POHJOIS-KARJALAN AMMATTIKORKEAKOULU Bioanalytiikan koulutusohjelma

POHJOIS-KARJALAN AMMATTIKORKEAKOULU Bioanalytiikan koulutusohjelma Johanna Hiltunen Maija Makkonen LAITE- JA MENETELMÄVERTAILU: VIRTSAN PARTIKKELIEN TUTKIMINEN SYSMEX UF-100 -ANALYSAATTORILLA JA MIKROSKOPOIMALLA Opinnäytetyö Syksy 2008

OPINNÄYTETYÖ Syksy 2008 Bioanalytiikan koulutusohjelma Tikkarinne 9 80200 JOENSUU p. (013) 260 600 Tekijät Johanna Hiltunen, Maija Makkonen Nimeke Laite- ja menetelmävertailu: Virtsan partikkelien tutkiminen Sysmex UF-100 -analysaattorilla ja mikroskopoimalla Toimeksiantaja ISLAB/Mikkelin aluelaboratorio Tiivistelmä Opinnäytetyön tarkoituksena oli vertailla Sysmex UF-100 -analysaattorin ja mikroskopointimenetelmän eroja virtsan partikkelien laskennassa. Lisäksi selvitettiin, onko tarpeellista mikroskopoida näytteitä, joille analysaattori antaa hälytyksen. Näytteiden analysointi suoritettiin Mikkelin aluelaboratoriossa. Näytteinä käytettiin laboratorioon tulleita virtsanäytteitä. Näytteet analysoitiin ensin Sysmex UF-100 -analysaattorilla. Mikroskopoitaviksi valittiin näytteitä, joissa oli runsaasti soluja tai analysaattori oli antanut hälytyksen. Sen jälkeen valitut näytteet tutkittiin vakioidun mikroskopointiohjeen mukaan. Virtsanäytteitä tutkittiin yhteensä 52 kappaletta. Saadut tulokset käsiteltiin SPSS- ohjelmalla. Tuloksille laskettiin Spearmanin järjestyskorrelaatiokerroin, jonka perusteella arvioitiin menetelmien vertailtavuutta. Hälytysten oikeellisuutta arvioitiin vertaamalla eri hälytyksiä ja näiden näytteiden sisältämien partikkelien määriä taulukoituna. Tutkimustulosten perusteella punasolujen, valkosolujen, levyepiteelisolujen ja bakteerien määrät korreloivat hyvin toisiaan. Pienten epiteelisolujen määrät olivat riippumattomia toisistaan. Vastaavia tutkimuksia on tehty Tampereella ja Yhdysvalloissa. Näiden tutkimusten tulokset olivat samansuuntaisia kuin tässä opinnäytetyössä. Lisäksi tämän opinnäytetyön tulosten perusteella voidaan suositella, että näytteet, joille analysaattori antaa hälytyksen, pitäisi edelleen mikroskopoida. Kieli suomi Sivuja 50 Liitteet 6 Liitesivumäärä 9 Asiasanat virtsan partikkeli, Sysmex UF-100, vakioitu virtsan mikroskopointi, laite- ja menetelmävertailu

Authors Johanna Hiltunen, Maija Makkonen THESIS Autumn 2008 Degree Programme in Biomedical Science Tikkarinne 9 80200 JOENSUU FINLAND Tel. 358-13-260 600 Title Instrument and method comparison: Urine particle counting with Sysmex UF-100 -analyzer and microscopy Commissioned by ISLAB/Mikkeli Regional Laboratory Abstract The purpose of this thesis was to compare the differences in urine particle counting between Sysmex UF-100 - analyzer and microscopy. It was also researched how necessary it is to perform microscopy to the specimen which cause the analyzer to the alarm sign. Urine samples were analyzed in the Regional Laboratory of Mikkeli. The used specimens were urine specimens. At first the specimens were analyzed with Sysmex UF-100 -analyzer. Next were selected specimens to the microscopy. The selected specimens either contained lots of cells or caused the analyzer to the alarm. Afterwards the specimens were analyzed with the instructions of standardized urine microscopy. Altogether 52 specimens of urine were studied. The data were analyzed by SPSS program. Spearman`s Rank Correlation was used to assess the comparison between the methods. The necessity of alarms was evaluated by comparing different alarms and particle amounts in the specimens with the help of tables. According to the research results, the number of red blood cells, white blood cells, squamous epithelia and bacteria correlated with each other. The numbers of small epithelia were independent from each other. Similar research has been made in Tampere, Finland and in the United States of America. Those research results are similar to the results of this thesis. Furthermore, on the basis of this thesis, it can be recommended that the sample which causes the analyzer to the alarm should be still microscopied. Language Finnish Pages 50 Appendices 6 Pages of Appendices 9 Keywords urine particle, Sysmex UF-100, standardize urine microscopy, instrument and method comparison

SISÄLTÖ TIIVISTELMÄ ABSTRACT 1 JOHDANTO... 6 2 VIRTSANERITYS... 7 2.1 VIRTSA... 7 2.2 MUNUAISTEN JA VIRTSATEIDEN RAKENNE... 7 2.3 VIRTSANMUODOSTUS... 8 3 VIRTSAN PARTIKKELIT... 9 3.1 PUNASOLUT... 9 3.2 VALKOSOLUT... 10 3.3EPITEELISOLUT... 11 3.4LIERIÖT... 13 3.5 MIKROBIT... 13 3.6 MUUT LÖYDÖKSET... 14 4 VIRTSAN PARTIKKELIEN LASKENTA (U-SOLUT)... 15 4.1 VIRTSAN PARTIKKELIEN LASKENTA SYSMEX UF-100 -ANALYSAATTORILLA... 15 4.2 VIRTSAN PARTIKKELIEN MIKROSKOPOINTI... 17 4.2.1 Sternheimerin supravitaalivärjäys... 17 4.2.2 Vakioitu virtsan mikroskopointi... 18 5 VIRTSANÄYTTEENOTTO, KULJETUS JA SÄILYTYS... 19 6 LABORATORION LAATU... 20 6.1 SISÄINEN LAADUNOHJAUS JA ULKOINEN LAADUNARVIOINTI... 20 6.2 LAATU VIRTSATUTKIMUKSISSA... 21 6.3 LAITE- JA MENETELMÄVERTAILU...21 7 AIKAISEMMAT TUTKIMUKSET... 22 8 TUTKIMUKSEN TARKOITUS JA TUTKIMUSONGELMAT... 23

9 TUTKIMUSAINEISTO JA MENETELMÄT... 24 9.1 TUTKIMUSAINEISTO JA TYÖN TOTEUTUS... 24 9.2 TILASTOLLISET TUTKIMUSMENETELMÄT... 26 10 TUTKIMUSTULOKSET... 27 10.1. MENETELMIEN VERTAILU... 27 10.2 HÄLYTYKSET... 32 11 POHDINTA... 35 11.1 TUTKIMUKSEN JOHTOPÄÄTÖKSET... 35 11.2 TUTKIMUKSEN LUOTETTAVUUS... 37 11.3 TUTKIMUKSEN EETTISYYS... 38 11.4 JATKOTUTKIMUSAIHEET... 39 LÄHTEET... 40 LIITTEET Liite 1 Liite 2 Liite 3 Liite 4 Liite 5 Liite 6 Opinnäytetyön toimeksianto Sternheimerin supravitaalivärjäysohje Sysmex UF-100 analysaattorin graafinen kuva ISLAB- potilasohje Tutkimustulokset Sysmex UF-100 analysaattorissa käytetyt reagenssit

