111111111111111111!111!1119!1111111111111

111111111111111111!111!1119!1111111111111 (12) PATENTTIJULKAISU PATENTSKRIFT (10) FI B SUOMI-FINLAND (FI) Patentti- ja rekisterihallitus Patent- och registerstyrelsen (73) Haltija - Innehavare (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats 15.11.1999 (51) Kv.lk.6 - Int.k1.6 A 61K 39/02, 39/09, 31/70 (21) Patenttihakemus - Patentansökning 914564 (22) Hakemispäivå - Ansökningsdag 27.09.1991 (24) Alkupäivä - Löpdag 27.09.1991 (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig 29.03.1992 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet 28.09.1990 US 590649 P 1. American Cyanamid Company, One Cyanamid Plaza, Wayne, NJ 07470, USA, (US) (72) Keksijä - Uppfinnare 1. Porro, Massimo, 97 Via Selvapiana, Rapolano Terme, Siena 53040, Italy, (IT) (74) Asiamies - Ombud: Kolster Oy Ab, Iso Roobertinkatu 23, 00120 Helsinki (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benåmning Menetelmä konjugoidun oligosakkaridin valmistamiseksi Förfarande för framstållning av en konjugerad oligosackarid (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer (57) Tiivistelmå - Sammandrag Keksintö kohdistuu parannettuun menetelmään oligosakkaridikonjugaattirokotteiden valmistamiseksi. Lisäksi keksinnön mukaisesti tuotetaan oligosakkaridirokotteita, jotka aiheuttavat monospesifisen ja homogeenisen immuunivasteen kapselipolysakkarideille. Eräs keksinnön spesifinen suoritusmuoto tuottaa rokotteita, joilla aikaansaadaan immuniteetti Streptococcus pneumoniae -bakteerin yleisimpiä serotyyppejä vastaan. Föreliggande uppfinning avser ett förbät-- trat förfarande för framställning av oligoxackaridkonjugatvaccin. Uppfinningen avser även framställning av oligosackaridvaccin, vilka uppvisar ett monospecifikt och homogent immungensvar gentemot kapsulär polysackarid. En specifik utföringsform enligt uppfinningen ger vaccin som inducerar immunitet gentemot mot vanliga serotyper av Streptococcus pneumoniae.

1 Menetelmä konjugoidun oligosakkaridin valmistamiseksi Sisällysluettelo 10 15 5 1. 2. 3. 4. 20 5. 25 30 6. Johdanto Keksinnön tausta 2.1. Streptococcus Pneumoniaen aiheuttamat taudit 2.2. Pneumokokkirokotteet 2.3. Konjugoidut rokotteet 2.3.1. Intaktit kapselipolysakkaridit rokotteen antigeenina 2.3.2. Kantajaproteiinien käyttö hapteenien antiseerumin valmistamiseksi 2.3.3. Konjugaatteja sisältävät rokotteet 2.3.4. Menetelmä konjugaattirokotteiden valmistamiseksi Keksinnön lyhennelmä 3.1. Lyhenteet ja määritelmät Kuvioiden suppea kuvaus Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 5.1. Oligosakkaridien valmistaminen 5.2. Oligosakkaridien aktivointi 5.3. Oligosakkaridien konjugointi proteiineihin 5.4. Glykokonjugaattien immunokemiallinen luonnehdinta 5.5. Rokotteen formulointi ja antomuoto 5.6. Oligosakkaridikonjugoitujen rokotteiden käyttökelpoisuus Esimerkki: Monivalenttikonjugoidun pneumokokkioligosakkaridirokotteen kehittäminen 6.1. Polysakkaridin valmistaminen 6.2. Polysakkaridin hydrolysoiminen

2 5 10 15 20 25 30 6.3. 6.4. 6.5. 6.6. 6.7. 6.8 6.2.1. S. Pneumonmiae -tyyppi 6A:n polysakkaridin hydrolysoiminen 6.2.2. S. Pneumoniae -tyyppi 14:n polysakkaridin hydrolysoiminen 6.2.3. S. Pneumoniae -tyyppi 19F:n polysakkaridin hydrolysoiminen 6.2.4. S. Pneumoniae -tyyppi 23F:n polysakkaridin hydrolysoiminen S. Pneumonie -oligosakkaridihapteenien immunokemiallinen luonnehdinta S. Pneumoniaen oligosakkaridien päätypelkistinyksikön aktivoiminen Aktivoidun oligosakkaridin konjugoiminen CRM 197 -proteiiniin 6.5.1. CRM 197 -proteiinin valmistaminen 6.5.2. Aktivoitujen oligosakkaridien konjugoiminen 6. 5. 2. 1. Konjugoinnin tehokkuuden vertailu, kun liittäjänä on käytetty adipiinihapon sukkinimidyylidiesteriä tai meripihkahaponsukkinimidyylidiesteriä S. Pnemoniaen glykokonjugaattien immunogeenisyys Oligosakkaridit, joiden ketjun pituus on DP 10-20, ovat suboptimaalisesti immunogeenisiä Immuunivaste glykokonjugaateille on monospesifinen ja homogeeninen

3 1. Johdanto Käsillä oleva keksintö koskee parannettua menetelmää oligosakkaridin ja kantajaproteiinin kovalenttisen konjugaattin valmistamiseksi. Lisäksi huomattakoon, että 5 keksinnön mukaan valmistetaan oligosakkaridirokotteita, jotka saavat aikaan monospesifisen ja homogeenisen immuunivasteen kapselikopolysakkarideille. Keksinnön spesifinen suoritusmuoto tuottaa rokotteita, jotka indusoivat immuniteetin vallitseville Sterptococcus pneumoniaen sero- 10 tyypeille, mikä saattaa olla tärkeätä niin lapsipotilaiden kuin myöskin vanhojen potilaiden ja sellaisten potilaiden kohdalla, joilla on alentunut immuniteetti heikosta kunnosta tai sairaudesta johtuen (kuten esimerkiksi AIDS-potilailla). 15 2. Keksinnön tausta 2.1. Streptococcus pneumoniaen aiheuttamat taudit Pneumokokki (Streptococcus pneumoniae) on gram-positiivinen kapseloitunut kokki, joka tavallisesti kasvaa parittain tai lyhyinä ketjuina. Diplokokkimuodolla ovat 20 vierekkäiset reunat pyöristyneet ja vastakkaiset päät hei- kosti terävät antaen sille lansetin muodon. Pneumokokit voidaan jakaa eri serotyyppeihin kapselia muodostavien monimuotoisten polysakkaridien perusteella. On voitu tunnistaa 84 eri serotyyppiä käsittelemällä 25 niitä tyyppispesifisillä antiseerumeilla, Neufeldin reaktiolla. Kaikki aiheuttavat ihmiselle tauteja, mutta tyyppejä 1, 3, 4, 7, 8 ja 12 tavataan yleisimmin kliinisessä käytännössä. Tyypit 6, 14, 19 ja 23 aiheuttavat usein pneumonian ja välikorvan tulehduksen lapsilla, mutta ovat 30 aikuisilla harvinaisempia (Austrian, "Harrison's Principles of Internal Medicine", Petersdorf et al., eds. 10. painos, McGraw Hill Book Co., New York (1983) ss. 918-922). Pneumokokki on selvästi yksi kolmesta lasten keuhkokuumeen, verenmyrkytyksen ja aivokalvontuleh- 35 duksen ensisijaisesta aiheuttajasta (mcmillan, Core text-

4 books of Pediatrics, Kaye et al., eds. toinen painos (1982), s. 498, J.B. Lippincott Co, Philadelphia). 2.2. Pneumokokkirokotteet Potilaat, joilla on jokin krooninen systeemisai- 5 raus, kuten sydäntauti, krooninen keuhkoihin ja keuhkoputkeen liittyvä tauti, maksatauti, munuaisen vajaatoiminta ja sairaus ovat yksilöitä, joilla on keskimääräistä suurempi riski kehittää pneumokokki-infektioita. Näiden henkilöiden rokottaminen pneumokokki-infektiota vastaan on 10 suositeltavaa. Tähän tarkoitukseen on saatavilla kaksikymmentäkolme rokotetta (Pneumovax R Merck, Sharp & Dohme, Pnulmmune R, Lederle Laboratories), jotka sisältävät pneumokokkityyppien 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, ja 15 33F kapselipolysakkaridia (jotka käsittävät serotyyppejä tai ryhmiä, jotka aiheuttavat 90 % Yhdysvaltojen ja muun maailman vakavista pneumokokkitaudeista). Tämän rokotteen teho lapsiin on kyseenalainen, koska alle kuuden vuoden ikäisillä lapsilla kyky osoittaa immunologista vastetta 20 eri kapseliantigeeneille kehittyy eri aikaan johtuen immuunijärjestelmän kypsymisen luonteesta ja suoja voi olla lyhytaikaisempi kuin aikuisilla havaittu. (Harrison et al., ibid). Vaikka suhteellisen harvojen pneumokokkiserotyyppien uskotaan olevan useinten lasten pneumokokki- 25 infektioiden aiheuttajia (Gray et al., J. Infect Disease 140, (1979) 979-983), ovat ne tyyppejä, joilla humaanin vasta-ainevasteen kypsyminen rokotteina käytettyjä puhdistettuja kapselipolysakkarideja vastaan on hitain (Anderson ja Betts, Pediatric Infec. Dis. J. 8 (1978) S50 - S53; 30 Borgono et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 157 (1978) 148-154). 2.3. Konjugoidut rokotteet Humaanilasten immuunivaste Haemophilus influenzae b -polysaakkaridille on saavutettu liittämällä kapselian- 35 tigeeni kantajaproteiiniin, jolloin muodostetaan "konju-

