HLA-DQ2-geenien promoottorialueiden metylaatio keliakiassa Pro gradu -tutkielma Tampereen yliopisto Lääketieteellisen teknologian instituutti Huhtikuu 2010 Saija Kukkola
KIITOKSET Tämä pro gradu -tutkielma tehtiin Tampereen yliopiston Lääketieteellisen teknologian instituutissa (IMT). Tutkimuksen kokeellinen osa tehtiin Tampereen yliopiston Lääketieteen laitoksen Lastentautien tutkimuskeskuksen keliakiatutkimusryhmässä. Haluan kiittää työn ohjaajia Keijo Viiriä ja Katri Lindforsia ohjauksesta ja neuvoista. Kiitän myös keliakiatutkimusryhmän johtajaa Markku Mäkeä mahdollisuudesta tehdä tämä tutkielma. Lisäksi haluan kiittää dosentti, erikoislääkäri Katri Kaukista, Anne Heimosta, Marja-Terttu Oksasta ja Laura Airaksista, jotka mahdollistivat näytteiden saamisen tähän tutkimukseen. Kiitokset kuuluvat myös kaikille keliakiaryhmäläisille avusta ja neuvoista. Kiitän myös professori Markku Kulomaata tutkielman tarkastamisesta. Lopuksi haluan osoittaa kiitokset perheelleni sekä erityisesti Dinis Kyllöselle kaikesta opiskelujeni aikana saamasta tuesta ja kannustuksesta. Tampere, Huhtikuu 2010 Saija Kukkola
PRO GRADU -TUTKIELMA Paikka: TAMPEREEN YLIOPISTO Lääketieteellinen tiedekunta Lääketieteellisen teknologian instituutti Tekijä: KUKKOLA, SAIJA SUSANNA Otsikko: HLA-DQ2-geenien promoottorialueiden metylaatio keliakiassa Sivumäärä: 55 s. Ohjaajat: FT Keijo Viiri ja FT Katri Lindfors Tarkastajat: Professori Markku Kulomaa ja FT Keijo Viiri Aika: Huhtikuu 2010 Tiivistelmä Tutkimuksen tausta ja tavoitteet: Keliakia on perinnöllinen autoimmuunisairaus, jossa vehnän, ohran ja rukiin gluteeni aiheuttaa kroonisen tulehduksen ohutsuolessa. Ympäristötekijöiden lisäksi keliakian puhkeamiseen vaikuttavat geneettiset tekijät, joista ihmisen leukosyyttiantigeeni (HLA)-molekyylit DQ2 ja DQ8 ovat parhaiten tunnettuja. Näitä molempia heterodimeerisiä molekyylejä koodaavat kaksi geeniä: DQA1 ja DQB1. Suurin osa DQ2/DQ8-positiivisista henkilöistä ei kuitenkaan koskaan sairastu keliakiaan. Geenien promoottorialueiden CpG-dinukleotidien poikkeava metylaatioprofiili voi osaltaan vaikuttaa eri sairauksien syntyyn. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää DQ2-geenien promoottorien metylaatiota keliakiassa vertaamalla metylaatiostatusta DQ2-positiivisten keliaakikkojen ja ei-keliaakikkojen kesken sekä hoidolla olevien ja gluteenille altistettujen keliaakikkojen kesken. Lisäksi tavoitteena oli tutkia, voiko metylaatiostatuksen selvittää kokoverestä pelkkien lymfosyyttien sijaan. Tutkimusmenetelmät: DQ2-geenien promoottorialueiden sekvenssit sekä niissä olevien CpG-dinukleotidien määrä ja mahdolliset CpG-saarekkeet määritettiin in silico. Näytteet olivat seitsemältä henkilöltä ja analysoitavia sekvenssejä oli yhteensä kolmetoista. Promoottorialueiden metylaatiostatus selvitettiin bisulfiittisekvensointimenetelmällä. Tutkimustulokset: DQB1-geenin promoottori sisältää yhden 204 emäsparin pituisen CpG-saarekkeen, jossa on kahdeksan CpG-dinukleotidia. DQA1-geenin promoottori puolestaan ei sisällä yhtään CpG-saareketta. Bisulfiittisekvensointimenetelmä pystytettiin onnistuneesti vain DQB1-promoottorille. Kahdessa näytteessä kolmestatoista oli yksi metyloitunut CpG-dinukleotidi transkription aloituskohdan suhteen asemassa +103. Nämä olivat keliaakikon lymfosyyttinäyte ja gluteenialtistuksen jälkeinen näyte. Tulosten tarkastelu: Ei-keliaakikon ja keliaakikkojen vertailussa DQB1-promoottorin metylaatiostatuksen suhteen tuli ilmi yksi eroavaisuus, samoin kuin lymfosyytti- ja verinäytteiden vertailussa. Lisäksi gluteenialtistuksen jälkeisissä näytteissä yhdessä havaittiin yksi metyloitunut CpG, mutta tälle näytteelle ei ollut käytettävissä vertailunäytettä ennen altistusta. Näin ollen ei voida sanoa, johtuuko ero gluteenialtistuksesta. Lisäksi näytteiden määrä oli liian pieni, jotta tulokset olisivat tilastollisesti merkitseviä. Johtopäätökset: On mahdollista, että DNA:n metylaatiolla on jonkinlainen epigeneettinen rooli keliakiassa, koska metyloitunut CpG oli havaittavissa samassa kohdassa kahdessa eri näytteessä. Tätä voisi tutkia tulevaisuudessa isommalla näytelukumäärällä, jotta tulokset olisivat tilastollisesti analysoitavissa. Näytteinä olisi parempi käyttää lymfosyyttejä kokoveren sijaan.
MASTER S THESIS Place: UNIVERSITY OF TAMPERE Faculty of Medicine Institute of Medical Technology, IMT Author: KUKKOLA, SAIJA SUSANNA Title: Methylation of promoter regions of HLA-DQ2 genes in celiac disease Pages: 55 pp. Supervisors: Keijo Viiri Ph.D, Katri Lindfors Ph.D. Reviewers: Professor Markku Kulomaa, Keijo Viiri Ph.D. Date: April 2010 Abstract Background and aims: Celiac disease is a hereditary autoimmune disease in which gluten from wheat, barley and rye causes a chronic inflammation in the small intestine. In addition to environmental factors, the onset of the disease is affected by genetic factors, the human leukocyte antigen (HLA) molecules DQ2 and DQ8 being the most wellknown. Both of these heterodimeric molecules are encoded by two genes: DQA1 and DQB1. Although almost all celiac patients are either DQ2 or DQ8 positive, the presence of these molecules is not sufficient for the development of the disease as the majority of DQ2/DQ8 positive people never have the disease. Aberrant DNA methylation profile of promoter regions of genes can contribute to the emergence of various diseases. The aim of this study was to study the DNA methylation status of promoter regions of DQ2 genes in celiac disease by comparing the methylation between DQ2 positive celiac and non-celiac subjects and between celiac patients on gluten-free diet and after exposed to gluten. In addition, the aim was to explore whether the methylation status could be examined using whole blood instead of purified lymphocytes. Methods: The sequences and the presence of CpG dinucleotides and possible CpG islands in DQ2 gene promoters were studied in silico. The samples used were from seven subjects and there were thirteen samples in total to be analysed. The methylation status was studied by bisulfite sequencing. Results: The promoter of DQB1 gene contains one CpG island which is 204 bp long and contains eight CpGs. The promoter of DQA1 gene does not contain any CpG island. The bisulfite sequencing method was successfully set up for studying only the methylation status of DQB1 promoter. There was one methylated CpG at a same position in two samples: a celiac lymphocyte sample and a sample after gluten exposure. Discussion: There was one difference in methylation status of DQB1 gene promoter between nonceliac and celiac subjects and between whole blood and lymphocyte samples. Also, it was found that one sample after exposed to gluten had one methylated CpG but there was no reference sample before the exposure available. Therefore, it cannot be concluded whether the difference results from the gluten exposure. In addition, the number of samples studied was too small to draw any statistical conclusions. Conclusions: It is possible that DNA methylation has some epigenetic role in celiac disease because the methylated CpG was found at a same position in two different samples. However, it should be studied further with more samples so the results could be statistically analysed. It would be better to use lymphocyte samples instead of whole blood.
SISÄLLYSLUETTELO 1 JOHDANTO... 7 2 KIRJALLISUUSKATSAUS... 9 2.1 KELIAKIA... 9 2.1.1 Yleistä keliakiasta... 9 2.1.2 Keliakian patogeneesi... 10 2.2 HLA-KOMPLEKSI... 12 2.2.1 Luokan I HLA-geenit... 12 2.2.2 Luokan III HLA-geenit... 13 2.2.3 Luokan II HLA-geenit ja transkription säätely... 13 2.2.4 Luokan II HLA-molekyylit... 15 2.3 KELIAKIAN GENETIIKKA... 15 2.3.1 HLA-alleelit... 15 2.3.2 Muut keliakiaan vaikuttavat geenit... 17 2.4 EPIGENETIIKKA... 18 2.4.1 Yleistä epigenetiikasta... 18 2.4.2 Histoniproteiinien translaation jälkeinen muokkaus... 19 2.4.3 DNA:n metylaatio... 20 2.4.4 Ympäristötekijät, epigeneettiset muutokset ja autoimmuniteetti... 25 2.5 BISULFIITTISEKVENSOINNIN PERIAATE... 27 3 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET... 29 4 MATERIAALIT JA MENETELMÄT... 30 4.1 DQ2-GEENIEN CPG-SAAREKKEIDEN MÄÄRITTÄMINEN IN SILICO... 30 4.2 NÄYTTEET... 30 4.2.1 Pakastettujen lymfosyyttien sulatus... 31 4.2.2 Lymfosyyttien eristäminen tuoreista kokoverinäytteistä... 31 4.3 DNA:N ERISTYS... 31 4.4 PCR... 32 4.5 BISULFIITTIKONVERSIO JA PCR KONVERTOIDULLE DNA:LLE... 34 4.6 TRANSFORMAATIO, KLOONAUS JA PLASMIDIEN ERISTYS... 35 4.7 SEKVENSOINTI... 36 4.8 SEKVENSSI- JA METYLAATIOANALYYSIT... 37 5 TULOKSET... 38 5.1 DQ2-GEENIEN PROMOOTTORIALUEIDEN CPG-SAAREKKEET... 38 5.2 PCR... 39 5.3 PCR BISULFIITTIKONVERTOIDULLE DNA:LLE... 40 5.4 SEKVENSOINTIREAKTIOIDEN JA BISULFIITTIKONVERSION ONNISTUNEISUUS... 40 5.5 DQB1-GEENIN PROMOOTTORIN METYLAATIOANALYYSI... 40 6 POHDINTA... 44
6.1 DQ2-GEENIEN CPG-SAAREKKEIDEN IDENTIFIOIMINEN IN SILICO... 44 6.2 MENETELMÄT... 45 6.2.1 PCR... 46 6.3 SEKVENSOINTIREAKTIOIDEN JA BISULFIITTIKONVERSION ONNISTUNEISUUS... 46 6.4 DQB1-GEENIN PROMOOTTORIN METYLAATIO... 48 6.4.1 Metylaatiostatus lymfosyytti- vs. kokoverinäytteet... 48 6.4.2 Metylaatiostatus ei-keliaakikko vs. keliaakikko... 49 6.4.3 Muutokset metylaatiossa gluteenialtistuksen jälkeen... 49 7 JOHTOPÄÄTÖKSET... 50 LÄHDELUETTELO... 51