6 1 JOHDANTO Virtsatutkimuksissa tavoitteena on etsiä tauteihin viittaavia aineita ja soluja, joita esiintyy usein normaalitilanteissa hieman, mutta joiden määrä on lisääntynyt esimerkiksi tulehduksissa (Nienstedt, Hänninen, Arstila & Björkqvist 2004, 357 359). Virtsan partikkelien tutkimista käytetään virtsatieinfektioiden, munuaissairauksien ja alempien virtsateiden sairauksien toteamiseen ja seurantaan (Kouri, Anttinen, Icén, Ikäheimo, Irjala, Kontiainen, Koskimies, Lipponen, Penttilä, Siitonen & Siukola 1999a, 4, 11 12). Manuaalinen eli käsin tehtävä mikroskooppinen virtsan partikkelien tutkiminen teki läpimurron kliinisissä laboratorioissa vuonna 1926 (Brunzel 1994, 208; Kouri 1998a, 173). Vuodesta 1982 lähtien on virtsan partikkeleja voitu tutkia automaattisesti. Ensin partikkeleja tutkittiin automaattisella mikroskoopilla, jolla otettiin kuvia virtsassa olevista partikkeleista. Kuvat selattiin monitorin ruudulla ja samalla löydösten luokitus varmistettiin. Laboratorioiden suosiota laite ei saavuttanut, koska se vaati edelleen paljon työvoimaa. (Deindoerfer, Gangwer, Laird & Ringold 1985, 1491; Kouri 1998a, 173.) Vuonna 1995 Sysmex Corporation toi markkinoille UF-100 automaattisen virtsan partikkelilaskimen, jonka toiminta perustuu fluoresenssi virtaussytometriaan (Sysmex Europe GmbH 2008). Analysaattorin etuina ovat laskennan parantunut toistettavuus ja nopeus mikroskopointiin verrattuna. Heikkoutena on se, että sillä ei pystytä tunnistamaan kaikkia partikkeleja. (Kouri & Pohjavaara 2002, 1848.) Opinnäytetyössä vertailtiin Sysmex UF-100 -analysaattoria ja mikroskopointimenetelmää virtsan partikkelitutkimuksessa. Samalla selvitettiin, kuinka tarpeellista on mikroskopoida näytteitä, joille analysaattori antoi hälytyksen. Toimeksiantajana oli Itä- Suomen laboratoriokeskuksen liikelaitoskuntayhtymä (ISLAB) Mikkelin aluelaboratorio, jossa työ toteutettiin. Aihe on tärkeä, koska molempia tutkimusmenetelmiä käytetään sekä yhdessä että erikseen kliinisissä laboratorioissa. Yhteneväinen tulostaso näiden menetelmien välillä on tärkeää potilaan hoidon kannalta. Lisäksi selvitettiin, aiheutuuko analysaattorin antamien hälytysten tarkistamisesta mikroskoopilla ylimääräistä työtä laboratoriohenkilökunnalle. Opinnäytetyö on laite- ja menetelmävertailu. Laite- ja menetelmävertailua käytetään kliinisissä laboratorioissa koestuksessa, vakioinnissa ja laitteiden toiminnan tarkastamisessa.

7 2 VIRTSANERITYS 2.1 Virtsa Virtsa muodostuu munuaisissa. Virtsanerityksessä munuaiset erottelevat verestä kuonaaineet ja elimistölle vieraat aineet. Ne pitävät solunulkoisen nesteen osmoottisen paineen ja määrän vakaana, säätelevät solunulkoisen nesteen ionien pitoisuutta ja ylläpitävät elimistön happoemästasapainoa. (Bjålie, Haug, Sand, Sjaastad & Toverud 1999, 376 377.) Virtsa sisältää noin 95 % vettä, johon muut aineet, kuten typpipitoiset kuonaaineet, ovat liuenneet. Virtsa sisältää myös liukoisia suoloja ja tuhansittain vähäisiä määriä muita aineita, kuten orgaanisia aineenvaihduntatuotteita. (Nienstedt, Hänninen, Arstila & Björkqvist 2004, 357-359.) 2.2 Munuaisten ja virtsateiden rakenne Ihmisellä on kaksi munuaista, ja yhteensä ne painavat noin 300 g (kuva 1). Ne ovat pavun muotoisia ja pituudeltaan 10 12 cm. Munuaisportin kautta kulkevat munuaisvaltimo, munuaislaskimo ja virtsanjohdin. Munuaisia ympäröi rasvakudoksen peittämä sidekudoskotelo. Munuaisissa on sekä kuorikerros että ydinkerros, joka muodostuu erillisistä munuaispyramideista. (Nienstedt ym. 2004, 347 348.) Nefronit ovat virtsaa tuottavia pieniä yksiköitä, ja niitä on kummassakin munuaisessa noin miljoona. Nefronin osat ovat hiussuonikeränen (glomerulus) ja munuaistiehyt (tubulus). (Bjålie ym. 1999, 376.) Hiussuonikeränen on keräsen kotelon sisällä munuaiskeräsessä. Munuaistiehyen osat ovat proksimaalinen kiemuratiehyt, henlen linko ja distaalinen kiemuratiehyt. Munuaistiehyt laskee kokoojaputkeen yhdessä useiden muiden nefronien munuaistiehyiden kanssa. Hiussuonikeräseen tulee verta munuaisvaltimosta tuojasuonta pitkin ja poistuu viejäsuonta pitkin. (Nienstedt ym. 2004, 349 350.)

8 KUVA 1. Munuaisen rakenne (Bjålie ym. 1999, 379). Virtsateihin kuuluvat kaksi munuaisallasta, kaksi vitsanjohdinta, virtsarakko ja virtsaputki. Munuaisaltaan haaroja kutsutaan munuaispikareiksi, joiden sisässä on munuaispyramidien kärjet. Virtsa kulkee kohti virtsarakkoa virtsanjohtimen seinämän lihaskerroksen kuljettamana peristalttisin liikkein. Virtsarakko on sileälihaspussi, jonka seinämän lihasyyt risteilevät eri suuntiin. Rakon alapinnassa virtsanjohtimet ja virtsaputki tulevat rakkoon lähelle toisiaan. Miehillä virtsaputken pituus on 20 25 cm pitkä ja naisilla 3-5 cm. (Hiltunen, Holmberg, Kaikkonen, Lindblom-Ylänne & Nienstedt 2001, 458 459.) 2.3 Virtsanmuodostus Alkuvirtsa eli primaarivirtsa on suodosta, joka muodostuu hiussuonikerästen suodattaessa veriplasmasta kaikki plasman ainesosat munuaistiehyisiin. Verisolut ja tavalliset valkuaisaineet jäävät verenkiertoon. (Bjålie ym. 1999, 377, 382 383.) Alkuvirtsasta jää vain noin 1 % lopulliseksi virtsaksi (Hiltunen ym. 2001, 454). Munuaistiehyissä otetaan elimistön tarvitsemia aineita takaisin vereen siten, että aineet kulkeutuvat munuaistiehyen ontelosta peritubulaarisiin hiussuoniin eli tapahtuu takaisinimeytyminen (reabsorptio). Tubuluksiin jää suurin osa kuona-aineista, joita elimistö ei tarvitse ja ne poistetaan virtsan mukana. Aineita imeytyy takaisin suuria määriä

9 aivan kuin niitä suodattuukin. (Bjålie ym. 1999, 377, 386.) Takaisin imeytyy vettä, natrium-, kalium-, kloridi- ja fosfaatti-ioneja, glukoosia, aminohappoja sekä muita orgaanisia aineita. Vettä ja pienimolekyylisiä aineita imeytyy takaisin verisuoniin passiivisesti. Aktiivista takaisinimeytymistä on natrium-kaliumpumpun toiminta. (Nienstedt ym. 2004, 351 352.) Sekreetio eli aktiivinen eritys tarkoittaa tiettyjen aineiden siirtymistä peritubulaarisista hiussuonista munuaistiehyen solujen läpi tiehyen onteloon, jolloin aineiden erittyminen virtsaan tehostuu. Tällä tavoin elimistöstä voidaan poistaa erilaisia vieraita aineita, kuten esimerkiksi hormoneja, lääkeaineita, elintarvikkeiden lisäaineita ja muita orgaanisia molekyylejä. (Bjålie ym. 1999, 388 389.) Takaisinimeytymisen ja sekreetion tuloksena alkuvirtsa muuttuu valmiiksi virtsaksi. Suodattumisen ja aktiivisen sekreetion kautta munuaistiehyiden onteloon tulleet imeytymättömät aineet poistuvat virtsan mukana. Valmis virtsa kulkee pois munuaisista virtsateitä pitkin. Kokoojaputkien kautta munuaisaltaisiin keräytynyt virtsa menee virtsanjohdinta pitkin virtsarakkoon ja poistuu elimistöstä virtsatessa virtsaputken kautta. (Bjålie ym. 1999, 377 378, 386.) 3 VIRTSAN PARTIKKELIT 3.1 Punasolut Punasoluja eli erytrosyyttejä voi esiintyä terveen ihmisen virtsassa. Virtsaan punasolut ovat tulleet munuaiskeräsistä tai virtsanjohtimista. (Kouri & Pohjavaara 2002, 1848.) Viitearvona eli solujen normaalina määränä virtsassa on 0-2 punasolua/näkökenttä (Penttilä 2004a, 221; Penttilä 2004b, 18). Jos punasoluja esiintyy virtsassa normaalia enemmän, tilaa kutsutaan hematuriaksi eli verivirtsaisuudeksi. Terveillä potilailla hematuria voi johtua kuukautisista, lievistä vammoista, ruumiillisesta rasituksesta, sukupuoliyhdynnästä, virusinfektioista tai lääkkeistä. Sairaudet, jotka aiheuttavat verivirtsaisuutta, voivat olla munuaisperäisiä, virtsa-

