Verisuonten tyvikalvojen pilkkoutumistuotteet: syövän kasvun estäjiä?

Katsaus SARA A. WICKSTRÖM JA JORMA KESKI-OJA Verisuonten tyvikalvojen pilkkoutumistuotteet: syövän kasvun estäjiä? Verisuonten uudismuodostus eli angiogeneesi on tärkeä tekijä syöpäkasvaimen kasvussa ja solukon leviämisessä. Tämän prosessin estäminen on uusi lupaava strategia syövän hoidossa. Angiogeneesin ja endoteelisolukon apoptoosin välistä tasapainoa säätelevät angiogeeniset kasvutekijät, ympäröivä soluväliaine ja angiogeneesin estäjät. Tyvikalvolla on useita erilaisia tehtäviä angiogeneesin säätelijänä. Tyvikalvosta pilkkoutuvat molekyylin osat ovat osoittautuneet mielenkiintoisiksi syövän kasvun säätelijöiksi ja potentiaalisiksi lääkkeiksi syövän hoitoon. Duodecim 2005;121:1829 37 V erisuoni koostuu luumenia rajaavista endoteelisoluista, niiden alla olevasta tyvikalvosta sekä niitä ympäröivistä sileälihassoluista tai perisyyteistä. Verenkierron happimolekyylit kykenevät diffundoitumaan 100 200 µm:n päähän verisuonesta ympäröivään kudokseen. Kudoksen kasvu tästä kauemmaksi johtaa hapenpuutteeseen eli hypoksiaan. Myös syöpäkasvaimet ovat riippuvaisia hapesta, eivätkä ne kykene kasvamaan halkaisijaltaan 2 3 millimetriä suuremmaksi elleivät käynnistä verisuonten uudismuodostusta eli angiogeneesiä (Folkman 1995, Lauren ja Alitalo 2000). Syöpäkasvaimen angiogeneesi on pääasiallisesti endoteelisolujen versomista olemassa olevista suonista. Joissakin tapauksissa syöpäsolut voivat myös hakeutua ja kasvaa jo olemassa olevien suonien ympärille. Luuytimestä mobilisoituneet endoteelisolujen kantasolut saattavat nekin osallistua uusien suonien muodostamiseen. Kasvainkudoksen nopea kasvu johtaa hypoksiaan itse tuumorimassan sisällä. Tämä tila indusoi erityisten hypoksian säätelemien geenien ilmentymistä. Hypoksian indusoimiin geeneihin lukeutuvat erityisesti angiogeeniset kasvutekijät, kuten endoteelikasvutekijä (VEGF) ja angiopoietiini 2. VEGF lisää verisuonten läpäisevyyttä, ja angiopoietiini 2 puolestaan höllentää endoteelisolujen kiinnittymistä ympäröivään soluväliaineeseen. Nämä muutokset ovat ensimmäinen vaihe tapahtumasarjassa, jossa verisuonet muodostavat uudissuonia versomalla. Tätä vaihetta seuraavat proteolyyttisten entsyymien vapautuminen ja plasman proteiinien ekstravasaatio. Proteaasit hajottavat ympäröivää soluväliainetta ja poistavat näin kudosta, joka on soluvaelluksen mekaanisena esteenä. Lisäksi ne vapauttavat soluväli aineeseen kiinnittyneitä kasvutekijöitä. Verisuoniston ulkopuolelle kulkeutuneet plasman proteiinit, kuten fibronektiini, muodostavat soluvaellukselle otollisen väliaikaisen matriksin (Carmeliet 2000). Kasvutekijät lisäävät puolestaan soluvaellusta ja solujen mitoottista aktiivisuutta sekä estävät apoptoosia. Soluvaelluksen päätteeksi endoteelisolut kiinnittyvät ympäröivään soluväliaineeseen integriiniadheesiomolekyylien avulla, järjestyvät putkimaisiksi rakenteiksi ja muodostavat jatkuvan luumenin. Lopuksi verisuonirakenteet stabiloituvat kiinnittymällä tyvikalvoon ja keräämällä ympärilleen perisyyttejä. Samalla endoteelisolut siirtyvät takaisin lepo tilaan. Kasvutekijöiden ja integriinien välittämät solunsisäiset viestintäreitit ovat näiden tapahtumien pääasiallisia säätelijöitä (Eliceiri ja Cheresh 2001) (kuva 1B). 1829

Vuonna 1993 havaittiin, että VEGF:n vaikutukset neutraloiva monoklonaalinen vasta-aine estää tuumorien kasvua hiirissä. Tämä havainto johti humanisoidun vasta-aineen bevasitsumabin kehittämiseen (Ferrara 2002). Yhdysvaltain Food and Drug Administration (FDA) on hyväksynyt bevasitsumabin käytön metastaattisen koolonkarsinooman hoidossa. Siitä tuli näin ensimmäinen angiogeneesin estäjä, joka on menestyksekkäästi läpäissyt kliiniset lääketutkimukset ja saavuttanut aseman syövän ensilinjan hoidossa. Samalla kyseinen havainto osoitti angiogeneesin eston olevan tehokas tapa hoitaa syöpää. Useita eri angiogeneettisiä mekanismeja vastaan suunnattuja lääkeaineita on parhaillaan kliinisissä kokeissa, joissa tutkitaan niiden tehoa yksinään tai yhdistelmänä vanhempien syöpälääkkeiden kanssa. Useat näistä aineista ovat tyvikalvon proteiinien osia, ja onkin esitetty hypoteeseja, että tyvikalvoproteiinien fragmentit toimisivat elimistön omina fysiologisina angiogeneesin estäjinä (ks. myös Bono ja Joensuu 2004, Kervinen ja Gahmberg 2004). Tyvikalvot