckarin laboratorioon. J.D.Watsonin vaikea ymmärtää Kalckarin tanskanvoittoista englantia luennoilla ja hän joutui pääasiallisesti työskentelemään Ole Maaløen sekä ( Max Delbrückin laboratoriosta Cal Techistä tulleen) Günther Stentin kanssa fagien parissa. Jim Watson oli tullut opiskelemaan Herman Kalckarin johdolla kemiaa, josta hän tiesi varsin vähän, sensijaan hän oli hyvin perillä kolmikon Max Delbrück, Salva Luria ja Al Hershey fagitutkimuksista ja tiesi DNA:n keskeisen merkityksen. Herman Kalckar kehoitti James Watsonia osallistumaan kanssaan Napolin eläintieteellisellä tutkimusasemalla keväällä 1951 pidettyyn makromolekyylikokoukseen, koska tämä ei näyttänyt saavan hänen opetuksestaan stipendin edellyttämää täyttä hyötyä. Watson sai 200$ matkarahan USA:sta, ja hän oleskeli Napolin tutkimusasemalla 6 viikkoa ennen varsinaista kokousta. Varsinaisesti Watson odotti kokouksessa John Randallin luvattua esitelmää nukleiinihappojen kristallografiasta. Samanaikaisesti kiireinen John T. Randall Kings Collegessa oli päättänyt lähettää Maurice Wilkinsin sijaisekseen Napolin makromolekyylisymposiaan. Varsinkin Wilkinsin esitelmän kuvat saivat Watsonin todella kiinnostumaan DNA:n kemiasta. Wilkinsin avulla hän yritti heti pyrkiä Lontooseen Randallin ryhmään, mutta Wilkins ei ollut kiinnostunut. Paluumatkalla Napolista Kööpen-haminaan James Watson pysähtyi Genevessä. Sinne oli juuri palannut Cal Techistä fagitutkija Jean Weigle, joka tiesi kertoa Linus Pauling in vastikään ratkaisseen proteiinien alfakierteen rakenteen. LP:llä oli ollut luennolla alfa-helix-malli peitettynä, ja aivan lopussa hän oli paljastanut sen dramaattisesti. Alfa-helix artikkeli saapui Kööpenhaminaan samoihin aikoihin kuin Jim Watson palasi sinne. Watson halusi päästä muuttamaan johonkin kristallografialaboratorioon; Koska Lontoon Kings College ei ollut kiinnostunut, Max Perutzin ryhmä Cambridgessä näytti ainoalta mahdollisuudelta. Maurice Wilkins Onneksi Salvador Luria tapasi MP:n työtoverin John Kendrew n Ann Arborin kokouksessa ja suositteli Watsonia Cambridgen ryhmään, joten Watson matkusti Englantiin tapaamaan Max Perutzia, jolle John Kendrew oli jo USA:sta kirjoittanut W:n tulosta. Seuraavana aamuna Watson tapasi myös Cavendish laboratorion johtajan, Sir Lawrence Braggin, joka antoi hänelle luvan päästä laboratorion kristallografiryhmään. Stipendilautakunta Washingtonissa ei aluksi Francis Harry Compton Crick suostunut Englantiin muuttoon varsinkaan uudelle alalle, josta James Watson ei tiennyt James Dewey Watson 1953 juuri mitään, vaan tarjosi Watsonille Casperssonin laboratoriota Tukholmassa. Lopulta Watson pääsi siirtymään kasvivirologi Roy Markhamin, Lurian ja Kendrewn avulla Cambridgeen muka osittain virustutkimukseen. Cavendish Labissa James Watson työtoverikseen Francis H.C. Crickin, joka myös oli tietoinen DNA:n