LYHENTEET APC Antigen presenting cell, antigeenin esittelijäsolu bp Base pair, emäspari CIITA Class II transactivator, luokan II transaktivaattori DMSO Dimethyl sulfoxide, dimetyylisulfoksidi HLA Human leukocyte antigen, ihmisen leukosyyttiantigeeni IEL Intraepithelial lymphocyte, intraepiteelinen lymfosyytti LINE Long interspersed nuclear element, usean kiloemäksen pituinen genominen toistojakso MHC Human major histocompatibility complex PBS Phosphate-buffered saline, fosfaatti-puskuroitu suolaliuos SINE Short interspersed nuclear element, lyhyt genominen toistojakso TG2 Transglutaminase-2, transglutaminaasi 2
1 JOHDANTO Keliakia on perinnöllinen autoimmuunisairaus, jossa elimistön immuunijärjestelmä reagoi vehnän gluteeniin sekä ohran ja rukiin samantyyppisiin proteiineihin ohutsuolessa. Sitä sairastaa arviolta 1 % maailman väestöstä. Keliakian puhkeamiseen vaikuttavat perinnöllisten tekijöiden ohella myös ympäristötekijät, kuten imetyksen puute, gluteenin suuri määrä maidonvastikkeissa sekä tulehdukset. Keliakia on polygeeninen sairaus, jossa MHC (human major histocompatibility complex) -molekyylit DQ2 ja DQ8 ovat keskeisiä perinnöllisiä tekijöitä keliakian puhkeamiselle. Kumpikin molekyyli muodostuu ihmisen leukosyyttiantigeeni (human leukocyte antigen, HLA) -kompleksiin kuuluvista DQA1- ja DQB1-geeneistä, jotka kuuluvat HLA-geenien II luokkaan. Nämä HLAgeenit muodostavat noin 50 % keliakian geneettisestä riskistä. (Green & Jabri, 2006.) Noin 90 % keliaakikoista ilmentää DQ2-molekyylejä ja noin 10 % DQ8-molekyylejä. Kuitenkin myös ei-keliaakikot ilmentävät näitä molekyylejä, esimerkiksi suomalaisista noin 35 % on joko DQ2- tai DQ8-positiivisia. (Mäki, 2006.) Nykyään on yhä enemmän tullut ilmi viitteitä siitä, että epigenetiikalla on merkittävä rooli eri sairauksissa, kuten syövässä, tulehduksellisissa oireyhtymissä ja autoimmuunisairauksissa (Wilson, 2008). Epigeneettinen muutos tarkoittaa perinnöllistä muutosta geenien ilmentymisessä, johon ei liity DNA-sekvenssin muutoksia, ja ne ovat välttämättömiä normaalille solujen kehitykselle ja erilaistumiselle (Docherty ym., 2009; Jiang ym., 2004). Epigeneettisiä muutoksia voivat aiheuttaa myös ympäristötekijät koko elämän ajan. Kaksi suurinta epigeneettistä mekanismia on kromatiinin histoniproteiinien translaation jälkeinen muokkaus sekä DNA:n metylaatio. (Wilson, 2008.) DNA:n metylaatiota tapahtuu CpG-dinukleotidien sytosiineissa. Monien geenien promoottorialueen säätelyalueilla CpG-dinukleotideja on paljon, jolloin ne muodostavat CpG-saarekkeita. Näillä säätelyalueilla olevat metyylisytosiinit voivat häiritä transkriptiotekijöiden sitoutumista promoottorialueelle ja houkutella paikalle muita tekijöitä, jotka saavat aikaan kromatiinin tiivistymistä sekä geenien hiljenemistä. Poikkeava metylaatioprofiili voi osaltaan vaikuttaa eri sairauksien syntyyn ihmisillä. (Docherty ym., 2009.) 7
Epigeneettisten muutosten vaikutuksesta keliakiaan ei ole tähän mennessä julkaistu tuloksia. Tämän tutkielman tavoitteena olikin pystyttää menetelmä keliakian kannalta keskeisten DQ2-geenien promoottorialueiden metylaatiostatuksen tutkimiseksi sekä alustavasti selvittää, liittyykö näiden geenien promoottorialueisiin DNA:n metylaatiota keliakiassa. 8
2 KIRJALLISUUSKATSAUS 2.1 Keliakia 2.1.1 Yleistä keliakiasta Keliakia on krooninen suolistotulehdussairaus, joka johtaa ohutsuolen nukkalisäkkeiden eli villusten surkastumiseen, kuopakkeiden eli kryptien kasvamiseen (kryptahyperplasia) sekä limakalvon tasaistumiseen. Sairauden puhkeamiseen vaikuttaa perinnöllinen alttius sekä ravinnon mukana saatu vehnän gluteeni ja samankaltaiset proteiinit rukiissa ja ohrassa. Nykyään keliakian ainoa hoitomuoto on elinikäinen gluteeniton ruokavalio, joka johtaa taudin lievenemiseen sekä estää monien pitkäaikaisten komplikaatioiden ilmenemisen. (Megiorni ym., 2009.) Keliakian kliininen luokitus perustuu ruuansulatuskanavan oireisiin. Klassisella keliakialla viitataan oireistoon, johon kuuluu ripuli joko ravintoaineiden imeytymishäiriön kanssa tai ilman. Epätyypillisessä tai hiljaisessa keliakiassa ruuansulatuskanavan oireet puuttuvat tai ovat vähäisiä. Vielä ei tiedetä, miksi oireisto on niin vaihtelevaa. Pikkulapsilla oireisiin kuuluu ripuli, kun taas vanhemmilla lapsilla voi olla anemiaa, neurologisia ongelmia, pienikokoisuutta ja muita epätyypillisiä oireita, kuten ummetusta. Yleensä ottaen keliaakikoilla yleisin oire on ripuli, mutta myös raudanpuutosta, osteoporoosia, ataksiaa ja epilepsiaa voi esiintyä. Keliakia voi ilmetä myös ihokeliakiana, jossa oireena on voimakkaasti kutiava rakkulainen ihottuma. (Hernandez & Green, 2006.) Alun perin keliakia miellettiin harvinaiseksi lastentaudiksi, mutta nykyään tiedetään, että sairaus on yleinen ja voi puhjeta millä iällä hyvänsä. Diagnoosimäärät ovat kasvussa aikuisväestössä ja myös niillä potilailla, joilla ei ole suolisto-oireita. Keliakian esiintyvyys on suurempi niillä potilailla, joilla on anemia, jokin autoimmuunisairaus tai Downin, Turnerin tai Williamsin oireyhtymä. Lisäksi keliakian todennäköisyyttä (esiintyvyyttä) nostaa se, jos ensimmäisen asteen sukulaisilla on sairaus. Iso osa keliakiatapauksista jää kuitenkin diagnosoimatta. Syy tähän voi olla se, että monilla potilailla on epätyypillisiä oireita tai ei oireita ollenkaan. (Megiorni ym., 2009.) 9
Keliakiadiagnoosi tehdään ohutsuolen histologisten näytteiden perusteella, mutta myös vasta-aineet tutkitaan (Qiao ym., 2009). Jos potilaan ohutsuolen yläosan koepalassa havaitaan nukkalisäkkeiden surkastumista, kryptien liikakasvua ja lymfosyyttien runsautta epiteelisoluissa, ja jos potilaan vaste gluteenin poisjättämiseen ruokavaliosta on yksiselitteinen, diagnoosina on keliakia. Koepalat otetaan, kun tautia epäillään kliinisten oireiden perusteella, serologiset testit ovat positiivisia tai, kun havaitaan vaurioita pohjukaissuolessa tähystyksen yhteydessä. (Green & Jabri, 2006.) Diagnoosia tukee verestä mitattavien keliakian autovasta-aineiden, endomysium- ja transglutaminaasi 2 (TG2)- vasta-aineiden (EmA ja anti-tg2) esiintyminen. Jos tilanne on diagnostisesti epäselvä, voidaan apuna käyttää keliakian perintötekijöiden HLA DQ2- tai DQ8-molekyylien määrittämistä. Jos potilas on näiden molekyylien suhteen negatiivinen eikä histologinen löydös ole täysin selvä, on keliakia hyvin epätodennäköinen. (Kaukinen, 2006.) 2.1.2 Keliakian patogeneesi Ihmisen elimistö ei hajota gluteenia täydellisesti, ja gluteenin alkoholiliukoinen osa, gliadiini, saa aikaan tulehdusreaktion ohutsuolessa keliaakikoilla. Gliadiinin indusoima T-soluvaste sisältää sekä spesifisen että synnynnäisen komponentin. Spesifisessä vasteessa ohutsuolen epiteelin lamina propriassa olevat antigeeniä esittelevät solut (antigen presenting cell, APC) ilmentävät DQ2- tai DQ8-molekyyliä ja stimuloivat CD4 + T- solujen lisääntymistä limakalvossa. Tietyt gliadiini-peptidit (ns. immunogeeniset peptidit) ovat TG2:n substraatteja, joiden glutamiiniaminohappoja entsyymi pystyy muuttamaan negatiivisesti varautuneiksi glutamaateiksi. Tässä prosessissa gliadiini-peptideistä tulee negatiivisesti varautuneita, mikä edesauttaa niiden sitoutumista DQ2- ja DQ8- molekyylien uurteeseen antigeenejä esittelevien solujen pinnalla. (Green & Jabri, 2006.) (Kuva 2.1.) TG2 pystyy muuttamaan paljon glutamiinia sisältävät gliadiini-peptidit hyvin immunogeenisiksi epitoopeiksi (Caillat-Zucman, 2008). TG2-entsyymiä tuotetaan normaalistikin pohjukaissuolessa, mutta keliaakikoilla sitä tuotetaan enemmän (Louka & Sollid, 2003). T-solujen tunnistaessa DQ2/DQ8-molekyylien ja gliadiini-peptidien muodostaman kompleksin keliakiaa sairastavan henkilön suolen limakalvon tulehdusreaktio käynnistyy, ja samalla myös limakalvon B-solut tuottavat paikallisesti oman kudoksen TG2:ta tunnistavaa vasta-ainetta, IgA:ta (Mäki, 2006). Lisäksi myös proinflammatoristen sytokiinien eritys alkaa (Megiorni ym., 2009). 10
Kuva 2.1. Keliakian patogeneesi. (Mukaillen Sollid, 2002.) Synnynnäinen immuunivaste puolestaan liittyy toksisiin gliadiinipeptideihin sekä CD8 + T-soluihin, joiden vaste epiteelissä kohdistuu suoraan stressaantuneita epiteelisoluja kohtaan (Green & Jabri, 2006). Lamina propriassa aikaisemmin aktivoitujen CD4+solujen tuottama sytokiini interleukiini-21 (IL-21) on todennäköisesti linkki adaptiivisen ja synnynnäisen immuunivasteen välillä. IL-21 vaikuttaa sekä muihin CD4+soluihin saaden ne tuottamaan lisää interferoni- :aa (IFN- ) lamina propriassa että interleukiini-15:ta (IL-15), joka stimuloi IFN- :n tuottoa soluista epiteelissä. (Heap & van Heel, 2009.) IL-15 myös indusoi intraepiteelisiä lymfosyyttejä (intraepithelial lymphocyte, IEL) ekspressoimaan NKG2D-reseptoria ja epiteelisoluja ekspressoimaan MICAmolekyyliä, joka on puolestaan NKG2D:n ligandi. Tämä johtaa siihen, että IEL:t tulevat sytotoksisiksi ja tappavat epiteelisoluja. (Jabri & Sollid, 2009.) Nämä tulehdukseen liittyvät tapahtumat johtavat tyypilliseen nukkalisäkkeiden atrofiaan keliakiassa (Heap & van Heel, 2009). 11