angiogeneesin säätelijöinä Tyvikalvot ovat tiiviitä soluväliaineen rakenteita, jotka toimivat epiteelin ja endoteelin sekä niitä ympäröivän kudoksen välisinä raja-aitoina. Tyvikalvot antavat kudoksille mekaanista tukea, eristävät niitä osastoihin ja säätelevät paikallisesti solujen käyttäytymistä. Kaikki solutyypit tuottavat tyvikalvon molekyylejä, joihin kuuluvat tyypin IV kollageeni, laminiinit, heparaanisulfaattiproteoglykaanit ja nidogeeni-entaktiini. Tyvikalvoissa on myös jonkin verran agriinia, SPARCia (secreted protein acidic and rich in cysteine), fibuliineja sekä tyyppien XV ja XVIII kollageeneja (Timpl 1996). Kollageenit ovat soluväliaineen yleisimmät proteiinit ja samalla yksi elimistön runsaslukuisimmista proteiiniperheistä. Kaikki kollageenit rakentuvat kolmesta alfaketjusta ja sisältävät ainakin yhden kolmoisheliksidomeenin, joka koostuu glysiinitoistojaksoista (Gly-X-Y-motiivi) (kuva 2) (Myllyharju ja Kivirikko 2004). Endoteelisolukon kiinnittyminen tyvikalvoon säätelee keskeisellä tavalla verisuoniston vakautta ja endoteelisolukon lepotilaa. Angiogeneesiin liittyvän proteolyysin vaikutuksesta tyvikalvoa hajoaa ja sen komponenttien kolmiulotteiset rakenteet avautuvat. Tällöin endoteelisolut joutuvat kosketuksiin soluväliaineen normaalisti kätkeytyneiden rakenteiden eli niin kutsuttujen kryptisten domeenien kanssa. Näin soluväli aineen molekyyli säätelee kulloisenkin konformaation mukaan endoteelisolujen käyttäytymistä eri tavoin angiogeneesin ja tuumorigeneesin eri vaiheissa. Perlekaani, laminiinit, SPARC sekä tyyppien XV ja XVIII kollageenit ovat tyvikalvon komponentteja, jotka sisältävät sekä angiogeenisia että antiangiogeenisia vasteita indusoivia domeeneja (taulukko 1) (Ortega ja Werb 2002, Mongiat ym. 2003). Ehyen, laskostuneen molekyylin ja toisaalta pilkkoutumistuotteiden hyvin erilaisten vaikutusten ajatellaan johtuvan näiden molekyylien sitoutumisesta eri adheesioreseptoreihin, kuten integriineihin. Solukalvon läpäisevät integriinit toimivat ankkureina, joilla solu kiinnittyy ympäristöönsä. Solunulkoisiin ligandeihin sitoutuessaan integriinit välittävät samalla signaaleja solun sisälle ja säätelevät solun liikettä ja kasvua. Integriinit α v, α v β 5, ja α 5 näyttävät olevan keskeisessä asemassa angiogeneesin aikana. Myös integriinien α 1 ja α 2 on osoitettu osallistuvan angiogeneesin säätelyyn. Kasvainten endoteelisolut ilmentävät näitä molekyylejä solukalvossaan enemmän kuin normaalit endoteelisolut. Erityisesti α v -integriinit näyttävät toimivan sekä negatiivisina että positiivisina angiogeneesin säätelijöinä. Molekyylit, jotka estävät α v -, tai α v β 5 -integriinien sitoutumista ligandeihinsa, estävät tuumoriangiogeneesia eläinmalleissa. Toisaalta kasvainten angiogeneesi on lisääntynyt poistogeenisissä hiirissä, joilta puuttuu - tai β 5 -integriini tai molemmat (Hynes 2002, Senger ym. 2002). Integriinien mahdollinen kaksoisrooli angiogeeneesissä on mekanismeiltaan vielä epäselvä, mutta näiden molekyylien toiminta sekä soluväliaineen komponenttien että endogeenisten angiogeneesin estäjien reseptoreina voisi olla ainakin osittain syynä tähän ilmiöön (Hamano ym. 2003). 1830 S. A. Wikström ja J. Keski-Oja

TAULUKKO 1. Tyvikalvon proteiinifragmentit angiogeneesin estäjinä. Angiogeneesin Lähde Estää Estää Indusoi Reseptori estäjä proliferaatiota migraatiota apoptoosia Endostatiini Tyypin XVIII kollageenin α1-ketju Ei Kyllä Kyllä α 5 -integriini Glypikaani VEGFR2 Restiini Tyypin IV kollageenin α1-ketju Ei Kyllä?? Arrestiini Tyypin IV kollageenin α1-ketju Kyllä Kyllä Kyllä α 1 -integriini Kanstatiini Tyypin IV kollageenin α2-ketju Kyllä Kyllä Kyllä? Tumstatiini Tyypin IV kollageenin α3-ketju Kyllä Ei Ei α v -integriini α6(iv)nc1-domeeni Tyypin IV kollageenin α6-ketju Kyllä??? Endorepelliini Perlekaani? Kyllä? α 2 -integriini SPARC-fragmentit SPARC Kyllä Ei?? VEGFR2 = endoteelikasvutekijäreseptori 2 SPARC = secreted protein acidic and rich in cysteine Tyypin IV kollageenin fragmentit Verisuonten tyvikalvosta eristetyllä tyypin IV kollageenilla ei ole angiogeneesiä estävää vaikutusta. Kiintoisa löydös olikin, että kun tätä kollageenia pilkotaan kasvainten yleisesti erittämillä proteaaseilla, siitä vapautuvat, normaalitilanteessa proteiinin rakenteeseen kätkeytyneet kryptiset fragmentit estävät angiogeeneesiä in vitro. Tyypin IV