SUOMI-FINLAND (I» KUULUTUSJOLKAISU UTLÄGGNINGSSKRIFT 41428 Kv. lk./int. Cl. A 61 k 23/00 30 h 6 ;inn3tt:r 10 ZI 1?(.) Patenttihakemus Patentansökning 983/65 Qit Hakemispäivä Ansökningsdag 22 IV 1965 Alkupäivä Giltighetsdag @ Tullut julkiseksi Blivit offentlig 1 VII 1968 Patentti- ja rekisterihallitus 44 Pantu nähtäväksi Utlagd 31 VII 1969 Patent- och registerstyrelsen 0 Pyydetty etuoikeus Begärd prioritet 22 IV 1964 Saksa-BRD-Tyskland B 76450 Toteennäytetty-Styrkt (71) Behringwerke Aktiengesellsohaft, Marburg/Lahn, Saksa-BRD-Tyskland (72) Keksijä-Uppfinnare: Kurt Herzberg, Nansenring 9, Frankfurt/Main, Saksa-BRD-Tyskland Asiamies-OmbUd: Kolater A/B (54) Influenssa-rokotteen valmistusmenetelmä - Förfarande för framställning av influensavaccin Patenttihakemuksen kohteena on influenmsa-rokotteen valmistusmenetelmä, jonka mukaisesti nisäkkäiden keuhkokudoksissa viljel- lään viruksia, jotka synnyttävät tautia nisäkkäiden hengitystien epiteelissä. On tunnettua, että influenssaviruksia voidaan viljellä kananmunissa. Tällä menetelmällä on kuitenkin se varjopuoli, että inf.; luenssaviruksen suojavaikutus alenee muna-siirtokulun aikana ja muna-siirtokuluilla saadaan influenssavirusta, josta voidaan valmistaa vain epätyydyttävästi suojaavaa rokotetta. Influenssaviruksia on yritetty viljellä myös hiiressä ja valmistaa rokotetta sen keuhkodudoksesta.. Ittfluenssaviruksen suojaava vaikutus säilyy tosin vakiona hiiri-siirtokuluissa, mutta suurien influenssavirus-määrien teknillinen talteenotto hiiristä on kuitenkin vaivalloista. Nyt on keksitty influenssarokotteiden valmistusmenetelmä, jolle on pääasiallisesti tunnusomaista se että v iruksilla suoritetaan niin monta nisäkäs-siirtoktilkua, ettei niiden hengitystien epiteelissä tautia aiheuttava kyky enää seuraavien haudontamuna-siirto-
2 41428 kulkujen aikana pienene ja että viruksien annetaan lisääntyä haudotuissa, alkion sisältävissä kananmunissa. Keksinnön mukaisesti influenssaviruksina tulevat kysymykseen influenssavirustyypit A,B ja C alalajeineen, esimerkiksi A/PR e, A l /FM 1, A l /Ann Arbor, A 2 /Asia, A 2 /Japan, B/Stockholm, B/Johannesburg, B/Maryland, B/Lee tai C/Taylor. Nlsäkkäiden keuhkokudoksina, joissa influenssaviruksia viljellään siksi kunnes niiden kyvyssä synnyttää tautia hengitystien epiteeliin ei haudonta-muna-siirtokulkujen aikana enää tapandu muutosta, tulevat erityisesti kysymykseen esimerkiksi hiirien, frettien (Putorius furo), marsujen, rottien, hevosten tai sikojen keuhkokudokset. Influenssaviruksia voidaan viljellä hiirissä, esim.: C.E. Van Rooyen ja A.J. Rhodes, Virus Discases of Man (Nelson, New York 1948) sivut 602 ja 603. Influenssavirusten lisääntymisen aikaansaamiseksi voidaan käyttää hyvin myös keuhkokudoksista saatuja kudosviljelmiä. Rokotteen valmistukseen tarvittavan virusmateriaalin saamiseksi esim. hiiressä olleita viruksia, jotka haudontamuna-siirtokulkuina ovat säilyttäneet kykynsä synnyttää tautia edellä mainitussa epiteelissä, siirretään haudottuun alkion sisältävään kananmunaan. Elatus kananmunassa voi tapahtua esim. C.E. van Rooyen'in ja A.J. Rhödes'in esittämällä tavalla (Virus Deseases of Man, Nelson New York 1948, sivut 616-621). Edullisimpana keksinnönmukaisen menetelmän suoritusmuotona pidetään menetelmää, jossa haudotussa kananmunassa olevan alkion rakkokalvoon infektoidaan 6-12, ensi sijassa 8-9 päivää kestäneen haudonnan jälkeen 