Mikrobivaurion toteaminen uusien menetelmien validointi ja vaurion vakavuuden arviointi

Transkriptio

1 Mikrobivaurion toteaminen uusien menetelmien validointi ja vaurion vakavuuden arviointi Anne Hyvärinen, Yksikön päällikkö, Dos. Asuinympäristö ja terveys -yksikkö ~ Esityksen nimi / Tekijä 1

2 Mikrobivaurioiden tutkiminen Perustuu ensisijaisesti rakennuksen tekniseen tutkimukseen (Kosteus- ja homevaurioituneen rakennuksen kuntotutkimus opas, päivitettävänä) Rakenteiden toteutus Rakenteiden kunto Tarkistuslistat Rakenneavaukset, mikrobimääritykset Pintakosteuskartoitus Lyhyt- ja pitkäkestoiset mittaukset Kosteusmittaukset Rakenteiden tiiveys ja epäpuhtauksien kulkeutuminen Mahdolliset sisäilmaolosuhteiden ja epäpuhtauksien mittaukset Esityksen nimi / Tekijä 2

3 Miksi mikrobiologisia näytteitä? Osoitetaan tai varmistetaan mikrobiologinen epäpuhtauslähde Mikrobikasvua pinnalla tai materiaalissa Epätavanomainen mikrobilähde Mikrobien kulkeutuminen sisäilmaan jostain toisesta tilasta ENSIJAISESTI rakennusmateriaalinäytteitä Käytetään apuna korjausalueen laajuuden määrittelyssä ja mahdollisesti rakenneosan kunnon määrittelyssä Tunnistetaan tavanomaisesta poikkeavia mikrobipitoisuuksia ja lajistoa rakennusmateriaali-, pinta- ja ilmanäytteistä Ohjeistus ja tulkinta tällä hetkellä vain kasvatusmenetelmään perustuville elinkykyisille mikrobeille Muiden menetelmien testauksesta lisää Esityksen nimi / Tekijä 3

4 Miksi kvantitatiivinen PCR? Mikrobit eivät usein elinkykyisiä, viljeltävissä ja/tai tunnistettavissa perinteisillä kasvatusmenetelmillä Myös kuolleet ja elinkyvyttömät mikrobit voivat olla merkityksellisiä Valtaosa mikrobeista ei viljeltävissä laboratorio-olosuhteissa Kasvatusalustat aina selektiivisiä tietyille lajeille Mikrobien tunnistaminen työlästä, epäspesifistä (esim. läheiset lajit), vaatii vuosien kokemuksen qpcr havaitsee myös elinkyvyttömät, ei-viljeltävissä olevat ja on objektiivinen, nopea ja herkkä, mutta Esityksen nimi / Tekijä 4

5 Tärkeää qpcr-menetelmästä Yksi qpcr-assay tai qpcr sovellus mittaa yhtä asiaa Aspergillus versicolorille spesifinen aluke mittaa vain Aspergillus versicoloria Ei tietoa muista lajeista ko. näytteessä! Penicillium/Aspergillus-spesifinen aluke mittaa Penicilliumit ja Aspergillukset näytteestä = ryhmäspesifinen assay Universaalit alukkeet eli nk. yleisalukkeet mittaavat esim. koko bakteeristoa tai sienten määrää näytteessä Mitä sovelluksessa mitataan ja millä tasolla: Bakteerit / sienet ryhmä suku laji Useamman mikrobin mittaaminen vaatii monta sovellusta Esityksen nimi / Tekijä 5

6 qpcr-menetelmän testaus asumisterveysnäytteille Rakennusmateriaali- ja ilmanäytteille Rakennusmateriaalinäytteet viljelty Asumisterveysoppaan (2009) mukaan DNA eristetty qpcr-menetelmää varten tunnetusta määrästä viljelysuspensiota Analysoitu useita eri qpcr sovelluksia keskitytty lupaaviin Aineisto tähän mennessä: 945 rakennusmateriaalinäytettä 184 ilmanäytettä 72 kosteusvaurioituneista kohteista 70 ei-vaurioituneista kohteista 56 ulkoilmanäytettä Esityksen nimi / Tekijä 6