10 teistä tai verenhyytymisjärjestelmän häiriöistä johtuvia. Tärkeimpiä hematurian aiheuttajia ovat virtsateiden pahanlaatuiset kasvaimet, joista yleisimpiä ovat eturauhas-, virtsarakko- ja munuaiskarsinoomat. (Lindell 2000, 818 822.) Virtsan punasolut ovat läpimitaltaan 7 µm, muodoltaan kiekkomaisia ja kaksoiskoveria. Supravitaalivärjäyksessä (liite 2) niiden väri voi vaihdella punaisen eri sävyissä. Niitä voi olla vaikea erottaa mikroskoopilla öljypisaroista ja hiivasoluista. Punasolut voivat näkyä mikroskoopissa myös värittöminä ympyröinä. Tällöin niitä kutsutaan varjopunasoluiksi. Varjopunasoluista hemoglobiini on liuennut pois. (Pietilä 1990, 3.) Punasolujen morfologiaa voidaan tarkastella paremmin faasikontrastimikroskoopilla, jolloin havaitaan helpommin poikkeavan muotoiset eli dysmorfiset punasolut (Kouri & Pohjavaara 2002, 1848). Solujen koko voi vaihdella runsaasti, ja niistä voi puuttua punasolun normaali hemoglobiinisisältö. Ne voivat olla fragmentoituneita eli pirstoutuneita ja vääristyneitä, eivätkä ne ole kaksoiskoveria. (Pietilä 1990, 3.) Eräs dysmorfisten punasolujen alaryhmä on akantosyytit. Tällaisissa punasoluissa on solukalvopullistumia. Punasolujen muodosta voidaan päätellä, mistä virtsanerityselimestä verenvuoto on peräisin. Normaalit punasolut ovat peräisin alemmista virtsateistä ja dysmorfiset munuaisista. (Kouri & Pohjavaara 2002, 1848.) 3.2 Valkosolut Virtsassa on aina jonkin verran leukosyyttejä eli valkosoluja. Viitearvona on 0-3 leukosyyttiä/näkökenttä. (Penttilä 2004a, 221.) Naisilla ja tytöillä voi anatomiasta johtuen olla miehiä ja poikia runsaammin valkosoluja. Yleisin valkosolu virtsassa on neutrofiilinen granulosyytti eli neutrofiili. Muita esiintyviä valkosoluja ovat lymfosyytit, makrofagit ja eosinofiilit. Jos virtsassa esiintyy valkosoluja enemmän kuin normaalisti, tilaa kutsutaan pyuriaksi. (Kouri & Pohjavaara 2002, 1848 1850.) Neutrofiilejä esiintyy virtsassa etenkin virtsateiden infektioissa ja virtsarakon lähielinten tulehduksissa, joita ovat umpilisäkkeen tulehdus ja sisäsynnytintulehdukset. (Kouri & Pohjavaara 2002, 1850.) Neutrofiiliset granulosyytit ovat pyöreitä soluja. Niiden halkaisija on 12 15 µm, ja ne ovat usein kasoissa. (Kouri ym. 1999a, 40.) Ne tunnistetaan liuskoittuneesta tumasta ja sytoplasman granuloista. Supravitaalivärjäyksessä tuma on

11 värjäytynyt helakansiniseksi, mutta se voi jäädä värjäytymättä kokonaan. Sytoplasma on granulainen väritön tai kalpean punertava. (Kouri 1993, 22; Pietilä 1990, 11.) Lymfosyytit ovat läpimitaltaan 10 20 µm ja muodoltaan pyöreitä soluja (Kouri ym. 1999a, 40). Niiden tuma on tummansininen ja se täyttää koko solun. Sytoplasma on sileä ja siinä ei ole granuloita. Lymfosyyttejä havaitaan virtsassa kroonisissa munuaistulehduksissa ja munuaisen siirron jälkeisissä hyljintäreaktioissa. (Kouri 1993, 22.) Normaalisti lymfosyyttien esiintymisellä ei ole kliinistä merkitystä (Kouri & Pohjavaara 2002, 1850). Makrofageja löytyy virtsasta pitkäaikaisissa tulehduksissa ja eturauhasleikkauksen jälkeen (Kouri & Pohjavaara 2002, 1850). Makrofageista käytetään myös nimitystä histiosyytti. Ne polveutuvat veren monosyyteistä, ja pystyvät fagosytoimaan elimistölle vieraita soluja. Solujen sisältä voidaan usein havaita bakteereja, punasoluja ja solufragmentteja. (Brunzel 1994, 223.) Makrofagit ovat läpimitaltaan 15 30 µm, ja muodoltaan pyöreitä tai soikeita. Niiden sytoplasmassa on granuloita ja vakuoleja. Tumassa kromatiini on jakaantunut epätasaisesti. (Kouri ym. 1999a, 40.) Supravitaalivärjäyksessä tumat värjäytyvät tumman sinipunaiseksi, ja sytoplasma punertavaksi tai jää värittömäksi. Makrofagit näkyvät usein fragmentteina, koska ne hajoavat helposti virtsassa. (Pietilä 1990, 11.) 3.3 Epiteelisolut Erilaisia epiteelisoluja voi esiintyä terveen ihmisen virtsassa, yleensä 0-3 kappaletta/näkökenttä. Virtsasta löytyviä epiteelejä ovat levy-, välimuotoinen- ja tubulusepiteeli. Levyepiteelisoluilla ei ole yleensä diagnostista merkitystä, toisin kuin muiden epiteelisolujen löytymisellä. (Penttilä 2004a, 221.) Virtsan epiteelisolujen avulla tauti voidaan paikantaa anatomisesti (Kouri ym. 1999a, 12). Levyepiteelisolut ovat peräisin emättimestä, virtsarakosta, virtsajohtimista tai munuaisaltaista. Niitä voi esiintyä näytteessä runsaastikin, ja silti niillä ei ole diagnostista merkitystä. Jos kuitenkin soluissa näkyy pahanlaatuisia muutoksia, näyte täytyy tutkia tarkemmin patologian laboratoriossa. (Penttilä 2004a, 221.) Yleensä runsas löydös johtuu epäonnistuneesta näytteenotosta, jolloin solut ovat joutuneet näytteeseen ulkoisista

