ISTUKAN KANTASOLUT TOKSIKOLOGISESSA TUTKIMUKSESSA

ISTUKAN KANTASOLUT TOKSIKOLOGISESSA TUTKIMUKSESSA Matias Sarkola Syventävien opintojen tutkielma Anatomian ja solubiologian laitos Oulun Yliopisto Joulukuu 2016 Petri Lehenkari, Juha Tuukkanen ja Antti Koskela

OULUN YLIOPISTO Lääketieteellinen tiedekunta Lääketieteen koulutusohjelma TIIVISTELMÄ Sarkola, Matias Syventävien opintojen tutkielma Istukan kantasolut toksikologisessa tutkimuksessa 26 sivua, ei liitettä Perfluoro-oktanihappo (PFOA) on ympäristössä yleisesti esiintyvä ympäristömyrkky. Yhdisteenä PFOA on erittäin stabiili, eikä se hajoa helposti biologisissa prosesseissa. Kestävyytensä vuoksi se kertyy organismeihin ja ihmisellä PFOA kertyy erityisesti maksaan ja luustoon. Hiirikokeissa PFOA:n ollaan huomattu kiihdyttävän osteoklastien toimintaa ja poikasten ollaan huomattu altistuvan PFOA:lle jo kohdussa. Mesenkymaaliset kantasolut ovat multipotentteja kantasoluja, jotka kykenevät korjaamaan vaurioituneita kudoksia. Lisäksi niillä on immunomodulatorisia ominaisuuksia, jonka vuoksi niiden käyttöä moniin sairauksiin tutkitaan. Mesenkymaalisia kantasoluja ollaan perinteisesti eristetty luuytimestä ortopedisten leikkausten yhteydessä. Niitä esiintyy kuitenkin myös monessa muussa kudoksessa, ja viime aikoina istukan kantasolut ovat herättäneet yhä enenevissä määrin kiinnostusta kantasolulähteenä. Istukan kantasoluja ollaan eristetty muun muassa napaverestä, korionkalvosta, amnionkalvosta ja Whartonin hyytelöstä, sekä napanuoran verisuonien seinämistä. Kantasolut menettävät jakautumisnopeuttaan ja erilaistumiskykyään solujen ikääntymisen myötä. Istukan kantasolujen ollaankin huomattu kasvavan nopeammin ja erilaistuvan paremmin kuin aikuisten kantasolut. Tässä tutkimuksessa istukan soluja altistettiin PFOA:lle ja solujen mitokondrioiden määrää ja osteoblastista erilaistumista mitattiin erilaisilla PFOA:n konsentraatioilla. Osteoblastista erilaistumista mitattiin kalsiumin kertymisellä soluihin ja alkaalisen fosfataasin aktiivisuudella. Mitokondrioiden määrä, kalsiumin kertyminen ja alkaalisen fosfataasin aktiivisuus määritettiin spektrofotometrisesti. Tämän tarkoituksena oli selvittää, vaikuttaako PFOA luuston kasvuun ja kehitykseen ja ovatko istukan solut herkempiä PFOA:lle, kuin aikuisen solut. Istukan soluille tehtiin myös pinta-analyysi, jossa selvitettiin, ilmensivätkö solut mesenkymaalisilta soluilta vaadittavia pinta-antigeeneja. Pinta-analyysi suoritettiin Whartonin hyytelöstä eristetyille soluille virtaussytometrian avulla. Pinta-analyysissä Whartonin hyytelön solut eivät noudattaneet mesenkymaalisten kantasolujen minimikriteerejä, joten ne olivat muita soluja, kuin mesenkymaalisia kantasoluja. Eri kudoksien mitokondrioiden määrät vaihtelivat huomattavasti toisistaan, ja erityisesti napaveren ja korionkalvon soluissa mitokondrioiden määrä oli suurempaa kuin muissa kudoksissa ja luuytimen soluissa. Osteoblastisen erilaistumisen kokeissa suurin AFOS-aktiivisuus ja kalsiumin kertyminen oli napaveren soluilla. Yllätykseksi kasvavat PFOA-konsentraatiot eivät vähentäneet solujen erilaistumista, tai vähentäneet niiden mitokondrioiden määrää, vaan mitokondrioiden määrä kasvoi, kalsiumin kertyminen lisääntyi ja alkaalisen fosfataasin aktiivisuus nousi kasvavien PFOA-konsentraatioiden mukana. Avainsanat: istukka, mesenkymaalinen kantasolu, perfluoro-oktaanihappo,

SISÄLLYS 1. JOHDANTO... 1 2. TUTKIMUKSEN TEOREETTINEN TAUSTA... 2 3. TUTKIMUKSEN TARKOITUS JA TUTKIMUSONGELMAT... 4 4. TUTKIMUSAINEISTO JA TUTKIMUSMENETELMÄT... 6 4.1. Istukkaverikantasolujen eristys... 7 4.2. Muiden näytteiden kantasolujen eristys... 7 4.3. Luuytimen kantasolujen eristys... 9 4.4. Kokoeiden suorittaminen... 9 4.5. Mesenkymaalisten kantasolujen pinta-analyysi... 9 4.6. Mitokondrioiden määritys... 10 4.7. Osteoblastinen erilaistumiskoe... 11 4.7.1. Alkaalisen fosfataasin aktiivisuusmittaus... 11 4.7.2. Kalsiumin kertyminen... 12 5. TULOKSET... 14 5.1. Mesenkymaalisten kantasolujen pinta-analyysi... 14 5.2. Mitokondrioiden määritys... 15 5.2.1. Korionkalvon MTT-tulokset... 15 5.2.2. Luuytimien MTT-tulokset... 16 5.2.3. Whartonin hyytelön MTT-tulokset... 17 5.2.4. Napaveren MTT-tulokset... 18 5.3. Osteoblastinen erilaistumiskoe... 19 5.3.1. Korionkalvon osteoblastinen erilaistuminen... 19 5.3.2. Amnionkalvon osteoblastinen erilaistuminen... 20 5.3.3. Napaveren osteoblastinen erilaistuminen... 21 6. POHDINTA... 22 7. LÄHTEET... 24

1. JOHDANTO Perfluoro-oktaanihappo (PFOA) on ympäristössä runsaasti esiintyvä ympäristömyrkky, jota käytettiin 1950-luvulta lähtien teollisuudessa raaka-aineena. Sitä on kertynyt ympäristöstä muun muassa ihmisiin, eläimiin ja kasvillisuuteen. PFOA on erittäin stabiili yhdiste, joten se ei hajoa biologisissa prosesseissa, vaan se kerääntyy eläviin organismeihin. (Ohno ym. 2014) Eri perfluoroalkyylejä esiintyy ympäristössä runsaasti (Ohno ym. 2014) ja niiden kertyminen ihmisruumiiseen vaihtelee, riippuen perfluoroalkyylistä. PFOA kertyy ihmisessä erityisesti luustoon ja maksaan. (Perez ym. 2013) Hiirillä tehdyissä kokeissa PFOA:n on todettu kiihdyttävän osteoklastien toimintaa ja haurastavan luustoa (Koskela ym. 2016). PFOA läpäisee istukan, ja hiirien ollaan todettu altistuvan PFOA:lle jo kohdussa (Yahnia ym. 2010). Oulussa tehdään tutkimusta luuytimen kantasoluilla, joita saadaan ortopedisten leikkausten yhteydessä. Luuytimen kantasolujen kasvunopeus ja erilaistumiskyky heikkenee kuitenkin iän myötä (Mennan ym. 2013). Luuytimen kantasolut menettävät in vitro erilaistumiskykynsä nopeammin, ja kasvavat hitaammin kuin istukan kantasolut (Jin ym. 2013), sekä erilaistuvat hitaammin, kuin istukan kantasolut (Baksh ym. 2007). Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, ovatko istukan kantasolut herkempiä PFOA:lle, kuin aikuisten kantasolut. Tutkimuksessa selvitettiin, kuinka PFOA vaikuttaa istukasta eristettyjen kantasolujen aineenvaihduntaan, tutkimalla solujen mitokondrioiden aktiivisuutta ja selvittämällä PFOA:n vaikutusta istukan kantasolujen erilaistumiseen osteoblasteiksi. Osteoblastien erilaistumista tutkittiin selvittämällä solujen alkaalisen fosfataasin (AFOS) aktiivisuus ja kalsiumin kertyminen. Lisäksi tehtiin vertailevaa tutkimusta aikuisten ja istukan kantasolujen välillä. Aikuisten kantasoluina käytettiin luuytimen kantasoluja, ja niille suoritettiin vastaava mitokondriomääritys kuin istukan kantasoluille.