7 qpcr vs. viljely Rakennusmateriaalinäytteet Verrattiin menetelmiä käyttämällä viljelyn vaurioluokituksen raja-arvoja Rakennusmateriaalit pmy/g ja viljelytuloksen perusteella määritettyä kolmiluokkaista aineistoa (pitoisuus ja lajisto) qpcr-analyysien optimaalisia raja-arvoja etsittiin suhteessa viljelyyn: Sensitiivisyys ja spesifisyys molemmat mahdollisimman korkeita tai ROC-käyrän AUC-arvo on mahdollisimman suuri Sensitiivisyys: qpcr-menetelmällä positiiviseksi osoitettujen näytteiden osuus kaikista viljelyssä positiivisiksi osoittautuneista näytteistä Spesifisyys: qpcr-menetelmällä negatiiviseksi osoitettujen näytteiden osuus kaikista viljelyssä negatiivisiksi osoittautuneista näytteistä Esityksen nimi / Tekijä 7

8 qpcr vs. viljely Rakennusmateriaalinäytteet Kriteerejä: Mahdollisimman suuret, yhtäaikaiset sensitiivisyyden ja spesifisyyden arvot Receiver operating characteristic (ROC)-käyrät kaksiluokkaista viljelytulosta vastaan käyrän AUC- (area under curve) arvon suurinta arvoa käytettiin yhtenä raja-arvojen valintakriteerinä Raja-arvot, jotka tuottivat korkean spesifisyyden yksittäiselle määritykselle ( 90%) Kumulatiivisten jakaumien tarkastelu Esityksen nimi / Tekijä 8

9 Korkea toistettavuus rakennusmateriaalinäytteiden qpcr -analyysissä (ICC>0.98) Samat RM-näytteet (n=21) eristetty 5 kertaa Näistä (n=105) tehty 3 rinnakkaista qpcr-määristystä (yht. 315 reaktiota) Esityksen nimi / Tekijä 9

10 qpcr rakennusmateriaaleista - johtopäätös Paras yhdistelmä: Sienten yleisaluke (nk. unifungi ) + Penicillium/Aspergillus/Paecilomyces varioti-ryhmän aluke PenAsp > CE/g tai Unifung > CE/g Sensitiivisyys: 90%, spesifisyys: 64% Streptomyces spp. määritys tarpeen myös Ei lisää spesifisyyttä/sensitiivisyyttä Joskus tilanteita, joissa ei homekasvua, mutta runsas sädesienipitoisuus Esityksen nimi / Tekijä 10

11 Menetelmät ilmanäytteet Viljelynäytteet Andersen-keräimellä 10 minuutin ajan qpcr-analyyseihin tulevat näytteet Button-keräimellä suodattimille vähintään 60 minuutin ajan Analysoitiin useita (23 kpl) eri qpcr-sovelluksia; Useimmissa lajispesifisissä analyyseissä runsaasti alle määritysrajan olevia näytteitä Keskityttiin seuraaviin kahteen qpcr-sovellukseen: Sienten yleissovellus (nk. unifungi) Penicillium, Aspergillus ja Paecilomyces variotii-ryhmät monistavaan sovellus (nk. PenAsp) Esityksen nimi / Tekijä 11

12 Menetelmien välinen kyky erottaa vaurio ja vertailu Viljelyllä ei selkeää eroa ulkoilmapitoisuus korkea Sienten yleisaluke erottelee vaurio-vertailu, mutta ulkoilma korkeampi kuin vertailu Pen/Asp: vauriokodit erottuvat vertailukodeista JA ulkoilmasta Esityksen nimi / Tekijä 12

13 Vuodenaikaisvaihtelu Viljely; vauriokodit erottuvat ei-vauriokodeista vain talvella Pen/Asp-qPCR; vauriokotien Pen/Asp-pitoisuus ulkoilmaa ja vertailukoteja korkeampi kaikkina vuodenaikoina Esityksen nimi / Tekijä 13

14 qpcr ilmanäytteistä - johtopäätös qpcr:lla analysoitaessa Pen/Asp-sovelluksen pitoisuus 250 CE/m 3 tuottaa suurimman sensitiivisyyden ja spesifisyyden eli erottelee parhaiten vauriokodit vertailukodeista tässä aineistossa Esityksen nimi / Tekijä 14

15 Mycometer -menetelmä Sienten biomassa voidaan määrittää mittaamalla β-n-asetyyliheksoaminidaasi (NAHA) entsyymin aktiivisuutta NAHA entsyymiä esiintyy sekä sienen rihmastossa että itiöissä ja sitä on havaittu aktiivisissa, lepotilassa ja elinkykynsä menettäneissä soluissa Eri sienissä eri määriä NAHA-entsyymiä Mycometer-menetelmällä mitataan fluorometrisesti NAHA-entsyymiä Ei kerro lajistosta! Esityksen nimi / Tekijä 15

