Materiaalinäytteiden qpcr-tulosten tulkinnasta Helena Rintala ja Teija Meklin Sisäilmastoseminaari 13.3.2014
Taustaa qpcr (kvantitatiivinen PCR) on nopea menetelmä mikrobien toteamiseen Käytetty paljon esim. kliinisessä diagnostiikassa, sisäympäristöissä käyttö on aluillaan (n. 2000 ->) Nopeille menetelmille rakennusmateriaalien mikrobikasvun toteamiseen on tarvetta esim. korjausten aikana vaurion laajuuden selvittämiseksi Asumisterveysohjeen mukaan uudet menetelmät on validoitava ATO:n menetelmiin verraten Vertasimme viljelyä ja qpcr:ää rakennusmateriaalien mikrobikasvun toteamisessa
Perustietoa vertailuaineistosta Näytemäärä: 630 rakennusmateriaalinäytettä Menetelmät: Laimennossarjaviljely ATO:n mukaan qpcr-määritykset: homeiden ja hiivojen kokonaismäärä (US EPA), Penicillium/Aspergillus/Paecilomyces variotii (Haugland ym., 2004), Cladosporium (Zeng ym., 2006), bakteerien kokonaismäärä (Kärkkäinen ym., 2010, Streptomyces (Rintala ja Nevalainen, 2006) ja Mycobacterium (Torvinen ym., 2010) Tilastolliset analyysit
Homeiden ja hiivojen kokonaispitoisuus viljely vs. qpcr Homeet viljely (M2) (pmy/g) Homeet viljely (DG18) (pmy/g) Homeet qpcr (CE/g) esiintyvyys 58 % 58 % 93 % minimi < mr < mr < mr maksimi 15 000 000 15 000 000 670 000 000 mediaani 460 460 110 000 keskiarvo 820 000 870 000 6 200 000
Bakteerien pitoisuus viljely vs. qpcr Bakteerit viljely (pmy/g) Bakteerit qpcr (CE/g) esiintyvyys 54 % 77 % minimi < mr < mr maksimi 2 500 000 2 400 000 000 mediaani 140 160 000 keskiarvo 350 000 14 000 000
Pitoisuuksien näytekohtainen vertailu Homeet qpcr-tulos > viljelytulos: 80 % qpcr-tulos viljelytulos: 16 % qpcr-tulos < viljelytulos: 4 % Bakteerit qpcr-tulos > viljelytulos: 72 % qpcr-tulos viljelytulos: 18 % qpcr-tulos < viljelytulos: 10 %
Pitoisuuserojen syyt Menetelmien erot qpcr-menetelmä mittaa mikrobien määrää mittaamalla niiden DNA:ta Mikrobi voi olla elävä tai kuollut Kokonainen solu tai solun osa Vain ne mikrobit, joille käytetty menetelmä on suunniteltu Viljelymenetelmä mittaa elinkykyisten mikrobien määrää Mikrobin täytyy olla elinkykyinen ja kasvaa annetuissa olosuhteissa Useampi solu voi tulla mitatuksi yhtenä Menetelmillä on erilaiset määritysrajat
Mitä haasteita menetelmien eroavaisuudet tuovat tulkintaan?