5 goitu" rokote; oletetaan kantajaproteiinin indusoineen T-lymfosyytin avustajaominaisuudet ja saaneen aikaan immuniteetin kehittymisen (Robbins et al., "Bacterial Vaccines" Germanier (1984) ss. 289-316, ed. Academic 5 Press, New York). Katso myös: Cruse ja Lewis, Karger, Basel, (1989) ss. 1-10. Pneumokokkirokotteiden valmistamista käsitellään vastaavasti. 2.3.1. Intaktit kapselipolysakkaridit rokotteen antigeenina 10 Eri tutkijat ovat eristäneet ja puhdistaneet intaktikapselipolymeerejä, jotka voivat olla käyttökelpoisia rokotteissa tai rokotteina. Esimerkiksi US-patentissa 4 220 717 esitetään menetelmä immunologisesti aktiivisen polyribosyyliribitolifosfaatin (PRP) eristämiseksi ja 15 puhdistamiseksi H. influenze b:n kapselipolymeeristä. Lisäksi US-patentti 4 210 641 käsittelee H. influenzen polysakkaridiuutteita, joiden todettu molekyylipaino on yli 200 000 D ja jotka pääasiallisesti koostuvat galaktoosista, glukoosista ja mannoosista ja sisältävät pienen 20 määrän osamiineja. Monet tutkijat ovat formulaateissa käyttäneet hyväkseen näitä ja muita kapselipolymeerejä saadakseen aikaan parempia immunovasteita. Esimerkiksi US-patentissa 4 196 192 kuvataan rokote, joka sisältää puhtaan intakti 25 PRP:n ja kokosolu Bordetella pertussis -rokoteformulaatin. Tämä lisääntyneen immunogeenisyyden saavuttaminen johti nuorten nisäkkäiden anti-prp- ja anti-pertussis-vastaaineiden kohonneisiin tasoihin. 2.3.2. Kantajaproetiinien käyttö hapteenien anti- 30 seerumin valmistamiseksi Kantajaproteiinit voivat tehdä enemmänkin kuin korostaa konjugoitujen kapselipolymeerien immunogeenisyytta; ne voivat myöskin saattaa hapteenit immunogeenisiksi. Hapteenit määritellään molekyyleiksi, jotka voivat spesifi- 35 sesti sitoutua vasta-aineeseen tai lymfosyyttireseptoriin,

6 mutta jotka eivät itse indusoi immuunivastetta (s.o. ne eivät ole immunogeenisia). Immuunivasteen aikaansaamiseksi pienten/alhaisen molekkyylipainon tai heikosti immunogeenisten molekyylien, joita kutsutaan hapteeneiksi, tulee 5 yleensä ensin liittyä suurempaan molekyyliin tai kantajaan, joka yleensä on heterologinen proteiini. Hapteenikantaja-kompleksin injisoiminen eläimeen saa aikaan B-lymfosyyttien vasta-aineiden tuotannon, joista jotkut pystyvät spesifisesti sitoutumaan vapaaseen, situotumattomaan 10 hapteenimolekyyliin. Varhaisimpia tutkittuja hapteeneja olivat atsoväriyhdisteet, kuten aniliini ja o-aminobentsoehappo. Landsteiner ja Lampl (Z. Immun. Forsch. 26 (1918) 293) liittivät näitä yhdisteitä diatsotoimalla seerumin proteiinei- 15 hin. Kun näitä keinotekoisesti valmistettuja atso-proteiineja injisoitiin, muodostivat kanit presipitaatiovastaaineita, jotka olivat spesifiset liitetylle kemialliselle osalle. Muita hapteeniyhdisteiden esimerkkejä ovat dinit- 20 rofenoli, josta tulee immunogeeninen, kun se dinitrofenyyli(dnp)ryhmänä liitetään naudan seerumialbumiiniin tai naudan gammaglobuliiniin (BGG), ja lysergiinihappodietyyliamidi. Myös formaldehydi on osoittanut hapteenikäyttäytymistä; henkilöt, joita on altistettu eri tuotteista tai 25 laboratoriosta saaduille formaldehydihöyryille, ovat herkistyneet tälle yhdisteelle seuraksena niiden endogeenisesta makromolekyylimuodostuksesta in vivo. Hapteenitoiminta ei rajoitu pieniin orgaanisiin molekyyleihin, ja polypeptidihormonit aina insuliinin ko- 30 koon asti ovat usein heikosti, jos lainkaan, immunogeenisiä. Jotta näille hormoneille saataisiin korkeat vasta-ainetiitterit, on siis tarpeen konjugoida ne kantajamolekyyliin (tai luoda suurempia molekyylejä ristiinsitomalla yhteen useita näitä polypeptidejä).

7 Kantajamolekyylin osuus on erityisen kiinnostava siitä syystä, että kantaja toimii enemmän kuin pelkästään siirtäjänä. Ovary ja Benaceraff (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 114 ( 1963) 114-723) osoittivat tämän ruiskuttamal- 5 la kaniin DNP-BCG:tä. Useiden immunogeenisten aineiden ruiskuttaminen eläimiin synnyttää altistuksen immunologisen "muistin". Kun myöhemmin annetaan toinen ruiske, saadaan näin paljon rajumpi immuunivaste. Näin, kun Ovary ja Benaceraff ruiskuttivat uudelleen DNP-BCG:tä, saatiin voi- 10 makas sekundaarinen vasta, jonka seurauksena oli DNP:n ja BCG:n vasta-aineden selvästi kohonneet tasot. Mutta kun toinen ruiske annettiin DNP-muna-albuminiilla, havaittiin paljon heikompi anti-dnp-vasta-ainevaste. Ero vasteessa johtui niin sanotusta kantaja-efektistä, ja se ilmeisesti 15 liittyy avustaja-t-lymfosyytteihin. Alustavat merkit viittaavat siihen, että kaikki proteiinit eivät ole yhtä tehokkaita annetun hapteenin kantajaproteiineja. Robbins et al. (Infect. Immun. 40, 245-256) esittävät tuloksia kokeellisista proteiini- 20 polysakkaridikonjugaattirokotteista, joissa sama polysakkaridihapteeni oli konjugoitu eri proteiinikantajiin ja vasta-ainevaste hapteenille määritettiin. Havaittiin merkittäviä eroja muodostetun anti-hapteenivasta-aineen määrässä, mikä osoittaa kantajan keskeistä tehtävää. 25 Kiinnittäen erityisen huomion pneumokokkirokotteisiin Lin ja Lee (Immunology 46 (1982) 333) tutkivat immuunivastetta, kun aikuiset ja nuoret hiiret altistettiin tyyppi 6A- ja 19F-polysakkarideille samoin kuin proteiinin konjugoidulle 19F:lle. Hiirille, jotka olivat saaneet 19F 30 polysakkaridi-proteiinikonjugaatteja, aiheutettiin merkittävästi korkemmat IgM ja IgG2-vasta-ainetiitterit kuin kontrolliryhmälle, joka oli saanut pelkästään 19F-polysakkaridia.