0,01-0,5, ensi sijassa 0,1 ml influenssavirussuspensiota, laimennuksen ollessa enintään 10-9, ensi sijassa 10-4. Laimennusnesteenä voidaan käyttää kaikkia isotonisia liuoksia, esim. tyrodi-keittosuola-liuosta, fysiologista keittosuola- 'Juosta, fosfaatti-puskuroitua keittosuolaliuosta, jonka ph on 7, Hank'in liuosta tai Earle'n liuosta. Sen jälkeen viruksen annetaan lisääntyä hautomalla infektoituja kananmunia 28-38 C:n, ensi sijassa 32-36,5 C:n lämpötiloissa. Tarkoituksenmukaisinta on, että alkion rakkokalvo-neste (allantois-neste) otetaan talteen kanden päivän kuluttua. Tätä alkion rakkokalvo-nestettä voidaan tunnetulla tavalla käyttää rokotteen valmistukseen. Sitä voidaan käyttää myös uusintasiirtokulkuina kananmunissa. Rokotteiden valmistuksessa alkion rakkokalvo-nesteitä käytetään sellaisinaan tai puhdistettuina, puhdistuksen tapahtuessa suodattamalla kirkastussuodattimen läpi ja/tai väkevöimällä, esim. käyttämällä ultrasentrifugia tai kromatografia. Esim. ultrasentrifugointia käytettäessä sedimentoitunut osa voidaan liuottaa isotoniseen liuokseen, esim. tyrodi-keittosuola-liuokseen.
3 4142;, Tämän jälkeen voidaan lisätä esimerkiksi inaktivointi-ainetta ja/tai säilöntäainetta samoin kuin tarvittaessa muita lisä-aineita. Lisäaineina käytetään esim. aluminiumfosfaattia, alunaa, epätäydeilistä Freund'in lisä-ainetta, ensi sijassa kuitenkin aluminiumhydroksulia. Käytettävien lisä-aineiden määrät ovat tarkoituksen mukaisimmin 0,1 - noin 2%, ensi sijassa - erityisesti aluminiumhydroksidia lisättäessä - 0,3-1 %. Inaktivointi-aineena käytetään etupäässä formaldehydiä. Inaktivoinnin jälkeen on tarkoituksenmukaisista, että formaldehydi-ylimäärä sidotaan stökiömetrisesti laskien 1 1/2 - kertaisella natriumbisulfiitti-määrällä. Inaktivointiin soveltuvat myös hydroksyyliamiini, UV-säteilytys, 8-profpiolaktoni j.n.e. Keksinnönmukaisesti saatujen yksityisten influenssaviruskantojen tiitteri vi i olla esim. välillä noin 100 - noin 5000 HAE/ml, ensi sijassa välillä 1000-3000 HAE/ml. Rokotteiden käyttötarkoituksesta riippuen tiitterialuerajoja voidaan mielivaltaisest. myös ylittää tai alittaa. Keksinnön mukaisesti viljellyistä influenssaviruksist valm!.stettujen rokotteiden teho määritetään"välittömällä hiirisuojakokeella". Rokotteen aikaansaaman immuniteetin arviointi pcfustuu tällöin keuhkomuutosten laajuuteen ja eloon jäävien hiirien -uhumäärään. On ilmennyt, että suojavaikutusta arvosteltaessa r;itkalseva merkitys ei ole hemoglutinatio-estokokeella, vaan suora/lk, hiirisuojakokeella. Hemoglutinatio-kokeessa eri influenssarokotteet voivat nimittäin osoittautua samanarvoisiksi, hiirisuojakokelden osoittaessa merkittäviä eroavuuksia. Rokotteen tehokkuuden määrittämiseen soveltuu myös NJ11-koe (minimivaatimukset: Influenza Virus Vaccins, julkaissut Public Health Service National Institutes of Health, Betesda, Maryland/ U.S.A., 6, tarkistus 15, toukok. 1947, 4.2.). Hiirisuojakoetta suoritettaessa on tarkoituksenmukaista menetellä seuraavasti: 25 g:n painoiset hiiret immunisoidaan injektoimalla vatsakalvon sisään 0,25 ml määritettävää virussuspensiota. 40:n tai useamman vuorokauden kuluttua immunisoidut hiiret injektoldaan nenän kautta viruspitoisella keuhkojauheella. Tämän valmistus t, ann h_ tuu siten, että 48 tuntia tätä ennen nenän kautta injektoitujen hiirien keuhkot jauhetaan hiennksi hiekan kanssa ja laimennetaan ty orq-kpittosuolalluoksella suhteessa 1:10, erottumisen jälkeen yläkerrosta sentrifugoidaan 10 minuuttia nopeuden ollessa 3000