2.2 HLA-kompleksi Alue kromosomin 6 lyhyessä varressa, lokuksessa 6p21.3, on nimeltään HLAkompleksi, jossa on yli 200 geenilokusta kattaen noin 0,5 % proteiineja koodaavista geeneistä. Monet HLA-geenituotteet ovat ligandeja, reseptoreja, vuorovaikuttavia proteiineja, signalointiproteiineja ja transkription säätelijöitä, jotka ovat keskeisessä asemassa tulehdusreaktioihin sisältyvissä antigeenien esittelyssä ja prosessoinnissa eli ne ovat keskeisiä tekijöitä adaptiivisessa immuunijärjestelmässä. Lisäksi ne vuorovaikuttavat luonnollisten tappajasolujen (NK-solut) sekä sytokiinien kanssa, ja ovat näin ollen osana myös synnynnäisen immuunisysteemin prosesseissa. Geenien lisäksi HLA-alue sisältää retrotransposoneja, transposoneja, säätelyelementtejä, pseudogeenejä sekä muutamia määrittelemättömiä sekvenssejä. HLA-alue jaetaan kolmeen luokkaan, joista luokka II on sentromeerisin, luokka I telomeerisin ja luokka III sijaitsee luokkien I ja II välissä. (Louka & Sollid, 2003; Shiina ym., 2009.) (Kuva 2.2.) Kuva 2.2. HLA-kompleksi. (Mukaillen Louka & Sollid, 2003.) 2.2.1 Luokan I HLA-geenit Suurinta osaa luokan I HLA-geeneistä ilmennetään melkein kaikissa soluissa. Luokan I klassisilla geeneillä (HLA-A, HLA-B ja HLA-C) on tärkeä rooli virusten infektoimien solujen tunnistamisessa ja niiden tuhoamisessa sekä luonnollisten tappajasolujen vasteiden kontrolloinnissa. Luokan I ei-klassiset HLA-geenit (HLA-E, HLA-F ja HLA-G), jotka eroavat klassisista rajallisemmalla polymorfismilla osallistuvat tiettyihin immuunisäätelytoimintoihin. Luokassa I on lisäksi 12 ei-koodaavaa geeniä tai pseudogeeniä. HLA luokan I molekyylit esittelevät endogeenistä alkuperää olevia peptidejä CD8+ T-solujen reseptoreille. (van den Elsen ym., 2004; Shiina ym., 2009.) 12
2.2.2 Luokan III HLA-geenit Luokassa III sijaitsee 55 proteiinia koodaavaa geeniä ja 5 pseudogeeniä. Geenit koodaavat mm. sytokiinejä ja monilla ei ole ilmeistä roolia immuunijärjestelmän toiminnassa tai tulehdusreaktioissa. Sen sijaan monet geenituotteet ovat mukana solujensisäisissä prosesseissa, kuten transkription säätelyssä, ylläpidossa (housekeeping), biosynteesissä ja elektronikuljetuksessa sekä proteiinien välisissä vuorovaikutustapahtumissa. (Shiina ym., 2009.) 2.2.3 Luokan II HLA-geenit ja transkription säätely Luokan II HLA-geenit ovat polymorfisia, ja niiden ilmentäminen on tiukasti säädeltyä. Näitä geenejä ilmennetään jatkuvasti ammattimaisissa antigeenejä esittelevissä soluissa, joihin kuuluvat dendriittisolut, makrofagit, kateenkorvan epiteelisolut ja kypsät B-solut. Lisäksi niitä ilmennetään sytokiinien, etenkin interferoni- :n, indusoimana aktivoituneissa T-soluissa, fibroblasteissa sekä endoteelistä ja epiteelistä alkuperää olevissa soluissa. Luokan II HLA-geenien säätelyssä tapahtuvat häiriöt, kuten yliekspressointi tai ekspressio tietyissä kudoksissa, vaikuttavat edesauttavasti useiden autoimmuunisairauksien puhkeamiseen. Geeninsäätely tapahtuu pääasiassa transkriptiotasolla luokan II HLA-geenien kohdalla. (van den Elsen ym., 2004; Kumanovics ym., 2003; Murphy ym., 2004; Radosevich & Ono, 2003.) Ensimmäisestä eksonista 160 emäsparia ylävirtaan kattavat säätelyalueen, joka on välttämätön sekä kudosspesifille että indusoituvalle ekspressiolle. Tämä proksimaalinen promoottori sisältää kolme elementtiä, jotka ovat X-, Y- ja S- (tai W-, H-, tai Z-) laatikko. Nämä säätelyelementit löytyvät kaikista luokan II geeneistä, joissa niiden sijainti on sama suhteessa toisiinsa. Y-laatikko, joka sisältää käänteisen CCAAT-elementin, on 10 emäsparin pituinen ja se sijaitsee normaalisti 50 80 emäsparia ylävirtaan transkription aloituskohdasta. Y-laatikosta 12 14 emäsparia ylävirtaan sijaitsee X-laatikko, joka voidaan jakaa edelleen X1- ja X2-laatikoihin. S-laatikko sijaitsee puolestaan 15 20 emäsparia ylävirtaan X-laatikosta ja sisältää seitsemän emäsparin pituisen konservoituneen alueen. (Beaty ym., 1995; Radosevich & Ono, 2003.) 13
X-laatikon tunnistavat monet tekijät, jotka voivat sitoutua joko X1- tai X2-osaan. X1- elementtiin sitoutuu RFX-tekijä (regulatory factor X), ja X2-elementtiin sitoutuvat proteiinit X2BP (X2 binding protein) ja CREB (camp response element binding protein), jotka myös lisäävät RFX-tekijän sitoutumista X1-elementtiin. Repressoivana tekijänä X1-elementtiin sitoutuva proteiini on NFX.1. Y-säätelyelementin sekvenssiin sitoutuvat transkriptiotekijät NF-Y (nuclear factor-y) ja YB-1. NF-Y on välttämätön, mutta eispesifinen tekijä, ja YB-1 on puolestaan negatiivinen säätelijä luokan II HLA-geenien transkriptiossa. Y-elementtiä vaaditaan luokan II HLA-geenien maksimaaliseen ekspressioon. Sekä X- että Y-elementti pystyvät sitomaan transkriptiotekijöitä, jotka voivat olla sekä ekspressiota lisääviä että vähentäviä. X-elementit ovat sekä välttämättömiä että riittäviä luokan II HLA-geenien ekspressiossa, mutta niihin sitoutuvat tekijät FRX ja CREB eivät yksistään riitä aktivoimaan geeniekspressiota. (Morris ym., 2000; Radosevich & Ono, 2003.) Koska S- ja X-elementtien sekvensseissä on homologiaa, samat proteiinit voivat sitoutua niihin kumpaankin. Esimerkiksi S-elementti voi sitoa RFX-tekijän ja sitoutuminen on voimakkaampaa, jos NF-Y on sitoununeena Y-elementtiin. (Radosevich & Ono, 2003.) Lisäksi NF-Y:n sitoutuessa Y-elementtiin myös RFX-kompleksin sitoutuminen X-elementtiin on voimakkaampaa. Luokan II HLA-geenien promoottorien aktiivisuus riippuu siis eri tekijöiden ko-operatiivisesta sitoutumisesta promoottorien eri säätelyelementteihin. (Reith ym., 1994.) Edellisten transkriptiotekijöiden lisäksi luokan II HLA-geenejä säätelee myös tekijä, joka ei itse sitoudu DNA:han. Tämä säätelytekijä on nimeltään luokan II transaktivaattori (class II transactivator, CIITA) ja toisin kuin DNA:han sitoutuvat proteiinit, CII- TA:n ekspressio on tiukasti säädeltyä. CIITA:n ekspressio korreloi täsmälleen luokan II geenien ekspression kanssa sekä antigeenejä esittelevissä soluissa että IFN-γindusoituvissa soluissa. Tämän vuoksi CIITA:a pidetään luokan II HLA-geenien tärkeimpänä säätelijänä. CIITA on sekä välttämätön että riittävä säätelemään kyseisiä geenejä, ja tiedetään myös, että niiden jatkuvaa ekspressiota ammattimaisissa antigeenejä esittelevissä soluissa, kuten dendriittisoluissa sekä IFN-γ:n indusoimissa B-soluissa ylläpitää nimenomaan CIITA. Koska CIITA ei itse sitoudu DNA:han, se vaikuttaa sitoutumalla suoraan S-, X- tai Y-elementteihin sitoutuneisiin tekijöihin tai yleisiin transkriptiotekijöihin. (Brown ym., 1998; Radosevich & Ono, 2003.) (Kuva 2.3.) 14
Kuva 2.3. Malli luokan II HLA-geenien transaktivaatiosta CIITA:n avulla. (Mukaillen Brown ym., 1998.) 2.2.4 Luokan II HLA-molekyylit Luokan II HLA-geenien koodaamat molekyylit ovat heterodimeerisiä solukalvon läpäiseviä glykoproteiineja. Ne muodostuvat kahdesta ketjusta (α ja β), joissa kummassakin on kaksi solun ulkopuolista domeenia yhdistyneenä solukalvossa olevaan alueeseen ja sytoplasmiseen alueeseen. Näin ollen molekyyleillä on neljä solun ulkopuolista domeenia. (Radosevich & Ono, 2003.) Luokan II HLA-molekyylien peptidejä sitova uurre muodostuu β-levyjen muodostamasta pohjasta sekä α-kierteiden muodostamista seinistä. Uurteessa on pieniä onkaloita, joissa on peptidien sitovuudesta vastuussa olevia aminohappoja. Luokan II molekyylien ensisijainen tehtävä on sitoa solun endosomaalisista osastoista tulevia antigeenejä ja esitellä ne CD4 + T-solujen pinnalla oleville T- solureseptoreille. (Kumánovics ym., 2003; Louka & Sollid, 2003.) Jotta ne saavat aikaan immuunireaktion, luokan II molekyylien täytyy siis sitoutua T-solureseptoriin. CD4 on koreseptori, joka löytyy niistä T-soluista, jotka ovat vuorovaikutuksessa luokan II molekyylien kanssa. CD4-koreseptori saa aikaan T-solureseptorien dimerisaation, mikä johtaa T-solujen signaalinvälitykseen ja aktivaatioon. (Radosevich & Ono, 2003.) 2.3 Keliakian genetiikka 2.3.1 HLA-alleelit Keliakian geneettisestä alttiudesta noin 50 % selittyy HLA-geeneillä. Yli 90 % keliaakikoista ilmentää DQ2-molekyyliä, jota koodaa alleelit DQA1*0501 ja DQB1*0201, jotka ovat samassa kromosomissa tai DQA1*0505 ja DQB1*0202, jotka ovat eri kromosomeissa. Suurimmalla osalla lopuista potilaista alleelit ovat DQA1*0301 ja 15
DQB1*0302, jotka koodaavat molekyyliä DQ8. (Caillat-Zucman, 2008; Louka & Sollid, 2003.) (Kuva 2.4.) Näiden alleelien tiivis yhteys keliakiaan voidaan selittää sillä, että APC:den ilmentämät DQ2- ja DQ8-molekyylit välittävät gluteeni-reaktiivisten CD4 + T- solujen aktivaatiota ohutsuolessa sitomalla spesifisesti gluteenista peräisin olevia gliadiini-peptidejä, joita TG2 on modifioinut, ja esittelemällä peptidit ohutsuolen T-soluille (Megiorni ym., 2009). Kuva 2.4. DQ2- ja DQ8-molekyylien muodostuminen haplotyyppien perusteella. (Mukaillen Qiao ym., 2009.) DQ2-molekyylin liittyminen keliakiaan on seurausta yksinomaan DQ2.5 (DR3-DQ2) haplotyypin kautta. Toisen DQ2-molekyylin, DQ2.2:n (DR7-DQ2), ei ole yksistään havaittu altistavan keliakialle. (Heap & van Heel, 2009.) Tämä selittyy sillä, että DQ2.5-molekyylejä ilmentävät APC:t sitovat gliadiinista peräisin olevia epitooppeja paljon herkemmin sekä esittelevät niitä T-soluille pidemmän aikaa kuin DQ2.2- molekyyli (Fallang ym., 2009). Koska jokainen haplotyyppi on läsnä vain yhdessä kromosomissa, on mahdollista tuottaa DQ2.5- ja DQ2.2 -molekyylien yhdistelmiä, jotka ilmenevät solujen pinnalla riippuen vanhemmilta peritystä genotyypistä. DQ2.5- haplotyyppiä on kahdenlaista, cis-tyyppi, jossa sekä -ketju että -ketjun geenit ovat samassa kromosomissa ja trans-tyyppi, jossa ketjuja koodaavat geenit ovat eri kromosomeissa, jolloin alleelit ovat peräisin kummaltakin vanhemmalta. (Heap & van Heel, 2009.) 16