8 2.3.3. Konjugaatteja sisältävät rokotteet Muut tutkijat ovat tutkineet kapselipolymeerien konjugoimista kantajaproteiineihin tarkoituksena edistää vasta-aineen muodostumista niin sanotun "kantaja-efektin" 5 avulla. Esimerkiksi Scheerson et al. (Journal. of Experimental Medicine 152 (1980) 361-376) kuvaa H. influenzae b:n polymeeri-proteiinikonjugaatteja, joilla osoittautui olevan kyky suoda immuniteetti H. influenzae b:n aiheuttamia tartuntatauteja vastaan. Viitteessä esitetään kapseli- 10 polymeerien iästä riippuvaa vaikutusta lapsiin ja pyritään voittamaan tämä ikäriippuvuus konjugoimalla intakti kapselipolymeeri useihin eri proteiineihin, m.m. seerumialbumiineihin, Limulus polyphemus hemocyanin- ja difteriatoksiiniin. Konjugointimenetelmässä tarvitaan liittämisainet- 15 ta, kuten esimerkiksi adipiinidihydratsidia. Geyer et al., Med. Microbiol. Immunol. 165 (1979) 171-288, konjugoi tiettyjä Klebsiella pneumoniaen kapselipolysakkaridin fragmentteja nitrofenyylietyyliamiinisitojaan pelkistävän aminoinnin avulla, ja saatu sokerijoh- 20 dos liitettiin sitten proteiineihin atsosidoksella. Mclnterin US-patentti 4 057 685, jonka hakemus on jätetty 9.5.1974, koskee Escherichia colin heikennetysti myrkyllistä lipopolysakkaridia, joka on kovalenttisesti halosyylihalidireaktion välityksellä sidottu proteiinian- 25 tigeeniin. Jennings et al.'n US-patentti 4 356 170, jonka hakemus on jätetty 27.5.1981 ja patentti myönnetty 26.10.1982 koskee polysakkaridi-proteiinikonjugaattien valmistusta pelkistävän aminoinnin avulla. 30 Anderson (Infection and Immunity 39 (1983) 233 -.- 238) käsittelee Haemophilus influenzae tyyppi b:n kapselipolysakkaridin oligosakkaridien ja CRM 197 :n, joka ei ole myrkyllinen, mutta on difteriatoksiinin antigeenisesti identtinen variantti, välistä konjugointia.

9 Snippe et al. (Infection and Immunity 42 (1983) 842-844) käsittelee puolisynteettistä rokotetta Streptococcus pneumoniae -tyyppi 3:a vastaan, jossa kapselipolysakkaridi S3:sta osittaisella happohydrolyysillä eristetty 5 heksasakkaridi oli sidottu steryyliamiinin pelkistävän aminoinnin avulla ja sitten liitetty liposomeihin. Saadun konjugaatti/liposomirokotteen todettiin antavan suojan S. pneumoniae -tyyppi 3:a vastaan hiirissä. Tsay et al.'n US-patentti 4 663 160, jonka hakemus 10 on jätetty 14.3.1983 ja patentti myönnetty 5.5. 1987, koskee bakteereja, joissa gram-negatiivisen bakteerin myrkyttömäksi tehty polysakkaridi on kovalenttisesti sidottu saman gram-negatiivisen bakteerilajin myrkyttömäksi tehtyyn proteiiniin 4-12 hiililiitoksella. 15 Gordonin US-patentti 4 619 828, jonka hakemus on jätetty 5.1.1984 ja patentti myönnetty 28.10.1986, koskee patogeenisten bakteerien, kuten Haemophilus influenzae b, Streptococcus pneumonieae, Neisseria meningitidis ja Escherichia coli, polysakkaridimolekyylien ja T-soluista 20 riippuvien antiageenien, kuten kurkkumätä- ja jäykkäkouristustoksoidien välisiä konjugaatteja. Andersonin ja Clementsin US-patentti 4 808 700, jonka hakemus on jätetty 10.8.1984 ja myönnetty 28.2.1989 ja Andersdonin US-patentti 4 761 283, jonka hakemus on 25 jätetty 28.3.1986 ja patentti myönnetty 2.8.1988, koskevat kapselipolymeerien fragmenttien kovalenttista kiinnittymistä bakteerien toksiineihin, toksoideihin tai sidososasiin pelkistävän aminoinnin avulla. Porro et al.'n US-pantentti 4 711 779, jonka hake- 30 mus on jätetty 2.7.1986 ja patentti myönnetty 8.12.1987, -;. koskee glykoproteiinikonjugaattirokotteita, joilla on tri- valentti immunogeeninen vaikutus ja joita ovat gram-positiivisen ja gram-negatiivisen bakteerin kapselipolysakkaridien antigeeniset determinantit samoin kuin joko CRM 197, 35 tetanustoksoidi tai hinkuyskätoksiini.

1 0 2.3.4. Menetelmä konjugaattirokotteiden valmista- miseksi Konjugaattirokotteiden, joissa kapselipolysakkaridihapteenit sidotaan kantajaproteiineihin, valmistaminen 5 käsittää seuraavat vaiheet: (i) valmistetaan kapselipolysakkaridi, (ii) jos käytetään polysakkaridifragmenttia, erotetaan se intaktipolysakkaridista, (iii) aktivoidaan sakkaridi tai saatetaan se konju- 10 goitiin soveltuvaksi, s.o. luodaan kohdat, jotka pystyy kovalenttisesti sitoutumaan proteiiniin, (iv) sakkaridi konjugoidaan proteiiniin. Taulukossa 1 esitetään eri tunnettuja menetelmiä näiden neljän vaiheen suorittamiseksi.

Taulukko I Viite Polysakkaridin Polysakkaridin Polysakkaridin Konjugointi valmistaminen pilkkominen aktivointi proteiiniin US-patentti nro Aldehydiryhmien Pelkistävä ami- 4 356 170, Jennings, luomiseksi käy- nointi syanibooanomus jätetty tetty perjodi- rihydridillä 27.5.1981, myönnet- happoa ty 25.10.1982 US-patentti nro Aldehydiryhmien 4-12 hiilen osuus 4 663 160, Tsay et luomiseksi käy- sidotaan proteiial., anomus jätet- tetty perjodi- niin kondensoivan ty 14.3.1983, happoa aineen, esim. karmyönnetty 5.5.1987 bodi-imidin läsnäollessa 2) Polysakkaridi sidotaan proteiiniin, johon on derivatoitu 4-12 hiilen osuus Schiffin emäsreaktion välityksellä pelkistävän aineen, esim. syaniboorihydridin läsnäollessa US-patentti nro Polysakkaridit Syanogeenibro- Konjugointi 4-8 4 619 828, Gordon, säädetty lämpö- midi hiiliatomin välikeanomus jätetty käsittelyllä sillan avulla samal- 5.1.1986, myönnet- molekyyliko- la tavalla, kuin se ty 28.10.1986 koon 200 000 - olisi proteiinin adi- 2 000 000:n D:n piinihappohydratsidivälille johdoksessa

Taulukko I (jatkuu) Viite US-patentti nro 4 808 700, Anderson ja Clements, anomus jätetty 10.8.1984, myönnetty 28.2.1989 Polysakkaridin Polysakkaridin Polysakkaridin Konjugointi valmistaminen pilkkominen aktivointi proteiiniin Lukuisia menetelmiä käytetty Konjugointi peltuottamaan antigeenisiä frag- kistävän aminoinmentteja, joissa on vähintäin nin avulla syaniyksi pelkistyvä pää, esimer- boorihydridin läskiksi osittainen hapettava pilk- näollessa (noin kominen perjodaatilla, hydrolyy- 2-3 viikkoa) si glykosidaaseilla tai happohydrolyysi Luku 6.5. yllä: Tanskalainen Happohydrolyysi 0,1 N HC1:ssa Konjugointi CMR. -ään Streptococcus Pneu- tyyppi 6A, 10 minuuttia 100 C:ssa luomaan fosfaattipuskur 1. 97 iss a moniaen kapselin Eli & Lilly Co pelkistäviä fragmentteja natriumsyaniboorihydpolymeerifragment- ridiä käyttäen 18 vrk:n tien konjugoiminen ajan 37 C:ssa CRM :ään 197 I1 US-patentti nro 4 711 779', Porro ja Costantino, anomus jätetty 2.7.1986, myönnetty 8.12.1987 Happohydrolyysi Aktivoitu tuo- Konjugointi toksoidiin 100 C:ssa 6 - malla primaari- orgaanisen liuottimen, 40 tuntia. So- sia aminoryhmiä esim. dimetyylisulfokpivilla haptee- terminaalisiin sidin läsnäollessa neilla on 1 000 - pelkistyviin ryh- 2 000:n D mole- miin (esim.'käytkyylipaino täen syanoboorihydridiä), jota seuraa esterien konversio (esim. adipiinihåppojohdosten läsnäollessa CD