2. TUTKIMUKSEN TEOREETTINEN TAUSTA PFOA on yksi ihmisen tuottamista perfluoratuista ympäristömyrkyistä. PFOA on valmistettu suuria määriä 1950-luvulta lähtien raaka-aineeksi moniin materiaaleihin. Lämpökestävyytensä sekä vettä ja likaa hylkivien ominaisuuksiensa takia sitä on käytetty monien pinnoitemateriaalien valmistuksessa. Biologista hajotusta kestävien ominaisuuksiensa takia PFOA:n pitoisuudet kertyvät luonnossa ja sitä on havaittu maailmanlaajuisesti muun muassa jätevesissä, villieläimissä ja ihmisissä. (Ohno ym. 2014, Miao ym. 2015) Kertyvyyteen vaikuttaa myös PFOA:n pitkä puoliintumisaika, joka eräässä tutkimuksessa ilmoitettiin 3,8:ksi vuodeksi. (Olsen ym. 2007) Eläinkokeissa PFOA:n ollaan todettu poistuvan erityisesti virtsan mukana, mutta myös sappihappojen mukana enterohepaattisen kierron kautta (Kudo ym. 2001). Eri perfluoratut yhdisteet kertyvät pääsääntöisesti tiettyihin kudoksiin kemiallisten ominaisuuksien mukaisesti. PFOA:a esiintyy erityisesti luustossa ja maksassa. Eräässä tutkimuksessa 99:ltä vainajalta otettiin näytteet eri kudoksista. Niissä luun keskimääräinen PFOA pitoisuus oli 60,2 ng/g ja maksan PFOA pitoisuus 13,6 ng/g. (Perez ym. 2013) PFOA:a on huomattu esiintyvän myös istukan napaveressä ja eräs tutkimus havaitsi sen pitoisuudeksi keskimäärin 1,6 ng/ml istukkaveressä (Chen ym. 2012). Huoli PFOA:n aiheuttamista terveysvaikutuksista on herännyt viimeisten vuosikymmenien aikana. Sen toksisia ja terveyteen vaikuttavia vaikutuksia on tutkittu paljon muun muassa eläinkokeissa, epidemiologisissa tutkimuksissa ja soluviljelyllä. Kuten aiemmin mainittiin, PFOA kertyy erityisesti luustoon ja maksaan. (Perez ym. 2013) Hiirillä tehdyssä kokeessa PFOA vaikutti luustoon vähentämällä luuston tiheyttä muun muassa stimuloimalla osteoklasteja (Koskela ym. 2016). PFOA altistus aiheuttaa maksassa oksidatiivista stressiä hiirillä. Altistus PFOA:lle voi johtaa maksassa muun muassa ödeemaan, nekroosiin ja tulehdustilaan, sekä maksan laajentumiseen. (Macon ym. 2011,Yang ym. 2014) Jälkeläiset voivat altistua PFOA:lle jo kohdussa. Hiirikokeissa emon altistuttua PFOA:lle, poikasten syntymäkoko oli pienempi verrokkiryhmään verrattuna ja kuolleisuus korkeampi, mitä suuremmaksi altistus kasvoi. (Yahia ym. 2010) PFOA saattaa vaikuttaa myös syöpätautien esiintyvyyteen ja invasiivisiin ominaisuuksiin stimuloimalla matrix-metalloprpteinaasi-2/-9- geenin transkriptiota (Miao ym. 2015). 2

PFOA:n vaikutukset välittyvät soluihin erityisesti peroxisome proliferator activated receptor alpha- tumareseptorin välityksellä, jonka vaikutuksiin kuuluu muun muassa rasvahappojen β- oksidaation lisääntyminen. PFOA vaikuttaa myös nuclear receptor 1H3:iin, joka vaikuttaa muun muassa rasvahappometaboliaan, kolesterolisynteesiin, hiilihydraattiaineenvaihduntaan ja sappihapposynteesiin maksassa. (Bjork ym. 2011) Lisäksi PFOA:n ollaan havaittu agonisoivan estrogeenireseptoria ja antagonisoivan androgeenireseptoria (Stigaard-Kjeldsen ym. 2013). Kantasolut ovat uusiutumiskykyisiä soluja, jotka kykenevät erilaistumaan eri solutyypeiksi. Niiden tehtävänä on elimistön korjaaminen ja tuottaa uusia soluja kuolleiden solujen tilalle, esimerkiksi luuytimessä, ihossa, lihaksistossa, luussa ja monessa muussa kudoksessa. Kantasolut voidaan jakaa erilaistumiskykynsä mukaan totipotenteiksi kantasoluiksi, joka on erilaistumaton solu, pluripotenteiksi kantasoluiksi, jotka voivat edelleen erilaistua kaikiksi elimistön soluksi ja multipotenteiksi kantasoluiksi, jotka voivat erilaistua tiettyjen linjojen kudoksikisi. Mesenkymaaliset kantasolut ovat elimistön eri kudoksista löytyviä multipotentteja kantasoluja, jotka korvaavat elimistössä kuolevia soluja. Mesenkymaalisille kantasoluille ollaan pyritty asettamaan minimikriteerit niiden määrittämiseksi ja paljon käytetty määritelmä on International Society of Cellular Therapy:n asettamat minimikriteerit: mesenkymaaliset kantasolut tarttuvat muoviin, ilmentävät CD 29-, CD44-, CD90-, CD49a-f-, CD51-, CD73-(SH3), CD105- (SH2), CD106-, CD166- JA Stro-1-markkereita ja samalla ovat negatiivisia CD45-, CD34-, CD14- tai CD11b-, CD79a- tai CD19- ja HLA-DR pintamolekyyleille. Mesenkymaalisilla kantasoluilla ei myöskään ole immunologisia vaikutuksia ja ne voivat korvata vahingoittuneita kudoksia. (Maleki ym. 2014) Istukan kantasolut ovat eettinen kantasolulähde, koska niitä voidaan kerätä muuten hävitettävästä kudoksesta, eikä niiden keräämisestä aiheudu luovuttajalle kipua tai muuta haittaa. Istukoiden suuren tarjonnan vuoksi niiden käytössä voidaan karsia sairailta luovuttajilta saadut istukat ja valikoida terveiltä luovuttajilta saadut istukat. Istukan ja napanuoran monista eri osista ollaan löydetty mesenkymaalisia kantasoluja jotka kykenevät erilaistumaan muun muassa adiposyyteiksi, kondrosyyteiksi ja osteoblasteiksi. Napanuorasta ollaan eristetty kantasoluja whartonin hyytelöstä, valtimon ja laskimoiden seinämistä, napanuoraa ympäröivästä sidekudoksesta ja napaverestä. (Jin ym. 2013, Mennan ym. 2013) Myös sikiötä ympäröivästä amnionkalvosta ja korionkalvosta ollaan onnistuttu eristämään istukan kantasoluja (Kwon ym. 2016). 3