kollageenin NC1-domeenin (NC = ei-kollageeninen, ei-kolmoiskierteinen) α1-, α2- ja α3-ketjuista on löydetty kolme tällaista fragmenttia: arrestiini, kanstatiini, ja tumstatiini (taulukko 1). Pilkkoutumaton tyypin IV kollageeni lisää endoteelisolujen proliferaatiota ja migraatiota α 1 - ja α 2 -integriinien välityksellä. Molekyylin proteolyyttinen pilkkoutuminen vähentää sen affinitettia näihin reseptoreihin. Tumstatiini sitoutuu α v - ja α 6 -integriineihin, kanstatiini α v - ja α 3 -integriineihin, ja arrestiini α 1 -integriinin. Nämä vuorovaikutukset saattavat välittää molekyylien angiogeenesiä estäviä vaikutuksia (Kalluri 2003) (kuva 1C). Tumstatiini estää endoteelisolujen proliferaatiota ja verisuonten muodostumista in vitro sekä myös syövän kasvua ja angiogeneesiä hiirillä. Tumstatiinia esiintyy nisäkkäiden plasmassa. Sen ajatellaan kulkeutuvan verenkiertoon solujen metaboliseen aktiivisuuteen liittyvän tyvikalvojen pilkkoutumisen seurauksena (Kalluri 2003). Kokeet poistogeenisillä hiirillä, joilta puuttuu tyypin IV kollageenin α3-ketju ja siten myös tumstatiini, ovat osoittaneet, että plasman tumstatiinilla saattaa olla fysiologista merkitystä syövän angiogeneesin estäjänä. Syöpäkasvainten on havaittu kasvavan nopeammin hiirissä, joilta puuttuu tumstatiini (Hamano ym. 2003). Kun näille hiirille annettiin tumstatiinia laskimoon, kasvainten kasvu hidastui verrokkien tasolle. Merkille pantavaa oli, että tumstatiinin puute ei näyttänyt vaikuttavan fysiologisiin prosesseihin, joihin liittyy angiogeneesiä. Näitä ovat mm. raskaus, alkion kehitys ja haavan paraneminen. Syytä tähän spesifisyyteen ei tiedetä. Fysiologisen angiogeneesin säätely saattaa tapahtua niin monella tasolla, että yhden tekijän estäminen ei kykene pysäyttämään prosessia. Toisaalta kasvaimen ja normaalin kudoksen endoteelisolujen on havaittu eroavan toisistaan molekyylitasolla merkittävästi. Siten myös angiogeneesin estäjien reseptorit saattavat ilmentyä näissä solutyypeissä eri tavoin. Tyyppien XV ja XVIII kollageenien fragmentit Vuonna 1996 Folkmanin tutkimusryhmä havaitsi tyypin XVIII kollageenin NC1-domeenin fragmentin olevan potentti endoteelisolujen migraation ja proliferaation estäjä. Tutkijat nimesivät proteiinifragmentin endostatiiniksi. Koesarjassa, jossa käytettiin hiiren ihon alle istutettuja kasvaimia, he osoittivat rekombinanttiendostatiinin Verisuonten tyvikalvojen pilkkoutumistuotteet: syövän kasvun estäjiä? 1831

A Proteaasit B Perisyyttien irtoaminen Migraatio MMP VEGF bfgf PDGF Proliferaatio Perisyyttien kerääntyminen Pilkkoutunut tyvikalvo Tilapäinen soluväliaine Tyvikalvo C Tumstatiini Endostatiini α v α 5 Proteiinisynteesi Solun tukiranka Proliferaatio Migraatio Angiogeneesi KUVA 1. Pilkkoutuneesta tyvikalvosta vapautuu proteiinifragmentteja, jotka säätelevät uudissuonten versomista vaikuttamalla endoteelisolujen käyttäytymiseen. A) Syöpäkasvaimen invasiiviseen kasvuun liittyy soluväliaineen ja tyvikalvojen lisääntynyttä proteolyyttistä pilkkoutumista. Syöpäsolukon ja ympäröivän strooman erittämät entsyymit irrottavat tyvikalvoista endostatiinia ja muita vastaavia proteiinifragmentteja. Nämä fragmentit kulkeutuvat verenkierron mukana myös kasvaimen verisuonistoon. B) Syöpäsolukon ja ympäröivän strooman erittämät proteaasit pilkkovat verisuonten tyvikalvoa ja ympäröivää soluväliainetta. Prosessissa syntyvä tilapäinen soluväliaine ja samanaikaisesti erittyvät kasvutekijät stimuloivat endoteelisolujen proliferaatiota ja migraatiota. Vaeltamaan ohjautuneet endoteelisolut kiinnittyvät uudessa ympäristössään ympäröivään soluväliaineeseen ja muodostavat putkimaisia rakenteita sekä jatkuvan luumenin. Tämän jälkeen solut muodostavat tyvikalvon ja keräävät ympärilleen perisyyttejä, jotka stabiloivat uuden verisuonen. Pilkkoutuneen soluväliaineen komponentit puolestaan säätelevät tätä tapahtumasarjaa vaikuttamalla endoteelisolujen toimintaan. MMP = matriksin metalloproteaasit, VEGF = endoteelikasvutekijä, bfgf = fibroblastikasvutekijäreseptori, PDGF = verihiutalekasvutekijä. C) Syöpäkasvainten aktivoituneet endoteelisolut ilmentävät sellaisia integriinejä, jotka toimivat reseptoreina myös endostatiinille ja tumstatiinille. Tumstatiini sitoutuu α v -integriiniin käynnistäen solunsisäisen viestiketjun, joka johtaa endoteelisolujen proliferaation estoon. Endostatiini puolestaan sitoutuu α 5 -integriiniin ja hajottaa endoteelisolujen tukirangan. Tämä estää endoteelisolujen migraatiota. Endoteelisolujen vähentynyt proliferaatio ja migraatio pysäyttävät verisuonten uudismuodostuksen ja syövän etenemisen. 1832 S. A. Wikström ja J. Keski-Oja

