Biotekniikan määritelmä Biotekniikka yhdistää luonnontieteitä ja insinööritieteitä tavalla, joka mahdollistaa elävien organismien, solujen ja niiden osien ja molekyylien sekä molekyylianalogien hyödyntämisen tuotteiden ja palveluiden tuottamiseksi (EFB: European Federation of Biotechnology) Biotekniikka geenitekniikka tai rekombinantti-dna-tekniikka PYTPI 2011/Heikki Ojamo 1
Organismit & solut Eukariootit : eläimet ja kasvit Eukariootit mikro-organismit: homeet, hiivat, levät, alkueläimet) Prokariootit : arkkibakteerit ja varsinaiset bakteerit PYTPI 2011/Heikki Ojamo 2
Solujen osat Solujen osia käytetään harvemmin sovelluksissa ja silloin lähinnä eukarioottien osia PYTPI 2011/Heikki Ojamo 3
Molekyylit Entsyymiproteiini PYTPI 2011/Heikki Ojamo 4 Solun pintamolekyylejä
Biotekniikan soveltaminen prosesseissa = bioprosessitekniikkaa Biotekniikassa tiedon määrä kasvaa nopeammin kuin millään muulla tieteen osa-alueella, mutta tähän tietoon perustuvien prosessiteknisten sovellusten määrä ei lisäänny samaa vauhtia Alalla on puutetta insinööriosaamisesta sekä riittävän pitkäjänteisestä pääomasta Joillakin bioprosessitekniikan (= teollisen biotekniikan) alueilla sovelluksia on runsaasti ja niiden taloudellinen, globaali, sosiaalinen... merkitys on todella suuri (esim. lääkkeiden valmistus, elintarvike- ja ympäristöbiotekniikka) (puhutaan myös biotaloudesta) PYTPI 2011/Heikki Ojamo 5
Bioprosessitekniikassa hyödynnetään erityisesti mikro-organismeja ja entsyymejä = tärkeimmät biokatalyytit Organismit, solut katalyytteinä Solut monistavat itseään = tuottavat solumassaa => vaativat ympäristöstään solumassan kaikki alkuaineet jossain muodossa (mikro-organismit edullisimmillaan yksinkertaisina kemikaaleina = ravinteet) Solut muokkaavat ravinnekomponentteja entsyymiensä avulla ensin monomeereiksi (= aineenvaihdunta eli metabolia) ja niistä edelleen osan polymeereiksi (ml. entsyymit), joista solumassa pääosin koostuu; entsyymien valmistusohjeet ovat DNAssa (= perintötekijät, perimä) PYTPI 2011/Heikki Ojamo 6
Organismit, solut katalyytteinä (jatkoa): Aineenvaihdunta muodostuu pitkistä, monimutkaisista, usein haaroittuneista reaktioketjuista (= metaboliareitit) Solut ovat tavallaan katalyyttikimppuja Metaboliareittien haarautumiskohdissa useammat katalyytit (= entsyymit) kilpailevat substraateistaan (eli reaktanteistaan) (sarja- ja rinnakkaisreaktioita) Yleensä bioprosesseissa hyödynnetään vain yhden organismin soluja; organismi valitaan siten, että prosessi on mahdollisimman tehokas : volumetrinen tuottonopeus (g l -1 h -1 ), tuotesaanto substraat(e)ista (g g -1 tai mol mol -1 ), tuotantokustannus ( kg -1 ) Ohessa metaboliareittien esitystapoja PYTPI 2011/Heikki Ojamo 7
PYTPI 2011/Heikki Ojamo 8
PYTPI 2011/Heikki Ojamo 9
PROSESSITEKNIIKAN PERUSTA 2010 PYTPI 2011/Heikki Ojamo 10