Perinteinen kantasolulähde on luuydin, josta ollaan pitkään eristetty luuydinkantasoluja eri tarkoituksia varten. Luuytimen kantasolujen käyttö ei kuitenkaan ole useasta syystä ongelmatonta. Luuydinnäytteet tulevat usein ortopedisista leikkauksista, jotka tehdään ikääntyneille ihmisille. Kantasolujen määrä luuydinnäytteissä on huomattu vähenevän iän myötä, niiden kasvunopeuden ollaan huomattu iän myötä hidastuvan ja erilaistumispotentiaalin heikkenevän. (Mennan ym. 2013) Kantasolujen kantasoluominaisuudet heikkenevät kudosten vanhetessa. Jo neonataalisolujen jakautumisnopeus vähenee sikiökauden edetessä ja hidastuminen jatkuu ikääntymisen myötä. Istukan kehittyessä se menettää erilaistumiskykyään raskauden edetessä. Solujen pluripotenttisia ominaisuuksia voidaan mitata muun muassa alkaalisen fosfataasin-, SSEA- 4:n, TRA-1-60:n, TRA-1-81:n, Oct-4:n- ja telomeraasin avulla. Näiden määrät laskevat jo raskauden aikana ja vähenevät ikääntymisen myötä. (Sung ym. 2010) Mesenkymaaliset kantasolut ovat immunomodulatorisia soluja, ja ne pystyvät sytokiinien ilmentymistä muuttamalla vaikuttamaan sekä luonnolliseen immuniteettiin, että hankittuun immuniteettiin (Lee ym. 2012). Eri kudoksista kerättyjen mesenkymaalisten kantasolujen immunomodulatorisissa ominaisuuksissa ollaan kuvattu toisistaan poikkeavia ominaisuuksia, ja kudoksista riippuen sekä aikuisten, että istukan kantasoluja ollaan kuvattu enemmän immunomodulatorisiksi. Esimerkiksi korionkalvon mesenkymaalisilla kantasoluilla on enemmän immunomodulatorisia ominaisuuksia, kuin luuytimen ja rasvakudoksen mesenkymaalisilla kantasoluilla (Lee ym. 2012). Toisaalta luuytimen mesenkymaalisilla kantasoluilla on havaittu olevan enemmän immunomodulatorisia ominaisuuksia verrattuna napaveren mesenkymaalisiin kantasoluihin (Heo ym. 2106). 3. TUTKIMUKSEN TARKOITUS JA TUTKIMUSONGELMAT Tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia ympäristössä esiintyvän PFOA:n vaikutusta mesenkymaalisten solujen kasvuun, jakautumiseen ja erilaistumiseen osteoblasteiksi. Mesenkymaalisia kantasoluja eristettiin istukan napaverestä, napaverisuonista, Whartonin hyytelöstä ja sikiökalvoista. Lisäksi eristettiin mesenkymaalisia kantasoluja luuytimestä, jolloin saatiin aikuisten kantasolulinja, jolloin voitiin verrata lapsen kantasolujen käyttäytymistä aikuisen kantasoluihin. Tarkoituksena oli selvittää PFOA:n toksikologisia vaikutuksia solun aineenvaihduntaan, ovatko lapsen kantasolut herkempiä PFOA:lle ja 4

vaikuttaako altistuminen enemmän istukasta eristettyjen solujen kasvunopeuteen, erilasitumiseen ja jakautumiseen ja sitä kautta voisiko PFOA aiheuttaa kehityshäiriöitä lapsessa. Istukan kantasolut ovat kirjallisuudessa kuvattu nopeasti kasvaviksi ja jakaantuviksi sekä nopeammin erilaistuviksi kuin aikuisista eristettävät kantasolut (Baksh ym. 2007). Istukat ovat biologista jätettä, ja ne hävitetään synnytyksen jälkeen, eikä niistä kerättävät näytteet aiheuta kipua tai rasitusta potilaalle, jonka takia ne ovat eettinen kantasolulähde. Tällä hetkellä anatomian- ja solubiologian laitoksella tehdään kantasolututkimusta lähinnä aikuisten kantasoluilla, eritysesti luuytimen kantasoluilla, jotka kerätään ortopedisten leikkausten yhteydessä. Tutkimuksen tarkoituksena oli myös saada uusi, runsaasti saatavilla oleva kantasolulähde tutkimuskäyttöön. 5

4. TUTKIMUSAINEISTO JA TUTKIMUSMENETELMÄT Eettiseltä toimikunnalta saatiin lupa tutkimuksen tekemiseen keväällä 2015 ja tutkimuslupa on voimassa kymmenen vuotta. Luuytimien näytteille Anatomian- ja solubiologian laitoksella on jo ennestään tutkimuslupa myönnetty. Synnyttäjille annettiin potilastiedotuslomake ja kaksi potilassuostumuslomaketta täytettäväksi, joista toinen jäi potilaalle. Istukat kerättiin Oulun Yliopistollisen sairaalan synnytysosastolla elektiivisten sektioiden yhteydessä. Yhteensä viidestä istukasta kerättiin kudosnäytteitä, ja lopullisiin kokeisiin käytettiin toisen ja neljännen istukan kudoksia. Keräyksen yhteydessä istukat punnittiin ja kirjattiin ylös raskausviikko ja lapsen sukupuoli. Istukkaveri kerättiin hepariinia sisältävään soluviljelypulloon istukan ja napanuoran verisuonista. Istukkaveren lisäksi istukasta otettiin näytteet istukan amnionkalvosta, korionkalvosta, Whartonin hyytelöstä. Luuydinnäytteet kerättiin lonkkaleikkausten yhteydessä otetuista luuydinnäytteistä. Näytteet kuljetettiin jäässä Clinical research centerin soluviljelylaboratorioon, jossa viljely ja kokeet suoritettiin. Taulukossa 1. on esitetty kaikki tutkimuksessa suoritetut kokeet ja niihin käytetyt kudokset ja näytteiden määrät. Taulukko 1. Taulukkoon on kerätty kaikki kirjoitelmassa esitetyt tutkimukset kudoksittain, kuinka monta kertaa kokeet on suoritettu ja kokeisiin käytettyjen näytteiden määrät. Koe ja kudos Suoritetut kokeet Näytteiden määrä Pinta-analyysi -Whartonin hyytelö 1 1 MTT -Luuydin 2 2 -Napaveri 1 1 -Korionkalvo 1 1 -Whartonin hyytelö 1 1 Kalsiumin kertyminen -Amnion 2 2 -Napaveri 1 1 -Korionkalvo 1 1 Alkaalisen fosfataasin aktiivisuus -Amnion 2 2 -Napaveri 1 1 -Korionkalvo 1 1 6

