Pipetointi, sentrifugointi ja spektrofotometria

Transkriptio

1 BIOKEMIAN MENETELMÄT I, SYKSY 2015 VASTAUKSET LUENTOMATERIAALIN TEHTÄVIIN: Pipetointi, sentrifugointi ja spektrofotometria Pesukoneen g-voimat: RCF (x g) = 1, (rpm)2 r = roottorin säde (cm), rpm= roottorin nopeus (kierrosta minuutissa), 1, = vakio sijoitetaan arvot kaavaan: 800 rpm: RCF = 1, x x 25 = 179 x g 1000 rpm: 298 x g 1200 rpm: 428 x g Huomaa g-voimien suurempi nousu kierrosnopeuteen verrattuna! Nomogrammista luettuna: 800 rpm: menee asteikon alle 1000 rpm: 280 x g 1200 rpm: 450 x g Kaavaa tai Nomogrammia tarvitaan yleensä silloin, jos roottorikohtaista g-arvotaulukkoa ei ole käytettävissä. Tällöin kaavasta ratkaistaan kierroslukumäärä kun haluttu g-arvo ja roottorin säde tiedetään. Huomaa että kulma- ja kääntyväputkiroottorissa roottorin säde ja siten sentrifugaalivoima on sentrifugiputken eri osissa erilainen!! Roottorin säteenä käytetään sentrifugiputken keskeltä mitattua arvoa. Millä sentrifugilla sentifugoisit: DNA-sakan erilleen 1 ml:sta nestettä x g? Bakteerit erilleen 200 ml:n kasvustosta 3000 x g? Sentrifugia valittaessa kiinnitetään huomio haluttuun sentrifugaalivoimaan ja sentrifugoitavan liuoksen tilavuuteen. DNA-sakan erilleen 1 ml:sta nestettä x g? : Sentrifugityyppien taulukon perusteella riittävät g-voimat löytyisivät seuraavista tyypeistä: mikro-, lattia- ja ultrasentrifugi. Lattiasentrifugi on tarkoitettu suurille liuostilavuuksille (10 ml satoja ml). Ultrasentrifugillakin käytettävät liuostilavuudet ovat suurempia, mutta ultrasentrifugia käytetään yleensä vain silloin, kun tarvitaan suurempia g-voimia kuin mitä lattiasentrifugilla saadaan. DNA-sakka on siis käytännöllisintä sentrifugoida mikrosentrifugilla (käynnistys- ja jarrutus/pysähtymisaika nopea, laite käytettävissä jokaisessa laboratoriossa).

2 Bakteerit erilleen 200 ml:n kasvustosta 3000 x g?: Em. taulukon perusteella kaikkien muiden paitsi minisentrifugin g-voimat riittävät. Näytetilavuuden perusteella käytännöllisimmät tyypit ovat lattia- ja pöytäsentrifugi. Jos 200 ml kasvuston bakteerisolut halutaan samaan pellettiin, valitaan lattiamalli ja esim. GSA-roottori. Jos bakteerisakka halutaan jakaa useampaan pieneen erään, voidaan sentrifugiputkina käyttää esim. 15 ml Falcon-putkia ja tehdä sentrifugointi pöytäsentrifugilla. Ultrasentrifugin käyttö on tarpeetonta, koska tarvittava g-arvo on pieni. DNA näyte laimennettiin pitoisuuden mittaukseen 1:100. Laimennokselle mitattiin A260=0,163 ja A280=0,1. Laske DNA:n alkuperäinen pitoisuus ja puhtaus. Määritettäessä DNA:n tai RNA:n pitoisuutta spektrofotometrillä, ei käytetä suoraan Lambert-Beerin lain kaavaa,koska pitkäketjuisen DNA:n tai RNA:n ainemäärän ilmoittaminen mooleina ei yleensä ole tarpeellista/käytännöllistä (lyhyiden yksijuosteisten DNA-ketjujen ns oligonukleotidien ainemäärät ilmoitetaan usein mooleina). Absorbanssin A alaviitteenä oleva luku tarkoittaa mittauksessa käytettävää aallonpituutta nanometreinä (nm). käytetään kaksijuosteiselle DNA:lle arvoa A 260 =1 kun pitoisuus on 50 µg/ml DNA:n pitoisuutta mitattaessa käytetään usein laimennettua näytettä, koska tavanomaisella spetrofotometrilla mittaus on tarkin silloin, kun mitattu absorbanssi on noin 0,1-0,8. otetaan huomioon laimennos, jolloin laimentamattoman näytteen absorbanssi olisi: 100 x 0,163 = 16,3 DNA:n pitoisuus on siis 16,3 kertaa suurempi kuin 50 µg/ml 16,3 x 50 µg/ml = 815 µg/ml = 0,82 mg/ml verrannolla sama asia: 1/50 = 16,3/x x= 50 x 16,3 µg/ml = 815 µg/ml DNA:n pitoisuuden voi tietysti laskea ensin laimennoksesta ja sen jälkeen kertoa saatu tulos laimennoskertoimella. Sinällään laimennetun näytteen DNA-pitoisuus on pelkkä laskennallinen välitulos ja haluttu arvo on aina laimentamattoman näytteen pitoisuus. Laimennosta tarvitaan vain oikealle mittausalueelle pääsemiseen. DNA:n puhtaus: mittaamalla absorbanssien suhde A260/A280 Puhtaalle DNA:lle suhde A 260/280 on noin 1,8-1,9. Proteiinit absorboivat aallonpituudella 280 nm joten jos DNA:lle mitattu A 260/280 on < 1,8 DNA-luoksessa voi olla mukana proteiinia kontaminaationa (epäpuhtautena). RNA :n ollessa epäpuhtautena A 260/280 voi olla > 1,9. Useimmiten DNA on käyttökelpoista vaikka A 260/280 suhde ei olisikaan optimaalinen. tehtävässä A 260/280 = 0,163/0,1 = 1,63 tulos viittaisi siis mahdolliseen proteiinikontaminaatioon.