Organismit, solut katalyytteinä (jatkoa): Noin 2 miljoonasta tunnetusta organismilajista suurin osa on mikro-organismeja, joilla on myös suurimmat vaihtelut ominaisuuksissaan => erilaisiin tarkoituksiin löytyy usein paras prosessimikro-organismi Prosessikehitys: Organismin valinta Organismin mahdollinen muokkaus geenitasolla Ravinteiden valinta Prosessityypin valinta (panos, fed-batch, jatkuva, solujen palautus...) Prosessiolosuhteiden valinta PYTPI 2011/Heikki Ojamo 11
Miksi/milloin valita solut katalyyteiksi Useiden reaktioiden ketjut edullisista ja saatavilla olevista raakaaineista tuotteiksi (solutehtaat eli cell factories) Stereo- tai muuten spesifiset reaktiot ja kiraaliset tuotteet (esim. L-lysiini, 5-keto-D-glukonihappo) Kemiallisesti monimutkaiset tuotteet (polymeerit, antibiootit, vitamiinit...; esim. proteiinit ja hiilihydraatit, tetrasykliinit, B 12 - vitamiini) Historialliset ja viranomais/kuluttajasyyt (esim. etanoli) Joskus ympäristö- ja kestävään kehitykseen liittyvät syyt (esim. liuottimien, myrkkyjen jne. käytön välttäminen) (sustainability) Energian säästö (reaktio-olosuhteet: T, p...) PYTPI 2011/Heikki Ojamo 12
Ksantaani-polymeeri L-lysiini Tetrasykliinit B 12 -vitamiini PYTPI 2011/Heikki Ojamo 13
Miksi/milloin valita solut katalyyteiksi Reaktiossa vaaditaan kofaktorin osallistumista (kts. entsyymiosa; esim. elektroninsiirtäjä-komponentti vaaditaan) Kemiallinen katalyytti asettaa raaka-aineelle (reaktantille, substraatille) tai prosessille epärealistisia vaatimuksia (esim. raaka-aineen/tuotteen puhdistaminen, reaktio-olosuhteet...) Kokonaistaloudellisuuden edellyttäessä PYTPI 2011/Heikki Ojamo 14
Solut katalyytteina/prosessi Prosessia kutsutaan yleensä nimellä fermentointi (engl. fermentation) tai biotransformaatio (biotransformation) tai biokonversio (bioconversion) Prosessin toteutuksessa useita vaihtoehtoja: panos, toistettu panos, fed-batch, jatkuva, jatkuva solujen palautuksella, useampivaiheinen jatkuva; toisaalta solujen suhteen: vapaat tai immobilisoidut solut; lisäksi: kiinteässä (solid-state) tai nestemuodossa (submerssi, submerge) Immobilisointi: solut liitetään tai suljetaan kiinteään kantajamateriaaliin Prosessi on solujen aineenvaihdunnan mukaan joko aerobinen (solut vaativat happea), mikroaerobinen (happea tarvitaan, mutta hyvin säädellysti ja vähän) tai anaerobinen (happea ei tarvita tai ei siedetä) PYTPI 2011/Heikki Ojamo 15
Fermentointiprosesseja From cells to cells From compound 1 by biocatalysts to compound 2 From cells by cells to compounds PYTPI 2011/Heikki Ojamo 16
Solut katalyytteina/prosessi Kullakin organismilla on tarkat vaatimukset prosessiolosuhteiden suhteen; lisäksi itse prosessi (esim. haluttu aineenvaihdunta) voi vielä rajata näitä olosuhteita Tärkeitä olosuhdetekijöitä: vesipitoisuus, T, ph, liuenneen hapen osapaine (po 2 ), ravinnepitoisuudet, aseptisuus (=> puhdasviljelmä), korkea homogeenisuusaste Solut käyttävät vain veteen liuennutta happea; happi erittäin niukkaliukoinen veteen (n. 8 mg l -1 30 o C:ssa) => jatkuva liuottaminen Erityisesti solumassaa tuotettaessa vapautuu lämpöä: eksoterminen tapahtuma (n. 460 kj/mol kulutettua happea) => lämmönsiirto = T-säätö Solujen toiminta usein muuttaa ympäristönsä ph:ta (happojen/ emästen tuotto/kulutus) => ph-säätö emästä/happoa lisäämällä PYTPI 2011/Heikki Ojamo 17