12 sukuelimistä tai virtsaputkesta. Raskaana olevilla naisilla levyepiteelisoluja voi irrota virtsaputkesta normaalia enemmän virtsaan hormonivaikutuksesta. (Kouri ym. 1999a, 12.) Miehillä runsas levyepiteelin määrä virtsassa johtuu estrogeenihoidosta, jota annetaan eturauhassyöpään. Levyepiteelisolut ovat suuria soluja ja niiden läpimitta on 30 50 µm. Supravitaalivärjäyksessä tuma värjäytyy selvärajaisesti ja tasaisesti sinipunaiseksi. Sytoplasma värjäytyy punertavaksi, ja sen rakenne on kiinteä. Levyepiteelisolut voivat värjäytyä samassa näytteessä erisävyisiksi. (Pietilä 1990, 11.) Muutamia välimuotoisia epiteelisoluja voi olla normaalissa virtsan sakassa. Ne ovat peräisin virtsaputken proksimaalisesta osasta, rakosta, virtsanjohtimista, munuaisaltaasta tai munuaispikareista. Niiden runsas löytyminen on patologinen löydös. (Pietilä 1990, 12.) Pinnallisia välimuotoisia epiteelisoluja löydetään alempien virtsatieinfektioiden yhteydessä ja tämä löydös ei ole patologinen. Syvempien kerrosten välimuotoisia epiteelisoluja havaitaan virtsatiekivien, rakkosyövän ja virtsateihin kohdistuneiden toimenpiteiden yhteydessä. (Kouri & Pohjavaara 2002, 1850.) Välimuotoiset epiteelisolut ovat halkaisijaltaan 20 30 µm, mutta ne voivat olla jopa 50 µm kokoisia (Kouri 1993, 21). Syvempien kerrosten solut ovat pienempiä kuin pinnalliset solut (Brunzel 1994, 226). Muodoltaan ne ovat soikeita, sukkulamaisia, päärynämäisiä tai pyöreitä. Tuma värjäytyy voimakkaan sinipunaiseksi. Se sijaitsee keskellä sytoplasmaa ja on suuri ja pyöreähkö. (Pietilä, 1990, 12.) Tumajyvänen on havaittavissa usein. Sytoplasma on hienorakeista ja vaaleaa. (Kouri ym. 1999a, 40.) Tubulusepiteelisolut ovat peräisin munuaisista, ja niiden lisääntynyt määrä virtsan sakassa viittaa aina munuaissairauteen. Kysymyksessä voi olla akuutti interstitiaalinen nefriitti (tubulusten ja sidekudoksisen väliaineen tulehdus) tai tubulusnekroosi. Tubulussoluja munuaisista voi irrottaa sydäninfarkti, verenkiertoshokki, nefrotoksinen särkylääke-, antibiootti-, tai solusalpaajahoito, kuivuminen tai vatsakalvontulehduksen aiheuttama munuaisvaurio. (Kouri & Pohjavaara 2002, 1850, 1852.) Lisäksi tubulussoluja voi esiintyä munuaissiirrännäisen hylkimisreaktiossa. Tubulusepiteelisoluja voi olla vaikea erottaa etenkin välimuotoisista epiteelisoluista, mutta yleensä niiden kanssa esiintyy myös lieriöitä. Tubulusepiteelisolut ovat läpimitaltaan 10 60 µm, ja niiden muoto vaihtelee pyöreästä kulmikkaaseen. Niiden tuma värjäytyy siniseksi tai sinivioletiksi. Tumassa ei ole tumajyväsiä. Sytoplasma värjäytyy punertavaksi, se on rakeinen ja siinä voi olla granuloita. (Kouri 1993, 22; Kouri ym. 1999a, 40.)

13 3.4 Lieriöt Lieriöt syntyvät munuaisten tubuluksissa tai kokoojaputkissa, kun orgaanista ainetta saostuu virtsan väkevöityessä. Virtsan sakasta löydettävät lieriöt ovat pitkänomaisia saostumia. Lieriön koko ja muoto vastaavar kokoojaputken tai distaalisen tubuluksen kokoa ja muotoa. (Kouri ym. 1999a, 41.) Ne koostuvat pääasiassa geelimäisestä hyaliiniväliaineesta, joka on glykoproteiinia. Se on Henlen lingon solujen erittämää proteiinia, jota kutsutaan Tamm-Horsfallin proteiiniksi. Kun lieriö saostuu munuaistubuluksessa, sen sisään jää tubuluksessa sillä hetkellä olevia partikkeleja. Lieriöiden löytyminen virtsasta viittaa munuaissairauteen. Joitakin hyaliinilieriöitä voi löytyä ilman, että löydetään munuaisvaurio. Tällöin lieriöiden muodostuminen johtuu esimerkiksi elimistön kuivumisesta. (Kouri & Pohjavaara 2002, 1851.) Lieriöt nimetään niiden solujen mukaan, joita lieriössä esiintyy eniten (Pietilä 1990, 13). Solulieriön pinta-alasta 1/3 on solujen peitossa, ja ne ovat merkityksellisempiä kuin soluttomat lieriöt. Solulieriöitä ovat punasolu-, valkosolu-, tubulus-, bakteeri- ja hiivasolulieriöt. Soluttomia lieriöitä ovat hyaliini-, jyväis-, vaha-, rasva-, hemoglobiini-, myoglobiini- ja bilirubiinilieriöt. Supravitaalivärjäyksessä lieriön proteiini värjäytyy sinertäväksi tai jää värittömäksi. Lima ja lieriöt voidaan erottaa toisistaan sillä, että lieriöt erottuvat taustasta tarkkarajaisesti. Jos kuitenkin lieriö on hajonnut, rajaa on vaikea havaita. (Kouri ym. 1999a, 41 42.) 3.5 Mikrobit Bakteerit ovat yleinen löydös virtsasta (Kouri & Pohjavaara 2002, 1851). Ne eivät värjäydy supravitaalivärjäyksessä, ja sen vuoksi niitä voi olla vaikea havaita (Kouri ym. 1999a, 16). Bakteerien tunnistaminen tapahtuu mikrobiologisen viljelyn avulla. Bakteerien suuri määrä yhdessä valkosolujen kanssa viittaa virtsatieinfektioon. (Kouri & Pohjavaara 2002, 1851.) Aikuisten virtsanäytteissä voi esiintyä hiivasoluja. Tavallisimmin ne ovat Candida albicans -soluja. Hiiva on peräisin emättimen eritteistä, mutta sitä kasvaa myös virtsateissä. Potilailla, joilla virtsasta löytyy hiivasoluja, on yleensä heikentynyt immuunivaste, dia-

14 betes, pitkä antibioottikuuri tai rakenteellisia poikkeavuuksia virtsateissä. (Kouri & Pohjavaara 2002,1852.) Hiivasolut eivät värjäydy supravitaalivärjäyksessä. Ne näkyvät värittöminä, ovat soikeita muodostavat pseudorihmaa. (Brunzel 1994, 254 255.) Alkueläimistä Trichomonas vaginalis voi löytyä virtsasta. Naisilla se aiheuttaa emätintulehduksia ja miehillä virtsaputkentulehduksia. (Kouri & Pohjavaara 2002, 1852.) Sillä on yksi tuma ja takaosassa häntämäinen uloke. Se liikkuu 4-5 flagellan ja aaltoilevan kalvon avulla. (Siikamäki, Jokiranta & Meri 2003, 327 328.) 3.6 Muut löydökset Joissakin tapauksissa virtsan sakasta voi löytyä rasvoja. Ne näkyvät vapaina rasvapalloina, kolesterolikiteinä, rasvalieriöinä tai tubulussoluina, jotka sisältävät rasvaa. Niitä löytyy vaikeassa proteinuriassa, jolloin lipoproteiineja pääsee virtsaan, ja tubulussolujen rasvanekroosissa. (Kouri ym. 1999a, 12.) Usein virtsasta löydetään myös kiteitä, joita muodostuu virtsan suolojen saostuessa. Yleisimmin löydetään fosfaattikiteitä. Ne syntyvät, kun virtsa konsentroituu ja jäähtyy. Niiden löytymisellä ei ole kliinistä merkitystä. Muita löydettyjä kiteitä ovat uraatti-, virtsahappo-, sulfoamidi-, leusiini-, tyrosiini- ja kystiinikiteet. Näillä on usein diagnostista merkitystä. (Penttilä 2004a, 222 223.) Esimerkiksi uraattikiteitä löytyy munuaisten vajaatoiminnassa tai tuumorin hajotessa solusalpaajahoitojen yhteydessä. Terveillä uraattikiteitä voi olla ruokavaliosta johtuen. Kiteillä on kliinistä merkitystä vain, jos niitä esiintyy virtsassa runsaasti. (Kouri & Pohjavaara 2002,1852.) Näytteessä saattaa olla erilaisia virtsaan kuulumattomia partikkeleja eli artefaktoja. Pesun yhteydessä näytteeseen voi joutua paperikuitua. Ne värjäytyvät supravitaalivärjäyksessä punertavaksi, kuidunpäät ovat murtuneet terävästi ja niissä on kovat reunat. Lisäksi näytteestä voi löytyä häpykarvoja. Niiden sisältä ei voi erottaa solujen jäännöksiä, ja niiden keratiinisäikeet ovat pitkulaisia. Peitinlasin vääränlainen asettaminen voi aiheuttaa näytteeseen pitkänomaisia muodostumia, jotka muistuttavat lieriöitä. Lieriöistä ne voidaan kuitenkin erottaa sillä, että kaikki havaittavat muodostumat ovat samansuuntaisia. Virtsassa on normaalisti aina jonkin verran limaa. Naisilla sitä on enemmän kuin