Veikko Sorsa: PERINNÖLLISYYSTIETEEN HISTORIAA V 3 rakenteen tärkeydestä. Pian he tulivat tulokseen, että uuden mallin rakentaminen oli välttämätön tie rakenteen ymmärtämiselle. Malleja kehittelemällä Linus oli juuri ratkaissut alfakierteen Braggin ja Perutzin harmiksi. Francis Harry Compton Crick (s.1916) B.Sc. University College Lontoo, fysiikka; Amiraliteetin Res. Lab. magneettisten ja akustisten miinojen suunnittelijana, suuntautui sodan jälkeen molek. rakenteen tutkimukseen, pyrki J.D. Sage Bernal in kristallografiryhmään (Birbeck College) Lontoossa, mutta päätyi sitten Max Perutzin, John Kendrew n työtoveriksi Cavendish-laboratorioon Cambridgeen, jossa hän valmisteli väitöskirjaa proteiinien kristallografiasta, kun Watson ilmestyi ryhmään 1951. DNA:n kaksoiskierremalli (WCmalliksi niihin aikoihin usein pilkallisestikin kutsuttu, ehkä myös ensimmäisen epäonnistuneen 3- runkoyrityksen takia) valmistui n. 18 kuukauden kokeilujen jälkeen maaliskuun lopussa 1953, ja ensimmäinen julkaisu ilmestyi Naturessa 25.4.1953. Sitä seurasi myös Naturessa toinen pitempi artikkeli ja Randallin ryhmän artikkeli röntgendiffraktiokokeiden tuloksista. Watson piti esitelmiä mm. Cold Spring Harborin Symposiassa kesäk. 1953, aihe otettiin mukaan vaikka vuorossa oli virus-symposia. Myöhemmin James Watson esitelmöi rakenteesta myös Kaliforniassa. Crick siirtyi USA:han työskennellen 1953-54 Brooklyn Polytech:issä. Myöhemmin F.C. vieraili useiden USA:n ryhmien avustajana työkennellen mm. Alex Rich in (MIT), M.Nirenbergin (NIH, Bethesda,Md)) ym. kanssa, ja Englannissa Crick alkoi kokeet kolmikkokoodin lukemistavan selvittämiseksi Lesley Orgelin,Sidney Brennerin ym. kanssa. Mathew Meselson ja Franklin Stahl todistamaan, että ainakin bakteeri- DNA:ssa replikaatio on semikonservatiivinen. Jo edellisenä vuonna kromosomien kahdentumisesta oli saatu DNA:ta (H3-tymidiinillä) leimaamalla oli saatu samanlaisia tuloksia (Taylor, Woods & Hughes 1957). Frank Stahlin ja Matt Meselsonin kokeissa tulos oli niin vakuuttava, että semikonservatiivinen malli katsottiin todistetuksi. DNA:ta mallijuosteen mukaisesti syntetoiva entsyymi (ensimmäinen DNA-polymeraasi, jota Lesley Orgel ja Francis Crick jo varhain epäilivät repair-tyyppiseksi) löydettiin jo 1955-6 (Arthur Kornberg, Wash. yliopisto, St. Louis, Missouri ja Stanford Univ.), ja samoina vuosina Severo Ochoa ja Marianne Grunberg-Manago (NY Univ. Medical School) onnistuivat syntetoimaan RNA:ta. Polymeraasiketjureaktion (PCR) keksi sattumalta Arthur Kornberg E Semikonservatiivinen replikaatio Kaksoiskierremallin eräs keskeinen idea on semikonservatiivisen kahdentumisen periaate l. replikaatiossa vanhat juosteet säilyvät ehjinä ja toimivat malleina uusille juosteille, jotka rakentuvat nukleotideistä emästunnistuksen mukaisesti. Muitakin replikaatio-malleja (konservatiivinen, dispersiivinen) pidettiin aluksi mahdollisina. Cal Techissa Jerome Vinograd ym. kehittelivät ns.gradienttisentrifugaatiota, jota käyttäen Franklin W. Stahl ja Matthew Meselson 1958 onnistuivat Severo Ochoa