Taulukko I (jatkuu) Polysakkaridin Polysakkaridin Polysakkaridin Konjugointi Viite valmistaminen pilkkominen aktivointi proteiiniin Streptococcus Happohydrolyysi Aktivoitu ammo- Konjugointi pneumoniae -tyyp- 100 C:ssa 39 niakkisella pus- CRY1 1,07 :ään pi 6A tuntia kurilla natrium- dime.eyylisyaniboorihydri- sulfoksidin din läsnäollessa läsnäolles- (primaaristen sa huoneenaminoryhmien lämpötilassa liittämiseksi) 15 tunnin kanden viikon ajan ajan; konvertoitu 4 tunnin ajan vastaaviksi monofunktionaalisiksi estereiksi dimetyylisulfoksidin vesiliuoksessa, joka sisältää adipiinihapon disukkinimidyyliesteriä O O ON

14 3. Keksinnön lyhennelmä Käsillä oleva keksintö koskee bakteerien kapselipolysakkarideista saatujen oligosakkaridien kovalenttista liittämistä kantajaproteiineihin uutta menetelmää käyttäen. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. Tämä menetelmä mandollistaa glykokonjugaattien tehokkaan,synteesin huomattavasti suuremmilla tuotantonopeuksilla kuin tähän asti käytetyt menetelmät. Keksinnön 10 glykokonjugaatteja voidaan käyttää rokoteformulaatioissa ja ne ovat osoittautuneet immunogeenisiksi. Tässä suoritusmuodossa käsillä oleva keksintö koskee sellaisten glykokonjugaattien valmistamista, jotka sisältävät Streptococcus pneumoniaen kapselipolysakkari- 15 deista saatuja oligosakkarideja. Keksinnön menetelmän tuloksena voidaan tehokkaasti tuottaa korkeita saantoja S. pneumoniaen glykokonjugaatteja, joita voi käyttää rokoteformulaatioissa erityisesti pediatrisessa käytännössä, jossa suuri osa merkittävistä sairauksista liittyy 20 S. pneumoniae -infektioon. Immunogeenisten konjugaattien on todettu olevan vähemmän iästä riippuvia kuin kapselipolymeerit yksinään ja ne ovat käyttökelpoisia hyvin nuorten lämminveristen nisäkkäiden aktiiviseen immunisointiin vastaavien kapseloituneiden bakteerien aiheuttamia systeemi- 25 infektioita vastaan. Tämän lisäksi keksinnössä on havaittu, että keksinnön glykokonjugaatit yllättäen saavat aikaan monospesifisen ja homogeenisen immuunivasteen, joka voi edullisesti kumota autoimmuunireaktioiden muodostumisen ja niihin 30 liittyvät rokotuksen jälkeiset oireet. On tärkeätä, etteivät keksinnön mukaisesti valmistetut immunogeeniset konjugaatit sisällä potentiaalisesti myrkyllisiä sidosaineita, kuten adipiinidihydratsidia tai p-nitrofenyylietyyliamiinia, joita on käytetty konjugoita- 35 essa hiilihydraatti proteiiniin.

15 3.1. Lyhenteet ja määritelmät CRM137 kurkkumätätoksiinin kanssa antigeenisesti ristireagoiva myrkytön proteiini DMSO dimetyylisulfoksidi 5 DP polymerointiaste (degree of polymeriz.) MIC SD pienin inhiboiva väkevyys (minimun inhib. conc.) substituointiaste (subst. degree) SIDEA adipiinihapon sukkinimidyyliesteri SIDES meripihkahapon sukkinimidyyliesteri 10 4. Kuvioiden suppea kuvaus Kuvio 1: Oligosakkaridiproteiinikonjugaattisynteesin yleinen menettely A. Hydrolysoidaan hapolla suurimolekyyliset polysakkaridit, jotta saataisiin oligosakkarideja, joiden 15 keskimääräinen molekyylipaino on 2,5 x 10'. B. Oligosakkaridit aktivoidaan (1) saattamalla ne reagoimaan diaminoetaanin [H 2N(CH 2 ) 2NH 2 ) kanssa ph 9:ssä, pelkistetään pyridiiniboorihydridillä (PyBH 3 ), sitten (2) annetaan reagoida sukkinimidyylidiesterin ja adipiinihapon 20 (SIDEA) kanssa dimetyylisulfoksidissa (DMSO). C. Aktivoidut oligosakkaridit yhdistetään kantajaproteiiniin lysiinijäännösten avulla. sessä Kuvio 2: Räätälöidyn välikkeen käyttö yhdistämi- 25 A. Edellisen Porro et al.'n (Mol. Immunol. 22 (1985) 907-919) kuvaaman menetelmän mukaisesti muodostettu glykokonjugaatti, jossa on amidisidos (nuoli) oligosakkaridin ja adipiinihapon neljän hiilen sitojan välillä. Välikkeen pituus on noin 10,4 Ä. 30 B. Käsillä olevan keksinnön mukaisesti muodostettu glykokonjugaatti, jossa kanden hiilen jäännös (nuoli, valmistettu diaminoetaanin avulla) ja amidisidos ovat oligosakkaridin ja SIDES:in kanssa reagoimalla saatujen meripihkahapon kanden hiilen sitojien välissä. Välikkeen koko- 35 naispituus on noin 10 Ä.

16 C. Käsillä olevan keksinnön mukaisesti muodostettu glykokonjugaatti, jossa kanden hiilen jäännös (nuoli, valmistettu diaminoetaanin avulla) ja amidisidos ovat oligosakkaridin ja SIDEA:n kanssa reagoimalla saadun adipiini- 5 hapon neljän hiilen jäännöksen välissä. Välikkeen koko- naispituus on noin 14,5 A. Kuvio 3:. CRM,:n konjugointi aktivoituihin oligosakkarideihin, hyötysyhteen vertailu käytettäessä adipiinihappo- tai meripihkahappojohdosvälikkeitä. Konjugaatioi- 10 den reaktiotuotteiden SDS-polyakryyliamidigeelielektrofo- reesi (värjäys hopealla) A. Kaista 1: Molekyylipainostandardit (92,5 K, 66,2 K, 45,0 K, 31,0 K, 21,5 K). Kaista 2: CRM 197 (1 pg) referenssi. 15 Kaista 3: Konjugoitu oligosakkaridi 6A-CRM197, jossa on meripihkahappovälike (2 pg) (suhde 1 : 1, monoesteri/- CRM,:n kokonaisaminoryhmät 50 % DMSO:ssa). Kaista 4: Konjugoitu oligosakkaridi 6A-CRM 197, jossa on meripihkahappovälike (2 pg) (suhde 1 : 2, monoesteri/- 20 CRM 197 :n kokonaisaminoryhmät 50 % DMSO:ssa). Kaista 5: Konjugoitu oligosakkaridi 6A-CRM 197, jossa on adipiinihappovälike (2 pg) (suhde 1 : 2, monoesteri/- CRM 7 :n kokonaisaminoryhmät 50 % DMSO:ssa). Kaista 6: Konjugoitu oligosakkaridi 14-CR/4 197, jossa 25 on meripihkahappovälike (2 pg) (suhde 1 : 4, monoesteri/- CRM" 7 :n kokonaisaminoryhmät 50 % DMSO:ssa). Kaista 7: Konjugoitu oligosakkaridi 19F-CRM197, jossa on meripihkahappovälike (2 pg) (suhde 1 : 4, monoesteri/crm 197 :n kokonaisaminoryhmät ilman 50 % DMSO:ta). 30 Kaista 8: Konjugoitu oligosakkaridi 23F-CRM 197, jossa on meripihkahappovälike (2 pg) (suhde 1 : 2, monoesteri/crm 197 :n kokonaisaminoryhmät 50 % DMSO:ssa). Kaista 9: CRM 197 (1 pg) referenssi.