15 miehillä. Lima värjäytyy epämääräisesti. Rakenteeltaan se voi olla säikeinen, yksittäinen rihma tai se voi esiintyä kasoina. (Kouri ym. 1999a, 42.) Näytteestä voi löytyä myös siittiöitä, jotka ilmoitetaan vain erikseen pyydettäessä (Kouri & Pohjavaara 2002, 1852). 4 VIRTSAN PARTIKKELIEN LASKENTA (U-Solut) 4.1 Virtsan partikkelien laskenta Sysmex UF-100 -analysaattorilla Sysmex UF-100 -analysaattorin (kuva 2) toiminta perustuu fluoresenssi virtaussytometriaan. Partikkelien erottelu tapahtuu niiden koon ja kemiallisten ominaisuuksien eli värjäytyvyyden perusteella. Analysaattori värjää näytteessä olevat partikkelit fluoresoivilla väreillä, ja ne kuljetetaan liuoksen avulla tasaisena virtauksena argon-laservalonsäteen ohi.(sysmex Europe GmbH 2008.) Partikkelien koko mitataan siitä, miten valo siroaa suoraan eteenpäin. Valon sironnan lisäksi niiden koko määritetään myös impedanssiperiaatteella eli sähköisellä vaihtovirtavastuksella. Analysaattori mittaa virtsan väkevyysvaihtelut ominaisjohtokyvyn eli sähkönjohtavuuden avulla. (Kouri 1998a, 173.) Tulokset analysaattori muuttaa sähköisiksi signaaleiksi ja tunnistaa niiden perusteella partikkelit. Tulokset tulevat sekä numeerisena että graafisena esityksenä (liite 3). (Sysmex Europe GmbH 2008.)

16 KUVA 2. Sysmex UF-100 -analysaattori (Sysmex Corporation of America 2000). Fluoresoivan värin perusteella soluista tunnistetaan erilaiset solunsisäiset molekyylit ja soluelimet, kuten nukleiinihapot ja mitokondriot. Myös solukalvot ovat fluoresoivia. (Sysmex Europe GmbH 2008.) Fluoresoivia värejä ovat fenantridiinijohdos, joka sitoutuu nukleiinihappoihin ja karbosyaniinijohdos, joka sitoutuu solukalvoihin. Fenantridiinijohdos lähettää oranssia valoa ja karbosyaniinijohdos vihreää valoa. (Kouri 1998a, 173.) Analysaattorin etuina ovat laskennan parantunut toistettavuus ja nopeus mikroskopointiin verrattuna. Sen heikkoutena on, että sillä ei pystytä tunnistamaan kaikkia munuaistason vaurioita, koska se tunnistaa huonosti tubulussoluja. Puna- ja valkosoluista sekä levyepiteelisoluista ja bakteereista saadaan luotettava tulos lähinnä silloin, kun näytteessä on niitä runsaasti. Myös solu- ja jyväslieriöitä voidaan tunnistaa osittain, samoin kuin tubulusepiteelisoluja, jos ne ovat valkosoluja suurempia. (Kouri & Pohjavaara 2002, 1848.)

17 4.2 Virtsan partikkelien mikroskopointi Virtsan partikkelit voidaan tutkia mikroskooppisesti usealla menetelmällä. Tutkimukseen käytettävässä mikroskoopissa olisi hyvä olla vaaleakentän lisäksi faasikontrastitekniikka. (Kouri 1998b, 107 108.) Faasikontrastimikroskoopissa muutetaan valon voimakkuutta ja kontrastia siten, että taitekerroin muuttuu ja pienen taitekertoimen omaavat solut ja kappaleet näkyvät paremmin (Brunzel 1994, 13). Jos näytteestä halutaan tutkia mikroskopoimalla tarkemmin punasolujen, valkosolujen ja bakteerien pitoisuuksia, se tehdään yleensä kammiolaskennalla. Näytteenä käytetään silloin sentrifugoimatonta, hyvin sekoitettua virtsaa. (Kouri 1998b, 107 108.) Virtsan partikkelien tunnistamisessa kammiolaskentaa helpompi menetelmä on peitinlasimenetelmä eli sakkatutkimus. Siinä partikkelit on helpompi tunnistaa, kun peitinlasin alle jää ohut nestekerros. Virtsanäyte sentrifugoidaan, supernatantti poistetaan ja jäljelle jäänyt sakka värjätään Sternheimerin supravitaalivärillä. Sen jälkeen suoritetaan vakioitu virtsan sakan mikroskopointi. (Kouri ym. 1999a, 15, 35 36.) 4.2.1 Sternheimerin supravitaalivärjäys Partikkelien laskennassa käytetään yleensä Sternheimerin vuonna 1975 julkaisemaa supravitaalivärjäystä (liite 2). Väriaineina siinä ovat vesiliukoiset Alcian-sininen ja pyroniini B. Alcian-sininen väri on vahvasti emäksinen ja sitoutuu negatiivisesti varautuneisiin solujen osiin ja värjää ne siniseksi. Tällaisia kohteita näytteissä ovat lima ja hyaliinilieriöiden Tamm-Horsfallin proteiini. Lisäksi se värjää erityisesti tumia, jopa happamissakin oloissa. Pyroniini B on Alcian-sinistä pienimolekyylisempi emäksinen väri. Se pystyy imeytymään nopeasti solukalvojen läpi ja sitoutuu erityisesti RNA:han, jolloin sytoplasmaa värjäytyy punaiseksi. Värit valmistetaan liuottamalla kumpikin erikseen veteen, minkä jälkeen ne suodatetaan imupaperin läpi. Oikea seos väreistä tehdään joko spektrofotometriaa avuksi käyttäen tai kokemusten perusteella. Näytteen ph ja muu kemiallinen koostumus voi vaihdella. Tästä johtuen eri näytteet värjäytyvät eri tavoin, eikä partikkelien tunnistamiseen voida käyttää tarkkoja värisävyjä. Kun näyte värjätään huolellisesti, partikkelien värit säilyvät muuttumattomana useita tunteja. (Kouri 2000, 162.)

18 4.2.2 Vakioitu virtsan mikroskopointi Supravitaalivärjättyä näytettä tarkastellaan mikroskoopilla ensin 10 x 10- suurennoksella. Tällöin lieriöt ja muut harvinaiset löydökset havaitaan varmimmin. Tarkempi partikkelien määrällinen ja laadullinen arviointi tehdään 10 x 40-suurennoksella. Peitinlasi, jota yleensä käytetään, on kooltaan 18x18 mm ja näytemäärä on 13 µl. Jos käytetään 22x22 mm:n peitinlaseja, näytettä tarvitaan 20µl. Näkökenttiä lasketaan 5-10 kappaletta. Koska solut ovat jakautuneet epätasaisesti peitinlasin alle, on hyvä valita näkökenttiä peitinlasin joka kulma-alueelta ja keskiosasta. Tulokset ilmoitetaan arvioituna keskimääräisenä lukumääränä näkökenttää kohti. Kaikkien havaittujen partikkelien määrät ilmoitetaan vakioidulla tavalla 400-kertaisessa näkökentässä. Tällöin tilavuusyksikkö pysyy koko ajan samana. (Kouri ym. 1999a, 37.) Vakioitu vastaustapa (taulukko 1) on seuraavanlainen: negatiivinen tai 0, 1 kpl/näkökenttä, keskiarvolukumäärä 1-30 kpl/näkökenttä tai yli 30 kpl/näkökenttä. Negatiivinen tai 0 vastataan jos näytteessä ei esiinny soluja tai saatu tulos on ristiriidassa virtsan liuskakokeen tulosten kanssa. 1 kpl/näkökenttä ilmoitetaan, jos soluja on alle 1 tai enintään 1 näkökenttää kohden. Soluja on kuitenkin muutama objektilasia kohden. 1-30 kpl/ näkökenttä tarkoittaa solujen keskimääräistä lukumäärää lasketuissa näkökentissä. Jos laskettavia soluja on enemmän kuin 30 näkökentässä, solujen tarkalla lukumäärällä ei ole enää merkitystä. (Kouri ym. 1999a, 37 38.) TAULUKKO 1. Vakioitu vastaaminen virtsan partikkelien mikroskopoinnissa Vastaus Soluja näkökentässä / 0 Ei yhtään solua 1 kpl Muutama solu lasilla 1-30 kpl Solujen keskimääräinen lukumäärä > 30 kpl Yli 30 solua