4142, kierr/min. ja näin saatu yläkerros laimennetaan laimennuksen ollessa 1:100. Tämän laimennuksen tiitteri on 10000 tappavaa annosta/ml. Infekttintia varten hiiret nukutetaan eetterillä ja niiden kuonot upotetaan useaan kertaan 4 sekunniksi hiirenkeuhko-siirtokulkuvirus-laimennukseen. Kontrollikoetta varten injektoidaan 20 normaalia hiirtä. Kuolleet hiiret avataan ja keuhkolöydökset rekisteröidään. Eloonjääneet tapetaan eetterillä 12 vrk:n kuluttua ja avataan. Viimeistään tunnin kuluttua avauksesta luetaan keuhkolöydökset ja arvostellaan pistein 0-4. Arvoksi ilmoitetaan kaikkien keuhkolöydösten aritmeettinen keskiarvo. Seuraavaan arviointitaulukkoon on yhdistetty keuhkomuutokset, lukuarvot ja immuniteetti-asteet: keuhkot kokonaisuudessaan Lukuarvo Immuniteettiaste tulehtuneet 4 ei immuniteettia 3/4 keuhkoista tulehtunut 3 ei immuniteettia puolet keuhkoista tulehtunut 2 heikko, osittainen immuni- teetti neljännes keuhkoista tulehtunut 1 selvä osittainen immuniteetti kandeksas osa keuhkoista tuleh- tunut 0,5 vahva osittainen immuniteetti hyvin pieniä läikkiä - negatii- vinen 0,25-0 vahva osittainen - täydelli- nen immuniteetti. Viruskonsentratio voidaan m ärittää myös hemoglutinatio-määrityksenä. Tällä tarkoitetaan ilmiötä, joka voidaan havaita kanojen punasolujen kerääntymisenä kokkareiksi niiden joutuessa kosketuksiin viruksia sisältävien liuosten kanssa. Tällä kokeella todetuista yksiköistä käytetään merkintää HAE ja niiden määrä ilmoitetaan yksikköinä millilitraa kohti. Esimerkiksi keksinnönmukaisesti viljellyn influenssaviruksen A 2 /Asia hemoglutiini-tiitteri on 2560 tai enemmän yhtä millilitraa kohti. Keksinnön mukaisesti valmistettujen rokotteiden teho on huomattavasti parempi kuin tunnettujen influenssa-rokotteiden. Siten esimerkiksi infektoitaessa 20 lasta keksinnönmukaisesti valmistetullia rokotteilla, jotka sisälsivät annosta kohden 2000 HAE-yksikköä antigeenia, kaikissa lapsissa ilmeni jo yhden infektoinnin jälkeen vasta-aineen muodostumista, s.o. vasta-aineen muodostuminen oli L00 Infektoitaessa täysikasvuisia yhtäsuurella määrällä
5 414 tunnettua influenssa-rokotetta (Heller, L., Körtof, B, Mörner, J ja Zetenberg, B., Nord.Med. 60, 1706 (1958) ja Heller, L., Bull. wao 20, 377 (1959), yhden rokotuksen jälkeen ainoastaan 68 %:lla, kihden rokotuksen jälkeen vain 78 %:lla rokotetuista esiintyi vastaaineen muodostusta. Tämä tehon ylivoimaisuus on sitäkin merkittävämpää koska lapsia on vaikeampi immunisoida influenssaa vastaan kuin aikuisia. Keksinnön mukaisesti valmistetuilla rokotteilla on se etu, että suurtuotantoon tarvittava virusmäärä voidaan valmistaa laooratoriossa yksinkertaisella tavalla pienellä työllä ja vähäisin 'stannuksin. Kun tiedettiin, että influenssaviruksen antigeenisu, /s heikkenee muna-siirtokulussa, oli odotettavissa, että myös hiiristirtokuluina viljellyt influenssavirukset vahingoittuisivat mni,asiirtokulkujen aikana. Näin ollen oli hämmästyttävää, että antgenisuus pysqtyttiin kuitenkin säilyttämään täydellisenä. Esimerkki 1. a) 40 ml seosallantoisnestettä, joka sisälsi A 2 /Asia la, j Singapore -- influenssaviruksia, jotka oli saatu viljelemällä haudontamuna-siirtokulkua, ja 20 ml fosfaattipuskuria ph 7,0 se:oitettiin keskenään ja ravisteltiin 30 min. ravistelukojeessa. b) 40 ml