kykenevän hävittämään kookkaitakin tuumoreita. Viitteitä toksisuudesta tai kehittyvästä lääkeresistenssistä ei havaittu (O Reilly ym. 1997). Endostatiini irtoaa tyypin XVIII kollageenin karboksipäästä proteolyyttisesti. Ainakin katepsiinit, matriksin metalloproteinaasit ja elastaasit kykenevät vapauttamaan monomeerisen endostatiinifragmentin kollageenista. Rakenteeltaan endostatiini on globulaarinen molekyyli, jolle on ominaista arginiineista muodostunut laaja emäksinen pinta (kuva 2). Nämä emäksiset aminohapot toimivat kiinnittymispintana hepariinille ja heparaanisulfaateille (Hohenester ym. 1998). Kun endostatiinimolekyylistä mutatoidaan nämä arginiinit, se menettää biologisen aktiivisuutensa. On myös havaittu, että synteettiset peptidit, jotka vastaavat endostatiinin aminohapposekvenssiä tältä runsaasti arginiinia sisältävältä alueel ta, kykenevät estämään angio geneesiä in vitro ja in vivo (Wickström ym. 2001 ja 2004, Olsson ym. 2004). Tyypin XV kollageenin NC1-domeeni on 60-prosenttisesti identtinen tyypin XVIII kollageenin vastaavan alueen kanssa. Tälläkin fragmentilla on antiangiogeenistä vaikutusta, mutta se on heikompaa kuin endostatiinin vaikutus (Sasaki ym. 2002). Tumstatiinin tavoin myös endostatiinia esiintyy verenkierrossa. Plasman endostatiinipitoisuus vaihtelee terveillä välillä 10 50 ng/ml (0,5 2,5 nm), mutta yksilöiden väliset erot ovat huomattavia (Hefler ym. 1999, Zorick ym. 2001). Koska endostatiini on osa tyvikalvoa, voitaisiin otaksua, että se pystyisi säätelemään paikallisesti endoteelisolujen toimintaa ja angiogeneesiä. Kokeet poistogeenisillä hiirillä ovat kuitenkin osoittaneet, ettei endostatiinilla ole merkittävää roolia verenkiertoelimistön kehityksessä. Myöskään merkittävää vaikutusta syöpäkasvainten angiogeneesiin ei ole havaittu (Fukai ym. 2002). Toisaalta endogeenisen endostatiinin merkitystä indusoidussa angiogeneesissä ei ole kattavasti tutkittu. Viitteitä endostatiinin mahdollisesta roolista on saatu angiogeneesimallista, jossa hiiristä eristettyjä aorttaleikkeitä on stimuloitu kasvutekijöiden avulla versomaan. Näissä kokeissa on havaittu, että endogeenisen endostatiinin puute johtaa lisääntyneeseen angiogeneesiin (Li ja Olsen 2004). Ateroskleroosiinkin liittyvän A T ES Endostatiini B Kollageeninen kolmoisheliksidomeeni Ei-kollageeninen domeeni Trimerisaatiodomeeni Matriksimetalloproteinaasit Katepsiini L Elastaasi angiogeneesin on havaittu lisääntyvän endostatiinin puuttuessa (Moulton ym. 2004). Endostatiinin tärkeään rooliin syövän angiogeneesin säätelijänä viittaavat myös seerumin suurentuneet endostatiinipitoisuudet useilla syöpäpotilailla. Suuret pitoisuudet korreloivat syövän nopeakasvuisuuden ja huonon ennusteen kanssa. Toisaalta seerumin suurentunut endostatiinipitoisuus saattaa heijastella syöpään liittyvää kiihtynyttä proteolyyttistä aktiivisuutta T ES ES ES KUVA 2. A) Tyypin XVIII kollageenin rakenne. Kollageenimolekyyli sisältää kymmenen kolmoishelikaalista kollageenista domeenia, joiden välissä sijaitsevat ei-kollageeniset domeenit. Proteaasit, kuten matriksin metalloproteinaasit, katepsiini L ja elastaasi vapauttavat monomeerisen endostatiinimolekyylin tyypin XVIII kollageenin C-päästä. Muokattu Zatterstromin ym. (2000) artikkelista. B) Endostatiinin rakenne. Endo statiinilla on kompakti globulaarinen rakenne, joka muistuttaa c-tyypin lektiinien rakennetta. Molekyylin N-päähän on sitoutunut sinkki-ioni, jonka toiminnallinen merkitys on epäselvä. Endostatiinissa on arginiineista muodostunut laaja emäksinen pinta, joka säätelee molekyylin biologista aktiivisuutta. Kuvaan on merkitty emäksiset arginiiniaminohapot (R) ja fenyylialaniinit (F) (Hohenester ym. 1998, Kreuger ym. 2002). Verisuonten tyvikalvojen pilkkoutumistuotteet: syövän kasvun estäjiä? 1833