4.1. Istukkaverikantasolujen eristys Istukkaveren kantasolujen eristämisessä käytettiin Punaisen Ristin Veripalvelun kehittämää protokollaa, joka pohjautui A. Laitisen artikkeliin (Laitinen ym. 2011). Istukkaveri laimennettiin aluksi fosfaattipuskurilla (PBS) suhteessa 4 osaa verta ja 5 osaa PBS. Tämän jälkeen veri-pbs-seoksen päälle pipetoitiin varovasti Ficoll-reagenssia, jonka jälkeen näytteitä sentrifugoitiin 50ml Falcon-putkissa 400g 40 minuutin ajan 20 C lämpötilassa ilman jarrua. Sentifugoinnin jälkeen monoklonaalisten solujen kerros pipetoitiin uuteen Falconputkeen ja pestiin PBS-liuoksella sentrifugoimalla kahteen kertaan 500g 10 minuutin ajan. Tämän jälkeen soluista otettiin näyte ja niiden määrä laskettiin. Lopuksi solut laitettiin fibronektiinilla päällystettyyn viljelypulloon kasvamaan napaverimediumiin. Napaverimediumin ohjeena käytettiin veripalvelun istukkaveren mesenkymaalisten kantasolujen proliferaatio mediumin ohjetta. Napaverimedium valmistettiin lisäämällä 88,7ml:aan α-mem + glutamiiniliuosta 10ml FBS, 50ml (50µM) Dexamethasonea, Epidermaalista kasvutekijää 100µl (10µg/ml), rekombinantti platelet-derived-growth-factoria 100µl (10µg/ml) ja Penisilliini-Streptomysiiniä 1ml. 4.2. Muiden näytteiden kantasolujen eristys Muiden kudosten mesenkymaalisten kantasolujen eristämiseen kehitettiin protokolla, joka perustui kirjallisuudesta löytyneisiin amnionkalvosta ja whartoninhyytelöstä eristämiseen kehitettyihin protokolliin. Yhteenvedetty protokolla koottiin suraavista artikkeleista: Yen ym. 2005, Fu ym. 2006, Fatimah ym. 2013, Lu ym. 2013, Luan ym. 2013, Soo-Seo ym. 2013, Yan ym. 2013, Tabatabei ym. 2014, Amari ym. 2015, Wang ym.2015, Zhu ym. 2015. Napaveren soluista poiketen, muiden solujen viljelyssä ei käytetty napaverimediumia, vaan kantasolujen soluviljelymediumia. Soluviljelymediumi valmistettiin lisäämällä 500 ml:aan α:mem:ia 10ml Hepes-puskuria, 5,5 ml glutamiinia, 5,5 ml Penisilliini-Streptomysiiniä ja 50 ml Fetal Bovine Serumia (FBS). Ensiksi näytteet pestiin soluviljelylaminaarissa 50 ml Falcon-putkissa PBS-liuoksessa, kunnes näytteet olivat puhtaita verestä ja muusta näkyvästä liasta. Kalvot ja whartonin hyytelö pilkottiin terävällä veitsellä kasvatusmaljalla, jossa pohjalla oli PBS-liuosta, kunnes ne olivat korkeintaan 5 x 5 mm kokoisia. Tämän jälkeen osa 7

näytteistä laitettiin suoraan fibronektiinilla päällystettyihin soluviljelypulloihin kasvamaan napaverimediumissa inkubaattoriin 37C. Kudospalojen annettiin olla pulloissa muutaman päivän, jonka jälkeen kudospalat poistettiin ja soluviljelypullo huuhdeltin kahdesti PBSliuoksella, solut irroitettiin soluviljelypullosta trypsiinillä ja siirrettiin Falcon-putkeen. Trypsiini neurtaloitiin soluviljelymediumilla ja näytteet pudistettiin sentrifugoimalla. Lopuksi solut siirrettiin takaisin kasvamaan soluviljelypulloihin. Osalla leikatuista paloista kokeiltiin myös käsittelyä Kollagenaasi-I:llä yön yli inkubaattorissa, jonka tarkoituksena oli vapauttaa soluja sidekudoksesta. Näytteistä solut puhdistettiin sentrifugoimalla ja solupelletit siirrettiin fibronektiinilla päällystettyihin soluviljelypulloihin kasvamaan inkubaattoriin. 8

4.3. Luuytimen kantasolujen eristys Luuydinnäytteet kerättiin Oulun yliopistollisessa sairaalassa lonkkaproteesileikkausten yhteydessä poisheitettävästä materiaalista. Leikkaussalissa luuydinnäytteet siirrettiin Falconnäyteputkeen, jossa oli soluviljelymediumia. Luuydinnäytteet siirrettiin soluviljelylaminaarissa soluviljelypulloon, johon lisättiin vastaava määrä soluviljelymediumia. Solut siirrettiin inkubaattoriin, jossa kantasolujen annettiin kiinnittyä pullon pohjaan. Tämän jälkeen soluviljelypullo huuhdeltiin muutaman päivän jälkeen PBSliuoksella, jonka jälkeen solut irroitettiin trypsiinillä. Trypsiini neutraloitiin soluviljelymediumilla, jonka jälkeen solut siirretiin Falcon-putkeen jossa solut sentrifugoitiin. Sentrifugoinnin jälkeen supernatantti pipetoitiin pois ja soluihin lisättiin soluviljelymediumia. Puhdistetut solut siirrettiin takaisin soluviljelypulloon soluviljelymediumiin kasvamaan inkubaattoriin. Kaikkien solulinjojen annettiin kasvaa, ja niiden määrän kasvaa, ja niiden kasvatusmediumit vaihdettiin kahdesti viikossa, kunnes soluja oli riittävästi kokeiden suorittamista varten. 4.4. Kokeiden suorittaminen Soluille suoritettiin kokeita PFOA:n toksikolgisen vaikutuksen arvioimiseksi. Kokeilla arvioitiin PFOA:n vaikutusta solujen kasvuun, erilaistumiseen osteoblasteiksi ja niiden aineenvaihdunnan tehokkuutta. Lisäksi soluille suoritettiin mesenkymaalisten kantasolujen pinta-analyysi, jolla selvitettiin solujen pinta-antigeenit. Näin pyrittiin karakterisoimaan, olivatko solut mesenkymaalisia kantasoluja, International Society of Cellular Therapy:n määrittämien kriteerien mukaisesti. 4.5. Mesenkymaalisten kantasolujen pinta-analyysi International Society of Cellular Therapy:n määritelmien mukaan mesenkymaalisten kantasolujen minimikriteeri solujen pinta-analyysissä on, että ne ovat yli 95 % positiivisia CD 29-, CD44-, CD90-, CD49a-f-, CD51-, CD73-(SH3), CD105- (SH2), CD106-, CD166- JA Stro-1-antigeeneille. Niiden on myös oltava alle 2 % positiivisia CD45-, CD34-, CD14- tai 9

CD11b-, CD79a- tai CD19- ja HLA-DR-pinta-antigeeneille. Lisäksi mesenkymaalisten kantasolujen on kyettävä erilaistumaan in virto sekä luu-, rusto- että rasvasoluiksi, sekä niiden on kyettävä tarttumaan muoviin. Niillä ei myöskään saa olla immunologisia vaikutuksia, ja niiden on kyettävä korvaamaan vahingoittunutta kudosta. (Maleki ym. 2014) Pinta-analyysissä käytettiin 1 miljoonaa kpl Whartonin hyytelöstä eristettyjä soluja, joilta mitattiin yhdeksän pinta-antigeenia ja 100 000 solua käytettiin negatiivisena kontrollinäytteenä. Solut olivat PBS-0,5%/BSA-leimauspuskuriliuoksessa 1 ml näyteputkessa, joista solut jaettiin kymmeneen näyteputkeen, joissa jokaisessa oli 100µl, ja näyteputkiin lisättiin 2µl pinta-antigeeneja per näyteputki. Määritettävinä antigeeneina oli CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, CD14, HLA-DR, CD19, CD54, CD49c ja CD44. Tämän jälkeen näytteet sentrifugoitiin ja sekoitettiin Vortex-laitteella ja inkuboitiin 20 min valolta suojattuna. Tämän jälkeen näyteputket täytettiin leimauspuskuriliuoksella ja sentrifugoitiin 3000 rpm viiden minuutin ajan. Sentrifugoinnin jälkeen supernatantti poistettiin ja senkka resuspensoitiin 100 µl 1% PFA-PBS-puskuriin. Lopuksi näytteet pipetoitiin FACS (fluorescence-activated-cell-sorting)-näyteputkiin ja laitettiin analyysikoneeseen analysoitavaksi. 4.6. Mitokondrioiden määritys MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide]- mittaus antaa suuntaa antavan määrän mitokokondrioiden määrästä solunäytteessä. Hengitysketju pelkistää MTTsuoloja liukenemattomiksi, violeteiksi kiteiksi solujen sisälle, joiden määrä voidaan määrittää spektrofotometrisesti. (Freimoser ym. 1999) MTT-mittaukseen käytettäviä soluja viljeltiin mediumissa, jossa oli viisi eri PFOA konsentraatiota sekä verrokkiryhmä, joka ei altistunut PFOA:lle. PFOA-konsentraatioina käytettiin 0µM, 1µM, 10µM, 100µM, 200µM ja 500µM. Soluja viljeltiin 96-kuoppaisella kuoppalevyllä, jossa joka PFOA-konsentraatiolle oli omat solut. Levyjä oli viisi, yksi jokaista mittausajankohtaa varten. Soluja viljeltiin PFOA-konsenteeriota vastaavalla mediumilla kokeen ajan, ja spektrofotometriset mittaukset suoritettiin ajankohtina; yksi päivä, viikko, kaksi viikkoa, kolme viikkoa ja neljä viikkoa ensimmäisen PFOA-altistuksen jälkeen. MTTmittausta edeltävästi PFOA-medium vaihdettiin MTT-mediumiksi, jossa oli MTT-liuosta 10 V-% ja perusmediumia 90 V-%, jonka jälkeen näytteitä inkuboitiin vielä kolme tuntia ennen 10