19 Bakteerit ilmoitetaan yleensä: ei lainkaan, vähän, kohtalaisesti tai runsaasti, siis 0, +,++ tai +++ (taulukko 2). Tarvittaessa tulokset täytyy pystyä muuttamaan yksiköksi kpl*10 6 /l, jolloin saatuja tuloksia on helpompi vertailla eri laboratorioiden välillä. (Kouri ym. 1999a, 37 38.) TAULUKKO 2. Bakteerien vastaaminen virtsan partikkelien mikroskopoinnissa Vastaus Bakteereja näkökentässä 0 Ei lainkaan + Vähän ++ Kohtalaisesti +++ Runsaasti 5 VIRTSANÄYTTEENOTTO, KULJETUS JA SÄILYTYS Virtsan perustutkimuksiin käytetään puhtaasti laskettua virtsaa. Puhtaasti laskettu virtsa on vakioitu näyte. Vakioidulle näytteelle voidaan soveltaa kyseiselle tutkimukselle annettuja viitevälejä. Näytteen ottamista suositellaan aamulla tai aamupäivällä. Vakioidun näytteen tulkinta on luotettavaa, kun on noudatettu oikeita näytteenotto-ohjeita (liite 4). Edellytys laadukkaan virtsanäytteen saamiseksi on, että opastus virtsanäytteenantoon annetaan potilaalle sekä suullisesti että kirjallisesti. Akuuttia virtsatieinfektiota sairastavilta näyte voidaan ottaa mihin vuorokauden aikaan tahansa. Tällöin kyseessä on vakioimaton näyte. Vakioimattoman näytteen tulos on suuntaa-antava, eikä negatiivinen tulos sulje pois positiivista tulosta, jos seuraava näyte annetaan vakioidusti. (Kouri ym. 1999a, 7, 9; Tapola 2004, 26 27.) Potilaan lähetteeseen kirjataan rakkoaika, näytteen saamisaika ja saamistapa, ja onko kyseessä vakioitu vai vakioimaton näyte, sekä mahdollinen mikrobilääkehoito. Näyte voidaan ottaa keskisuihkunäytteenä, pussivirtsanäytteenä, rakkopunktiona, katetrinäytteenä tai avannenäytteenä. (Jaakkola 2008, 41 42; Kouri ym. 1999a, 7, 9.) Virtsanäytteenoton voi suorittaa kotona, mikäli näytteen säilytys ja kuljetus laboratorioon hoidetaan asianmukaisesti. Virtsanäytteisiin käytetään sekä säilöntäaineellisia että

20 säilöntäaineettomia putkia. Säilöntäaineelliseen putkeen otettu virtsanäyte säilyy analysointikelpoisena 24 tuntia huoneenlämmössä. Näyteputket on sekoitettava huolellisesti, jotta säilöntäaine liukenee mahdollisimman hyvin virtsaan. Liukenematon säilöntäaine voi johtaa koneellisessa partikkelien laskennassa vääriin positiivisiin tuloksiin ja siihen, että analysaattori ei osaa luokitella soluja oikein. Säilöntäaineettomaan putkeen otettu näyte tulee pakata kylmävaraajien kanssa, ja se toimitetaan laboratorioon kahden tunnin kuluessa ja tutkitaan neljän tunnin kuluessa. (Jaakkola 2008, 41; Kouri ym. 1999a, 10; Kouri, Malminiemi, Vuotari & Pelkonen 2007, 15 16.) 6 LABORATORION LAATU 6.1 Sisäinen laadunohjaus ja ulkoinen laadunarviointi Laboratorioiden laadunvarmistukseen kuuluvat sisäinen laadunohjaus sekä ulkoinen laadunarviointi. Sisäisessä laadunohjauksessa laboratorio osoittaa tulostason pysyvyyttä ja päivittäisen analytiikan toimivuutta. Näillä menettelytavoilla pyritään toimivaan laatujärjestelmään ja laadun jatkuvaan parantamiseen. (Tikkanen 2000, 11.) Kontrollien tarkoituksena on jatkuva analyysimenetelmien suorituskyvyn seuranta (Linko 2004, 60 61). Kontrollit ovat tunnetun pitoisuuden omaavia liuoksia (Jaarinen & Niiranen 2005, 25). Ne voivat olla kaupallisia näytekontrolleja, potilasnäytteistä itse valmistettuja pooleja tai potilasnäytekontrolleja. Niiden täytyy soveltua käyttötarkoitukseensa, olla hyviä ja stabiileja materiaaliltaan ja ominaisuuksien tulee olla samankaltaisia potilasnäytteiden kanssa. (Linko 2004, 60 61.) Ulkoisilla laadunarviointikierroksilla laboratoriot tutkivat näytteitä tai valmisteita, joiden arvoja ne eivät tiedä (Penttilä 2004c, 38). Osallistumalla ulkoisille Labquality Oy:n laadunarviointikierroksille laboratoriot voivat vertailla tulostasoaan muiden laboratorioiden tuloksiin. Osallistumisen lisäksi tärkeää on reagoida mahdollisiin poikkeaviin tuloksiin ja korjata ne. (Kaihola 1997, 250; Tikkanen 2000, 10 11.) Kierrosnäytteen kriteereitä ovat homogeenisyys, säilyvyys ja taloudellisuus. Lisäksi näyte pitäisi pystyä analysoimaan usealla menetelmällä ja saatujen tulosten pitäisi olla vertailukelpoisia. (Loikkanen 2005, 90.) Osallistuminen kierroksiin on vapaaehtoista (Penttilä 2004c, 38).

21 6.2 Laatu virtsatutkimuksissa Virtsatutkimuksissa virheitä syntyy esivalmistelussa, näytteenotossa, näytteen kuljetuksessa ja säilytyksessä, analysoinnissa ja tulosten vastaamisessa. Tämän vuoksi näytteiden laadun yhtenäistäminen eli vakiointi ja riittävä dokumentointi ovat tärkeitä. Viitevälien sovellus käy vain vakioituihin näytteisiin. (Kouri ym. 1999a, 10, 22-23.) Sysmex UF-100 -analysaattorin laadunvarmistukseen käytetään UF CHECK -kontrollia. Kontrolli määritetään aamuisin ennen näytteiden analysointia. Kontrollin rajat on asetettu valmiiksi analysaattoriin. Kun kontrollin arvot ovat viiterajoissa, analysaattori on valmis mittauksia varten. Analysaattorin vakiointi suoritetaan laitevalmistajan lateksipartikkeleilla UF-IQAS -määräaikaishuoltojen yhteydessä. Vakiointia seurataan UF CHECK -kontrollinäytteellä ja kontrollin rinnakkaislaskulla kammiossa. (Sysmex- Operator s Manual 2003.) Laboratoriot voivat osallistua Labqualityn järjestämille virtsatutkimusten laadunarviointikierroksille. Tutkittavana näytteenä voi tällöin olla kylmäkuivattu tai liukoinen virtsanäyte sekä solujen tunnistamista paperikuvista. (Labquality.) Mikroskooppisessa virtsan sakkatutkimuksessa jokaisen henkilön tulisi käyttää tunnistukseen samoja kriteerejä. Hyvin dokumentoidulla ohjekirjalla varmistetaan mikroskooppisen tutkimuksen samankaltaisuus. Vakioitavia tekijöitä ovat tutkimukseen käytettävä virtsan määrä, aika sentrifugoinnista, sentrifugoinnin nopeus, sakan pitoisuus ja määrä, objekti- ja peitinlasit sekä raportointi muoto. Partikkelien tunnistuksen laatua voidaan seurata toistamalla saman näytteen mikroskopointi. (NCCLS 2001, 11 12, 14.) 6.3 Laite- ja menetelmävertailu Laite- ja menetelmävertailua käytetään validoinnissa. Validoinnilla tarkoitetaan tutkintaan ja objektiiviseen todistusaineistoon perustuvaa varmistusta siitä, että tiettyä käytäntöä koskevat erityisvaatimukset täyttyvät. (Eurachem-Suomi 1997, 55.) Validointia käytetään uuden analyysijärjestelmän tai laitteen koestuksessa. Siinä uudella menetelmällä saatuja tuloksia verrataan asetettuihin laatukriteereihin sairauden toteamis-, hoidonseuranta- ja kliiniset päätöksentekorajat huomioon ottaen. (Linko 2004, 62.)