TAULUKKO 2. Kliinisissä kokeissa olevia angiogeneesin estäjiä. Lääke Vaiktusmekanismi Kliininen koevaihe Angiostatiini Estää endoteelisolujen proliferaatiota ja migraatiota Vaihe I Bevasitsumabi Monoklonaalinen VEGF-vasta-aine Kliinisessä käytössä Kanstatiini Sitoutuu α v -integriiniin ja estää endoteelisolujen proliferaatiota ja migraatiota Vaihe I Kombretastatiini Sitoutuu tubuliiniin ja aiheuttaa mikrotubulusten depolymerisaatiota Vaihe I Endostatiini Sitoutuu α 5 -integriiniin ja estää endoteelisolujen migraatiota Vaiheet I ja II NM-3 Pienimolekyylinen VEGF:n estäjä Vaihe I Trombospondiini Sitoutuu CD36-reseptoriin ja estää endoteelisolujen proliferaatiota ja migraatiota Vaiheet I ja II 2-metoksi-estradioli Indusoi endoteelisolujen apoptoosia estämällä mikrotubulusten toimintaa Vaiheet I ja II Vitaksiini Monoklonaalinen α v -integriinin vasta-aine Vaiheet I ja II VEGF = endoteelikasvutekijä (Feldman ym. 2000 ja 2002, Suzuki ym. 2002). Kiintoisaa on myös, että endostatiinin geenissä sijaitsevan pistemutaation on havaittu liittyvän lisääntyneeseen alttiuteen sairastua eturauhasen adenokarsinoomaan (Iughetti ym. 2001). COL18A1-geeni sijaitsee kromosomissa 21, joka on monistunut Downin syndroomassa. Down-potilailla esiintyy vähemmän kasvaimia kuin väestöllä keskimäärin. Myös seerumin keskimääräiset endostatiinipitoisuudet ovat heillä suuremmat. Mikään tunnettu tuumorisuppressorigeeni ei paikannu tälle geenialueelle, joten on arveltu plasman endostatiinin voivan suojata näitä potilaita syövältä (Zorick ym. 2001). Vaikka endostatiinin biologinen tehtävä on yhä epäselvä, ovat lukuiset eläinkokeet osoittaneet, että rekombinanttiendostatiini on tehokas syövän angiogeneesin estäjä. Endostatiini kykenee sekä estämään tuumorien kasvua että vähentämään etäispesäkkeiden muodostumista. Tumstatiinin tavoin endostatiinikin tuntuu vaikuttavan spesifisesti kasvainten endoteelisoluihin, eikä se juuri häiritse muita angiogeneesistä riippuvaisia prosesseja, kuten haavan paranemista (Berger ym. 2000, Bloch ym. 2000). Endostatiinin molekyylibiologisia vaikutusmekanismeja Endostatiinin on havaittu sitoutuvan useisiin solun pinnan proteiineihin. Näihin lukeutuvat heparaanisulfaattiproteoglykaani glypikaani ja α 5 -integriini. Nämä proteiinit ovat solun pinnan adheesiomolekyylejä (Karumanchi ym. 2001, Rehn ym. 2001). Vahvaa syysuhdetta ei kuitenkaan ole havaittu endostatiinin näihin reseptoreihin sitoutumisen ja antiangiogeenisten vaikutusten välillä. Näiden molekyylien merkitystä endostatiinin aiheuttamassa tuumorien kasvun estossakaan in vivo ei tunneta. Toisaalta on havaittu, että endostatiini estää endoteelisoluviljelmissä endoteelisolujen liikettä ja kasvua sekä indusoi ohjelmoitunutta solukuolemaa (Dixelius ym. 2003). Endostatiinin on todettu estävän sekä VEGF:n että fibroblastikasvutekijän (bfgf) indusoimaa soluvaellusta, mutta se ei ilmeisestikään estä kummankaan kasvutekijän aiheuttamaa solunsisäistä signaalinvälitystä (O Reilly ym. 1997, Yamaguchi ym. 1999, Dixelius ym. 2000, Eriksson ym. 2003). Onkin ilmeistä, että endostatiini vaikuttaa endoteelisoluihin jollain toisella, ehkä tälle molekyylille spesifisellä mekanismilla. Yksi todennäköinen endostatiinin soluvaellusta estävä mekanismi on endoteelisolujen ja soluväliaineen vuorovaikutuksen häiritseminen. Tätä teoriaa tukevat havainnot, että rekombinanttiendostatiini hajottaa solun liikkeessä tarpeellisia aktiinitukisäikeitä ja adheesiokomplekseja sekä estää fibronektiinimatriksin muodostumista (Wickström ym. 2001, 2002 ja 2003) (kuva 1C). Uusimmat tutkimustulokset osoittavat että endostatiini saattaa ohjelmoida uudella tavalla koko angiogeneesiä säätelevän geeniverkoston. Endostatiinilla käsiteltyjen endoteelisolujen geeniekspression laaja analyysi on osoittanut, että endostatiini häiritsee angiogeneesiä sääteleviä viestinvälitysreittejä. Angiogeneesiä indusoivat geenit, kuten Id, HIF1-α, efriinit, NF-κB, AP-1, Stat, Ets ja trombiinireseptorin geeni, ilmenty- 1834 S. A. Wikström ja J. Keski-Oja