Perittyjen HLA-DQ-alleelien kokoonpano vaikuttaa suoraan siihen, millä todennäköisyydellä keliakia puhkeaa. Sisaruksilla, joilla on kummallakin DQ2.5-haplotyyppi, on isompi riski sairastua keliakiaan kuin mitä sisaruksilla yleensä. Myös geenien kopioluku vaikuttaa sairastumisriskiin. Potilailla, jotka ovat homotsygootteja alleelin DQB1*02 suhteen, on viisinkertainen riski sairastua, mutta sairastumisikään tai keliakian vakavuuteen se ei vaikuta. (Heap & van Heel, 2009; Murray ym., 2007.) Myös potilailla, jotka ovat heterotsygootteja DR7-DQ2- ja DR5-DQ7 -haplotyyppien suhteen, on merkittävästi suurempi riski sairastua keliakiaan. Tämä selittyy sillä, että näiden henkilöiden vastinkromosomeissa sijaitsevat DQA1- ja DQB1-alleelit tuottavat DQ2.5-molekyyliä. DQ2.5- ja DQ2.2-molekyylit eroavat DQA1-alleelin suhteen, joten voidaankin olettaa, että DQA1-alleelin variaatiolla on merkittävä vaikutus keliakiariskiin. (Fallang ym., 2009.) 2.3.2 Muut keliakiaan vaikuttavat geenit Eurooppalaista alkuperää olevista ei-keliaakikoista noin 20 30 % kantaa DQ2-geenejä, joten on ilmeistä, että DQ2/DQ8-positiivisuus ei yksin selitä keliakiaan sairastumista. Vain noin 3 % DQ2-molekyyliä ilmentävästä väestöstä sairastuu keliakiaan. Lisäksi konkordanssi monotsygoottisilla kaksosilla on paljon korkeampi kuin HLA-identtisillä ditsygoottisilla kaksosilla. Nämä tiedot viittaavat siihen, että HLA-alueen ulkopuolella on olemassa tärkeitä geenejä, jotka liittyvät keliakian patogeneesiin. (Adamovic ym., 2007; Wolters & Wijmenga, 2008.) Geneettiset kytkentäanalyysit tai assosiaatiotutkimukset ovat paljastaneet, että mahdollisia keliakiaan liittyviä geenejä on kromosomialueilla 2q33 (Djilali-Saiah ym., 1998), 5q32 (Adamovic ym., 2007), 6q21-22, (van Belzen ym., 2003) 6q25.3 (van Belzen ym., 2004), 9p21-13 (van Belzen ym., 2004), 15 ja 19p13.1 (van Belzen ym., 2003). Lisäksi muissa geneettisissä assosiaatiotutkimuksissa on löydetty kahdeksan muuta lokusta (4q27, 1q31, 2q11-2q12, 3p21, 3q25-3q26, 3q28, 6q25 ja 12q24), joissa sijaitsevien immuunipuolustukseen liittyvien geenien variaatiot vaikuttavat riskiin sairastua keliakiaan (Hunt ym., 2008). 17
2.4 Epigenetiikka 2.4.1 Yleistä epigenetiikasta Epigenetiikalla viitataan geenien ilmentymistason periytyvien muutosten tutkimukseen. Epigeneettiset mekanismit liittyvät geenien toiminnan säätelyyn, eikä DNAsekvenssissä itsessään tapahdu muutoksia. Geenien ilmentymisen säätelyn epigeneettinen kontrollointi periytyy solun jakautuessa tytärsoluihin kromatiinin rakenteen mukana. Kaksi tärkeintä epigeneettistä mekanismia on kromatiinin histoniproteiinien translaation jälkeinen muokkaus sekä DNA:n metylaatio, jota tapahtuu pääasiassa CpGdinukleotideissa. Nisäkkäillä noin 80 % sytosiineista, jotka ovat osana CpGdinukleotideja, ovat metyloituneita. Suurin osa ei-metyloituneista sytosiineista sijaitsee CG-rikkaissa sekvensseissä eli CpG-saarekkeissa, joita löytyy erityisesti geenien promoottorialueilta. Histonien muokkausta, kuten metylaatiota ja asetylaatiota sekä DNA:n metylaatiota säädellään eri tavalla, mutta mekanismit ovat kytkeytyneitä toisiinsa. Epigeneettiset muutokset ovat vakaita, mutta palautuvia prosesseja, jotka ovat välttämättömiä normaalille solujen kehitykselle ja erilaistumiselle. (Curradi ym., 2002; Docherty ym., 2009; Jiang ym., 2004; Wilson, 2008.) Epigeneettisillä mekanismeilla on tärkeä rooli eukaryoottien geeninsäätelyssä ja epigeneettisen kontrolloinnin avulla sellaisia geenejä pystytään hiljentämään solutyypeissä, joissa niiden tuotteita ei tarvita. Epigeneettistä kontrollointia tapahtuu erityisesti nisäkkäiden kehitysvaiheessa. Esimerkkinä tästä on X-kromosomin inaktivaatio, joka tasaa siinä olevien geenien toimintaa eri sukupuolten välillä sekä genominen leimautuminen, jossa alleeleja ilmennetään eri tavalla riippuen siitä, kummalta vanhemmalta alleeli on peritty. Kumpaankin tapahtumaan liittyy DNA:n metylaatiota sekä histonien deasetylaatiota ja esimerkiksi histonin H3 lysiinin 27 trimetylaatiota (H3-K27me3), jotka kaikki hiljentävät geenien toimintaa. (Hewagama & Richardson, 2009; Wolfe & Matzke, 1999; Zhao ym., 2008.) Transkriptionaalisesti aktiivisessa kromatiinissa DNA on metyloitumaton ja histonit ovat asetyloituneita, ja päinvastoin. Kun DNA on metyloitunut, metyylisytosiineja sitovat proteiinit sitoutuvat siihen ja houkuttelevat paikalle kromatiinin inaktivaatiokomplekseja sisältäen myös histonideasetylaaseja. Histonideasetylaasit poistavat asetyyliryhmiä histoneista, mikä edesauttaa tiiviin, transkriptionaalisesti inaktiivisen kromatiinirakenteen muodostumisen. (Richardson, 2007.) 18
Epigenetiikan ala on nopeasti kasvava kuin myös ymmärrys sen kliinisestä merkityksestä. Nykyään on yhä enemmän tullut ilmi viitteitä siitä, että epigenetiikalla on merkittävä rooli erilaisissa sairauksissa, kuten syövässä ja tulehduksellisissa oireyhtymissä. Epigeneettisiä muutoksia voivat aiheuttaa myös ympäristötekijät koko elämän ajan. Esimerkiksi ravinnosta peräisin olevilla tekijöillä voi olla merkittäviä vaikutuksia tiettyjen geenien ilmentymiseen juuri epigeneettisten modifikaatioiden kautta. Nämä muutokset voivat sitten periytyä seuraaville sukupolville. (Richardson, 2007; Wilson, 2008.) 2.4.2 Histoniproteiinien translaation jälkeinen muokkaus Histonit ovat DNA:n pakkausproteiineja, ja yhdessä DNA ja histonit muodostavat nukleosomeja, kromatiinin alayksiköitä. Nukleosomaalisia histoniproteiineja on neljää päätyyppiä: H3, H4, H2A ja H2B, joita kutakin on kaksi kopiota yhdessä nukleosomissa. Kromatiinirakenteen avulla DNA saadaan pakattua tiiviimmäksi, mutta sen avulla myös säädellään transkriptiotekijöiden pääsyä DNA:n lähelle ja sitoutumista siihen. Histonien aminoterminaalisten päiden translaation jälkeisiä kovalenttisia modifikaatioita on yli 60 erilaista ja yleisimpiä niistä ovat asetylaatio, metylaatio, fosforylaatio sekä ubikitinaatio. (Hirst & Marra, 2009; Richardson, 2007.) Histonien asetylaatio on palautuva muutos, joka kohdistuu tiettyihin aminohappoihin histoniproteiineissa. Sitä kontrolloivat histoniasetylaasit (HAT) ja histonideasetylaasit (HDAC), jotka tyypillisesti toimivat transkriptionaalisina ko-aktivaattoreina ja korepressoreina. Histonien asetylaatio on parhaiten ymmärretty histonimodifikaatiomuoto, ja sen epänormaali säätely voi johtaa poikkeavaan geeniekspressioon sekä tuumorigeneesiin. Asetylaatio voi säädellä geeniekspressiota kahdella tasolla: yleisellä tai promoottorikohtaisella. Yleinen asetylaatio korreloi yleisen transkriptionaalisen aktiivisuuden kanssa, mutta promoottorikohtainen on tärkeä mekanismi tiettyjen geenien aktiivisuuden säätelyssä. Histonien asetylaatio vaikuttaa kromatiinirakenteen lisäksi myös transkriptiota sääteleviin proteiineihin ja niiden vuorovaikutukseen DNA:n kanssa. Esimerkiksi, jos HDAC poistaa asetyyliryhmiä, siitä seuraa kromatiinin tiivistymistä ja transkription repressiota. Se voi myös indusoida muita epigeneettisiä mekanismeja, kuten DNA:n metylaatiota, mikä johtaa pysyvään geenin hiljenemiseen. (Vaissière ym., 2008.) 19
Histonien metylaatio kohdistuu suurilta osin histonien H3 ja H4 aminoterminaalisiin lysiiniaminohappoihin. Metylaation vaikutus geeniaktiivisuuteen riippuu kohteena olevasta lysiinistä sekä siitä, missä kohtaa geeniä kyseinen histoni sijaitsee. Esimerkiksi alkionkehityksen aikana normaalin kehityksen kannalta tärkeitä geenejä repressoiva tekijä on histonin 3 lysiinin 27 trimetylaatio (H3K27me3). Myös histonin 4 lysiinin 20 metylaatio (H4K20me) liittyy transkriptionaaliseen hiljentämiseen ja sen metylaatiostatus vaihtelee solujen erilaistumisen aikana. Transkription aktivaatioon puolestaan liittyy esimerkiksi histonin 3 lysiinin 4 trimetylaatio (H3K4me3), joka on yleistä etenkin transkriptoitavien geenien 5 -päässä. (Hirst & Marra, 2009; Lennartsson & Ekwall, 2009.) 2.4.3 DNA:n metylaatio Nisäkkäillä suurin osa genomin CpG-dinukleotideista on kemiallisesti modifioitunut siten, että metyyliryhmä on kovalenttisesti kiinni sytosiinirenkaan C5-asemassa. (Kuva 2.5.) Metyylisytosiineja löytyy kaikkialta genomista; proteiineja koodaavilta alueilta, endogeenisistä toistojaksoalueilta sekä transposoneista, ja ne aiheuttavat transkription repressiota. Metyylisytosiinit kuitenkin deaminoituvat spontaanisti tymiineiksi, mikä on johtanut CpG-dinukleotidien mutatoitumisen TpG:ksi ja CpA:ksi. Tämän vuoksi CpGdinukleotidien määrä genomissa on pienempi, mitä odotusarvon perusteella voisi olettaa (21 % odotusarvosta). (Cross & Bird, 1995; Illingworth & Bird, 2009.) Kuva 2.5. DNA:n metylaatiossa CG-dinukleotidin sytosiinin 5 -asemaan on kovalenttisesti liittynyt metyyliryhmä. (Mukaillen Barros & Offenbacher, 2009.) 20