16 Pintanäyte valmistajan antama tulosten tulkinta Esityksen nimi / Tekijä 16

17 Materiaalinäyte valmistajan antama tulosten tulkinta Esityksen nimi / Tekijä 17

18 Mycometer edut ja heikkoudet Menetelmä on herkkä havaitsemaan homeen entsyymiaktiivisuutta Ei havaitse hiivoja, bakteereja, aktinomykeettejä + - Kenttäkäyttöinen (pieni, kevyt) Nopea (tulos jo kentällä) Käy eri näytetyypeille (pinta-, ilma-, materiaalinäytteet) Ei riittävästi käyttökokemusta Ei asumisterveysasetuksen mukainen menetelmä! Ei suomalaisia vertailuaineistoa vielä Reagenssit melko hinnakkaita Entsyymiä voi esiintyä mm. kasveissa ja niistä saaduissa elintarvikkeissa (esim. jauhot), eläimissä (mm. hyönteisten osat), veressä, ihossa, ihossa, siitepölyssä Esityksen nimi / Tekijä 18

19 THL testaa - alustavia tuloksia Mycometer vs. Viljely: Rakennusmateriaalit Näytteiden sijoittuminen eri luokkiin, kun viljelytulos jaoteltu yli ja alle pmy/g sienten kokonaispitoisuuden mukaan (n=289) vääriä positiivisia ja vääriä negatiivisia Viljelytulos pmy/g Mycometer kategoria A Mycometer kategoria B Mycometer kategoria C alle (71,9 %) 28 (15,1 %) 24 (13,0 %) BDL=36 (alle määritysrajan) BMQL=25 (alle laskennallisen rajan) yli (28,9 %) 38 (36,5 %) 36 (34,6 %) BDL=4 (alle määritysrajan) BMQL=1 (alle laskennallisen rajan) Esityksen nimi / Tekijä 19

20 THL testaa alustavia tuloksia Mycometer vs. Viljely: Pintanäytteet vaurio-vertailuasetelma Yhteensä 82 vaurio-vertailuparia Mycometer erotteli vauriopinnat vertailupinnoista viljelymenetelmää paremmin (vertailu A kategoriassa, vaurio B tai C kategoriassa) Vain 11 näytettä yli viljelyn vaurioluokituksen (>1000 pmy/cm 2 ) Mycometer Viljely N Vertailu Vaurioepäily Vertailu Vaurioepäily (yht. 82) Mycometer-kategoria Mycometer-kategoria (pmy/cm 2 ) (pmy/cm 2 ) 52 (63,4 %) A A alle alle (12,2 %) A B alle alle (2,4 %) B B tai C alle alle (1,2 %) C A alle alle (7,3 %) A C alle alle (2,4 %) A B alle 1000 yli (9,8 %) A C alle yli (1,2 %) B C alle yli Esityksen nimi / Tekijä 20

21 THL testaa alustavia tuloksia Mycometer vs. viljely: Ilmavuotokohdista otetut näytteet Vaurio-vertailu asetelma Yhteensä 108 vaurio-vertailuparia Erot ilmavuoto- ja vertailunäytteiden välillä olivat selvemmin nähtävissä Mycometer menetelmällä Esityksen nimi / Tekijä 21

22 Mitä alustavien tulosten perusteella voi sanoa? Mycometerillä analysoidut rakennusmateriaalit suhteessa viljelyyn: vääriä positiivisia ja vääriä negatiivisia Näytteen epähomogeenisuus? Pieni näytemäärä? Toimisiko paremmin joillakin materiaaleilla? Viljelyyn verrattaessa pitää muistaa, että menetelmät mittaavat eri asiaa Pintanäytteiden viljelyssä vaurioluokitusraja 1000 pmy/cm 2 korkea Pintanäytteiden vertailu-vaurio-asetelmassa Mycometermenetelmä vaikuttaa lupaavalta Erottelee paremmin vaurio- ja vertailupinnat kuin viljely Ilmavuotokohdista otetut näytteet erosivat vertailupinnoista paremmin Mycometer -menetelmällä Esityksen nimi / Tekijä 22

23 Entäs muut menetelmät? Mikrobien haihtuvia aineenvaihduntatuotteita (MVOC) (homeen haju) myös muita lähteitä ei mikrobivaurioiden toteamiseen Mikrobitoksiinit yleisyyttä ja pitoisuuksia selvitetään, ei tiedetä normaalipitoisuuksia ei mikrobivaurioiden toteamiseen Toksisuustestaus myös muut kuin mikrobitekijät voivat aiheuttaa toksisuutta pölynäytteen toksisuuden mittausta ei tule käyttää kosteusvaurion vakavuuden arviointiin eikä mikrobivaurioiden toteamiseen Esityksen nimi / Tekijä 23