seosallantoisnestettä, joka sisälsi A 2/Asia lnj Singapore - influenssaviruksia, jotka oli saatu viljelemällä 424 hiiri-keuhko-siirtokulkua ja sen jälkeen yli 33 haudontamuna-sirtokulkua ja 20 ml fosfaattipuskuria ph 7,0 sekoitettiin keskenään ja ravisteltiin 30 minuuttia ravistelukojeessa. c) 40 ml seosallantoisnestettä, joka sisälsi A 2/Asia la,;: Singapore - influenssaviruksia, jotka oli saatu viljelemällä 8 haudontamuna-siirtokulkua, ja 20 ml fosfaattipuskuroitua alumitimhydroksidia, jonka ph oli 7,0, sekoitettiin keskenään ja ravisteltiin 30 minuuttia ravistelukojeessa. d) 40 ml seosallantoisnestettä, joka sisälsi A 2/Asia lai Singapore - influenssaviruksia, jotka oli saatu elättämällä 424 hiirikeuhko-siirtokulkua ja sen jälkeen yli 33 haudontamuna-siirtokulkua, ja 20 ml fo/ifaattipuskuroitua aluminiumhydroksidia, jonka ph oli 7,0, sekoitettiin keskenään ja ravisteltiin 30 min. ravistelukcjeessa. Kaikilla neljällä rokotteella on sama 850 HAE/ml:n viruskonsentratio. Niitä kokeiltiin käyttämällä välitöntä hiirisuojakoetta; Rasitusinfektoinnit suoritettiin rokotteiden a ja b osalta 99 vrk:n,
6 4142F, rokotteiden c ja d osalta 100 vrk:n kuluttua. Tulokset on koottu seuraavaan'taulukkoon: Välitön hiirisuojakoe Rokotelaatu Eloon Keskimääräiset leik- Leikkauslöydökjääneitä kaus löydökset set 0,25-0 eloonjääneistä ja kuoleista eloonjääneistä Haudontamuna- 11/20 siirtokulku- 55 % 2,44 1,39 1/20 sarja 81 Hiiren keuhko- 18/20 ja haudonta-muna- 90 % 1,15 0,88 7/20 siirtokulku-sarja 424/33 1 udontamuna- 17/20 siirtokulku-sarja 85 % 1,19 0,69 6/20 81 A1(011), :n kanssa Hiiren keuhko- ja 20/20 haudontamuna-siir- 100 % tokulku-sarja 424/ 33 Al(OH) 3 :n kanssa 0,39 0,39 13/20 Kontrollit 0/20 3,83 0/20 Taulukko osoittaa, että kummankin rokoteparin pelkän allantoissaran rokotteet (a ja c) immunisoivat heikommin kuin rokotteet (b ja d), jotka oli saatu käyttämällä viruksia, joita oli viljelty hiirien keuhkoissa ennen allantois-sarja-siirtokulkua. Suurempaa tehokkuutta ilmentävät eloon jääneiden hiirien lukumäärä, luvut, jotka ilmaisevat leikkauslöydösten keskimääriä ja loytdösten "0,25-0 (selvä osittäinen - täydellinen immuniteetti)" yleisyys. Luvut osoittavat keksinnönmukaisesti viljeltyjen influenssavirusten ylivoimaisuuden nykyisen tekniikan tason mukaisesti viljeltyihin influenssaviruksiin verrattuina. Erot ovat erityisen suuret
7 4142f, verrattaessa keskenään rokotteita b ja a, mutta kuitenkin yksiselitteisen selvät myös verrattaessa keskenään rokotteita d ja e. Esimerkki 2. 5 ml:n allantoisneste-seosta, joka sisälsi 454 hiirenkeuhkosiirtokulusta ja 29 haudontamuna-siirtokulusta saatua influenssavirusta, lisättiin 45 ml tyrodi-keittosuolaliuosta (1:10) ja sekoitettiin 50 ml:n kanssa Al(OH 3 ):a. Allantoisneste-laimennus on tällöin 1:20, se sisältää 32 HAE/0,25 ml, Al(OH) 3-pitoisuus on 0,75 %. Rokotteen tehokkuuden määrittämiseksi suoritettiin välitön hiirisuojakoe kuudella hiirellä, rasitusinfektointi suoritettiin 102 vrk:n kuluttua. Rokote antoi täydellisen suojan. Kaikki kuusi hiirtä, joille oli annettu immuniteettirasitusinfektio, jäivät eloon, keuhkoleikkauslöydösten keskiarvo oli vain 0,25-0. Tehokkuuden määritys osoittaa, että keksinnönmukaisesti viljeltyjä influenssaviruksia käytettäessä on mandollista valmistaa kaksikymmenkertaisesti laimennettua rokotetta, joka antaa täydellisen immuteetti-suojan. Vastaavalla tavalla