17 B. Kaista 1: CRM 197 (1 pg) referenssi. Kaista 2: CRM 197 (1 pg eri valmiste-erästä kuin kaista 1:ssä) referenssi. Kaista 3: Konjugoitu oligosakkaridi 23F-CRM 197, jos- 5 sa on adipiinihappovälike (2 pg) (suhde 1 : 2, monoesteri/crm197 :n kokonaisaminoryhmät 50 % DMSO:ssa). Kaista 4: Molekyylipainostandardit (92,5 K, 66,2 K, 45,0 K, 31,0 K, 21,5 K). Kaista 5: Konjugoitu oligosakkaridi 23F-CRM 197, jos- 10 sa on adipiinihappovälike (2 pg) (suhde 1 : 2, monoesteri/crm 197 :n kokonaisaminoryhmät 50 % DMSO:ssa). Kaista 6: CRM 197 (1 pg eri valmiste-erästä kuin kaista 1:ssä) referenssi. Kaista 7: Konjugoitu oligosakkaridi 6A-CRM 197, jossa 15 on adipiinihappovälike (2 pg). C. Kaista 1: Molekyylipainostandardit (92,5 K, 66,2 K, 45,0 K, 31,0 K, 21,5 K). Kaista 2: CRM 197 (1 pg) referenssi. Kaista 3: Konjugoitu oligosakkaridi 6A-CRM 197, jossa 20 on adipiinihappovälike (2 pg). Kaista 4: Konjugoitu oligosakkaridi 14-CRM 197, jossa on adipiinihappovälike (2 pg). Kaista 5: Konjugoitu oligosakkaridi 19F-CRM 197, jossa on adipiinihappovälike (2 pg). 25 Kaista 6: Konjugoitu oligosakkaridi 23F-CRM 197, jossa on adipiinihappovälike (2 pg). Kaista 7: Molekyylipainomarkkerit (92,5 K, 66,2 K, 45,0 K, 31,0 K, 21,5 K). Kuvio 4: Kanin IgG-vaste S. pneumoniae -oligosak- 30 karidi 6A-CRM 197 konjugaateille. Kapselipolysakkarideihin indusoidun IgG-isotyypin affinitettiarvo, inhibitio- ELISA-analyysi. A. Tyyppi 6A kapselipolysakkaridi. B. Tyyppi 6A oligosakkaridi (DP = 10) vapaana tai 35 CRM,:ään konjugoituna.

18 C. Tyyppi 14 oligosakkaridi (DP = 12), joka on aktivoitu molekyylivälikkeellä tai konjugoitu CRM 197 :ään. 5. Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Käsillä oleva keksintö koskee bakteerien kapselipo- 5 lysakkarideista saatujen oligosakkaridien kovalenttista liittämistä kantajaproteiineihin; keksinnön menetelmä luo uusia glykokonjugatteja uudella menetelmällä. Esityksen selventämiseksi, kuitenkaan mitään rajoittamatta, keksinnön yksityiskohtainnen kuvaus jaetaan 10 seuraaviin osiin: 15 dinta Rokotteen formulointi ja antomuoto Oligosakkaridikonjugaattirokotteiden käyttö- (v) (vi) kelpoisuus. (i) Oligosakkaridien valmistaminen (ii) Oligosakkaridien aktivointi (iii) Oligosakkaridien konjugointi proteiiniin (iv) Glykokonjugaattien immunokemiallinen luonneh- 5.1. Oligosakkaridien valmistaminen 20 Suuren molekyylipainon kapselipolysakkaridia voi ostaa kaupallisesti (Amerikkalainen tyyppikokoelma, ATCC, Rockville, MD) tai sitä voi saada Porro et al.'n (J. Biol. Stand. 11 (1983) 65-71) kuvaamilla menetelmillä. Mitä tahansa polysakkaridia voi käyttää, esimerkiksi, mutta 25 tähän rajoittumatta, niitä joita saadaan seuraavien bakteerien kapseleista: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitis, Escherchia coli, Salmonella typhi, Streptococcus mutans, Cryptococcus neoformans, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus ja 30 Pseudomonas aeruginosa. Kapselipolymereistä voi lukuisilla menetelmillä muodostaa antigeenisia fragmentteja, joilla on vähintään yksi pelkistyvä pääte, riippuen kyseisen kapselipolymeerin rakenteellisista ominaisuuksista. Rajattu hapettava pilk- 35 kominen perjodaatilla (tai vastaavilla reagensseilla)

19 tuottaa aldehydipäätteitä; tämä menettely rajoittuu polymeereihin, joiden ketjumaisessa jäännöksessä on läheisyydessä dihydroksiryhmiä. Glykosidisidoksen hydrolyysi tuottaa pelkistävän sokeripäätteen. Tällainen hydrolyysi 5 voidaan mitä spesifisinten suorittaa entsymaattisesti glykosidaasien avulla, mutta tämä tapa rajoittuisi suhteellisen harvoihin kapselipolynmeereihin, esimerkiksi Streptococcus pneumoniae 8 -bakteeriin, jolle tunnetaan glykosidaaseja. Happohydrolyysiä käytetään tavallisesti glykosi- 10 disidosten hydrolyysiin. Tämän tavan käyttökelpoisuus olisi rajoitettu, jos polymeeri sisältää hapolle herkkiä haarasidoksia, jotka ovat antigeenispesifisyydelle tärkeät. Keksinnön spesifisessä suoritusmuodossa S. pneumoniae -tyyppi 6A -bakteerin kapselipolysakkaridi voidaan 15 hydrolysoida noin 10-2 M etikkahapossa noin 100 C:ssa noin 30 tunnin aikana; S. pneumoniae -tyyppi 14:n kapselipolymeeri voidaan hydrolysoida noin 0,5 M trifluorietikkahapossa noin 70 C:ssa noin 7 tunnissa; S. pneumoniae -tyyppi 19 F:n polysakkaridi voidaan hydrolysoida noin 10-2 M 20 etikkahapossa noin 50 C:ssa noin 48 tunnissa ja S. pneumoniae -tyyppi 23 F:n polysakkaridi voidaan hydrolysoida noin 0,25 M trifluorietikkahapossa noin 70 C:ssa noin 3 tunnissa. Keksinnön mukaisesti proteiineihin konjugoitavat 25 oligosakkaridit sisältävät edullisesti kolmesta kuuteen toistuvaa yksikköä (tai kymmenestä kolmeenkymmeneen monosakkaridijäännöstä), ja edullisemmin kolmesta neljään toistuvaa yksikköä (tai noin viisitoista monosakkaridijäännöstä), koska tämän pituiset glykokonjugaattei- 30 hin sisällytetyt oligosakkaridit ovat osoittautuneet optimaalisesti immunnogeenisiksi. 5.2. Oligosakkaridien aktivointi Oligosakkaridit voidaan aktivoida pelkistävällä aminointimenmetelmällä, ja sen jälkeen antamalla reagoida 35 kaksifunktioisen molekyylin, kuten diesterin kanssa, kui-

20 tenkaan tähän rajoittumatta. Keksintö pääpiirteittäin esitetään kuviossa 1 ja kaulukossa II, joka vertaa käsillä olevan keksinnön menetelmää Porro et al.'n (Mol. Immunol. 22 (1985) 907-919) kuvaaman menetelmän kanssa. Huomatta- 5 koon, että edellisessä menmetelmässä aktivointiin käytettiin 7-14 vrk; käsillä olevassa keksinnössä aika on lyhentynyt 15 minuutiksi. Huomattakoon myös, että edellisen menetelmän pelkistämiseen käytetty aika oli 7-14 vrk; nykyisen menetelmän mukaan tämä on lyhentynyt 48 tunniksi. 10 Näinollen käsillä oleva keksintö vaatii 12-26 vrk vähemmän lopputulokseen kuin aikaisempi menetelmä. Tämä on tärkeä etu, koska hiilihydraattien käsittely kohonneissa lämpötiloissa, kuten 50 C:ssa, voi johtaa niiden hajoamiseen.

21 Taulukko II 5 S.pneumoniaen oligosakkaridien pelkistyvän pääteyksikön kemiallinen aktivointi Parametrit Aikasempi menetelmä Nykyinen menetelmä Tuotu ryhmä NH 2 NH(CH 2 )NH 2 10 Reagenssi(pH) Ammoniakkipuskuri(9) Diaminoetaani(9) Aktivointi- 50 C 100 C lämpötila Aktivointiaika 7-14 vrk 15 minuuttia Pelkistin Na-syaniboorihyd- Pyridiiniboraani 15 ridi Pelkistys- 50 C 50 C lämpötila Pelkistysaika 7-14 vrk 48 tuntia Saatu tuote Oligo-NH 2 Oligo-NH(CH 2 ) 2NH 2 20 Aktivoiva kaksi- SIDEA SIDES tai SIDEA funkt. välike Reaktiolämpö- 25 C 4 C tila Reaktioaika 4 tuntia 2 tuntia 25 Saatu tuote Oligo-NH-monoesteri Oligo-NH(CH 2 ) 2NH- Reaktion hyöty- 25-30 % 70 % suhde monoesteri 30 SIDEA = adipiinihapon sukkinimidyylidiesteri SIDES = meripihkahapon sukkinimidyylidiesteri Keksinnön menetelmän mukaisesti oligosakkaridin pelkistyvän pääteyksikön pelkistävä aminointi suoritetaan 35 käyttäen molekyyliä, jossa on kaksi aminoryhmää. Keksinnön edullisessa suoritusmuodossa pelkistävä aminointi toteute-