DNA:n metylaatiosta vastaavat de novo- ja ylläpitometyylitransferaasit. Alkionkehityksen aikaisessa vaiheessa DNA:n metylaatiopohjan muodostumisesta vastaavat de novometyylitransferaasit Dnmt3a ja -3b. Ylläpitometyylitransferaasi Dnmt1 sen sijaan vastaa metylaation levityksestä ja ylläpidosta solusukupolvien välillä. (Vaissière ym., 2008.) DNA:n metylaatio on suorin epigeneettinen mekanismi, jolla solut pystyvät säilyttämään geenirepression solujen jakautuessa. Symmetrisesti metyloituneilla CpGdinukleotideilla on yksi metyylisytosiini kummassakin DNA-kaksoisjuosteessa replikaation jälkeen. DNA-synteesin jälkeen hemimetyloitunut CpG-dinukleotidi metyloidaan nopeasti noin minuutissa. (Wolfe & Matzke, 1999.) (Kuva 2.6.) Synteesin jälkeinen metyyliryhmän lisäys sytosiineihin muuttaa DNA:n isomman uurteen (major groove) muotoa ja nämä DNA:n epigeneettiset markkerit kopioituvat edelleen syntetisoidun DNA:n kromatiinirakenteeseen. (Jones & Takai, 2001.) DNA:n metylaatiolla on tärkeä rooli normaalissa solun toiminnassa ja poikkeava metylaatioprofiili voi osaltaan vaikuttaa eri sairauksien syntyyn ihmisillä (Wilson, 2008). Kuva 2.6. DNA:n metylaatiostatuksen periytyminen. (Mukaillen www.webbooks.com/mobio/free/ch7f2.htm, 6.10.2009.) Metylaatio vaikuttaa proteiinien ja DNA:n vuorovaikutukseen, mikä johtaa kromatiinin rakenteen muutoksiin. Lopputuloksen kannalta kriittisintä on se, missä kohtaa geenisekvenssiä metylaatiomuutos tapahtuu suhteessa transkription aloituskohtaan. (Docherty 21
ym., 2009; Jones & Takai, 2001.) Geenien säätelyalueilla olevat metyloituneet sytosiinit häiritsevät transkriptiotekijöiden sitoutumista promoottorialueelle sekä saavat aikaan metyyliryhmiä sitovien proteiinien sitoutumisen metyloituneisiin CpG-dinukleotideihin. Nämä metyyliryhmiä sitovat proteiinit houkuttelevat paikalle histonideasetylaaseja, jotka deasetyloivat histoniproteiineja, jolloin nukleosomit tiivistyvät ja geenien toiminta hiljenee. (Docherty ym., 2009; Wilson, 2008.) 2.4.3.1 CpG-saarekkeet CpG-saarekkeet ovat tavallisesti metyloitumattomia 1-2 kiloemäksen pituisia alueita DNA:ssa, jotka yhdessä kattavat noin 2 % genomista. Kaikki geenit huomioon ottaen, 60 70 % sisältää niiden 5 -puolella CpG-saarekkeita, jotka useimmiten kattavat promoottorin, transkription aloituskohdan sekä ensimmäisen eksonin. CpG-saarekkeiden G+C-pitoisuus (60 70 %) on suurempi kuin muualla genomissa (40 %) ja niissä CpGdinukleotidien tiheys on suurempi. (Cross & Bird, 1995; Illingworth & Bird, 2009.) Kaikkien jatkuvasti ilmennettävien ylläpitogeenien promoottoreissa on CpG-saarekkeita ja lisäksi noin puolet kudosspesifisten geenien promoottereista sisältää CpG-saarekkeita (Antequera, 2003). CpG-saarekkeita löytyy promoottorialueiden lisäksi myös geenien koodaavilta alueilta. Esimerkiksi geenissä APOE on sisäinen CpG-saareke, joka kattaa eksonin 4. Intrageenisiä CpG-saarekkeita on yleensä niissä geeneissä, joiden ekspressio on rajoittuneempaa. (Jones, 1999.) Intrageeniset CpG-saarekkeet voivat itse asiassa sisältää sellaisia transkription aloituskohtia, joita ei ole vielä identifioitu. On mahdollista, että näitä ylimääräisiä promoottoreita hyödynnetään hyvin kudosspesifisellä tavalla. Useat transkriptit alkavat intrageenisistä CpG-saarekkeista, ja niiden on huomattu ilmentyvän tiettyjen kehitysvaiheiden aikana. (Illingworth & Bird, 2009.) Suurin osa CpG-saarekkeita sisältävistä promoottoreista pysyy metyloitumattomana jopa niissä solutyypeissä, joissa kyseisiä geenejä ei ilmennetä ollenkaan (Weber ym., 2007). Syytä, miksi useimmat promoottorialueiden CpG-saarekkeet pysyvät metyloitumattomina laajamittaisesta de novo -metylaatiosta huolimatta varhaisen alkionkehityksen aikana, ei täysin tiedetä. Todennäköisin selitys on se, että sitoutuneet perustranskriptiotekijät vievät tilan eli muodostavat steerisen esteen Dnmt:n sitoutumiselle. (Ku- 22
va 2.7.) Tätä vaihtoehtoa tukevat tutkimustulokset globiinigeenien ilmentymisestä hiiren alkionkehityksen aikana. α-globiinia, jonka promoottori sisältää CpG-saarekkeen, transkriptoidaan alkiossa, kun taas transkriptionaalisesti hiljainen β-globiini, jonka promoottori ei sisällä CpG-saareketta, ei ilmenny alkiossa. Hiiren embryogeneesin tarkempi analyysi osoitti, että 93 % tutkituista ekspressoiduista geeneistä sisälsivät promoottoreissaan CpG-saarekkeen. Näin ollen CpG-saarekkeet voivat olla transkriptiomekanismin aikaansaamia jälkiä alkionkehityksen de novo -metylaation aikana. (Illingworth & Bird, 2009.) Kuva 2.7. Potentiaalinen mekanismi CpG-saarekkeiden hypometylaatiolle. Perustranskriptiotekijät (RNA polymeraasi II ja TF) sekä yleensä aktiivisiin geeneihin assosioituva histoniproteiinin metylaatio (H3K4me3) estävät metyylitransferaasien sitoutumisen transkription aloituskohtaan. Mustat pallot kuvaavat metyloituneita CpG-dinukleotideja ja valkoiset metyloitumattomia. (Mukaillen Illingworth & Bird, 2009.) Metyloituneet CpG-saarekkeet Promoottorialueilla olevien CpG-saarekkeiden de novo-metylaatiota tapahtuu genomisessa leimautumisessa, X-inaktivaatiossa, kehityksellisissä sairauksissa sekä syövässä. (Shen ym., 2007.) Metyloituneen DNA:n transkription hiljentämiseen osallistuvat MeCP-proteiinit (methyl-cpg-binding protein), jotka sitoutuvat spesifisesti metyloituneisiin CpG-dinukleotideihin ja houkuttelevat paikalle histonien deasetylaaseja ja muita transkriptionaalisia repressoreita. CpG-dinukleotidit aiheuttavat vahvan MeCPproteiinien sitoutumisen ja saavat aikaan hyvin tehokkaan ja stabiilin transkription repression kromatiinirakenteen muutosten seurauksena. (Antequera, 2003; Weber ym., 2007.) 23
Nykyään on yleisesti hyväksytty, että CpG-saarekkeet ylläpitogeeneissä sekä kudosspesifisissä geeneissä lukuun ottamatta edellä mainittuja leimautumisgeenejä sekä X- inaktivaatioon liittyviä geenejä eivät ole metyloituneita missään vaiheessa. Suurin osa CpG-saarekkeista on siis metyloitumattomia normaaleissa kudoksissa, mutta muutaman saarekkeen tiedetään olevan metyloitunut. Nämä saarekkeet eivät liity leimautumiseen eivätkä X-inaktivaatioon, ja niillä on todennäköisesti rooli kudosspesifisten geenien ohjatussa ekspressiossa erilaistumisprosessissa. (Shen ym., 2007.) Monien geenien kohdalla CpG-saarekkeen metylaation on todettu korreloivan transkription hiljentymisen kanssa normaaleissa soluissa. Useimmissa tapauksissa korrelaatioon liittyvät kuitenkin intrageeniset CpG-saarekkeet eivätkä promoottorialueen saarekkeet. Kuitenkin myös muutaman promoottorialueen saarekkeen metylaation on todettu korreloivan transkription hiljentymisen kanssa, mutta näissä CpG-dinukleotidien tiheys on ollut alhainen. (Shen ym., 2007.) Onkin todennäköistä, että geenirepression voimakkuus riippuu paikallisesta CpG- ja metylaatiotiheydestä promoottorialueella (Boyes & Bird, 1992). 2.4.3.2 Intrageeninen metylaatio Toisin kuin promoottorialueen tavallisesti metyloitumattomat CpG-saarekkeet, geeneissä sijaitsevat liikkumis- ja kopioitumiskykyiset elementit eli transposonit, kuten LINEt (usean kiloemäksen pituiset genomiset toistojaksot), SINEt (lyhyet genomiset toistojaksot) ja endogeeniset retrovirustyyppiset transposonit ovat hyvin metyloituneita somaattisissa kudoksissa. Nämä elementit kattavat enemmän kuin 45 % ihmisen genomista ja vastaavat suurilta osin genomin kaikista metyloituneista CpG-dinukleotideista. Useimmiten näitä liikkuvia elementtejä löytyy intronisilta alueilta, joten intrageeninen CpGmetylaatio on yleistä transkription aloituskohdasta alavirtaan. (Lorincz ym., 2004.) Epigenomiset tutkimukset ovat osoittaneet, että transkription etenemisen (elongation) epigeneettinen kontrollointi on laajalle levinnyt säätelymekanismi. Intrageenistä DNA:n metylaatiota tapahtuu enemmän, ja sillä on laajempi vaikutus geenien ekspressiotasoon kuin promoottorialueen metylaatiolla. Metylaatio proteiineja koodaavilla alueilla voikin yksinään inhiboida geeniekspressiota. Choi ym. (2009) on tutkinut erityisesti koodaavien sekvenssien raja-alueiden nukleosomien rakennetta ja niissä esiintyvää DNA:n mety- 24
laatiota. Raja-alueiden rooli on ilmeisesti RNA:n pilkkomisen kontrolloinnissa. Ensimmäisen ja viimeisen eksonin pitää transkriptoitua mrna:han, jotta saadaan aikaan toimiva proteiini. Kun transkription eteminen hidastuu näiden epigeneettisten markkereiden kohdalla, välttämättömien eksonien mukaan saaminen tehostuu. (Choi ym., 2009.) Lorincz ym. (2004) puolestaan on osoittanut, että metylaatio alavirtaan aktiivisesta promoottorista voi vaikuttaa negatiivisesti transkription etenemiseen nisäkässoluissa. Intrageeninen metylaatio ei kokonaan estä transkription etenemistä, mutta on mahdollista, että tällainen metylaatio kuitenkin vähentää sen tehokkuutta. Tämä johtuu siitä, että intrageeninen metylaatio indusoi tiiviin kromatiinirakenteen muodostumista histonien hypoasetylaation kautta. (Lorincz ym., 2004.) 2.4.4 Ympäristötekijät, epigeneettiset muutokset ja autoimmuniteetti DNA:n ja histonien epigeneettiset muutokset muodostavat linkin genotyypin ja fenotyypin välille. Periytyvät epigeneettiset markkerit muodostuvat alkionkehityksen aikana ja niiden syntyyn vaikuttavat sisäisten tekijöiden lisäksi myös ympäristötekijät. Näin muodostuu epigenotyyppi, joka määrittää eri geenien aktivaation tai repression kautta yksilön fenotyypin. Ikääntyessä erilaiset ympäristö-, toksikologiset sekä ravitsemukselliset tekijät vaikuttavat epigeneettisten markkereiden somaattiseen ylläpitoon ja sitä kautta epigenotyyppiin ja lopulta fenotyyppiin. (Feil, 2006.) (Kuva 2.8.) Kuva 2.8. Genotyypin, epigenotyypin ja fenotyypin linkittyminen toisiinsa. (Mukaillen Feil, 2006.) 25