22 Validointiin liittyy laitekoestus. Laitekoestuksella tarkoitetaan prosessia, jolla varmistetaan, että hankittu laitteisto on käyttötarkoitukseen sopiva. Samalla tarkistetaan, että laitteisto toimii laitetoimittajan ja käyttäjän yhdessä sopimien vaatimusten mukaisesti. (Eurachem-Suomi 1997, 15.) Koestuksessa potilasnäytteet mitataan sekä uudella laitteella että laitteella, jonka tulostaso on tunnettu. Eri laitteilla saatuja tuloksia vertaillaan keskenään piirtämällä regressiosuora ja laskemalla korrelaatiokerroin. Niiden avulla voidaan selvittää miten saadut tulokset poikkeavat toisistaan. (Kaihola, Rintola & Sandbacka 1990, 180.) Vakiointi suoritetaan vertaamalla vakioitavaa laitetta tai vertailuainetta mittanormaaliin eli vakioon. Tällöin saadaan selville vakion ja vakioitavan laitteen välisten arvojen välinen yhteys tietyissä olosuhteissa. Vakiointiin ei liity laitteen säätöä. (Eurachem-Suomi 1997, 7, 26.) Vakiointi voidaan suorittaa tunnetulla vertailumenetelmällä, kaupallisilla vakiointimateriaaleilla tai potilasnäytteillä. Vertailumenetelmällä tuotetaan tavoitearvot, joita käytetään vakiointimateriaalina. (Rajamäki 1999, 128.) Laitteiden toiminnan tarkastamiseen voidaan käyttää laite- ja menetelmävertailua. Solujen tunnistamisessa vertailumenetelmänä on yleensä mikroskopointi. Näin pystytään tarkistamaan, onko laite tunnistanut ja laskenut solut oikein. Normaaleja tuloksia pitäisi kontrolloida noin kerran kuukaudessa, vertailemalla kahdella käytössä olevalla menetelmällä saatuja tuloksia. Kaikki poikkeavat tulokset pitäisi tarkistaa aina vertailumenetelmällä. (Uppa 2001, 74.) 7 AIKAISEMMAT TUTKIMUKSET Vastaavasta aiheesta ei ole aiemmin tehty opinnäytetöitä. Vertailututkimuksina käytettiin Tampereen yliopistollisessa keskussairaalassa ja Virginian yliopistollisessa sairaalassa tehtyjä tutkimuksia. Tampereen yliopistollisessa sairaalassa tutkimus tehtiin vuonna 1996. Siinä vertailtiin keskenään Sysmex UF-100 -analysaattoria ja solujen mikroskooppi laskentaa kammiossa ja peitinlasimenetelmällä. Tutkimuksen aineistona oli 304 virtsanäytettä, joissa kai-

23 kissa oli löydöksiä. Näytteet tutkittiin vähintään neljän tunnin kuluessa näytteenotosta, ja kuljetuksen aikana näytteet säilytettiin jääkaappilämpötilassa. Tutkimuksessa saatiin selville, että analysaattori tunnisti punasoluja, valkosoluja ja bakteereja hyvin. Kammiolaskennalla ja analysaattorilla saatiin samansuuntaisia tuloksia. Peitinlasimenetelmällä mikroskopoitaessa näiden solujen määrä laski, koska osa soluista tuhoutui sentrifugoinnissa. Tubulussoluja ja lieriöitä analysaattori tunnisti kohtalaisesti. Varsinkin, jos virtsassa oli näitä löydöksiä paljon, erottelukyky oli parempi kuin pienemmissä pitoisuuksissa. Näitä soluja havaittiin kuitenkin paremmin mikroskopoimalla peitinlasimenetelmällä. (Kouri, Kähkönen, Malminiemi, Vuento & Rowan 1999b, 25 35.) Yhdysvalloissa Virginian yliopistollisessa sairaalassa vuonna 1997 tehdyssä tutkimuksessa tutkittiin 252 näytettä. Näytteet tutkittiin mikroskopoimalla peitinlasimenetelmällä ja Sysmex UF-100 -analysaattorilla saman päivän aikana. Mikroskopoinnin suoritti aina sama laboratoriohoitaja samalla mikroskoopilla. Tällä tavoin mikroskopoinnista saatiin toistettava. Tutkimuksessa todettiin, että analysaattori laskee enemmän punasoluja, valkosoluja ja pieniä epiteelisoluja, kuin mikroskooppimenetelmällä. Syyksi todettiin, että soluja häviää sentrifugoinnissa ja supernatantin poistossa. Lieriöitä analysaattori tunnisti huonommin kuin edellä mainittuja soluja. (Ben-Ezra, Bork & McPherson 1998, 92 95.) 8 TUTKIMUKSEN TARKOITUS JA TUTKIMUSONGELMAT Opinnäytetyön tarkoituksena oli selvittää Sysmex UF-100 -analysaattorin ja mikroskooppisen menetelmän välistä vertailukelpoisuutta virtsan partikkelitutkimuksessa. Tarkoituksena oli vertailla molemmilla menetelmillä samasta näytteestä saatuja partikkelien määriä toisiinsa. Opinnäytetyön lähtökohtaoletuksena oli, että molemmilla menetelmillä, virtsan partikkelilaskimella ja mikroskopoimalla, saadaan samansuuntaisia tuloksia. Sen lisäksi tarkoituksena oli seurata, onko tarpeellista mikroskopoida näytteitä, joille analysaattori antaa hälytyksen.

24 Tutkimusongelmat: 1. Ovatko Sysmex UF-100 -analysaattorin antamat tulokset täsmääviä mikroskopoimalla saatujen tulosten kanssa? 2. Onko näyte, jolle Sysmex UF-100 -analysaattori antaa hälytyksen, tarpeellista mikroskopoida? 9 TUTKIMUSAINEISTO JA MENETELMÄT 9.1 Tutkimusaineisto ja työn toteutus Opinnäytetyön käytännön työskentely toteutettiin ISLAB Mikkelin aluelaboratoriossa 14. 17.4.2008. Tutkimusaineistona käytettiin ISLAB Mikkelin aluelaboratorioon tulleita U-Solut-potilasnäytteitä. Virtsanäytteet olivat joko säilöntäaineellisissa tai säilöntäaineettomissa putkissa. Tässä opinnäytetyössä ei ollut merkitystä millaisissa putkissa näytteet olivat. Kaikki näytteet ajettiin Sysmex UF-100 -analysaattorilla. Sen antamien tulosten perusteella valittiin näytteet, jotka mikroskopoitiin. Mikroskopoitaviksi valittiin näytteet, joissa oli runsaasti soluja tai laite antoi + punaisella pohjalla hälytyksen. Virtsanäytteitä analysoitiin 52 kappaletta, ja analysaattori antoi näistä näytteistä hälytyksen 36 näytteelle. Päivän aluksi Sysmex UF-100 -analysaattorilla ajettiin laitevalmistajan suosittelema UF CHECK -kontrolliliuos. Virtsanäytteet olivat putkissa, joiden halkaisija oli 12 15 mm ja pituus 100 120 mm. Putkessa oli oltava näytettä vähintään 4 ml, josta laite otti näytettä 800 µl. Analysaattori luokittelee partikkelit seuraavasti: punaiset verisolut (RBC), valkoiset verisolut (WBC), epiteelisolut (EC), hyaliinilieriöt (CAST), bakteerit (BACT), patologiset lieriöt (PATH. CAST), kiteet (X TAL), pienet epiteelisolut (SRC), sperma (SPERM), hiivasolut (YLC) ja muut (OTHERS). Lisäksi se analysoi näytteen osmoottisen paineen ja diureettisen tilan sekä antaa erilaisia hälytyksiä. Punasolut, valkosolut, levyepiteelit, bakteerit, kiteet, hiivat ja sperma tunnistetaan virtaussytometrian avulla.