vät verrokkisoluja vähemmän, kun taas angiogeneesiä estävät geenit, kuten trombospondiini, ilmentyvät enemmän (Abdollahi ym. 2004). Angiogeneesin estäjät syövän hoidossa Useita vaikutusmekanismeiltaan erilaisia aineita on kehitetty estämään syövän angiogeneesiä tavoitteena pysäyttää syöpäsolukon kasvu ja etäpesäkkeiden muodostuminen. Monet niistä ovat parhaillaan kliinisissä kokeissa (taulukko 2). Endoteelisoluihin kohdistuvan lääkehoidon on ajateltu olevan mielekästä, koska nämä solut ovat geneettisesti vakaita ja siksi vähemmän alttiita kehittämään lääkeaineresistenssiä (Boehm ym. 1997). Useimmat näistä aineista estävät uusien verisuonien versomista olemassa olevista. Jotkin niistä indusoivat olemassa olevien suonien re gressiotakin. Molemmissa tapauksissa tuloksena on hypoksia ja tuumorisolukon kasvun pysähtyminen tai kuolema. Angiogeneesin estäjät voivat myös toimia epäsuorasti heikentämällä esimerkiksi tuumorisolujen kykyä erittää angiogeenisiä kasvutekijöitä (Kerbel ja Folkman 2002). Angiogeneesin estäjät saattavat myös vähentää hetkellisesti verisuonten läpäisevyyttä, mikä johtaa lisääntyneeseen perfuusioon ja pienentyneeseen tuumorinsisäiseen paineeseen. Angiogeneesin estäjät voivat tätä kautta myös lisätä sädehoidon tehoa ja solunsalpaajien kulkeutumista kasvainalueelle (Jain 2001). Vaikka kasvaimen perfuusio hoidon alkuvaiheessa saattaa jopa lisääntyä, näyttää hoidon lopputulos olevan perfuusion asteittainen väheneminen. Tällainen vaikutus on havaittu myös endostatiinihoitoa saaneiden syöpäpotilaiden kasvaimissa (Herbst ym. 2002b). Eläinkokeista saadut tulokset viittaavat siihen, että endostatiinihoito on tehokkaampaa jatkuvana infuusiona kuin intervallihoitona tai boluksina. Lisäksi hoito näyttää olevan tehokkainta silloin, kun seerumin endostatiinipitoisuus on jatkuvasti 300 500 ng/ml. Tämän ylittävät tai alittavat pitoisuudet johtavat tuntemattomasta syystä heikentyneeseen vasteeseen (Kerbel ja Folkman 2002). Endostatiinilla tehdyt vaiheen I kliiniset kokeet ovat osoittaneet, että rekombinanttiproteiinia voidaan antaa potilaille suuriakin määriä ilman toksisuutta tai haittavaikutuksia. (Herbst ym. 2002a). Vaiheen II kokeet ovat käynnissä, mutta niiden tuloksia ei vielä ole saatavilla. Syövän hoitoon angiogeneesin estäjillä liittyy potentiaalisia ongelmia. Näitä ovat toistuvat ruiskeet, pitkäkestoisen mahdollisesti elinikäisen hoidon tarve, bakteereissa tuotettujen proteiinivalmisteiden sisältämät epäpuhtaudet ja hoidon kalleus. Onkin tärkeätä kehittää uusia keinoja, joilla pystytään sekä saavuttamaan tasaisen suuria lääkeainepitoisuuksia että lisää- Y D I N A S I A T Soluväliaine ja tyvikalvot sisältävät niiden rakenteiden sisään suojautuneita domeeneja, jotka proteolyysin seurauksena pilkkoutuvat ja pystyvät sitten sitoutumaan solujen pinnan integriinireseptoreihin ja säätelemään solujen käyttäytymistä. Tyvikalvojen pilkkoutumistuotteet ovat useissa eläinkokeissa osoittautuneet tehokkaiksi angiogeneesin estäjiksi. Eläinkokeiden menestyksestä nousseet suuret odotukset endostatiinin ja muiden tyvikalvoperäisten angiogeneesin estäjien tehosta syövän hoidossa ovat osoittautuneet epärealistisiksi. Endostatiinilla on kuitenkin selviä sekä verisuonten että itse tuumorien kasvua estäviä ominaisuuksia tietyissä syöpätyypeissä. Verisuonten uudismuodostuksen estosta, yksinään tai muuhun lääkehoitoon yhdistettynä, muodostunee osa syövän, diabeettisen retinopatian ja muiden patologisesta angiogeneesistä riippuvaisten tautien tehokasta hoitoa. Verisuonten tyvikalvojen pilkkoutumistuotteet: syövän kasvun estäjiä? 1835

mään lääkkeiden tehoa. Mahdollisia strategioita ovat 1) yhdistelmähoidot, joissa angio geneesinestäjä yhdistetään sädehoidon, solunsalpaajien, immunoterapian tai toisen angiogeeneesinestäjän kanssa, 2) kokonaan uusien lääkeaineiden kehittäminen, 3) geeniterapia, jonka etuja ovat hoidon pidempi kesto, mahdollisuus täsmähoitoon ja halpa hinta sekä 4) lääkeaineiden muokkaaminen niiden ohjaamiseksi suurina pitoisuuksina vain tautipesäkkeisiin (Cao 2001). Lopuksi Tyvikalvon komponenttien ja niistä pilkkoutuvien proteolyyttisten fragmenttien roolista angiogeneesin säätelyssä on viime vuosina opittu runsaasti uutta. Uusimmat tutkimustulokset ovat nostaneet esille mahdollisuuden käyttää näitä aineita syövän hoidossa. Vuonna 1997 karakterisoidun endostatiinin hiirikokeissa todetut dramaattiset vaikutukset syövän kasvuun ovat herättäneet runsaasti huomiota (Porkka 1997). Näiden lääkeaineiden kliinisiin kokeisiin kohdistui alkuun suuria odotuksia, jotka ovat osoittautuneet osittain epärealistisiksi. Vaiheen I kliiniset kokeet ovat varmistaneet, että endostatiinia voidaan antaa suurinakin annoksina ilman toksisia vaikutuksia ja että sillä on verisuonten ja tuumorien kasvua estäviä ominaisuuksia. Vaikka endostatiini ja muut parhaillaan kliinisissä kokeissa olevat tyvikalvon fragmentit eivät päätyisikään kliiniseen käyttöön angio geneesin estäjinä, voi