Tekijät, joiden tiedetään vaikuttavan DNA:n metylaatioon, ovat karsinogeenit, tulehdukset sekä ruokavalio. Karsinogeeneista ainakin tupakan, alkoholin, arseenin ja asbestin on todettu liittyvän metylaatiomuutoksista aiheutuvaan geeniaktivaatioon monissa syövissä. Tämän vuoksi voidaan olettaa, että erilaisille ympäristötekijöille altistuminen elämän aikana voi vaikuttaa suoraan tai epäsuorasti metylaatiomuutoksiin ja edistää muidenkin sairauksien syntyä. (Christensen ym., 2009.) Geenien epigeneettinen tila on altis muutoksille ympäristötekijöiden vaikutuksesta koko aikuiselämän ajan ja yleisesti ottaen genomin metylaatio vähenee iän mukana (Grolleau- Julius ym., 2009.). Toisaalta taas CpG-saarekkeiden metylaation on todettu lisääntyvän ikääntyessä (Christensen ym., 2009). Ikään liittyvä DNA:n metylaation muutos on hyvin dokumentoitua, mutta histonien modifikaatioista on sen sijaan vain vähän tietoa. On arvioitu, että epigeneettisten muutosten toistumistiheys eliniän aikana olisi yksi tai kaksi kertaa nopeampi kuin somaattisilla mutaatioilla. Yksi selitys tähän voi olla eroavaisuudet ympäristötekijöille altistumisen kestossa. Myös identtisten kaksosten epigenetiikassa on sitä enemmän eroja, mitä vähemmän aikaa he ovat kasvaneet yhdessä samassa ympäristössä. (Grolleau-Julius ym., 2009.) Ympäristötekijöille altistuminen voi saada aikaan epigeneettisiä muutoksia, jotka periytyvät myös jälkeläisille. Tutkimustuloksia tästä on saatu erityisesti hiirikokeilla. Esimerkiksi hiirien ruokavalion sisältämä metyylilisäravinne raskauden aikana vaikuttaa jälkeläisten epigeneettiseen vaihtelevuuteen ja DNA:n metylaatioon, ja sitä kautta jälkeläisten terveyteen sekä eliniän pituuteen. Näiden tutkimustulosten valossa voidaan sanoa, että hiirillä ruokavalio ja/tai metaboliset vaikutukset säätelevät endogeenisten retrovirustyyppisten transposonien (IAP) pitkien terminaalisten toistojaksojen (LTR, long terminal repeats) ilmentymistä, maternaalista epigeneettistä periytyvyyttä sekä leimautumista. Myös ihmisillä on samanlaisia endogeenisiä transposoneita (HIAP), jotka liittyvät moniin immunologisiin sairauksiin. (Cooney ym., 2002; Wolff ym., 1998.) Heijmans ym. (2008) osoittivat ensimmäisenä, että alkion varhaisessa kehitysvaiheessa tietyille tilapäisille ympäristötekijöille altistuminen voi aiheuttaa epigeneettisiä muutoksia, jotka ovat pysyviä koko elämän ajan. Tutkimuksessa verrattiin Hollannissa vuosien 1944 1945 aikana nälänhädälle altistuneiden raskaana olevien naisien jälkeläisiä heidän samaa sukupuolta oleviin sisaruksiin sekä ei sukua oleviin, jotka olivat syntyneet ennen 26
nälänhätäjaksoa. Tutkimuksessa havaittiin, että hedelmöitymisen aikaan nälänhädälle altistuneilla IFG2-geeni oli vähemmän metyloitunut kuin verrokeilla vielä kuuden vuosikymmenen jälkeenkin. IFG2-geeni on tärkeä tekijä ihmisen kasvu- ja kehitystapahtumissa, ja se on maternaalisesti leimautunut ja metyloitunut. IFG2-geenin hypometylaatio saa aikaan sen, että geenin molemmat alleelit ilmentyvät, vaikka normaalisti vain toisen alleelin pitäisi ilmentyä. (Heijmans ym., 2008.) Immunologinen toleranssi on välttämätön normaalille immuunijärjestelmän toiminnalle ja sen menettäminen voi johtaa autoimmuniteettiin. Epigeneettiset mekanismit voivat häiriintyä tiettyjen ympäristötekijöiden vuoksi, mikä voi johtaa poikkeavaan geeniekspressioon tietyissä soluissa. Seurauksena on, että nämä solut menettävät immunologisen toleranssinsa ja edistävät autoimmuunisairauden syntyä henkilöillä, jotka ovat sille geneettisesti alttiita. (Hewagama & Richardson, 2009.) Epigeneettiset mekanismit ovat osoittautuneet liittyvän syöpien, synnynnäisten ja perinnöllisten sairauksien lisäksi myös eräiden autoimmuunisairauksien patogeneesiin. Näitä ovat mm. reumaattiset sairaudet, kuten nivelreuma sekä etenkin SLE (systemic lupus erythematosus, perhosreuma), jossa DNA:n metylaation osuutta sairauteen on eniten tutkittu. (Richardson, 2007.) Lisäksi epigeneettiset häiriöt voivat vaikuttaa lupuksen (ihohukka), MS-taudin (multiple sclerosis, pesäkekovettumatauti) ja tyypin 1 diabeteksen syntyyn. (Hewagama & Richardson, 2009.) Epigeneettiset muutokset ovat solutyyppispesifisiä. Esimerkiksi SLE:ssä muutoksia DNA:n metylaatiossa ja histoniproteiinien modifikaatioissa tapahtuu CD4 + T-soluissa ja B-soluissa. Nivelreumassa puolestaan muutoksia histoniasetylaatiossa tapahtuu lymfosyyteissä sekä nivelpussin sisäkerroksen (synovial) fibroblasteissa ja MS-taudissa aivosoluissa retroviraalisten elementtien ekspressio on häiriintynyt. (Renaudineau, 2009.) 2.5 Bisulfiittisekvensoinnin periaate Bisulfiittisekvensointi on yleisin menetelmä, jolla voidaan tutkia DNA:n metylaatiostatusta yhden emäksen tarkkuudella. Menetelmän kehitti Frommer ym. (1992), koska perinteisellä Sangerin dideoksisekvensoinnilla ei voi erottaa sytosiineja ja metyylisytosiineja toisistaan. (Grunau ym., 2001.) Metylaatiostatusten tutkimiseen on yritetty käyttää myös Maxam-Gilbertin menetelmää yhdistettynä erilaisiin lisätoimenpiteisiin 27
signaalin vahvistamiseksi, mutta tulosten tulkinta oli vaikeaa. Bisulfiittisekvensointi perustuu siihen, että yksijuosteisen DNA:n metyloitumattomat sytosiinit konvertoituvat (deaminoituvat) urasiileiksi natriumbisulfiitin avulla. Modifioitu DNA monistetaan PCR:n avulla ja sekvensoidaan suoraan tai subkloonauksen kautta. Koska 5- metyylisytosiinit eivät reagoi bisulfiitin kanssa toisin kuin metyloitumattomat sytosiinit, lopullisessa sekvensointituloksessa kaikki alkuperäiset sytosiinit ilmenevät tymiineinä, kun taas metyylisytosiinit ilmenevät sytosiineina. (Frommer ym., 1992; Grunau ym., 2001.) 28
3 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET Koska suurin osa DQ2-positiivisista henkilöistä ei sairastu keliakiaan, pro gradu - tutkielman tarkoituksena oli alustavasti selvittää DQ2-geenien promoottorien metylaatiostatusta keliakiassa. Tarkemmat tavoitteet olivat: 1. tutkia in silico DQ2-geenien promoottorialueita mahdollisten CpG-saarekkeiden identifioimiseksi sekä CpG-dinukleotidien määrän analysoimiseksi 2. pystyttää bisulfiittisekvensointimenetelmä, jolla voidaan analysoida DQ2- geenien promoottorialueiden metylaatiostatusta 3. selvittää, poikkeaako DQ2-geenien promoottorien metylaatiostatus DQ2- positiivisten keliaakikkojen ja ei-keliaakikkojen kesken; verrata hoidolla olevien ja gluteenille altistettujen DQ2-positiivisten keliaakikkojen DQ2-geenien promoottorien metylaatiostatusta; ja tutkia, voiko metylaatiostatuksen selvittää kokoverestä pelkkien lymfosyyttien sijaan vai häiritsevätkö veren granulosyytit saatuja tuloksia. 29
4 MATERIAALIT JA MENETELMÄT 4.1 DQ2-geenien CpG-saarekkeiden määrittäminen in silico DQ2-geenien promoottorialueilla olevat mahdolliset CpG-saarekkeet ja niiden sekvenssit määritettiin National Center for Biotechnology Information (NCBI) -sivuston Entrez Gene-tietokannassa (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/mapview/) olevien tietojen avulla. 4.2 Näytteet Tutkittavat näytteet olivat peräisin seitsemältä eri henkilöltä, joista yksi oli DQ2- positiivinen ei-keliaakikko ja loput kuusi DQ2-positiivisia keliaakikkoja. Näytteet olivat joko pakastettuja tai tuoreita kokoverinäytteitä tai pakastettuja lymfosyyttinäytteitä. Eikeliaakikon ja yhden hoidolla olevan keliaakikon tuoreet verinäytteet saatiin vapaaehtoisilta, ja niitä käytettiin sellaisenaan ja lisäksi niistä eristettiin lymfosyytit. Muiden keliaakikkojen näytteet saatiin tutkimuksesta, johon oli eettisen lautakunnan suostumus (PSHP R07107). Hoidolla olevat tutkimukseen osallistuneet potilaat olivat oireettomia, seerumin keliakiavasta-aineiden suhteen negatiivisia ja heidän ohutsuolen limakalvonsa olivat terveet. Näistä potilaista saatuja näytteitä oli kaksi pakastettua kokoverinäytettä ja yksi pakastettu lymfosyyttinäyte, joita tässä tutkimuksessa käytettiin. Potilaat oli altistettu kolmen vuorokauden ajan gluteenille ja kolme päivää gluteenialtistuksen päättymisen jälkeen potilaista oli kerätty verinäytteet. Verinäytteistä osa oli pakastettu sellaisenaan ja osasta oli eristetty lymfosyytit, jotka oli myös pakastettu. Näistä näytteistä tähän tutkimukseen saatiin viisi kokoverinäytettä ja yksi lymfosyyttinäyte. (Taulukko 4.1.) Taulukko 4.1. Tutkimuksessa käytetyt näytteet. Kokoveri Tuoreet lymfosyytit Pakastetut lymfosyytit Ei-keliaakikko, n=1 1 1 Hoidolla oleva keliaakikko, n=4 3 1 1 Gluteeni-altistettu keliaakikko, n=5 5 1 30