22 taan antamalla annetun oligosakkaridimoolimäärän reagoida 10-kertaisesti molaarisen ylimääräisen diaminoetaaniliuoksen kanssa 0,2 M KH 2 PO4 :ssä noin ph 9:ssä noin 25-100 C:ssa, ja edullisesti 100 C:ssa noin 1-60 minuu- 5 tissa, ja edullisesti noin 15 minuutissa. Tämän jälkeen voidaan lisätä pyridiiniboraanimäärä, joka molaarisesti vastaa 25-kertaisesti valmisteen oligosakkaridin molaarista pitoisuutta, ja reaktion annetaan tapahtua noin 25-100 C:ssa, edullisesti noin 50 C:ssa noin 1-72:ssa ja 10 edullisesti 48 tunnissa. Pelkistävästä aminointireaktiosta saatu tuote voidaan sitten saattaa reagoimaan kaksifunktioisen molekyylin kanssa, jonka kumpikin toiminnallinen ryhmä pystyy reagoimaan aktivoidun oligosakkaridin kumman tahansa terminaali- 15 sen aminoryhmän kanssa sekä kantajaproteiinien rakenteessa esiintyvien aminoryhmien kanssa siten, että kaksifunktioinen molekyyli pystyy sitomaan yhteen oligosakkaridin ja kantajaproteiinin. Keksinnön edullisessa suoritusmuodossa kaksifunktioinen ryhmä on diesteri, ja on nimenomaan adi- 20 piinihapon diesteri, jonka on voitu osoittaa liittyvän tehokkaampaan proteiinin glykosylaatioon. Keksinnön edullisessa spesifisessä suoritusmuodossa annetaan oligosakkaridin, jolle on suoritettu pelkistävä aminointi kuten yllä kuvattu, reagoida edelleen meripihkahapon tai edullisemmin 25 adipiiniihapon sukkinimidyylidiesterin kanssa; tämä reaktio voidaan parhaiten suorittaa aminoidun oligosakkaridin kanssa, jonka molaarinen pitoisuus (aminoryhmien suhteen) vastaa noin viidettä osaa SIDEAn (tai SIDESin) molaarisesta pitoisuudesta, dimetyylisulfoksidiliuoksessa (DMSO) 30 noin 0-25 C:ssa, ja edullisesti noin 4 C:ssa noin 0,5-5, ja edullisesti noin 2 tunnin aikana. Aktivoitu oligosakkaridi voidaan ottaa talteen saostamalla käyttäen 1,4-dioksaania (80 % v/v), joka myös jättää supernatanttiin ylimääräisen SIDEAn (tai SIDESin).

23 5.3. Oligosakkaridien konjugointi proteiiniin Keksinnön mukaisesti käytettäviä proteiineja on mm. mikä tahansa proteiini, jota turvallisesti voi antaa nuorille nisäkkäille ja joka voi toimia immunologisesti 5 tehokkaana kantajaproteiinina. Nimenomaisissa suoritusmuodoissa voidaan käyttää solupinnan proteiineja, membraaniproteiineja, toksiineja ja toksoideja. Turvallisuuskriteerejä on mm., ettei primaarista toksisuutta esiinny ja minimaalinen allergisen reaktion riski. Kurkkumätä- ja jäyk- 10 käkouristustoksoidit täyttävät nämä kriteerit; se tarkoittaa, että sopivasti valmistettuna ne eivät ole myrkyllisiä, ja allergisten reaktioden esiintyminen on hyväksyttävän alhainen. Vaikka allergisten reaktioiden riski aikuisilla voi olla merkittävä, on se lapsilla minimaalinen. 15 Muissa nimenomaisissa keksinnön suoritusmuodoissa soveliaita kantajaproteiineja ovat mm., näihin kuitenkaan rajoittumatta, Salmonella flagelliini-, Haemophilus piliini-, Haemophilus 15 kda-, 28-30 kda- ja 40 kda-membraaniproteiinit, Escherichia colin lämpölabii- 20 li enterotoksiini LTB, koleratoksiini ja virusproteiinit, kuten rotavirus VP7- ja respiratoorinen solusitkosvirus F- ja G-proteiinit. "Kantaja-efektin" johdosta heikosta antigeenistä, kun se liitetään voimakkaampaan kantaja-antigeeniin 25 (s.o. heterologiseen proteiiniin), tulee immunogeenisempi kuin mitä se yksinään edustaisi. Jos eläin aikaisemmin on immuinisoitu pelkästään kantajalla, niin eläin voi olla "perusrokotettu" ja osoittaa lisääntynyttä immuunivastetta ei pelkästään kantaja-antigeeniä, vaan myöskin liitettyjä 30 hapteeniryhmiä kohtaan. Lapset immunisoidaan ruutiininomaisesti jäykkäkouristus- ja kurkkumätätoksoideilla. Näin heidät olisi perusrokotettu jompaankumpaan näistä toksoideista konjugoidun kapselipolymeeriantigeenin vastaiseen esiintymiseen.

24 Yleisesti, mikä tahansa heterologinen proteiini voisi toimia kantaja-antigeenina. Kuitenkin tietyillä bakteeritoksiineilla, kuten jäykkäkouristus- ja kurkkumätätoksiineilla on se lisäetu, että ne koostuvat kandesta 5 osasta, joista toisella ("sitoja"-alayksiköllä) on voimakas affiniteetti sitoutua nisäkässolujen pintaan. Näin on mandollista, konjugointi tällaiseen "sitoja"proteiiniin saattaisi kannetun antigeenin tehokkaammin herättämään vasteita immuunisysteemin soluissa. 10 Kantajaproteiinit, joihin kapselipolymeeri on konjugoitu, voivat olla natiivitoksiinia tai heikennettyä toksiinia (toksoidia). Myös suhteellisen uudella mutaatiotekniikalla voidaan tuottaa geneettisesti muunnettuja proteiineja, jotka ovat antigeenisesti toksiinin kaltaisia, 15 kuitenkaan olematta myrkyllisiä. Näitä kutsutaan "ristiinreagointimateriaaliksi" eli CRM:ksi. CRM 197 on merkittävä, koska se yhden ainoan aminohapon kohdalla poikkeaa natiivista kurkkumätätoksiinista, mutta immunologiosesti ei erotu siitä. 20 Kapselipolymeerin konjugointi natiivitoksiiniin voi alentaa toksisuutta, mutta merkittävää myrkyllisyyttä saattaa jäädä. Sen vuoksi proteiinin lisädetoksikointiin käytetään formaliinia, joka reagoi proteiinin vapaiden aminoryhmien kanssa. Jäännöstoksisuus voi vielä olla huo- 25 Lena. Sen lisäksi missä tahansa valmiste-erässa on spontaani detoksikaatio mandollinen ja se on otettava huomioon tässä työskentelytavassa. Vaihtoehtoisesti nativitoksiini voidaan tehdä myrkyttömöksi formaliinilla, jolloin valmistetaan tavanomai- 30 nen toksoidi ennen konjugointia kapselipolymeeriin. Kuitenkin edeltävä formaliinikäsittely vähentää kapselipolymeerifragmenttien pelkistettävien ryhmien reaktioon käytettävien vapaiden aminoryhmien lukumäärää. CRM:illä on näinollen merkittäviä etuja siinä suhteessa, ettei niillä 35 ole mitään luontaista toksisuutta eikä mikään niiden ami-

25 noryhmistä ole formaliinin miehittämä. Lisäetu on myös, ettei työskentelyyn CRM:ien kanssa liity mitään terveysriskejä. CRM 197 :n tapauksessa, joka immunologisesti on ident- 5 tinen natiivitoksiinin kanssa, formaliinikäsittely (joskaan tässä ei ole mitään detoksikaation tarvetta) tehostaa suuresti immuunivastetta. Tämän käsitetään johtuvan molekyylin stabiloitumisesta kehon hajoittamismekanismeja vastaan ja/tai ristisidosten aggregaatiosta (partikkelien 10 immunogeenisuus lisääntyy koon myötä). Kaikista yllä esitetyistä syistä ovat jäykkäkouristus- ja kurkkumätätoksiinit ensisijaisia kantajaproteiiniehdokkaita, joskin on olemassa muita, jotka myöskin voivat olla sopivia. Vaikka näiden muiden turvallisuudesta ei ole 15 olemassa samaa tietämystä kuin kurkkumädän ja jäykkäkouristuksen, voi kuitenkin niiden käyttöön olla olemassa muita ylivoimaisia syitä. Esimerkiksi ne voivat kantajina olla jopa tehokkaampia, tai niiden tuottaminen voi olla merkittävästi taloudellisempaa. Muita kantajaehdokkaita 20 ovat esimerkiksi psedomonas-, stafylokokki-, streptokokki-, pertussis- ja Escherichia coli -toksiinit. Keksinnön spesifisessä suoritusmuodossa aktivoidut oligosakkaridit voidaan sitoa CRM 197 -proteiiniin, joka on puhdistettu seuraavasti: 25 Corynebacterium diphteriaella tuotettu CRM 197 voidaan eristää elatusaineesta suodattamalla bakteeriviljelmä Millipore-membraanin läpi, saostamalla proteiini suodoksesta ja puhdistamalla CRM 197 ioninvaihtokromatografisesti, kuten jäljempänä kappaleessa 6 esitetään. Vaihtoehtoisesti 30 voidaan oleellisesti puhdasta CMR 197 :ää tuottaa millä tahansa tunnetulla menetelmällä. Aktivoitu oligosakkaridi voidaan kovalenttisesti sitoa kantajaproteiiniin orgaanisen liuottimen ja haluttaessa minkä tahansa muun aineen (kuten kondensoivan ai- 35 neen) läsnäollessa edistämään aktivoidun oligosakkaridin