niiden toimintamekanismien ymmärtäminen solu- ja molekyylitasolla johtaa tehokkaampien lääkeaineiden kehittämiseen tai kokonaan uusien kohdemolekyylien löytämiseen. Bevasitsumabin esimerkki on osoittanut, että antiangiogeeninen hoito, yksinään tai muuhun lääkitykseen yhdistettynä, on tulevaisuudessa osa syövän, diabeettisen retinopatian ja muiden patologisesta angiogeneesistä riippuvaisten tautien tehokasta hoitoa. * * * Alkuperäistutkimuksiamme ovat tukeneet Suomen Akatemia, Syöpäjärjestöt, Sigrid Juséliuksen Säätiö, Suomen Lääketieteen Säätiö, Emil Aaltosen Säätiö, Paulon Säätiö, Ida Montinin Säätiö ja Biomedicum Helsinki Säätiö. Kiitämme akatemiaprofessori Kari Alitaloa käsikirjoituksemme kommentoinnista. Kirjallisuutta Abdollahi A, Hahnfeldt P, Maercker C, ym. Endostatin s antiangiogenic signaling network. Mol Cell 2004;13:649 63. Berger AC, Feldman AL, Gnant MF, ym. The angiogenesis inhibitor, endostatin, does not affect murine cutaneous wound healing. J Surg Res 2000;91:26 31. Bloch W, Huggel K, Sasaki T, ym. The angiogenesis inhibitor endostatin impairs blood vessel maturation during wound healing. FASEB J 2000;14:2373 6. Boehm T, Folkman J, Browder T, O Reilly MS. Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance. Nature 1997;390:404 7. Bono P, Joensuu H. Angiogeneesin estosta hyötyä etäpesäkkeisen paksusuolisyövän hoidossa. Duodecim 2004;120:261 2. Cao Y. Endogenous angiogenesis inhibitors and their therapeutic implications. Int J Biochem Cell Biol 2001;33:357 69. Carmeliet P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med 2000;6:389 395. Dixelius J, Cross MJ, Matsumoto T, Claesson-Welsh L. Endostatin action and intracellular signaling: beta-catenin as a potential target? Cancer 2003;196:1 12. Dixelius J, Larsson H, Sasaki T, ym. Endostatin-induced tyrosine kinase signaling through the shb adaptor protein regulates endothelial cell apoptosis. Blood 2000;95:3403 11. Eliceiri BP, Cheresh DA. Adhesion events in angiogenesis. Curr Opin Cell Biol 2001;13:563 8. Eriksson K, Magnusson P, Dixelius J, Claesson-Welsh L, Cross MJ. Angiostatin and endostatin inhibit endothelial cell migration in response to FGF and VEGF without interfering with specific intracellular signal transduction pathways. FEBS 2003;536:19 24. Feldman AL, Alexander HR Jr., Yang JC, ym. Prospective analysis of circulating endostatin levels in patients with renal cell carcinoma. Cancer 2002;95:1637 43. Feldman AL, Tamarkin L, Paciotti GF, ym. Serum endostatin levels are elevated and correlate with serum vascular endothelial growth factor levels in patients with stage IV clear cell renal cancer. Clin Cancer Res 2000;6:4628 34. Ferrara N. VEGF and the quest for tumour angiogenesis factors. Nat Rev Cancer 2002;2:795 803. Folkman J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nat Med 1995;1:27 31. Fukai N, Eklund L, Marneros AG, ym. Lack of collagen XVIII/endostatin results in eye abnormalities. EMBO J 2002;21:1535 44. Hamano Y, Zeisberg M, Sugimoto H, ym. Physiological levels of tumstatin, a fragment of collagen IV α3 chain, are generated by MMP-9 proteolysis and suppress angiogenesis via α v integrin. Cancer Cell 2003;3:589 601. Hefler L, Tempfer C, Kainz C, Obermair A. Serum concentrations of endostatin in patients with vulvar cancer. Gynecol Oncol 1999;74:151 2. Herbst RS, Hess KR, Tran HT, ym. Phase I study of recombinant human endostatin in patients with advanced solid tumors. J Clin Oncol 2002(a);20:3792 803. Herbst RS, Mullani NA, Davis DW, ym. Development of biologic markers of response and assessment of antiangiogenic activity in a clinical trial of human recombinant endostatin. J Clin Oncol 2002(b);20:3804 14. Hohenester E, Sasaki T, Olsen BR, Timpl R. Crystal structure of the angiogenesis inhibitor endostatin at 1.5 A resolution. EMBO J 1998; 17:1656 64. 1836 S. A. Wikström ja J. Keski-Oja