Väärät negatiiviset ja positiiviset (tulkinnan osalta) Väärä negatiivinen = analyysitulos on negatiivinen, referenssimenetelmä antaa positiivisen tuloksen Voi johtua esim. siitä, ettei qpcr-menetelmä tunnista mikrobia, tai toimii huonosti kyseiselle mikrobille (Tai näytteessä on PCR-inhibiittoreita, jotka estävät qpcrmenetelmän toimimisen osittain tai kokonaan tai DNA-eristys ei onnistunut) DNA-eristyksen onnistumista ja PCR-inhibiittoreita kontrolloidaan sisäisen standardin avulla
Väärät negatiiviset ja positiiviset (tulkinnan osalta) Väärät negatiiviset erittäin harvinaisia tässä aineistossa 4 / 630 (0,6%) näytettä, joissa viljelyn perusteella mikrobikasvua, mutta qpcr:n perusteella ei suurin osa (3/4) kuitenkin tulkittiin qpcr-tuloksen perusteella epäilyksi mikrobikasvusta 1 näytteessä viljelyssä todettu mikrobikasvu perustui sädesienihavaintoon (pieni pitoisuus) Streptomyces qpcr-tulos <mr; todennäköinen syy on se, että näytteessä kasvaneet sädesienet eivät olleet Streptomyces-sukua, jolloin qpcr ei tunnistanut niitä
Väärät negatiiviset ja positiiviset (tulkinnan osalta) Väärä positiivinen = analyysitulos on positiivinen, referenssimenetelmä antaa negatiivisen tuloksen 31% koko aineistosta; 11%:ssa tulkinnan ratkaisi bakteerien pitoisuus, 1%:ssa Streptomyces-pitoisuus, 19%:ssa homepitoisuus yksin tai yhdessä bakteerien ja/tai Streptomyces-pitoisuuden kanssa Suurin syy on se, että mikrobit eivät ole elinkykyisiä käytetyissä olosuhteissa, jolloin viljelyssä saadaan todellista pienempi pitoisuus Lisäksi syynä muut menetelmien erot mittaamisessa
Väärät negatiiviset ja positiiviset (tulkinnan osalta) 31% vääriä positiivisia - iso osuus? Kyllä, mutta ovatko oikeasti vääriä? Kun kasvusto on tuoretta, qpcr ja viljelytulos korreloivat hyvin Kuollut mikrobisto on yhtä haitallista kuin elinkykyinen qpcr tuo vanhat kuivuneet vauriot esiin paremmin kuin viljely Tulosten tulkinnassa on otettava huomioon myös muut seikat; mistä näyte on otettu, onko kosketusta maaperän tai ulkoilman kanssa, onko ilmayhteyttä sisätiloihin, jne.
Indikaattorimikrobit Indikaattorimikrobi = on mikrobi, jonka on viljelymenetelmällä todettu esiintyvän useammin kosteusvaurioituneissa rakennuksissa kuin ei-vaurioituneissa käytetään avuksi viljelytulosten tulkinnassa; jos homepitoisuus on alle 10 000 pmy/g, mutta näytteessä esiintyy indikaattoreita, tulkitaan epäilyksi qpcr vain yleisalukkeilla ei indikaattoreille spesifisiä menetelmiä (paitsi Streptomyces (ja Mycobacterium)) kuinka käy tulkinnan?
Indikaattorimikrobit Tässä aineistossa oli 185 näytteen homepitoisuus viljelyssä 45-10 000 pmy/g välillä (indikaattoreita +/-) 132/185 (71%) näytteessä todettiin home-qpcrmenetelmällä joko epäily tai mikrobikasvu 4 (0,6% koko aineistosta) näytteessä todettiin tulkintaristiriita; home-qpcr:ssä pieni pitoisuus, jolloin tulkintana ei mikrobikasvua, mutta viljelyssä indikaattorimikrobeita, jolloin tulkintana oli epäily mikrobikasvusta
Johtopäätökset Pääosin qpcr- ja viljelymenetelmien tulkinta on yhteneväinen Suurimmat tulkintaristiriidat tulevat siitä, että qpcr mittaa sekä elinkykyisiä, että kuolleita mikrobeita, viljely ainoastaan elinkykyisiä Vääriä negatiivisia on erittäin vähän qpcr on käyttökelpoinen menetelmä mikrobikasvun ja kontaminaation toteamisessa Erityisesti vanhan ja kuivuneen kasvuston toteamisessa Ja silloin kun nopeus on valttia
Kiitos mielenkiinnosta Mikrobioni Oy Neulaniementie 2 70211 Kuopio PL 1188 www.mikrobioni.fi