3 ph JA PUSKURILIUOKSET, LIUOSTEN VALMISTUS JA STERILOINTI KANTALIUOSLASKUJA 1. Kuinka valmistat yhden litran seuraavia liuoksia? A) 1 M NaOH B) 10 % NaCl (w/v) C) 10 % metanoli (v/v) M(NaOH)= 40 g/mol, M(NaCl)=58 g/mol, M(metanoli)= 32 g/mol C= n/v n=m/m A) m=c x V x M= 1 mol/l x 1 l x 40 g/mol = 40 g punnitaan 40 g NaOH ja liuotetaan vajaaseen 1 litraan vettä, siirretään liuos 1 litran mittapulloon ja täytetään merkkiin saakka B) 1 litra vettä painaa 1000 g, 10 % tästä on 10/100 x 1000 g = 100 g punnitaan 100 g NaCl ja liuotetaan vajaaseen 1 litraan vettä, siirretään liuos 1 litran mittapulloon ja täytetään merkkiin saakka C) 1 litra = 1000 ml 10 % tästä on 10/100 x 1000 ml = 100 ml mitataan 100 ml metanolia 1 litran mittapulloon ja täytetään vedellä merkkiin saakka 2. Käyttämällä 1. kohdassa valmistettuja kantaliuoksia kuinka teet seuraavan liuoksen (lopputilavuus 100 ml), jossa on 500 mm NaOH, 1% NaCl ja 1 % metanoli. NaOH V 2 = 100 ml, C 2 = 0,5 M V 1 = (C 2 x V 2 )/C 1 = (0,5 mol/l x 0,1 l)/ 1 mol/l = 0,05 l = 50 ml NaCl V 2 = 100 ml, C 2 = 1 % V 1 = (C 2 x V 2 )/C 1 = ( 1 % x 0,1 l)/ 10 % = 0,01 l = 10 ml Metanoli V 2 = 100 ml, C 2 = 1 % V 1 = (C 2 x V 2 )/C 1 = ( 1 % x 0,1 l)/ 10 % = 0,01 l = 10 ml Lisätään 100 ml:n mittapulloon 50 ml NaOH kantaliuosta, 10 ml NaCl kantaliuosta, 10 ml metanolia ja täytetään vedellä merkkiin saakka. 3. Kuinka valmistat ammoniumsulfaatista (M w 132 g/mol) 1M liuoksen, jonka tilavuus on 500 ml? C= n/v n=m/m m ammoniumsulfaatti = C x V x M = 1 mol/l x 0,5 l x 132 g/mol = 66g Liuotetaan ammoniumsulfaatti vajaaseen puoleen litraan vettä, siirretään liuos 500 ml:n mittapulloon ja täytetään vedellä merkkiin saakka.