Hynes RO. A reevaluation of integrins as regulators of angiogenesis. Nat Med 2002;8:918 21. Iughetti P, Suzuki O, Godoi PH, ym. A polymorphism in endostatin, an angiogenesis inhibitor, predisposes for the development of prostatic adenocarcinoma. Cancer Res 2001;61:7375 8. Jain RK. Normalizing tumor vasculature with anti-angiogenic therapy: a new paradigm for combination therapy. Nat Med 2001;7:987 9. Kalluri R. Basement membranes: structure, assembly and role in tumour angiogenesis. Nat Rev Cancer 2003;3:422 33. Karumanchi SA, Jha V, Ramchandran R, ym. Cell surface glypicans are low-affinity endostatin receptors. Mol Cell 2001;7:811 22. Kerbel R, Folkman J. Clinical translation of angiogenesis inhibitors. Nat Rev Cancer 2002;2:727 39. Kervinen J, Gahmberg GC. Syövän täsmälääkkeet ja niiden kehitystyö. Duodecim 2004;120:2323 30 Kreuger J, Matsumoto T, Vanwildemeersch M, ym. Role of heparan sulfate domain organization in endostatin inhibition of endothelial cell function. EMBO J 2002;21:6303 11. Lauren J, Alitalo K. Syöpäkasvaimet kuriin verisuonihoidolla? Duodecim 2000;116:705 11. Li Q, Olsen BR. Increased angiogenic response in aortic explants of collagen XVIII/endostatin-null mice. Am J Pathol 2004;165:415 24. Mongiat M, Sweeney SM, San Antonio JD, Fu J, Iozzo RV. Endorepellin, a novel inhibitor of angiogenesis derived from the C terminus of perlecan. J Biol Chem 2003;278:4238 49. Moulton KS, Olsen BR, Sonn S, Fukai N, Zurakowski D, Zeng X. Loss of collagen XVIII enhances neovascularization and vascular permeability in atherosclerosis. Circulation 2004;110:1330 6. Myllyharju J, Kivirikko KI. Collagens, modifying enzymes and their mutations in humans, flies and worms. Trends Genet 2004;20:33 43. Olsson A, Johansson I, Akerud H, Einarsson B, ym. The minimal active domain of endostatin is a heparin-binding motif that mediates inhibition of tumor vascularization. Cancer Res 2004;64:9012 7. O Reilly MS, Boehm T, Shing Y, ym. Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell 1997;88:277 85. Ortega N, Werb Z. New functional roles for non-collagenous domains of basement membrane collagens. J Cell Sci 2002;115:4201 14. Porkka K. Endostatiini valoa hiiren syövän hoitoon. Duodecim 1997;113: 2241. Rehn M, Veikkola T, Kukk-Valdre E, ym. Interaction of endostatin with integrins implicated in angiogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A 2001;98:1024 9. Sasaki T, Hohenester E, Timpl R. Structure and function of collagen-derived endostatin inhibitors of angiogenesis. IUBMB Life 2002;53:77 84. Senger DR, Peruzzi CA, Streit M, Koteliansky VE, de Fougerolles AR, Detmar M. The α 1 and α 2 integrins provide critical support for vascular endothelial growth factor signaling, endothelial cell migration, and tumor angiogenesis. Am J Pathol 2002;160:195 204. Suzuki M, Iizasa T, Ko E, ym. Serum endostatin correlates with progression and prognosis of non-small cell lung cancer. Lung Cancer 2002;35:29 34. Timpl R. Macromolecular organization of basement membranes. Curr Opin Cell Biol 1996;8:618 24. Wickström SA, Alitalo K, Keski-Oja J. Endostatin associates with integrin α 5 and caveolin-1, and activates Src via a tyrosyl phosphatase-dependent pathway in human endothelial cells. Cancer Res 2002;62:5580 9. Wickström SA, Alitalo K, Keski-Oja J. Endostatin associates with lipid rafts and induces reorganization of the actin cytoskeleton via down-regulation of RhoA activity. J Biol Chem 2003;278:37895 901. Wickström SA, Alitalo K, Keski-Oja J. An endostatin-derived peptide interacts with integrins and regulates actin cytoskeleton and migration of endothelial cells. J Biol Chem 2004;279:20178 85. Wickström SA, Veikkola T, Rehn M, Pihlajaniemi T, Alitalo K, Keski-Oja J. Endostatin-induced modulation of plasminogen activation with concomitant loss of focal adhesions and actin stress fibers in cultured human endothelial cells. Cancer Res 2001;61:6511 6. Yamaguchi N, Anand-Apte B, Lee M, ym. Endostatin inhibits VEGF-induced endothelial cell migration and tumor growth independently of zinc binding. Embo J 1999;18:4414 23. Zatterstrom UK, Felbor U, Fukai N, Olsen BR. Collagen XVIII/endostatin structure and functional role in angiogenesis. Cell Struct Funct 2000;25:97 101. Zorick TS, Mustacchi Z, Bando SY, ym. High serum endostatin levels in Down syndrome: implications for improved treatment and prevention of solid tumours. Eur J Hum Genet 2001;9:811 4. SARA A. WICKSTRÖM, LT, tutkija Max Planck Institute for Biochemistry Department of Molecular Medicine Am Klopferspitz 18a 82152 Martinsried Germany JORMA KESKI-OJA, professori jorma.keski-oja@helsinki.fi Haartman-instituutti, patologian ja virologian osastot Biomedicum Helsinki PL 63, 00014 Helsingin yliopisto Verisuonten tyvikalvojen pilkkoutumistuotteet: syövän kasvun estäjiä? 1837