mittausta. Lopuksi MTT-medium poistettiin ja tilalle pipetoitiin 100µl DMSO:a, jonka jälkeen spektrofotometriset mittaukset suoritettiin 550nm ja 650nm aallonpituuksilla Victoranalysaattorilla. 4.7. Osteoblastinen erilaistumiskoe Osteoblastien erilaisumiskokeessa vijeltäville soluille tehtiin oma osteoblastien erilaistamismedium, jossa oli perusmediumin aineosien; α-minimum-essential-medium 200ml, Penisilliini-Streptomysiini 2,2ml, Fetal-bovine-serum 20ml ja HEPESpuskuriliuoksen 4ml lisäksi osteoblastiseen erilaistumiseen vaadittavat deksametasoni konsentraatiolla 10-7 M, β-glyserolifosfaatti konsentraatiolla 10-2 M sekä askorbiinihappo konsentraatiolla 2.8 x 10-4 M. Osteoblastien erilaistumiseen vaadittavasta mediumista tehtiin viidellä eri PFOA-konsentraatiolla lopulliset mediumit, joissa PFOA-pitoisuus oli 1µM, 10µM, 100µM, 200µM ja 500µM. Lisäksi tehtiin kontrollimedium, jonka PFOA-pitoisuus oli 0µM. Solut pipetoitiin 24-kuoppaisille kuoppalevyille, -jokaiseen kuoppaan 10 000 solua. Soluja viljeltiin omaa PFOA-pitoisuutta vastaavalla mediumilla kokeiden suorittamisen vaadittavan ajan. 4.7.1. Alkaalisen fosfataasin aktiivisuusmittaus AFOS on erityisesti maksassa ja luustossa esiintyvä defosforyloiva entsyymi, joka defosforyloi proteiineja ja nukleotideja. Sitä käytetään erityisesti maksa- ja luustosairauksien diagnostiikassa. AFOS liittyy luiden metaboliaan, heijastaen osteoblastien aktiivisuutta. (Kang ym.2015) Kolmen viikon kasvatuksen jälkeen solut pestiin kolme kertaa PBS:llä, jonka jälkeen kuoppiin lisättiin AFOS-lyysipuskuriliuosta, joka sisälsi 50 mm Tris-HCl, 0,1%Triton x-100 ja 0,9%NaCl, 200µl per kuoppa ja lopuksi solut pakastettiin -70C. AFOS:n aktiivisuusmääritys aloitettiin sulattamalla solut jääkaapissa. Näytteet sekoitettiin pipetoimalla homogeeniseksi, jonka jälkeen näytteet pipetoitiin kahteen rinnakkaiseen kuoppaan kuoppalevyllä, sekä proteiinimääritystä varten omalle kuppalevylle vastaavasti. Yhteen kuoppaan pipetoitiin 10µl näytettä, 85µl AFOS-määrityspuskuriliuosta, joka sisälsi 1M Tris ja 1mM MgCl2, ja 15µl PNPP:a (para-nitrofenyylifosfaatti). Lisäksi kuoppalevyille pipetoitiin 11

verrokkinäyte, jossa oli PNPP:a ja AFOS-määrityspuskuriliuosta. Näytteitä inkuboitiin 30 minuuttia, jonka jälkeen reaktio lopetettiin lisäämällä kuoppiin 100µl 1M NaOH:a. Reaktiossa reaktiotuote oli värillinen, jonka absorbanssi mitattiin spektrofotometrisesti Viktor-analysaattorilla aallonpituudella 405nm. Absorbansseista vähennettiin verrokkinäytteen absorbanssi ja lopuksi absorbanssi suhteutettiin proteiinipitoisuuteen. Proteiinimääritys suoritettiin näytteille, jotta AFOS:n aktiivisuus voitiin suhteuttaa kokonaisproteiinimäärään. Näytettä pipetoitiin 10µl per kuoppa kahdelle rinnakkaiselle kuoppalevylle. Proteiinistandardia pipetoitiin vastaava määrä kahdelle rinnakkaiselle kuoppalevylle, ja lisäksi pipetoitiin kuoppalevyille proteiinistandardien nollanäyteeksi vesi, ja näytteiden nollanäyteeksi lyysipuskuri. Jokaiseen kuoppaan pipetoitiin 25µl Reagent A:ta ja 200µl Reagent B:tä, jonka jälkeen näytteitä inkuboitiin 15 minuuttia. Lopuksi näytteiden absorbanssi mitattiin Viktor-analysaattorilla aallonpituudella 650nm. Proteiininäytteiden absorbansseja verrattiin proteiinistandardien absorbansseihin. Proteiinistandardien absorbansseista vähennettiin veden absorbanssi ja proteiininäytteiden absorbanssista vähennettiin AFOS-lyysipuskurin absorbanssi, jolloin saatiin laskettua proteiinien oma absorbanssi. Koska jokaista näytettä oli kaksi kappaletta, lopullisena absorbanssina käyettiin niiden absorbanssien keskiarvoa. 4.7.2. Kalsiumin kertyminen Osteoblastinen erilaistuminen määritettiin myös kalsiumin kertymisellä kasvatuslevyjen kuoppiin. Kalsiumin kertymistä varten soluja kasvatettiin viisi viikkoa osteoblastien erilaistumismediumilla. Solulinjoja kasvatettiin 0µM:n, 1µM:n, 10µM:n, 100µM:n, 200µM:n ja 500µM:n PFOA konsentraatioilla. Viiden viikon jälkeen mediumit imettiin pois kuoppalevyiltä ja solut pestiin kalsiumista ja magnesiumista vapaalla PBS:llä kolme kertaa. Tämän jälkeen kuoppalevyt pakastettiin -70C :ssa. Sulattamisen yhteydessä kuoppiin lisättiin 200µl 0.6 M suolahappoa, jonka jälkeen soluja inkuboitiin yön yli. Seuraavana päivänä pipetoitiin yhdestä kaivosta 20µl näytettä 96-kaivon levylle. Levylle pipetoitiin myös kalsiumstandardia näytteiden kalsiumpitoisuuksien määrittämiseksi. Näytettä ja standardia pipetoitiin kahteen kuoppaan, jolloin niiden absorbanssien määrittämisen yhteydessä voitiin laskea tulosten keskiarvo. Myös HCl:a sisältävän taustanesteen absorbanssi määritettiin. Kaivoihin lisättiin näytteen ja standardin päälle 200µl reagenssiseosta. Reagenssiseoksen lisäämisen jälkeen absorbanssit kuoppalevyiltä määritettiin aallonpituudella 550nm. 12