4.2.1 Pakastettujen lymfosyyttien sulatus Pakastetut lymfosyyttinäytteet, jotka olivat RPMI-mediumissa ja 10 % DMSO:ssa, sulatettiin laittamalla putket heti nestetypestä vesihauteeseen, 37 C. Kun näytteet olivat sulaneet, putket desinfioitiin 70 % etanolilla kontaminaatioiden estämiseksi ja näytteet suspensoitiin 9 ml:aan PBS:ää (1 X phosphate-buffered saline). Tämän jälkeen näytteet sentrifugoitiin (Sigma 4-10) 250 x g, 10 minuuttia, poistettiin supernatantti ja suspensoitiin pelletti 5 ml:aan PBS:ää. Solususpensiot säilytettiin +4 C:ssa. 4.2.2 Lymfosyyttien eristäminen tuoreista kokoverinäytteistä Tuoreista kokoverinäytteistä eristettiin lymfosyytit käyttämällä Accuspin System- Histopaque -1077 -putkia (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA). Ennen varsinaista eristystä, +4 C:ssa säilytettävien Accuspin-putkien annettiin olla huoneenlämmössä noin 30 minuuttia valolta suojattuna. Verinäytteitä applikoitiin 4 ml/putki ja sentrifugoitiin (Sigma 4K15) huoneenlämmössä 1000 x g, 10 minuuttia. Tämän jälkeen plasmakerrokset poistettiin pasteurpipetillä ja kerättiin mononukleaaristen solujen muodostamat kerrokset (MNC-fraktiot) talteen 15 ml:n putkiin. MNC-fraktiot pestiin 10 ml:lla PBS:ää (1 X phosphate-buffered saline), sekoitettiin varovasti ja sentrifugoitiin (Sigma 4-10) huoneenlämmössä 250 x g, 10 minuuttia. Toistettiin PBS-pesu ja sentrifugointi. Lopuksi solut resuspensoitiin 5 ml:aan PBS:ää ja laskettiin solut. Solususpensiot säilytettiin +4 C:ssa. 4.3 DNA:n eristys DNA:n eristyksessä käytettiin EZ DNA Methylation Direct -kitin (Zymo Research Corp., Orange, CA, USA) protokollaa B näytteiden proteinaasi K -käsittelyssä sekä sovellettiin kitin protokollaa sen jälkeisessä näytteiden puhdistuksessa. Proteinaasi K - käsittelyyn käytetty lymfosyyttimäärä oli noin 20 000 solua ja verimäärä 0,5 µl sekä muut reagenssit 13 µl M-Digestion puskuria, 1 µl proteinaasi K:ta ja steriiliä vettä 26 µl:aan asti. Näytteitä inkuboitiin 20 minuuttia +50 C:ssa, minkä jälkeen niitä sekoitettiin ja sentrifugoitiin (Eppendorf 5417R) 10 000 x g, 5 minuuttia, RT. Supernatantista jatkokäsittelyyn otettiin 20 µl näytettä, joka laitettiin yhdessä 600 µl sitojapuskurin (M- Binding Buffer) kanssa Zymo-Spin IC kolumniin kerääjäputkessa. Näytteitä sekoitettiin kääntelemällä ja sentrifugoitiin 20 800 x g, 30 s. Tämän jälkeen kolumnin matrik- 31
siin sidottu DNA pestiin lisäämällä ensin 100 µl pesupuskuria (M-Wash Buffer), sentrifugoimalla ja lisäämällä vielä 200 µl pesupuskuria ja sentrifugoimalla kuten aikaisemmin. Lopuksi DNA eluoitiin siirtämällä kolumnit 1,5 ml:n sentrifuugiputkiin, lisäämällä 10 µl eluointipuskuria (M-Elution Buffer) suoraan kolumnien matriksiin sekä sentrifugoimalla, kuten edellä. Eluoitu DNA säilytettiin -20 C:ssa. 4.4 PCR DQB1-geenin promoottorille oli käytettävissä neljä eri aluketta (Sigma-Aldrich Finland Oy, Helsinki, Suomi), kaksi forward- ja kaksi reverse-aluketta. PCR:n toimivuutta kokeiltiin forward- ja reverse-alukkeiden eri yhdistelmillä. DQA1-geenin promoottorille oli vain yksi alukepari (Sigma-Aldrich). Taulukkoon 4.2. on merkitty käytetyt alukeyhdistelmät, niiden sekvenssit, alukkeiden kiinnittymislämpötilat (T a ) sekä PCR-tuotteiden oikeat koot (bp). Alukkeiden nimissä olevat lukuarvot tarkoittavat etäisyyttä (- ja +) transkription aloituskohdasta. Nimistä käy ilmi myös niiden suunta (fwd / rev) ja kohdegeeni. Taulukko 4.2. PCR:n optimoinnissa käytetyt alukeyhdistelmät. (T a -arvot laskettu kaavalla 3 x (C+G) + 2 x (AT).) PCR-tuotteen koko Alukepari Sekvenssi (5 -> 3 ) T a (bp) -158 Fwd DQB1 +247 Rev DQB1 CAGTACAATTTGAAGACGTC CAAGGAGAGCCTGTTCCC 48 47 405-202 Fwd DQB1 +300 Rev DQB1 GCTCTTCTATAATCGAGAGG GATGAAAGATTGTGTCCAAG 47 48 502-158 Fwd DQB1 +300 Rev DQB1 CAGTACAATTTGAAGACGTC GATGAAAGATTGTGTCCAAG 48 48 458-202 Fwd DQB1 +247 Rev DQB1 GCTCTTCTATAATCGAGAGG CAAGGAGAGCCTGTTCCC 47 47 449-435 Fwd DQA1 +154 Rev DQA1 CGTCAGGGTCGATGAACCCTCC GGAGTGAGTACGTGAGTG 58 46 589 32
Tärkein huomioon otettava seikka PCR:n optimoinnissa on alukkeiden optimaaliset kiinnittymislämpötilat, jotka arvioitiin karkeasti laskemalla ne kaavan 3 x (C+G) + 2 x (A+T) avulla. Tutkimuksessa kokeiltiin ensin kiinnittymislämpötilaa 47 C kaikille alukepareille. Lisäksi DQA1-alukeparin optimaalisen kiinnittymislämpötilan määrittämiseksi kokeiltiin 12 reaktion gradientti-pcr:ta, jossa T a -arvona oli 50 C ja gradienttina 10. Gradientti-PCR:n etu on, että voidaan samanaikaisesti kokeilla useita eri T a -arvoja. DQA1-alukeparin toimivuutta kokeiltiin myös touchdown-pcr:n avulla. Touchdown- PCR:n periaate on, että syklit aloitetaan ensin laskettua T a -arvoa korkeammalta ja lämpötilaa lasketaan jokaisen tai joka toisen syklin jälkeen esimerkiksi yhdellä asteella, kunnes saavutetaan laskettu kiinnittymislämpötila tai muutaman asteen alempi. Näin saadaan vähennettyä epäspesifisten tuotteiden monistumista. Tässä tutkimuksessa T a - arvona oli ensin 57 C, joka laski 0,5 C 20 syklin ajan, minkä jälkeen oli vielä 20 sykliä saavutetulla 47 C:n T a -arvolla. Monistettavan DQA1-geenin promoottorialueen korkean CG-pitoisuuden vuoksi PCR:n toimivuutta kokeiltiin lopuksi myös käyttämällä reaktioseoksissa DMSO:ta (5 %) sekä formamidia (2 % ja 5 %). Tulokset eri PCR-menetelmistä on esitetty kappaleessa 5.2. Tutkimuksessa käytetty PCR-reaktioseos oli seuraavanlainen: Zymo-Taq DNA-polymeraasi (Zymo Research) dntp-seos (Zymo Research) 2X reaktiopuskuri (Zymo Research) Forward-aluke (20 M) Reverse-aluke (20 M) DNA-templaatti ddh 2 O 0,5 l 0,5 l 25 l 1 l 1 l 4 l 18 l Yht. 50 l 33
Optimoinneista saatujen tulosten perusteella kaikki PCR-reaktiot ajettiin PCR-laitteessa (Eppendorf Mastercycler) seuraavanlaisella ohjelmalla: 95 C 10 min 95 C 30 s 47 C 40 s x 40 72 C 1 min 72 C 7 min 4 C PCR-tuotteet detektoitiin agaroosigeelielektroforeesin (BioRad POWER PAC 300) avulla. Käytetty agaroosigeeli oli 1,5-prosenttinen, ja se valmistettiin 0,5 X TBEpuskuriin. Oikean kokoiset tuotteet eristettiin geeliltä ja puhdistettiin QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) -ohjeiden mukaisesti. 4.5 Bisulfiittikonversio ja PCR konvertoidulle DNA:lle Näytteiden bisulfiittikonversio tehtiin EZ DNA Methylation Direct -kitin ohjeiden mukaisesti. Proteinaasi K-käsittelyn jälkeen näytteistä otettiin 20 l supernatanttia, johon lisättiin 130 l CT konversioreagenssia (CT Conversion Reagent). Bisulfiittikonversiossa käytettiin PCR-laitetta (Eppendorf Mastercycler) ja ohjelmana oli 98 C, 8 minuuttia ja 64 C, 3,5 tuntia. Tämän jälkeen konvertoitu DNA puhdistettiin kitin protokollan mukaisesti ja DNA:ta säilytettiin -20 C:ssa. PCR:n optimoinnissa käytetty alukepari suunniteltiin Li & Dahiya (2002) kehittämän MethPrimer-ohjelman (http://www.urogene.org/methprimer/index1.html) avulla. Ohjelma suunnittelee alukkeet sitoutumaan DNA:han sellaisille kohdille, joissa ei ole CpG-dinukleotidejä, mutta joiden tuottama tuote kuitenkin kattaa mahdollisimman suuren osan CpG-saarekkeesta. Taulukossa 4.3. on kerrottu alukkeiden nimet, sekvenssit, kiinnittymislämpötilat (T a ), PCR-tuotteen koko sekä tuotteeseen tulevien CpGdinukleotidien määrä. 34
Taulukko 4.3. MethPrimer-ohjelmalla suunnitellut alukkeet. (T a MethPrimer) Tuote CpG:den Alukepari Sekvenssi (5 -> 3 ) T a (bp) määrä -42metDQB1Fwd +214metDQB1Rev GAGGGATTATTTAATTTTGTTATTTA AAAAACAACTACCCTACACTTACC 54 55 256 8 Optimaalisen kiinnittymislämpötilan määrittämisessä käytettiin 12 reaktion gradientti- PCR:ta, jossa T a -arvona oli 45 C ja gradienttina 10. Tulokset optimoinnista on esitetty kappaleessa 5.3. Käytetty PCR-reaktioseos oli samanlainen kuin kappaleessa 4.4. mainittu. Optimoinneista saatujen tulosten perusteella reaktiot ajettiin PCR-laitteessa (Eppendorf Mastercycler) seuraavanlaisella ohjelmalla: 95 C 10 min 95 C 30 s 45 C 40 s x 40 72 C 40 s 72 C 7 min 4 C 4.6 Transformaatio, kloonaus ja plasmidien eristys PCR-tuotteiden transformaatiossa ja kloonauksessa käytettiin TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) -menetelmää soveltaen. TOPO TA -kloonaus perustuu siihen, että Taqpolymeraasilla monistetut PCR-tuotteet, joissa on deoksiadenosiinit (A) 3 -päässä, insertoidaan suoraan plasmidivektoriin ilman ligointia. Ligaasia ei tarvita, koska linearisoitu plasmidivektori on aktivoitu topoisomeraasi I:lla, joka on kovalenttisesti kiinni vektorissa. Kun reaktiot on tehty, plasmidit voidaan transformoida kompetentteihin bakteerisoluihin ja kloonata. Ensimmäiseksi tehtiin TOPO kloonaus -reaktioseokset: 4 l PCR-tuotetta, 1 l suolaliuosta (salt solution) ja 1 l TOPO -vektoria (pcr 2.1). Reaktioita inkuboitiin 5 minuuttia huoneenlämmössä, minkä jälkeen ne laitettiin jäille. Tämän jälkeen tehtiin kemiallinen transformaatio, jossa käytettiin TOP10-soluja (One Shot Chemically Com- 35
petent E. coli). Yhteen putkeen soluja lisättiin 2 l kloonausreaktioseosta, inkuboitiin 30 minuuttia jäillä, tehtiin lämpöshokki 45 s, 42 C ja siirrettiin solut jäille. Lisättiin putkiin 150 l S.O.C. mediumia (Invitrogen) ja sekoitettiin ravistelijassa 1 h, 200 rpm, 37 C. Lopuksi levitettiin 50 l transformaatioseosta esilämmitetyille (37 C) maljoille (LB + agar, 50 g/ml ampisilliini), joille oli aikaisemmin levitetty 40 l X-gal:a (40 mg/ml). Maljoja inkuboitiin yön yli 37 C. Seuraavana aamuna poimittiin jokaiselta maljalta kaksi valkoista pesäkettä, joita kasvatettiin ampisilliiniä sisältävässä LB-mediumissa (3 ml LB-mediumia ja 3 l ampisiillinia (50 mg/ml) yön yli ravistelijassa, 200 rpm, 37 C. Plasmidit eristettiin minikasvatuksista seuraavana päivänä QIAprep Miniprep -kitin (Qiagen) protokollan mukaisesti ja konsentraatiot mitattiin spektrofotometrillä. Positiivisten kloonien varmistamiseksi plasmidit analysoitiin restriktioanalyysillä ja detektoitiin agaroosigeelielektroforeesilla. Plasmidien linearisointiin käytettiin 0,5 l HindIII-entsyymiä (Fermentas GmbH, Saksa), 2 l 10X puskuria (R) (Fermentas), 200 ng plasmidia ja vettä 20 l:aan asti. Kontrollina käytettiin tyhjää pcr2.1-vektoria. Reaktioita inkuboitiin 37 C, 1 h, minkä jälkeen ne ajettiin 0,8 % agaroosigeelille. 4.7 Sekvensointi Positiivisten kloonien sekvensoinneissa käytettiin BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kittiä (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA, USA). Jokaista näytettä kohden sekvensoitiin yksi positiivinen klooni. Sekvensointireaktioseokset tehtiin seuraavasti: BigDye terminal reaction mix Dilution buffer (5X) Aluke (3,2 M) H 2 O Templaatti (n. 300 ng plasmidia) 1 l 2 l 1 l 5 l 1 l Yht. 10 l 36