Veikko Sorsa: PERINNÖLLISYYSTIETEEN HISTORIAA V 4 vasta 1986 Kary B. Mullis työskennellessään Cetus Corporationin palveluksessa ollessaan Univ. of Calif.:ssa, San Franciscossa; (Nobel-palkittu Mullis on nykyisin yksityinen konsultti La Jollassa). F Transskriptio ja translaatio Sytokemiallisin värjäyksin RNA:n syntyminen tumassa ja vaeltaminen ulos sytoplasmaan oli havaittu jo 1940-luvulla ja myöhemmin osoitettu myös H3- uridiini-markkerilla. Jerard Hurwitz ja J.J. Furth kokeilivat St.Louisissa (Washington Univ. School of Med.) RNA-RNA-synteesiä, mutta osoittatui, että RNA vaatii DNA-mallin l. primerin, siis RNA syntyy DNA:n kopiona. A. Stevens (St. Louis) ja S.B. Weiss Univ. Chicago) totesivat DNA---> RNA - synteesin. Elliot Volkin ja Lazarus Astrachan (Natl.Lab.Oak Ridge,Tenn.) havaitsivat bakteereissa fagi-injektion jälkeen virus-rna:n synteesiä, mutta RNA:n merkitys oli edelleen James Watsonin hokeman (DNA makes RNAmakes protein) varassa, jonka Crick myöhemmin formuloi ja esitti Central Dogma-nimellä eräässä esitelmässään (Soc. Experimental Biol.,London, 1957). Toisaalta tutkittaessa aminohappojen aktivaatiota 1953-56 havaittiin (Mahlon B. Hoagland, Paul C. Zamecknik, Mary Louise Stephenson ja Jesse F. Scott, Huntington Hosptl. ja Harvard Med. School, Boston, Mass.), että juuri ennen liittymistään polypeptidiksi aminohapot olivat kiinni pienessä, liukoisessa RNA:ssa, joka myöhemmin sai nimen transfer-eli siirtäjä-rna. G RNA-tie club, puuttuva messenger ja triplettikoodi Neljän nukleotidityypin ja 20 aminohapon yhteys tuotti päänvaivaa tutkijoille. Kuitenkin jo varsin varhaisessa vaiheessa tuli esille sekundaarinen triplettikoodi RNA:n ja proteiinien välillä: Dounce esitti jo 1952 hypoteesin, että kolme viereistä emästä RNA:ssa voi vastata ja koodata yhtä aminohappoa (Enzymologia 15.). Dounce arveli myös, että RNAtemplaatin rakenne voi olla säilöttynä DNA:ssa (ks. Martinas Ycas:The Biological Code, 1969). Kaksoiskierremallin tultua valmiiksi kävi selväksi, että yksi juoste sivulla olevine emäksineen muodostaa kirjainjonon sekä DNA:ssa että RNA:ssa, ts. siihen sisältyy geneettinen koodi, jonka yksiköille Sydney Brenner keksi nimen CODON. Keskeinen pulma oli, miten codonit muodostetaan. Näytti ilmeiseltä, että ne ovat yhtä pitkiä. Erilaisten aminohappojen luku määräsi miten monta erilaista codonia pitää olla. Heti DNA-mallin tultua julki 1953 venäl.