25 Lieriöt ja pienet epiteelisolut tunnistetaan impedanssin ja virtaussytometrian avulla. (Sysmex-Operator s Manual 2003; Sysmex Europe GmbH 2008.) Sysmex UF-100 antaa hälytyksiä esimerkiksi punasoluista, valkosoluista, patologisista lieriöistä tai pienistä epiteelisoluista. Se antaa hälytyksen, jos se ei ole tunnistanut partikkeleita tai saadut tulokset eivät ole luotettavia. Tällöin tehdään partikkelien laskenta mikroskooppisesti. Analysaattori voi antaa erilaisia hälytysmerkkejä. Plus-merkki punaisella pohjalla tarkoittaa, että näyte pitää tarkastella mikroskoopilla. Plus-merkki keltaisella pohjalla merkitsee, että koneen antama tulos on lähellä koneeseen asennettuja ylä- ja alarajoja. Tähti punaisella pohjalla kertoo, että kone ei ole pystynyt laskemaan soluja luotettavasti. Hälytysmerkki nähdään analysaattorin graafisessa esityksessä hälytyksen antaneen partikkelin tuloksen perässä (liite 3). (Sysmex-Operator s Manual 2003.) Mikroskopointiin valitut näytteet sentrifugoitiin, supernatantti (liuos sakan päällä) poistettiin ja sakka värjättiin Sternheimerin supravitaalivärillä. Näytteiden annettiin värjäytyä vähintään 5 minuuttia. Näytettä pipetoitiin objektilasille 13 µl, jonka jälkeen 18x18 mm:n peitinlasi asetettiin näytepisaran päälle. Käytössä olivat tavallinen valomikroskooppi ja faasikontrastimikroskooppi. Näytettä tarkasteltiin mikroskoopilla ensin 10 x 10-suurennoksella. Tarkempi partikkelien määrällinen ja laadullinen arviointi tehtiin10 x 40-suurennoksella ja näkökenttiä laskettiin viisi jokaisesta näytteestä. Näytteistä suoritettiin virtsan partikkelien peruslaskenta. Virtsan partikkelien peruslaskennassa lasketaan ja ilmoitetaan punasolut, valkosolut, levyepiteelisolut, pienet epiteelisolut, lieriöt (hyaliinilieriö + muut lieriöt), bakteerit, hiivasolut, trichomonas, sakkaisuus, artefaktat ja pyydettäessä myös siittiöt. Virtsan partikkelien erittelylaskennassa solujen morfologiaa tutkitaan edellistä tarkemmin, ja se vaatii mikroskopoijalta suurta ammattitaitoa. (Kouri & Pohjavaara 2002, 1846 1847.) Tulokset ilmoitettiin vakioidun virtsan mikroskopointiohjeen mukaisesti (kappale 4.2.2).

26 9.2 Tilastolliset tutkimusmenetelmät Saadut tulokset käsiteltiin SPSS-ohjelmalla laskemalla niille Spearmanin korrelaatiokerroin. Sillä voidaan laskea kahden populaatioyksikön muuttujien arvojen välinen järjestyskorrelaatio. Muuttujien täytyy olla vähintään järjestysasteikkoa, ja niiden jakaumien täytyy olla jatkuvia. Muuttujat järjestetään kummassakin populaatiossa suuruusjärjestykseen ja niiden arvot korvataan järjestysluvuilla. Spearmanin korrelaatiokertoimella mitataan muuttujien arvojen järjestyksen samankaltaisuutta. Kerroin on 1, jos muuttujien arvojen järjestys on täysin samanlainen. Jos muuttujien arvojen järjestys on täysin päinvastainen, kerroin on -1. Jos taas kerroin on 0, tällöin muuttujien arvojen järjestys on toisiinsa nähden satunnainen. Spearmanin korrelaatiokertoimen laskukaava on: r s 2 1 d i 2 6* n *( n 1) Kaavassa n on havaintoparien lukumäärä, ja d i on havaintoyksikön i järjestyslukujen erotus. (Karjalainen 2004, 103: Ranta, Rita & Kouki 1994, 438 439.) Kun tehdään tilastollisia päätelmiä Spearmanin korrelaatiokertoimen avulla, muodostetaan hypoteesipari. Nollahypoteesina on se, että muuttujat ovat toisistaan riippumattomia ja vastahypoteesina on, että muuttujien välillä on positiivinen tai negatiivinen järjestyskorrelaatio. (Ranta ym. 1994, 441.) Hypoteeseja koskevat johtopäätökset tehdään p-arvon avulla. Jokaisessa testityypissä on oma menetelmä, jolla se lasketaan. P-arvo ilmoittaa, kuinka suuri riski on, että oikea nollahypoteesi hylätään. Jokaisessa tutkimuksessa päätetään erikseen, millä p-arvolla nollahypoteesi hylätään tai jätetään voimaan. Usein käytetään 5 %:n riskirajaa. Tällöin nollahypoteesi hylätään jos p-arvo on pienempi kuin 0,05. (Karjalainen 2004, 194 195.)

27 10 TUTKIMUSTULOKSET 10.1. Menetelmien vertailu Sysmex UF-100 -analysaattorilla ja mikroskopoimalla saatuja solujen määriä käsiteltiin SPSS-ohjelmalla laskemalla Spearmanin järjestyskorrelaatiokerroin. Muuttujat olivat vähintään järjestysasteikollisia ja niiden jakaumat olivat jatkuvia. Solujen lukumääriä ei voitu käyttää sellaisenaan, koska mikroskopoimalla ei saatu tarkkoja solumääriä, jos soluja oli runsaasti. Muuttujat eli solujen lukumäärät asetettiin suuruusjärjestykseen ja niiden arvot korvattiin järjestysluvuilla. Korrelaatiokertoimen laskemista varten asetettiin jokaiselle solulle hypoteesiparit. Punasolut: H 0 : Sysmex UF-100 -analysaattorilla ja mikroskopoimalla laskettujen punasolujen määrät ovat toisistaan riippumattomia. H 1 : Sysmex UF-100 -analysaattorilla ja mikroskopoimalla laskettujen punasolujen määrien välillä on positiivinen tai negatiivinen järjestyskorrelaatio. P-arvo on 0,000. H 0 hylätään, koska p-arvo on < 0,05. Sysmex UF-100 -analysaattorilla ja mikroskopoimalla laskettujen punasolujen määrien välillä on vahva positiivinen järjestyskorrelaatio(r s = 0,703), kuten kuviosta 1 voidaan havaita. Kuvaajan asteikko on muutettu logaritmiseksi, jotta havainnot olisivat lähempänä toisiaan. KUVIO 1. Regressiosuora punasoluista

28 Valkosolut: H 0 : Sysmex UF-100 -analysaattorilla ja mikroskopoimalla laskettujen valkosolujen määrät ovat toisistaan riippumattomia. H 1 : Sysmex UF-100 -analysaattorilla ja mikroskopoimalla laskettujen valkosolujen määrien välillä on positiivinen tai negatiivinen järjestyskorrelaatio. P-arvo on 0,000. H 0 hylätään, koska p-arvo on < 0,05. Sysmex UF-100 -analysaattorilla ja mikroskopoimalla laskettujen valkosolujen määrien välillä on vahva positiivinen järjestyskorrelaatio (r s = 0,923), joka havaitaan kuviossa 2. Kuvaajan asteikko on muutettu logaritmiseksi, jotta havainnot olisivat lähempänä toisiaan. KUVIO 2. Valkosolujen regressiosuora

29 Levyepiteelisolut: H 0 : Sysmex UF-100 -analysaattorilla ja mikroskopoimalla laskettujen levyepiteelisolujen määrät ovat toisistaan riippumattomia. H 1 : Sysmex UF-100 -analysaattorilla ja mikroskopoimalla laskettujen levyepiteelisolujen määrien välillä on positiivinen tai negatiivinen järjestyskorrelaatio. P-arvo on 0,000. H 0 hylätään, koska p-arvo on < 0.05. Sysmex UF-100 -analysaattorilla ja mikroskopoimalla laskettujen levyepiteelisolujen määrien välillä on positiivinen järjestyskorrelaatio (r s = 0,473), joka nähdään kuviosta 3. KUVIO 3. Levyepiteelisolujen regressiosuora

30 Pienet epiteelisolut: H 0 : Sysmex UF-100 -analysaattorilla ja mikroskopoimalla laskettujen pienten epiteelisolujen määrät ovat toisistaan riippumattomia. H 1 : Sysmex UF-100 -analysaattorilla ja mikroskopoimalla laskettujen pienten epiteelisolujen määrien välillä on positiivinen tai negatiivinen järjestyskorrelaatio. Koska p-arvo on 0,684, H 0 jää voimaan. Järjestyskorrelaatiokerroin on 0.058. Sysmex UF-100 -analysaattorilla ja mikroskopoimalla laskettujen pienten epiteelisolujen määrät ovat toisistaan riippumattomia (kuvio 4). KUVIO 4. Regressiosuora pienistä epiteelisoluista