26 terminaalisen funktionaalisen ryhmän sitomista proteiiniin. Keksinnön spesifisessä edullisessa suoritusmuodossa aktivoitu oligosakkaridi, jolla on terminaalinen esteriryhmä, voidaan kovalenttisesti sitoa kantajaproteiinissa 5 läsnäoleviin vapaisiin aminoryhmiin seuraavasti: Aktivoitu oligosakkaridi voidaan liuottaa dimetyylisulfoksidiin ja sitten lisätä kantajaproteiinin, (esimerkiksi CMR 197 :än, tähän kuitenkaan rajoittumatta, jota on noin 2 mg/ml) vesiliuokseen siten, että monoesteriaktivoi- 10 dun oligosakkaridin ja kantajaproteiinin aminohapporyhmien kokonaismäärän molaarinen suhde on noin 1 : 2 ja lopullinen DMSO:n pitoisuus on noin 50 % v/v. Tämä konjugointireaktio suoritetaan 4 C:ssa, ja joskin reaktio on lähes valmis noin kandessa tunnissa, on sopivaa jättää se käy- 15 mään yli yön, jotta reaktion kaikkien spesifisten glykokonjugaattityyppien saanto nostetaan mandollisimman korkeaksi. Näin saadut glykokonjugaatit puhdistetaan sitten geelikromatografisesti. Yksivalenttisen rokotteen syntetisoimiseksi baktee- 20 rin yhdestä serotyypistä saadut oligosakkaridit voidaan konjugoida proteiiniin. Monivalenttisen rokotteen syntetisoimiseksi glykokonjugaatit voidaan valmistaa sitomalla useista eri bakteerilajeista tai eri serotyypeistä saatu oligosakkaridien seos kantajaproteiiniin; vaihtoehtoisesti 25 voidaan sekoittaa glykokonjugaatteja, jotka on saatu antamalla yhden oligosakkaridityypin reagoida kantajaproteiinin kanssa erillisinä reaktioina käyttäen eri oligosakkarideja. Näin monivalenttirokote voi sisältää kantajaproteiinin, jossa on homogeeninen tai heterogeeninen popu- 30 laatio sidottuja oligosakkarideja.

27 dinta 5.4. Glykokonjugaattien immunokemiallinen luonneh- Yllä kuvatulla menetelmällä valmistettujen glykokonjugaattien immunogeenisyyden todentaminen voidaan testata 5 millä tahansa sopivalla eläinjärjestelmällä ennen humaanikäyttöä, tähän kuitenkaan rajoittumatta, mm. kaneilla, sioilla, marsuilla, hiirillä, rotilla tai vuohilla. Keksinnön spesifisessä suoritusmuodossa kaneihin (noin 2 kg:n painoisiin) inokuloidaan ihon alle glykoproteiinikonju- 10 gaattia alumiinifosfaatin läsnäollessa tai ilman sitä. Noin 2,5 pg oligosakkaridia muodostaisi 2 kg:n kanille sopivan annoksen. Vasta-ainetiitterit arvioitaisiin ELISAmenetelmällä (entsyymiin sidottu immunosorbenttimääritys) tai millä tahansa muulla tunnetulla menetelmällä. Koska 15 keksinnön glykokonjugaatteja vastaan kehitetyt vasta-aineet eivät ehkä pysty immunopresipitoimaan antigeenia, ei sellaisia vasta-ainemäärityksiä, jotka perustuvat immunopresipitaatioon, voi suositella tiitterin määritykseen. 5.5. Rokotteen formulointi ja antomuoto 20 Rokotteen formuloinissa sopivia kantaja-aineita ovat mm. natriumfosfaatilla puskuroitu keittosuolaliuos (ph 7,4) tai natriumfosfaatilla puskuroituuun keittosuolaliuokseen (ph 6) suspendoitu 0,125 M alumiinifosfaattigeeli tai muut tavanomaiset väliaineet. 25 Yleensä rokotteet, jotka sisältävät n. 5 - n. 100 pg, edullisesti n. 10 - n. 50 pg oligosakkaridia, ovat sopivia aikaansaamaan tehokkaita vasta-ainetasoja nuorten lämminveristen nisäkkäiden kapselipolymeereille. Tietysti tarkka annostelu tulisi määritelä rutiinimaisella 30 annos/vaste -kokeilulla. Lasten rokotteiden valmistamiseksi glykoproteiinikonjugaattien pitoisuus on noin 25-200 lig oligosakkaridin rajoissa. Suurempia annoksia voidaan antaa kehon painon perusteella. On odotettavissa, että perättäisesti annetut pienet annokset ovat paremmat,

28 kuin jos sama konjugaattimäärä annettaisiin yhtenä ainoana ruiskeena. Valmistettuja rokotteita voidaan antaa kaiken ikäsille lämminverisille nisäkkäille ja erityisesti ne sovel- 5 tuvat aiheuttamaan aktiivisen immunisoinnin patogeenisten Haemophilus influenzae -tyyppi b-, Escherichia colj-, Streptococcus pneumoniae-, Neisseria meningitis- ja Pseodomonas aerugenosa -bakteerien nuorissa nisäkkäissä aiheuttamia systeemisairauksia vastaan. 10 Keksinnön mukaisesti valmistettu rokote voidaan an- taa ihon alle, laskimosisäisesti, lihakseen, vatsaontelonsisäisesti, suun tai nenän kautta. Rokote voi sisältää glykokonjugaatin liuoksena tai mikropartikkeleina tai se on sisällyttetty pieniin pallosiin tai rakkuloihin, esi- 15 merkiksi liposomeihin. 5.6. Oligosakkaridikonjugoitujen rokotteiden käyttökelpoisuus Edullisessa toimintamuodossa glykokonjugaattirokotteita kapseloituja patogeensia bakteereja vastaan käyte- 20 tään suojaamaan herkkiä yksilöitä näiden bakteerien aiheuttamilta kehittyviltä taudeilta. Herkkiä yksilöitä ovat esimerkiksi nuoret lapset, joiden immuunisysteemi ei ole kehittynyt, henkilöt joilta on poistettu perna, kuin myöskin kaikki yksilöt, joilla on epävarma immuunisysteemi tai 25 krooninen tauti, varsinkin hankittu immuunikato (AIDS), hematopoeettinen tauti, diabetes, krooninen sydäntauti, krooninen keuhkotauti ja sirppisoluanemia. Proteiinikantajaan konjugoitumisensa ansiosta tehostavat keksinnön glykokonjugaatit sisältämiensä oligosakkaridien immunogeeni- 30 suutta. Täten keksinnön mukaisesti valmistettuja glykokonjugaatteja voidaan käyttää antamaan suojaa mitä tahansa bakteeri-infektiota vastaan, jolla on polysakkaridikapseli, näitä ovat mm. Streptococcus pneumoniae, Haemophilus in- 35 - - - 11 -

29 la typhi, Streptococcus mutans. Cryptococcus neoformans, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus ja pseudomonas aerugenosa. Lapsilla erityisen virulentteja ja nimenomaan tässä keksinnössä käytettyjä S. pneumoniae -kan- 5 toja ovat mm. tyypit 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23 ja 33F. Tässä nimenomaisessa suoritusmuodossa keksinnön rokotteita voidaan käyttää indusoimaan monospesifinen ja 10 homogeeninen immuunivaste. Monospesifiseen immuunivasteeseen liittyy useita etuja, esimerkiksi se tarjoaa vastaaineita, (I) joilla on homogeeninen spesifisyys ja pääasiallisesti kaikki vasta-aineet ovat suuntautuneet yhteen spesifiseen epitooppiin ja niillä on sama affiniteettiva- 15 kio, (II) joilla on korkea affiniteettivakio ja voimakas antibakteerinen aktiivisuus, (III) joilla on lisääntynyt kohdespesifisyys ja joilta puuttuu ristireagointi isäntää lähellä olevien antigeenien kanssa, mistä seurauksena saadaan turvallisempi rokote, (IV) joilla on alentunut komp- 20 lementin aktiivisuus johtuen monospesifisten antigeenien vasta-aineiden alentuneesta presipitaatioaktiivisuudesta, millä myöskin saadaan turvallisempi rokote. On lisäksi suoritusmuotoja, joissa käsillä olevaa keksintöä voidaan käyttää tuottamaan rokotteita, jotka 25 tunnistavat kantajaproteiineihin keksinnön menetelmin sidottuja peptidejä tai lipo-oligosakkarideja tai muita pintaoligosakkaridihapteeneja. Tällaisia rokotteita voidaan käyttää esimerkiksi aiheuttamaan immuuniteettia kasvainsoluja kohtaan tai valmistettaessa kemialliseen lääkeai- 30 neseen tai bioaktiiviseen aineseen konjugoituja antituumorivasta-aineita; tällainen antituumoriaktiivisuus voitaisiin indusoida sitomalla tuumorispesifinen antigeeni tai sen epitooppi kantajaproteiiniin käyttäen keksinnön menetelmiä.