suoritetussa kokeessa, jossaallantoisnesteen laimennus oli 1:40 (16 HAE/0,25 ml), suoja oli vielä 80- prosenttinen (kuudesta hiirestä yksi kuoli), leikkauslöydös-keskiarvo oli 0,85 ja kuudesta hiirestä neljällä leikkauslöydös-arvo oli välillä 0,25-0. Nelikymmenkertaisesta allantois-nestelaimennuksesta huolimatta immuniteetti-suoja on täten ainakin samanarvoinen kuin esimerkissä 1 c ilmoitetulla, tunnettua tekniikkaa käyttäen valmistetulla rokotteella, joka sisältää pelkkää haudontamuna-viljelysarjan allantoisnestettä laimentamattomana. Samaa virusta käyttämällä saatu rokote, joka sisältää allantoisnestettä lopullisen laimennuksen ollessa 1:16-40 HAE/0,25 ml rokotetta - ja 0,1 % A1(OH) 3 :a, antaa täydellisen suojan kaikille kuudelle hiirelle. Leikkauslöydösten keskiarvo on 0,25, kuudesta hiirestä viiden leikkauslöydös-arvo oli välillä 0,25-0. Tämäkin rokotekokoomus osoittaa, että keksinnönmukaisesti viljellyt virukset antavat hyvän immuniteetti-suojan. Esimerkki 3. 100 ml:n allantoisnestettä, jonka virukset oli puhdistettu (ei spesifisistä) sivuaineista suorittamalla kaksi ultrasentrifugointia (1 tunti, 20000 kierr./min) ja erottamalla fosfaattipusku-
4 1 4 2 F, rilla pr-arvoon 7,00 puskuroidusta nesteestä sedimentoitunut osa, lisätään 0,037 % formaldehydiä annetaan seisoa kaksitoista tuntia 20 o C:ssa ja lisätään sen jälkeen A1(OH) 3 :a kunnes sen määrä on 0,5 %. Välittömänä hiirisuojakokeella saadaan seuraavat tulokset: Välitön hiirisuojakoe Rasitus- infektio Kuolleita Eloon jääneiden ja Leikkauslöydös kuolleiden leikkaus- 0,25-0. löydös-keskiarvo 41 vrk:n kuluttua 0/25 0,21 22/25 Tulokset osoittavat, että keksinnönmukaisesti viljellyt virukse'6 antavat hyvän suojan silloinkin kun virus on inaktivoitu formaldehydillä. Esimerkki 4. Influenssavirus tyyppi B, alalaji Marburg 5, siirretään 166 hiirisiirtokulun jälkeen - tiitteri on 10 3-10 4 hiiren tappavaa yksikköä/ml - kananmunaan, allantoisneste korjataan talteen ja uuden haudontamuna-siirtokulun jälkeen siitä valmistetaan puskuroitua A1(OH) 3 :a käyttäen aluminiumhydroksidi-imeytymisrokotetta. 24 hiirtä immunisoidaan tällä rokotteella ja infektoidaan 40 vrk immunisoinnin jälkeen sadalla tappavalla annoksella. Kaikki jäivät eloon. 12 päivänä 20:11ä näistä keuhkolöydösarvo oli välillä 0,25-0 (vahva osittainen - täydellinen immuniteetti). 15 kontrollihiirestä sitävastoin kuoli 14.
9 41428 Patenttivaatimus: Menetelmä influenssarokotteiden valmistamiseksi viljelemällä nisäkkäiden keuhkokudoksissa viruksia, jotka synnyttävät tautia nisäkkäiden hengitystien epiteelissä, tunnettu siitä, että viruksilla suoritetaan niin monta nisäkäs-siirtokulkua, ettei niiden hengitystien epiteelissä tautia aiheuttava kyky enää seuraavien haudontamuna-siirtokulkujen aikana pienene, ja että viruksien annetaan lisääntyä haudotuissa, alkion sisältävissä kananmunissa, sekä valmistetaan rokote tunnetulla tavalla.
Patentkrav: 1 0 41428 Förfarande för framställning av influensavaccin genom att virus, som alstrar sjukdom i epitelet i däggdjurs luftvägar, bdlas i däggdjurs lungvävnader,kännetecknat därav, att man med virusen utför så många däggdjurspassager, att deras förmåga att alstra sjukdom i luftvägarnas epitel inte mera minskar under de följande ruväggspassagerna och att man låter virusen föröka sig i ruvade hönsägg, som innehåller foster, samt att vaccinet framställes på känt sätt. y.illcaisuja-4nförda