Absorbanssien määrityksen jälkeen, taustan absorbanssi vähennettiin näytteiden ja kalsiumstandardien absorbanssista, jolloin saatiin näytteiden kalsiumin absorbanssi. Näytteiden absorbanssia verrattiin kalsiumkontrollin absorbanssiin, jonka kalsiumpitoisuus tunnettiin. Vertailemalla näytteitä kalsiumkontrolliin, saatiin laskettua näytteiden kalsiumin määrä. 13

5. TULOKSET 5.1. Mesenkymaalisten kantasolujen pinta-analyysi Pinta-analyysi, jossa selvitettiin, ilmentävätkö solut mesenkymaalisten kantasolujen pintaantigeeneja, suoritettiin ensimmäisestä istukasta Whartonin hyytelöstä eristetyille soluille. Solujen määrityksessä noudatettiin siis International Society of Cellular Therapy-järjestön määritelmää mesenkymaalisista kantasoluista, ja määriteltäviä solujen pinta-antigeeneja olivat CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, CD14, HLA-DR, CD19, CD54, CD49e ja CD44. Taulukko 2. Mesenkymaalisten kantasolujen pinta-analyysi. Taulukossa esitetään International Society of Cellular Therapy:n kriteerit mesenkymaalisten kantasolujen pintaantigeeneista, sekä tulokset Whartonin hyytelön solujen pinta-analyysistä. Pinta-antigeeni ISCT:n kriteeri % Tulokset pinta-analyysistä % CD105 >95 14,87 CD73 >95 39,55 CD90 >95 23,69 CD44 >95 27,93 CD49e >95 61,99 CD14, HLA-DR, CD19 <2 6,44 CD54 <2 1,63 CD34 <2 3,13 CD45 <2 3,42 Taulukko 2. esittää tulokset mesenkymaalisten kantasolujen pinta-analyysistä, jotka suoritettiin Whartonin hyytelöstä eristetyille soluille. Taulukossa on esitetty keskellä International Society of Cellular Therapy:(ISCT) minimikriteerit, -eli kuinka suuren osan soluista on ilmennettävä kyseistä pinta-antigeenia, sekä oikealla pinta-analyysin tulokset. Tuloksista ilmenee, että CD54:ä poislukien solut eivät noudata International Society of Cellular Therapy:n asettamia minimikriteerejä pinta-antigeenien ilmentämisestä. Näin ollen kyseisiä soluja ei voi kutsua mesenkymaalisiksi kantasoluiksi. 14

5.2. Mitokondrioiden määritys MTT-testi suoritettiin soluille niiden mitokondrioden määrän ja sitä kautta solumäärän arvion selvittämiseksi. MTT-testi suoritettiin luuydinsoluille, istukan korionkalvon soluille ja Whartonin hyytelön soluille sekä istukan napaveren soluille. MTT-testissä solujen absorbanssit mitattiin ja tulosten tilastollinen merkitsevyys määritettiin SPSS-ohjelmalla. Eri PFOA-konsentraatiolla altistettujen solujen absorbansseja vertailtiin kontrolliin, niiden tilastollisten eroavaisuuksien määrittämiseksi. Kuvioissa p-lukua merkitään tähtimerkillä, jossa yksi tähti merkitsee p-luvun olevan alle 0,05, kaksi tähteä merkitsee p-luvun olevan 0,01 tai sen alle ja kolme tähteä merkitsee p-luvun olevan 0,001 tai sen alle. Kuvioissa 1-5 näkee, että absorbanssit eri kudoksien välillä vaihtelee paljon, -esimerkiksi korionkalvon ja napaveren sekä Whartonin hyytelön välillä absorbanssien vaihelu on suurta (ks. kuvio 1, kuvio4 ja kuvio 5). 5.2.1. Korionkalvon MTT-tulokset PFOA ei näytä vaikuttavan korionkalvosta eristettyjen solujen kasvuun, paitsi suurimmalla 500µM:n konsentraatiolla. Pienemmillä konsentratioilla kasvu näyttää jopa kiihtyvän. Kuviosta nähdään myös, että eri PFOA-konsentraatioiden välillä on tilastollisesti merkitseviä eroja solujen määrissä (ks. kuvio 1). 15

Kuvio 1. Korionkalvon MTT-testitulokset. Kuviossa nähdään tulokset eri PFOAkonsentraatioilla jokaisen mittauspäivän kohdalla. Kuvioon on myös merkitty kontrollista tilastollisesti poikkeavat erot tähdillä. 5.2.2. Luuytimien MTT-tulokset Luuytimien solujen kuvioissa (kuvio 2 ja kuvio 3) PFOA ei näytä hidastavan solujen aineenvaihduntaa suurimmillakaan konsentraatioilla. Luuytimien solujen kasvu näyttää jopa kiihtyvän kasvavan PFOA-konsentraation myötä ja tilastollisesti merkitsevät erot tukevat tätä. Luuytimien kohdalla absorbanssi ei kuitenkaan ollut napaveren solujen ja korionkalvon solujen tasolla. 16

Kuvio 2. Ensimmäisen luuydinnäytteen MTT-testin tulokset, jossa nähdään jokaisen mittauspäivän tulokset eri PFOA-konsentraatioilla. Tähdet osoittavat kontollista tilastollisesti poikkeavat tulokset. Kuvio 3. toisen luuydinnäytteen MTT-testin tulokset. Kontrollista tilastollisesti poikkeavat erot on merkitty kuvaajaan tähdillä. Kuvaajassa nähdään mittauspäivien tulokset jokaisella käytetyllä PFOA-konsentraatiolla. 5.2.3. Whartonin hyytelön MTT-tulokset Whartonin hyytelön kohdalla PFOA:n eri konsentraatiot eivät näytä aiheuttavan eroja solujen MTT-testin tuloksiin verrattaessa kontrolliin. Eri PFOA-konsentraatioiden välillä ei ole tilastollisesti poikkeavia eroja verrattaessa soluihin, joita kasvatettiin ilman PFOA:a. Lisäksi 17

absorbanssi Whartonin hyytelön solujen kohdalla on pientä verrattuna muiden kudosten absorbansseihin. Kuvio 4. Whartonin hyytelön MTT-testin tulokset. Kontrollista tilastollisesti poikkeavat tulokset on merkitty kuvaajaan tähdillä. Kuvioon on merkitty eri mittauspäivien tulokset eri PFOA-konsentraatioilla. 5.2.4. Napaveren MTT-tulokset Napaveren MTT-testin tuloksissa solujen solumäärä näyttää kasvavan maltillisesti kasvavilla PFOA-konsentraatioilla verrattaessa ilman PFOA:a kasvatettuihin soluihin (kuvio 5). Napaveren soluilla on kuitenkin suurin absorbanssi kaikista vertailussa olleista kudoksista. 18

Kuvio 5. Kuviossa nähdään napaveren MTT-testitulokset. Kontrollista tilastollisesti poikkeavat arvot on merkitty kuvaajaan tähdillä. Kuvaajassa on eri mittauspäiville merkitty tulokset käytetyillä PFOA-konsentraatioilla. 5.3. Osteoblastinen erilaistumiskoe Solujen osteoblastista erilaistumista selvitettiin niiden alkaalisen fosfataasin aktiivisuudella ja kalsiummineraalin kertymisellä. Kalsiumin kertyminen ja alkaalisen fosfataasin aktiivisuus määritettiin istukan amnionkalvon soluille, istukan korionkalvon soluille ja istukan napaveren soluille. Kalsumin kertyminen määritettiin mikrogrammoina soluviljelykuoppaa kohden ja AFOS:n aktiivisuus proteiinimilligrammaa kohden. Solulinjojen absorbanssit määritettiin ja tulosten merkitsevys määritettiin SPSS-ohjelmalla, jossa eri PFOA-konsentraatioilla viljeltyjä solulinjoja vertailtiin kontrolliin ja tilastollisesti poikkeavat erot määritettiin. 5.3.1. Korionkalvon osteoblastinen erilaistuminen Kuviossa 6. esitellään korionkalvon osteoblastisen erilaistumiskokeen tulokset. PFOA:n eri konsentraatioilla ei näytä olevan vaikutusta solujen AFOS:n aktiivisuuteen. Kalsiumin kertymisessä nähdään kontrollista tilastollisesti poikkeavia arvoja, jossa pienemmillä konsentraatioilla kalsiumin kertyminen näyttää kiihtyvän ja vasta suurimmalla 500µM PFOAkonsentraatiolla kalsiumin kertyminen vähenee. 19