-amer. kosmologi George Gamow päätyi 20 aminohapon luetteloon, kuten myös monet muut. Myös Sangerin meneillään ollut analyysi insuliinin rakenteesta tuki tätä käsitystä. Gamow alkoi pohtia myös koodia. Kesällä 1954 Jim Watson ja Francis Crick olivat 3 viikkoa Woods Holen meribiologisella asemalla, jossa myös Gamow vietti kesää Albert Szent-Györgyin huvilassa. Koodin pohtimiseksi Geo Gamow perusti RNA Tie Club-nimisen kerhon, jossa oli 24 jäsentä (20 ahjäsentä ja 4 nukleotidi-jäsentä). Seura ei koskaan kokonaisuudessaan kokoontunut, mutta se kierrätti jäsentensä kirjoituksia. Niissä tuli esille mm. ajatus adapteri RNA:sta (t-rna!), messenger-rna:sta, jonka aluksi oletettiin olevan ribosomi-rna:ta, ja kolmikkokoodista. Kokeellinen ratkaisu alkoi Marshall W. Nirenberg in ja J. Heinrich Matthaein (NIH,Bethesda) tutkimuksista poly-u-lähetillä,joka tuotti pelkkää fenyylialaniinia popypeptidiin (esitelmä Moskovan Biokem. Konf. 1961). Jatkossa Nirenberg, Gobind Khorana (Madison, Wisc.) ja Severo Ochoa ryhmineen selvittivät kaikkien kolmikkojen merkitykset translaation aloitus- ja lopetusmerkkeineen. Seymour Benzer in T4-fagin mutaatiokantojen avulla Francis Crick, Lesley Barnett, Sydney Brenner, Richard J. Watts-Tobin ja Robert Shulman osoittivat 1961 miten koodi luetaan ja miten nukleotidien poistot tai lisäykset vaikuttavat lukuraamiin. PaJaMo-ryhmän kokeet (Arthur Pardee, Jacob ja Monod) kumosivat hypoteesin, että ribosomi- RNA on samalla messenger. Francois Jacob & Jaques Monod olettivat erillisen messengerin, joka on hetken kiinni ribosomeissa, tällainen löydettiinkin monella taholla: mm. S. Brenner, F. Jacob, M. Meselson (Cal Tech), F. Gros, W. Gilbert, H. Hyatt, C.G. Kurland ja J.D. Watson (Harvard). Informaation kulku geenistä proteiiniksi tuli siten pääpiirteissään Sydney Brenner 1954 ja n.1990
Veikko Sorsa: PERINNÖLLISYYSTIETEEN HISTORIAA V 5 selvitetyksi 1967. Robert W. Holley selvitti hiivan alaniinin siirtäjä-rna:n rakenteen ja vastaavan geenin. J. Beckwith, Nancy Maizels ym. eristivät ja EMkuvasivat lac-operonin alueen bakteerin DNA:sta. Benno Müller-Hill, Allan Maxam ym. onnistuivat kuvaamaan elektroni-mikroskoopilla myös lacoperoniin kiinnittyneen repressori-molekyylin. Robert W. Holley H Yleistä henkilö- ja tapahtumahistoriaa 1869 Friedrich Miescher löysi nukleiinin, josta nukleiinihappotutkimus alkoi 1910 Albert Kossel sai Nobel-palkinnon nukleiinihappotutkimuksistaan 1914 Robert Feulgen kehitti DNA-värjäyksen 1930-luvulla tetranukleotidimalli vakiintui 1944 Oswald Avery, Colin MacLeod ja Maclin McCarty: Geeni = DNA 1950 Erwin Chargaff: Emäksiä parittain yhtäpaljon A=T; G=C 1953 J.D. Watsonin ja F.H.C.Crickin kaksoiskierremalli; M. Wilkins, R. Franklin ym. vahvistavat mallin vastaavan röntgentuloksia DNA-kiteistä 1961- Kolmikkokoodi selvitetään, Messenger-RNA löytyy 1962 Nobel-palkinnot Crick, Watson ja Wilkins 1965 Robert Holley selvitti alaniinin s-rna:n sekvenssin hiivasta 1966-8 Crick esitti wobble-hypoteesin koodin degeneraatiosta, W. Gilbert ja B. Müller-Hill löysivät lac-repressorin, Khoranan ryhmä sevitti koodin, R. Okazaki löysi replikaatiokatkot 1968 R. Holley, G. Khorana ja M. Nirenberg saivat Nobel-palkinnon Jonathan Beckwith