Alukkeina käytettiin TOPO TA Cloning -kitin M13 Forward (-20) ja M13 Reverse - alukkeita. Käytetty PCR-ohjelma oli seuraavanlainen: 94 C 5 min 94 C 1 min 55 C 40 s x 44 60 C 4 min 60 C 10 min 4 C Sekvensointireaktiot saostettiin etanolisaostuksella. Näytteet lämmitettiin huoneenlämpöön 10 minuuttia, lisättiin 90 l 70 % (v/v) etanolia ja inkuboitiin huoneenlämmössä 15 minuuttia. Tämän jälkeen näytteet sentrifugoitiin (Sigma 4K15) 2500 x g, 45 minuuttia. Putket tyhjennettiin kääntämällä ne, lisättiin 150 l 70 % etanolia ja sentrifugoitiin 2500 x g, 10 minuuttia. Putket tyhjennettiin jälleen kääntämällä ne ja sentrifugoitiin 700 x g, 1 min ylösalaisin käännettynä ilman korkkeja. Tämän jälkeen näytteet resuspensoitiin pipetoiden 15 l Hi-Di formamidiin (Applied Biosystems), denaturoitiin 95 C, 2 minuuttia, jäähdytettiin jäillä ja vielä sentrifugoitiin 700 x g, 2 minuuttia. Sekvensoinnit tehtiin ABI 3130 Genetic Analyzer -laitteella (Applied Biosystems). 4.8 Sekvenssi- ja metylaatioanalyysit Ennen varsinaista analysointia sekvensointireaktioiden onnistuneisuus tarkistettiin ja ylimääräiset, vektorista peräisin olevat sekvenssit, poistettiin ChromasPro (versio 1.5) - ohjelman (Technelysium Pty Ltd) avulla, jonka kokeiluversio on saatavilla ilmaiseksi (http://www.technelysium.com.au/chromaspro.html). Lisäksi verrattiin näytteiden eibisulfiittikonvertoituja DNA-sekvenssejä keskenään Ali Bee Multiple Alignment (versio 2.0) -ohjelman (http://www.genebee.msu.su/services/malign_reduced.html) avulla. Bisulfiittikonversion onnistuneisuuden arviointiin sekä metylaatioanalyysiin käytettiin siihen soveltuvaa BiQ Analyzer -ohjelmaa (Bock ym., 2005), joka on saatavilla ilmaiseksi (http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/download.php). 37
5 TULOKSET 5.1 DQ2-geenien promoottorialueiden CpG-saarekkeet DQB1-geenin promoottorialueella sijaitsee yksi CpG-saareke, joka on 204 emäsparin pituinen ja sijaitsee 50 emästä ylävirtaan ja 154 emästä alavirtaan transkription aloituskohdasta. Sen sijaan DQA1-geenin promoottorialueella ei ole yhtään CpG-saareketta. Kuvassa 5.1. on esitetty Entrez Gene-tietokannasta saadut tiedot DQ2-geenien promoottorien CpG-saarekkeista. Kuvassa on näkyvillä geenien transkription aloituskohdat ja ensimmäiset eksonit (tummansininen). Kuva 5.1. DQA1-geenin (vasemmalla), promoottorialueella ei ole CpG-saareketta mutta DQB1-geenin (oikealla) promoottorialueella on yksi CpG-saareke. (DQA1-geenin transkription suunta on kuvassa ylhäältä alaspäin, kun taas DQB1-geenin transkriptio etenee alhaalta ylöspäin.) 38
Kuvassa 5.2. on esitetty osa DQB1-geenin promoottorialueen sekvenssistä, CpGsaareke, saarekkeessa olevien kahdeksan CpG-dinukleotidien sekä lisäksi yhden saarekkeen jälkeisen CpG-dinukleotidin sijainnit. Saarekkeen GC-pitoisuus on 51 %. Kuvassa 5.3. on esitetty tutkimuksen kohteena oleva alue DQA1-geenin promoottorista ja siinä olevat CpG-dinukleotidit. Kuva 5.2. DQB1-geenin promoottorialueen CpG-saarekkeen sekvenssi (sinisellä pohjalla) ja CpG-dinukleotidit (keltaisella pohjalla). Transkriptoitava alue on alleviivattu ja ensimmäinen eksoni tummennettu. Kuva 5.3. DQA1-geenin promoottorialueen sekvenssiä ja siinä olevat CpGdinukleotidit (keltaisella pohjalla). Koko sekvenssin GC-pitoisuus on 49 %. 5.2 PCR DQB1-promoottorialueen alukeyhdistelmistä yksi, -158 Fwd DQB1 ja +247 Rev DQB1 (- ja + -arvot tarkoittavat etäisyyttä transkription aloituskohdasta), tuotti oikeankokoisen 405 emäsparin PCR-tuotteen, kun kiinnittymislämpötilana oli 47 C, mutta muut kolme yhdistelmää eivät tuottaneet. DQA1-promoottorialueen alukkeet tuottivat vain epäspesifisiä tuotteita tässä lämpötilassa. Gradientti-PCR:ssa DQA1-alukkeet tuottivat vain epäspesifisiä tuotteita jokaisessa 12 eri kiinnittymislämpötilassa, vaikkakin niitä oli sitä vähemmän, mitä korkeampi lämpötila oli. Touchdown-PCR:n tulos oli samanlainen kuin edellisissä. DMSO (5 %) ja formamidi (5 %) vähensivät huomattavasti epäspesifisten tuotteiden määrää, mutta oikeankokoista spesifistä tuotetta ei siltikään syntynyt. Sen sijaan 2 %:n formamidi-pitoisuudella ei ollut havaittavissa eroa ilman lisäaineita tehtyi- 39
hin reaktioihin. Näiden tulosten perusteella kaikista näytteistä monistettiin vain DQB1- geenin promoottorialuetta alukeparilla -158 Fwd ja +247 Rev kiinnittymislämpötilan ollessa 47 C. Tuotetut PCR-tuotteet kloonattiin ja sekvensoitiin onnistuneesti. 5.3 PCR bisulfiittikonvertoidulle DNA:lle Gradientti-PCR:ssa DQB1-geenin bisulfiittikonvertoitu promoottorialue saatiin monistumaan parhaiten kiinnittymislämpötilan ollessa 43,7 C ja 46,6 C. Alukkeilla - 42metDQB1Fwd ja +214metDQB1Rev monistetut PCR-tuotteet olivat oikeankokoisia eli 256 emäsparia eikä epäspesifisiä tuotteita syntynyt huomattavissa määrin. Näin ollen optimaaliseksi T a -arvoksi saatiin 45 C, jota käytettiin onnistuneesti bisulfiittikonvertoitujen näytteiden DQB1-geenin promoottorialueen monistamisessa. Bisulfiittikonvertoidut PCR-tuotteet kloonattiin ja sekvensoitiin onnistuneesti. 5.4 Sekvensointireaktioiden ja bisulfiittikonversion onnistuneisuus Ei-bisulfiittikonvertoituja sekvenssejä verrattiin toisiinsa Ali Bee Multiple Alignment -ohjelmalla. Sekvenssit olivat 95,8 % homologisia. Erot sekvensseissä johtuvat DQB1*02-alleelien promoottorialueiden luontaisesta polymorfiasta ja/tai heterotsygotiasta. Bisulfiittikonvertoidut sekvenssit analysoitiin BiQ Analyzer -ohjelmalla ja tehokkuuden osoittavat lukuarvot on saatu sen avulla. Bisulfiittikonversion tehokkuus oli keskimäärin 99,7 % (vaihteluväli 98 100 %). Tehokkuutta alentaa se, jos sellaiset sytosiinit, jotka eivät ole osana CpG-dinukleotidia, eivät konvertoidu tymiiniksi. Tällaisia sytosiinejä oli kahdessa sekvenssissä molemmissa yksi. 5.5 DQB1-geenin promoottorin metylaatioanalyysi Bisulfiittikonvertoiduille näytteille alukkeet oli suunniteltu siten, että monistettava 256 emäsparin pituinen tuote kattoi yhteensä kahdeksan CpG-dinukleotidia. CpGsaarekkeen ensimmäinen CpG-dinukleotidi ei tullut mukaan monistettuihin tuotteisiin. Sen sijaan analysoidut seitsemän ensimmäistä CpG-dinukleotidia kuuluvat CpGsaarekkeeseen ja kahdeksas on saarekkeen jälkeinen CpG-dinukleotidi. Metylaatio- 40
analyysissä bisulfiittikonvertoituja sekvenssejä verrattiin aina samasta näytteestä saatuun ei-konvertoituun sekvenssiin. Taulukossa 5.1. on esitetty tulokset analysoitujen kolmentoista sekvenssin metylaatioanalyysistä kahdeksan CpG-dinukleotidin suhteen. Metyloitumaton tarkoittaa sitä, että ei-konvertoidun sekvenssin CpG oli vastaavassa konvertoidussa sekvenssissä TpG eli sytosiini oli konvertoitunut tymiiniksi. Metyloitunut puolestaan tarkoittaa, että eikonvertoidun sekvenssin CpG oli vastaavassa konvertoidussa sekvenssissä myös CpG. CpG-dinukleotidien 1, 2 ja 5 suhteen oli sekvenssejä, joille ei voitu tehdä metylaatioanalyysiä. Tällaiset näytteet on merkitty taulukkoon ei analysoitavissa. Se, että metylaatioanalyysiä ei voitu tehdä, johtui siitä, että ei-konvertoidussa sekvenssissä oli kyseisen CpG-dinukleotidin sijaan jokin muu dinukleotidi. Taulukko 5.1. Bisulfiittikonvertoitujen sekvenssien vertailu vastaaviin eikonvertoituihin sekvensseihin kahdeksan CpG-dinukleotidin suhteen. CpG 1 2 3 4 5 6 7 8 Metyloitumaton 1 1 13 11 2 13 13 13 Metyloitunut 2 Ei analysoitavissa 12 12 11 Analysoitujen kahdeksan CpG-dinukleotidien sijainnit transkription aloituskohdan suhteen ovat -14, +40, +72, +103, +111, +121, +149 ja +189. Sijainnit on laskettu NCBI:n tietokannasta saadun sekvenssin perusteella. Kuvassa 5.4. on esitetty näytekohtaisesti promoottorin metylaatiostatus CpG-dinukleotidien suhteen. Kahdessa näytteessä, keliaakikon lymfosyyttinäytteessä (celiacl) sekä toisen keliaakikon gluteenialtistuksen jälkeen otetussa verinäytteessä (5day6B) oli metyloitunut CpG kohdassa +103. 41
Kuva 5.4. CpG-dinukleotidien metylaatiostatus lollipop-mallilla kuvattuna. Musta pallo on metyloitunut CpG, valkoinen metyloitumaton ja x tarkoittaa ei analysoitavissa. Sijainnit on merkitty suhteessa transkription aloituskohtaan. Näytteiden nimissä day0=ennen gluteenialtistusta, day6=gluteenialtistuksen jälkeen, B=verinäyte, L=lymfosyyttinäyte, celiac=keliaakikko ja nonceliac=ei-keliaakikko. Näyte on peräisin samalta henkilöltä, kun edessä on sama numero. Kuvassa 5.5. on esimerkki bisulfiittikonvertoidun DNA:n sekvensointikromatogrammista, jossa toisessa näkyy metyloitunut CpG:n sytosiini ja toisessa metyloitumaton. Ylempi sekvenssi on peräisin keliaakikon gluteenialtistuksen jälkeisestä verinäytteestä (5day6B) ja alempi toisen keliaakikon verinäytteestä (celiacb). 42
Kuva 5.5. Esimerkki bisulfiittikonvertoidun DNA:n sekvensointikromatogrammista. 43