Kuvio 6. Korionkalvon AFOS:n aktiivisuusmittaus ja kalsiumin kertyminen. 5.3.2. Amnionkalvon osteoblastinen erilaistuminen Amnionille osteoblastinen erilaistumiskoe suoritettiin kahdesta eri istukasta eristetyille soluille, joiden tulokset esitetään kuviossa 7 ja kuviossa 8. PFOA:n eri konsentraatiolla ei näytä olevan vaikutusta amnionista eristettyjen solujen AFOS:n aktiivisuuteen kummassakaan solulinjassa. AFOS:n aktiivisuus eri istukoista eristettyille amnionsoluille poikkeaa toisistaan kuitenkin huomattavasti. Kalsiumin kertymisessä ei kuviossa 7. nähdä kontrollista tilastollisesti poikkeavia arvoja. Kuviossa 8. kuitenkin nähdään kontrollista tilastollisesti poikkeavia arvoja suurimmilla PFOA-konsentraatioilla, jossa 200µM:n ja 500µM:n konsentraatioilla kalsiuimin kertyminen näyttää kasvavan. Kuvio 7. Amnionin AFOS:n aktiivisuusmittaus ja kalsiumin kertyminen. Kuviossa nähdään tulokset toisesta istukasta eristetyille amnionsoluille. 20

Kuvio 8. Amnionin AFOS:n aktiivisuusmittaus ja kalsiumin kertyminen. Kuviossa nähdään neljännestä istukasta eristettyjen solujen tulokset. 5.3.3. Napaveren osteoblastinen erilaistuminen Napaveren osteoblastisen eriaistumisen tulokset esitellään kuviossa 9. PFOA ei näytä hidastavan solujen AFOS:n aktiivisuutta, vaan pikemminkin suurentavan sitä. Suurimmilla 100µM:n ja 200µM:n PFOA-konsentraatioilla AFOS:n aktiivisuus on kasvanut verrattaessa kontrolliin. Lisäksi napaveren AFOS:n aktiivisuus näyttää olevan huomattavasti suurempi kuin muista kudoksista eristettyjen solujen. Kalsiumin kertymiseen napaveren soluilla PFOA:lla ei näytä olevan vaikutusta. Kalsiumin kertymisessä ei esiinny tilastollisia eroja kontrollin ja eri PFOA-konsentraatioiden välillä. Kuvio 9. Napaveren AFOS:n aktiivisuus ja kalsiumin kertyminen. 21

6. POHDINTA Tutkimuksessa tehtiin ensimmäiseksi mesenkymaalisten kantasolujen pinta-analyysi Whartonin hyytelöstä eristetyille soluille. Tuloksista selvisi, että Whartonin hyytelön solut eivät noudattaneet taulukossa 1. esitettyjä kriteerejä, eivätkä siis olleet mesenkymaalisia kantasoluja. Kyseiset solut olivat mahdollisesti jo alun perin olleet muita soluja kuin mesenkymaalisia kantasoluja, tai ne olivat ehtineet jo erilaistua. Seuraavaksi soluille tehtiin PFOA-altistuskokeet, jossa selvitettiin PFOA:n vaikutusta solujen aineenvaihduntaan ja niiden erilaistumiseen osteoblasteiksi. Lisäksi vertailtiin PFOA:n vaikutusta istukan ja luuytimen solujen mitokondrioiden määrän välillä. Istukan solujen mitokondrioiden aktiivisuus oli suurempaa kuin luuytimen solujen, -pois lukien Whartonin hyytelön solut, joiden mitokondrioiden aktiivisuus osoittautui pienimmäksi kaikista MTT-testissä. Istukan solujen suurempi aktiivisuus voi selittyä niiden nopeammalla kasvulla ja jakautumisnopeudella (Jin ym. 2013). Whartonin hyytelön kohdalla solujen pieni mitokondrioiden aktiivisuus selittynee niiden heikosta jakautumisesta kokeen aikana. Lopuksi istukan eri kudoksille tehtiin osteoblastinen erilaistumiskoe, jossa selvitettiin AFOS:n aktiivisuutta ja kalsiumin kertymistä. PFOA:n eri konsentraatioilla ei ollut vaikutusta AFOS:n aktiivisuuteen, kuin napaveren soluilla, joilla AFOS:n aktiivisuus oli korkeinta kaikista käytetyistä kudoksista. Kalsiumin kertymiseen PFOA aiheutti tilastollisia eroja vain korionkalvon soluille ja neljännen istukan amnionin soluille. Korionkalvon soluissa vasta suurin 500µM:n konsentraatio laski kalsiumin kertymistä ja amnionin kohdalla kalsiumin kertyminen nousi 200µM:n ja 500µM:n konsentraatioilla. Suurimpaa 500µM konsentraatiota lukuun ottamatta PFOA ei näytä vaikuttavan istukan soluissa osteoblastiseen erilaistumiseen hidastavasti, vaan näyttää jopa nopeuttavan solujen erilaistumista osteoblasteiksi. Tutkimuksessa käytettiin montaa eri kudosta eri kokeisiin. Eri kokeiden välillä kudokset vaihtelivat kuitenkin toisistaan, joten mistään kudoksesta ei saatu tuloksia jokaisesta kokeesta. Whartonin hyytelön pinta-analyysin tuloksiin vaikutti todennäköisesti se, että solut olivat jo kauan olleet viljelyssä ja sen yhteydessä jaettu useampaan kertaan, jolloin niillä oli ollut aikaa erilaistua. Koska pinta-analyysi suoritettiin vain Whartonin hyytelön soluille, ei muiden kudosten kantasoluominaisuuksista ollut riittävää informaatiota. Vertailevaa tutkimusta ei myöskään voitu tehdä, kuin MTT-testin osalta, koska luuytimen soluja ei erilaistettu osteoblasteiksi. Solumäärän arvioinnissa ei myöskään voida suoraan luottaa MTT-testiin, koska se mittaa elektronisiirtoketjun aktiivisuutta tietyssä solupopulaatiossa. Tämän takia se 22

antaa lähinnä kuvan mitokondrioiden määrästä, joka voi vaihdella soluista riippuen huomattavasti. Lisäksi kokeiden pieni määrä lisää tutkimuksen tulosten epävarmuutta. Jokainen koe suoritettiin vain kerran ja vain yhdestä istukan näytteestä saaduille soluille ja yhtä solulinjaa viljeltiin kuoppalevyllä vain kuudessa kuopassa. Pienen solumäärän takia myös tulosten virhemarginaali jäi suureksi. Koska kokeisiin käytettiin soluja vain yhdestä istukasta, ei myöskään eri istukoiden välisiä eroja voitu arvioida. Tutkimuksen perusteella PFOA ei hidasta istukan solujen aineenvaihduntaa, eikä vaikuta niiden erilaistumiseen luusoluiksi. 23