4 4. Kuinka saat kohdassa 3 valmistettua liuosta käyttämällä liuoksen, jonka tilavuus on 100 ml ja jonka ammoniumsulfaattikonsentraatio on 500 µm? C 1 x V 1 = C 2 x V 2 V 1 = (C 2 x V 2 )/C 1 = (500 x 10-6 mol/l x 0,1 l)/ 1 mol / l = 5 x 10-5 l = 0,00005 l = 0,05 ml = 50 µl Pipetoidaan 50 µl kantaliuosta 100 ml mittapulloon ja täytetään vedellä merkkiin saakka Ratkaisu kysymällä Kuinka paljon ammoniumsulfaattia tarvitaan? n= C x V = 500 x 10-6 mol/l x 100 x 10-3 l = 5 x 10-5 mol Kuinka paljon on kantaliuosta pipetoitava, jotta saataisiin 5 x 10-5 mol? V= n/c = 5 x 10-5 mol / 1 mol/ l = 5 x 10-5 l = 0,00005 l = 0,05 ml = 50 µl 6. Proteiinin tuottamiseksi pet 15b vektorissa E.coli bakteerin kannassa BL21 (DE3) plyss solut on kasvatettava LB-kasvatusliemessä, jossa on seuraavat antibiootit: kanamycin 50 ug/ml, gentamicin 7 ug/ml ja tetracycline 10 ug/ml. Kuinka paljon pipetoit antibiootteja 500 ml:aan LB-lientä, kun kunkin antibiootin kantaliuos on pitoisuudeltaan 10 mg/ml? C 1 x V 1 = C 2 x V 2 V 1 = (C 2 x V 2 )/C 1 Kanamycin: V 1 = (50x10-6 g/ml x 500 ml)/10 x 10-3 g/ml = 2,5 ml Gentamicin: V 1 = (7x10-6 g/ml x 500 ml)/10 x 10-3 g/ml = 0,35 ml Tetracycline: V 1 = (10x10-6 g/ml x 500 ml)/10 x 10-3 g/ml = 0,50 ml Ratkaisu kysymällä esim kanamycin: Kuinka paljon kanamysiiniä tarvitaan yhteensä? 50 µg/ml x 500 ml = µg = 25 mg Paljonko on kantaliuosta pipetoitava, jotta saataisiin 25 mg? 25 mg / 10 mg/ml = 2,5 ml

5 MOLEKYYLIBIOLOGIAN PERUSMENETELMÄT Sinun pitää katkaista 4 µg plasmidi-dna:ta EcoRI-restriktioentsyymillä EcoRI-reaktiopuskurissa. Reaktion kokonaistilavuus on 40 µl. Plasmidi-DNA:n pitoisuus 1 µg/µl reaktiopuskuriliuos 5x restriktioentsyymi 20 U/µl (1 U entsyymiä katkaisee 1 µg:n plasmidi-dna:ta tunnissa) Ilmoita kuinka paljon ja mitä pipetoit DNA:n katkaisureaktioon? Mitä välineitä tarvitset? PLASMIDI: V 1 = (C 2 x V 2 )/C 1 = 4µg / 1 µg/µl = 4 µl (huomaa että C 2 x V 2 = 4 µg annettiin valmiina) PUSKURI 5X : V 1 = (C 2 x V 2 )/C 1 = (1X x 40 µl) / 5X = 8 µl (muista että lasketaan/laimennetaan lopputilavuuteen) RESTRIKTIOENTSYYMI: V 1 = (C 2 x V 2 )/C 1 = 4U / 20 U/µl = 0,2 µl (tässäkin C 2 x V 2 = 4 U annettiin valmiina) VESI= 40 µl 4 µl 8 µl 0,2 µl = 27,8 µl muista että C 1 x V 1 = C 2 x V 2 kaavassa konsentraation paikalla voi olla: konsentraatio mol/l massakonsentraatio esim mg/ml pitoisuus unitteina U, esim. 10 U/µl pitoisuus prosentteina, esim 5% pitoisuus kertaisuutena, esim. 5X TARVITTAVAT VÄLINEET: em. reagenssit jäähauteella, automaattipipetit 0,5 µl- 10 µl ja 5 µl- 50 µl, eppendorf-putki, vortex, minisentrifugi, lämpöblokki tai vesihaude 37 o C. Kirjoita tai piirrä yhteenveto: Mikä ero on plasmidi-dna:n, genomisen DNA:n ja totaali-rna:n eristämisessä? solujen hajotukseen käytetään toisistaan poikkeavia liuoksia DNA:n eristyksessä käytettävän fenolin ph on noin 8. RNA:n eristyksessä fenolin ph on noin 4 genomisen DNA:n eristyksessä solujen hajotus on tehtävä erityisen varovasti plasmidi-dna:n eristyksessä solujäämät poistetaan saostamalla ja sentrifugoimalla, muissa fenoliuutolla. Miten nukleiinihapot saadaan puhdistettua solu/kudoslysaatista ja mihin puhdistuminen perustuu?