24 Vaurioiden/epäpuhtauslähteen vakavuuden arviointi Ei ole olemassa yhtä yksittäistä mittausta/tutkimusta, joka kertoo vaurioiden vakavuuden tason Tulee myös perustua kokonaisuuden arviointiin, jossa huomioidaan Vaurioiden/epäpuhtauslähteen esiintyminen, laajuus/vakavuus Altistumisen todennäköisyys Toteutuneet terveyshaitat (oireet ja sairaudet): huomioiminen haastavaa, koska yksittäisen asukkaan kokeman oireilun merkitystä on vaikea arvioida - herkkyys vaihtelee voimakkaasti Toimenpiteiden kiireellisyyden määrittelyssä merkittävää myös Altistumisen välttämisen mahdollisuudet ja siitä seuraavat olosuhteet Noudattaa samoja periaatteita, mitä kuvattu Toimintaohje työpaikkojen sisäilmasto-ongelmien selvittämiseen Esityksen nimi / Tekijä 24

25 Vaurioiden esiintyminen, laajuus / vakavuus Onko toteutuneita kosteusvaurioita? Onko kosteusvaurioille alttiita riskirakenteita, onko riskit toteutuneet? Ovatko vauriot rajallisia, helposti korjattavia vai koskevat kokonaisia rakenneosia ja/tai laajoja alueita? Ovatko kosteusvauriot johtaneet mikrobikasvustoon? Miten voimakasta/laajaa kasvustoa esiintyy? Esityksen nimi / Tekijä 25

26 Altistumisen todennäköisyys ja määrä Rakennuksessa on vaurio/epäpuhtauslähde, josta vapautuu hiukkasmaisia ja haihtuvia epäpuhtauksia Vaurion/epäpuhtauslähteen sijainti ja laajuus vaikuttaa, esim. Tilat, joissa oleskellaan toistuvasti vs. joissa ei oleskella Pinnoilla, sisäpuolisissa vai ulkopuolisissa rakenteissa Ilmanvaihtokanavissa Onko ilmayhteys vaurioituneisiin rakenteisiin tai tiloihin, muuhun epäpuhtauslähteeseen Paine-erot Hallittavissa / ei hallittavissa Toistuva ja/tai merkittävä alipaineisuus Mikrobialtistuminen havaittavissa ilmanäytteissä vahvistaa altistumisen todennäköisyyttä, mutta EI heikennä sitä, että altistumista ei tapahtuisi, jos vaurioita havaittu ja on olemassa altistumisreitti HUOMIO ns. puhtaat ilmanäytteet EIVÄT poissulje altistumista! Esityksen nimi / Tekijä 26

27 Oireilun rooli Oireilu ja sairastavuus saavat erityisesti kosteus- ja homevaurioiden arvioinnissa usein erityisen painon Toistaiseksi ei tiedetä oireilun aiheuttajaa kosteus- ja homevauriorakennuksessa Toisaalta ei myöskään selvää hometalosairautta, eikä diagnostisia työkaluja osoittaa sairastumista Sisäilmakyselyjä voidaan käyttää toteutuneiden oireiden ja sairastuvuuden arvioinnissa esim. TTL:n kyselyä ei suositella käytettäväksi, jos vastaajia < 20 Asunnoissa voi ylittyä, jos ongelma koskettaa asunto-osakeyhtiötä Yksittäisen asukkaan kokeman oireilun merkitystä on vaikea arvioida - herkkyys vaihtelee voimakkaasti Esityksen nimi / Tekijä 27

28 Terveyshaitasta toimenpiteisiin Toimenpidesuositusten ja niiden kiireellisyyden tulee perustua kokonaisuuteen, jossa huomioidaan terveyshaitan esiintyminen altistumisen todennäköisyys, määrä, laatu ja kesto altistumisen välttämisen ja poistamisen mahdollisuudet rakennuksen käyttäjien kokema oireilu ja sairastavuus Altistumisen todennäköisyyteen ja määrään vaikuttavat lähteen laajuus, sijainti ja ominaisuudet epäpuhtauksien vapautuminen ja leviäminen sisäilmaan sekä niihin vaikuttavat tekijät, kuten ilmanvaihto ja ilmavuotoreitit Esityksen nimi / Tekijä 28