7. LÄHTEET Amari A, Ebtekar M, Moazzeni SM, Soleimani M, Amirabad LM, Tahoori MT et.al. Investigation of immunomodulatory properties of Human Wharton s Jelly-derived Mesenchymal Stem Cells after lentiviral transduction. Cell Immunol 2015; 293:59-66. Baksh D, Yao R, Tuan RS. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells 2007; 25:1384-1392. Bjork JA, Butenhoff JL, Wallace KB. Multiplicity of nuclear receptor activation by PFOA and PFOS in primary human and rodent hepatocytes. Toxicology 2011; 288:8-17. Chen MH, Ha EH, Wen TW, Su YN, Lien GW, Chen CY et.al. Perfluorinated compounds in umbilical cord blood and adverse birth outcomes. 2012 PLoS ONE 7(8): e42474. Fatimah SS, Tan GC, Ghua K, Fariha M, Tan AE, Hayati AR. Stemness and angiogenic gene expression changes of serial-passage human amnion mesenchymal cells. Microvasc Res 2013; 86:21-29. Freimoser FM, Jakob CA, Aebi M, Tuor U. The MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- Diphenyltetrazolium Bromide] Assay Is a Fast and Reliable Method for Colorimetric Determination of Fungal Cell Densities. Appl Environ Microbiol 1999; 8:3727-3729. Fu YS, Cheng YC, Lin MY, Cheng H, Chu PM, Chou SC et.al. Conversion of Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells in Wharton's Jelly to Dopaminergic Neurons In Vitro: Potential Therapeutic Application for Parkinsonism. Stem Cells 2006; 24:115-124. Heo JS, Choi Y, Kim HS, Kim HO. Comparison of molecular profiles of human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, umbilical cord blood, placenta and adipose tissue. Int J Mol Med 2016; 37:115-125. Jin HJ, Bae YK, Kim M, Kwon SJ, Jeon HB, Choi SJ. Comparative analysis of human mesenchymal stem cells from bone marrow, adipose tissue and umbilical cord blood as sources of cell therapy. Int. J. Mol. Sci. 2013; 14:17986-18001. Kang KY, Hong YS, Park SH, Ju JH. Increased serum alkaline phosphatase levels correlate with high disease activity and low bone mineral density in patients with axial spondyloarthritis Semin Arthritis Rheum 2015; 2:202-207. Koskela A, Finnilä MA, Korkalainen M, Spulber S, Kopnen J, Håkansson H et.al. Toxicol Appl Pharmacol 2016; 301: 14-21. Kudo N, Suzuki E, Katakura M, Ohmori K, Noshiro R, Kawashima Y. Comparison of the elimination between perfluorinated fatty acids with different carbon chain lenght in rats. Chem Biol Interact 2001; 134:203-216. Kwon A, Kim Y, Kim M, Kim J, Choi H, Jekarl DW et.al. Tissue specific differentiation potency of mesenchymal stromal cells from perinatal tissues. Sci Rep. 2016; 6: 23544. 24

Laitinen A, Nystedt J, Laitinen S. The Isolation and Culture of Human Cord Blood- Derived Mesenchymal Stem Cells Under Low Oxygen Conditions. Methods Mol Biol 2011; 698:63-73. Lee JM, Jung J, Lee HJ, Jeong SJ, Cho KJ, Hwang SG et.al. Comparison of immunomodulatory effects of placenta mesenchymal stem cells with bone marrow and adipose mesenchymal stem cells. Int Immunopharmacol 2012; 13: 219-224. Lu G, Zhu S, Ke Y, Jiang X, Zhang S. Transplantation-potential-related biological properties of decidua basalis mesenchymal stem cells from maternal human term placenta. Cell Tissue Res 2013; 352:301-312. Luan X, Li G, Wang G, Wang F, Lin Y. Human placenta-derived mesenchymal stem cells suppress T cell proliferation and support the culture expansion of cord blood CD34+ cells: A comparison with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Tissue Cell 2013; 45:32-38. Macon MB, Villanueva LR, Tatum-Gibbs K, Zehr RD, Strynar MJ, Stanko JP et.al. Prenatal perfluorooctanoic acid exposure in CD-1 mice: low-dose development effects and internal dosimetry. Toxicol Sci 2011; 1:134-145. Maleki M, Ghanbarvand F, Behvarz MR, Ejteamei M, Ghadirkhomi E. Comparison of mesenchymal stem cell markers in multiple human adult stem cells. Int J Stem Cells 2014; 7:118-126. Mennan C, Wriht K, Bhattacharjee A, Balain B, Richardson J, Roberts S. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. Biomed Res Int. 2013; 2013: 916136. Miao C, Ma J, Zhang Y, Chu Y, Li J, Kuai R et.al. Perfluorooctanoic acid enhances colorectal cancer DLD-1 cells invasiveness through activating NF-κB mediated matrix metalloproteinase-2/-9 expression. Int J Clin Exp Pathol 2015; 8:10512-10522. Ohno M, Ito M, Ohkura R, Mino A, Kose T, Okuda T et.al. Photochemical decomposition of perfluorooctanoic acid mediated by iron in strongly acidic conditions. J Hazard Mater 2014; 15:150-155. Olsen GW, Burris JM, Ehresman DJ, Froehlich JW, Seacat AM, Butenhoff JL et.al. Half-Life of Serum Elimination of Perfluorooctanesulfonate, Perfluorohexanesulfonate, and Perfluorooctanoate in Retired Fluorochemical Production Workers. Environ Health Perspect 2007;9: 1298-1305. Perez F, Nadal M, Navarro-Ortega A, Fabrega F, Domingo JL, Barcelo D et.al. Accumulation of perfluoroalkyl substances in human tissues. Environ Int 2013; 59:354-362. Soo-Seo M, Park SB, Kim HS, Kang J, Chae JS, Kang KS. Isolation and characterization of equine amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells. J Vet Sci 2013; 14:151-159. Stigaard-Kjeldsen L, Bonefeld-Jørgensen EC. Environ Sci Pollut Res 2013; 20:8031-8044. Sung HJ, Hong SC, Yoo JH, Oh JH, Shin HJ, Choi IY et.al. Stemness Evaluation of Mesenchymal Stem Cells from Placentas According to Developmental Stage: Comparison to Those from Adult Bone Marrow. J. Korean Med Sci 2010; 25:1418-1426. 25

Tabatabaei M, Mossafa N, Nikoo S, Bozorgmehr M, Ghods R, Kazemnejad S et.al. Isolation and Partial Characterization of Human Amniotic Epithelial Cells: The Effect of Trypsin. Avicenna J Med Biotechnol. 2014; 6:10-20. Wang X, Hu H, Hua R, Yang J, Zheng P, Niu X et.al. Effect of umbilical cord mesenchymal stromal cells on motor functions of identical twins with cerebral palsy: pilot study on the correlation of efficacy and hereditary factors. Cytotherapy 2015; 17:224-231. Yahia D, El-Nasser MA, Abedel-Latif M, Tsukuba C, Yoshida M, Sato I et.al. Effects of perfluorooctanoic acid (PFOA) exposure to pregnant mice on reproduction. J. Toxicol. Sci. 2010; 4:527-533. Yan M, Sun M, Zhou Y, Wang W, He Z, Tang D et.al. Conversion of Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells in Wharton s Jelly to Dopamine Neurons Mediated by the Lmx1a and Neurturin In Vitro: Potential Therapeutic Application for Parkinson s Disease in a Rhesus Monkey Model. Plos One. 2013; 8(5): e64000. Yang B, Zou W, Hu Z, Liu F, Zhou L, Yang S. Involvement of oxidative stress and inflammation in liver injury caused by perfluorooctanoic acid exposure in mice. Biomed Res Int 2014; 409837. Yen BL, Huang HI, Chien CC, Jui HY, Ko BS, Yao M et.al. Isolation of Multipotent Cells from Human Term Placenta. Stem Cells. 2005; 23: 3-9. Zhu Z, Liu Z, Liu J, Bi M, Yang T, Wang J. Proteomic profiling of human placenta-derived mesenchymal stem cells upon transforming LIM mineralization protein-1 stimulation. Cytotechnology 2015; 67:285-297. 26