6 proteiinit poistetaan fenoliuutolla tai pylväskromatografialla tarvittaessa nukleiinihapot saostetaan alkoholilla (etanoli tai isopropanoli) suolan läsnä ollessa puhdistumisessa käytetään hyväksi eroja nukleiinihappojen ja proteiinien liukoisuudessa ja KROMATOGRAFIAN PERUSTEET Paperi- ja ohutlevykromatografian suoritus: Miten paperi/levy asetetaan astiaan ja miten pitkälle ajoliuoksen annetaan kulkeutua? Paperi/levy asetetaan ajokammioon niin että alalaidassa olevat näytteet tulevat pohjan puolelle ja yläreuna nojaa astian reunaan. Ajokammioon on kaadettu ajoliuosta niin että pinta jää näytepisteiden alapuolelle. Ajoa jatketaan kunnes liuosrintama on lähes saavuttanut paperin ylälaidan. Jos liuosrintama ehtii edetä paperin ylälaitaan saakka, Rf-arvoja ei voida enää luotettavasti määrittää. Ioninvaihtokromatogafia Mikä on anioininvaihtaja? Matriksi, jossa on positiivisesti varautuneita ryhmiä, sitoo negatiivisesti varautuneita molekyylejä = anioninvaihtaja Kuvassa on kationinvaihtaja. Edellisen kuvan perusteella kirjoita itsellesi ylös, mitä vaiheissa 1, 2, 3, ja 4 tapahtuu. 1) Proteiininäyte valutetaan pylvääseen. Positiivisen nettovarauksen omaavat proteiinit tarttuvat pylvääseen. Mitä suurempi (enemmään varauksia) varaus sitä tiukemmin proteiini tarttuu. 2) Pylvääseen valutetaan matalaa suolapitoisuutta, low salt jolloin epäspesifisesti (muun kuin varauksen kautta ) tarttuneet proteiinit irtoavat pylväästä. Negatiivisesti varautuneet proteiinit valuvat suoraan pylvään läpi. Matala suola,esim mm NaCl kannattaa lisätä suoraan proteiininäytteeseen, jolloin estetään turhien proteiinien tarttuminen pylvääseen. Puhdistuksen kannalta on parempi estää kontaminanttiproteiinien tarttuminen heti alussa,kuin antaa niiden tarttua alussa ja yrittää irrottaa niitä myöhemmin. 3) Keskinkertainen medium salt suolapitoisuus n mm irrottaa heikosti tarttuneet proteiinit (voi olla heikon positiivisen varauksen ja vahvemmin epäspesifisesti sitoutuneita proteiineja. 4) suuri suolapitoisuus high salt, noin mm irrottaa vahvemmin tarttuneet positiivisesti varautuneet proteiinit.

7 ELEKTROFOREETTISET MENETELMÄT DNA-fragmenttien erottelu ja koon määritys Onko plasmidille ja insertille määritetyt koot oikein, kun tarkastelet geelikuvaa? geelikuvan perusteella standardeihin verrattuna plasmidin koko (nä 2 ja 3 ylin vyöhyke) on noin 3,5 kb ( neljänneksi ylin standardi in 4361 bp ja plasmidi on selvästi tätä alempana. seuraava standardi on 2322 bp on jo selvästi plasmidia pienempi. standardikuvaajalta katsottuna plasmidi on 4457 bp eli liian suuri geeliltä katsottuna insertti on lähes saman kokoinen kuin khi X 174- HindIII standardin neljänneksi pisin standardi 603 bp. sen koko voisi olla noin 580 bp. kuvaajalta määritetty arvo on 550 bp, mikä vaikuttaa oikealta. Mitä voit sanoa pilkkomattomasta plasmidista? Pilkkomattoman plasmidin koko osien perusteella (plasmidi-vektori 3,5 kb + insertti 0,55 kb) = noin 4 kb Pilkkomaton plasmidi geelillä: kulkeutunut hieman pidemmälle kuin pilkottu plasmidi-vektori, vaikka siinä on insertti mukana. Pilkkomattoman rengasmaisen plasmidin liikkumiseen vaikuttaa sen rakenne: jos plasmidi on superkierteinen ( kiertynyt kierteelle kuin kuminauhalenkki), se likkuu geelillä nopeammin kuin sama DNA lineaarisena. jos taas superkierre on purkautunut ( plasmidi avoin rengas; toisen juosteen katkettua) plasmidirengas liikkuu geelillä hitaammin kuin sama DNA lineaarisena.