30 6. Esimerkki: Monivalenttikonjugoidun pneumokokkioligosakkaridirokotteen kehittäminen 6.1. Polysakkaridin valmistaminen S. pneumoniae -tyyppi 6A:n kapselipolysakkaridia, 5 S.pneumoniae -tyyppi 14:n kapselipolysakkaridia, S. pneumoniae -tyyppi 19F:n kapselipolysakkaridia ja S.pneumoniae -tyyppi 23F:n kapselipolysakkaridia saatiin Amerikkalaisesta tyyppiviljelmäkokoelmasta (ATCC). 6.2. Polysakkaridin hydrolysoiminen 10 6.2.1. S. pneumoniae -tyyppi 6A:n polysakkaridin hydrolysoiminen 2 mg S. pneumoniae -tyyppi 6A:n kapselipolysakkaridia liuotettiin 1 ml:aan vesiliuoista, jossa oli 10 mm etikkahappoa ph 3,4, sitten annettiin hydrolysoitua sulje- 15 tuissa ampulleissa öljyhauteella 100 C:n lämpötilassa 30 tunnin ajan. Tuloksena saadut oligosakkaridit erotettiin sitten reaktioseoksesta kromatografisesti Sephadex G15:lla (Pharmacia, Uppsala), joka oli tasapainotettu 15 mm NaCl-liuoksella ph 7,0 4 C:ssa. 20 Kromatografiaefluentit analysoitiin sitten Kabatin ("Experimental Immunochemistry", ed. E. A. Rabat & Mayer, 1964, ss. 538-541), Chen et al.'n (Anal. Chem. 28 (1956) 1756-1758) ja Porro et al.'n (Anal. Bioch. 118 (1981) 301-306) julkaisemien menetelmien mukaan metyylipentoo- 1 25 sien, fosforin ja pelkistävien ryhmien, esimerkiksi aldehydien läsnäolon toteamiseksi. Analyysissä saatiin metyylipentoosi/aldehydisuhteeksi 3,96, metyylipentoosi/fosforisuhteeksi 0,96 ja fosfori/aldehydisuhteeksi 4,12. Geelikromatografiassa Sephadex G-50 Superfinellä 30 (Pharmacia) puskuria käyttäen saatiin jakautumisvakioksi (kd) 0,538 (heksoosilla), jota vastaa molekyylipaino n. 2 500. Ydinmagneettinen resonanssi (NMR), kaasukromatografia ja stökiometrinen analyysi osoittivat oligodsakkari- 35 dien koostuvan 3-4 :stö toistuvasta yksiköstä, joiden

31 joukossa todettiin galatoosia, joka oli immunodominoiva sokeri. 6.2.2. S. pneumoniae -tyyppi 14:n polysakkaridin hydrolysoiminen 5 2 mg S. pneumoniae -tyyppi 14:n kapselipolysakkaridia liuotettiin 1 ml:aan vesiliuosta, jossa oli 0,5 M trifluorietikkahappoa, ja annettiin hydrolysoitua suljetuissa ampulleissa öljyhauteella 70 C:n lämpötilassa 7 tuntia. Tuloksena saadut oligosakkkaridit erotettiin reaktio- 10 seoksesta kromatografisesti Sephadex G 15:11ä (Pharmacia, Uppsala), joka oli tasapainotettu 15 mm NaC1- liuoksella ph 7,0 4 C:ssa. Kromatografiaefluenttien heksosamiini- ja aldehydipitoisuudet analysoitiin ja saatiin heksosamiini/aldehydi- 15 suhteeksi 3,17. Kaasukromatografinen ja stökiometrinen analyysi osoittivat molekyylipainon vastaavan 3-4 toistuvaa perusyksikköä. Galaktoosin haaraketjujen poistuma kaasukromatografisesti määritettynä oli 10 % :n rajoissa. Geelikromatografialla Sephadex G-50 Superfinellä (Phar- 20 macia) käyttäen 15 mm NaCl-liuosta ph 7,0 saatiin oligosakkarideille jakautumisvakioksi (Kd) 0,30 määritettynä koko heksoosista. 6.2.3. S. pneumoniae -tyyppi 19F polysakkaridin hydrolysoiminen 25 2 mg S. pneumoniae -tyyppi 19F:n kapselipolysakkaridia liuotettiin 1 ml:aan vesiliuosta, jossa oli 10 mm etikkahappoa ph 3,4 ja annettiin hydrolysoitua suljetuissa ampulleissa öljyhauteella 50 C:n lämpötilassa 49 tuntia. Saadut oligosakkaridit erotettiin sitten reaktioseoksesta 30 kromatografoimalla Sephadex G-15:11ä (Pharmacia, Uppsala), joka oli tasapainotettu 15 mm NaCl-liuoksella ph 7,0 4 C:ssa. Kromatografiaefluentit analysoitiin sitten Kabatin ("Experimental Immunochemistry", ed. E.A. Rabat ja Mayer 35 (1964), ss. 538-541), Chen et al.'n (Anal. Chem. 28

32 (1956) 1756-1758) ja Porro et al.'n (Anal. Biochem. 118 (1981) 301-306) esittämillä menetelmillä metyylipentoosien, fosforin ja pelkistävien ryhmien, esimerkiksi aldehydiryhmien, läsnäolon toteamiseksi. Analyysissä saatiin 5 metyylipentoosi/pelkistetty metyylipentoosisuhteeksi 3,5 ja metyylipentoosi/fosforisuhteeksi 3,2. Geelikromatografia Sephadex G-50 Superfinellä (Pharmacia) antoi tuloksena oligosakkarideille Kd = 0,46 (kokonaisheksoosille) ja yhdistetty kaasukromatografinen ja 10 stökiometrinen analyysi osoitti sen koon vastaavan 3-4 toistuvaa perusyksikköä. 6.2.4. S. Pneumoniae -tyyppi 23F:n polysakkaridin hydrolysoiminen 2 mg S. pneumoniae -tyyppi 23F:n kapselipolysakkari- 15 dia liuotettiin 1 ml:aan 0,25 M trifluorietikkahapon vesiliuosta ja annettiin sitten hydrolysoitua suljetuissa ampulleissa öljyhauteella 70 C:n lämpötilassa 3 tuntia. Saadut oligosakkaridit erotettiin sitten reaktioseoksesta kromatografisesti Sephadex G15 avulla (Pharmacia, Uppsa- 20 la), joka oli tasapainotettu 15 mm NaC1 -liuoksella ph 7,0 4 C:ssa. Kromatografiaefluentit analysoitiin sitten Kabatin ("Experimental Immunochemistry", ed. E. A. Rabat ja Mayer (1964) ss.538-541), Chen et al.'n (Anal. Chem. 28 (1956) 25 1756-1758) ja Porro et al.'n (Anal. Biochem. 118 (1981) 301-306) esittämien menetelmien mukaisesti metyylipentoosien, fosforin ja pelkistävien ryhmien, esimerkiksi aldehydiryhmien, läsnäolon toteamiseksi. Analyysissä saatiin heksoosi/aidehydisuhteeksi 4,5-4,5, heksoosi/metyy- 30 lipentoosisuhteeksi 2,3 ja fosfori/aldehydisuhteeksi 2,9. :. Kaasukormatografinen ja stökiometrinen analyysi osoittivat 3,5-4,5:n toistuvan perusyksikön läsnäolon. Ramnoosin haaraketjujen poistuma, joka määritettiin kaasukromatografisesti, oli vähemmän kuin 8 %.