Tärkeitä insinööriaspekteja: Solut katalyytteina/prosessi Lämmönsiirto (toteutus vaipan avulla; organismityyppi vaikuttaa: useimmat mesofiileja (T: 25-40 o C); myös termofiilejä (T: 40-80 o C) ja hypertermofiilejä (T: 80-120 o C) Aineensiirto: erityisesti hapen osalta, jolloin ajava voima (DC) on erittäin pieni; toisaalta aineensiirto partikkeleihin ja partikkeleissa (immobilisoidut solut) Sekoituksen vaikutus homogeenisuuteen, lämmönsiirtonopeuteen, aineensiirtoon, soluihin, fluidin (solut+neste) viskositeettiin Laite- (fermentori) suunnittelu => aseptiikka & sterilointi Taloudelliset indikaattorit: volumetrinen tuottonopeus => laitteiden/laitoksen koko (investointi); tuotesaanto => raakaainekustannukset PYTPI 2011/Heikki Ojamo 18
Solut vs. kemialliset katalyytit Osa raaka-aineista kuluu solumassan tuottoon => tuotesaanto Perinteisesti solumassan tuotto on osa prosessia (tuotetaan ns. siirrostevaiheissa asteittain fermentoritilavuutta kasvattamalla) Yleensä solut sietävät selvästi alhaisempia reaktanttipitoisuuksia kuin kemialliset katalyytit => tuotepitoisuudet Solut ovat hitaita: tyypillinen volumetrinen tuottonopeus perinteisissä prosessitoteutuksissa: 2-4 g l -1 h -1 Soluja voidaan kierrättää Ylijäämäsolumassa hyödynnettävissä, mutta taloudellinen arvo alhainen Solujen ominaisuuksia voidaan muuttaa => GMO (geneettisesti muunnnetut organismit); esim. metabolian muokkaus: solut saadaan sopivien geenien siirroilla/poistamisilla yms. tuottamaan yhdisteitä, joita ne eivät luonnostaan ole tuottaneet (= metabolian muokkaus = metabolic engineering) PYTPI 2011/Heikki Ojamo 19
Tyypillinen fermentointiprosessi Siirrosteen tuotto Tuotantofermentointi Tuotteen puhdistus (= jälkikäsittely) Jätteiden käsittely PYTPI 2011/Heikki Ojamo 20
Entsyymit katalyytteina Entsyymit ovat aktiivisia proteiineja, jotka katalysoivat reaktioita (= alentavat katalysoimansa reaktion aktivoitumisenergiaa) kulumatta itse reaktiossa (teoriassa kyllä, käytännössä entsyymin aktiivisuus usein pikku hiljaa alenee) Entsyymejä ei annostella reaktioseoksiin painon vaan aktiivisuuden mukaan (1 U = 1 µmol min -1 ; 1 nkat = 1 nanokatal = 1 nmol s -1 ) Usein reaktio-/substraatti-/stereospesifisiä Entsyymit luokitellaan katalysoimansa reaktion mukaan 5 luokkaan, joista prosessisovelluksia on eniten hapetus/pelkistys- (dehydrogenaasit ja oksidaasit) entsyymeillä, intramolekulaarisia muutoksia aikaansaavilla entsyymeillä (isomeraasit) sekä hydrolyyttisillä (hydrolaasit) entsyymeillä PYTPI 2011/Heikki Ojamo 21
Entsyymit katalyytteina (jatkoa) Hydrolaasit liittävät kemiallisiin sidoksiin vettä katkaisten sidoksen; esim.: PROSESSITEKNIIKAN PERUSTA 2011 Entsyymi + H 2 O ----------> + + sakkaroosi glukoosi fruktoosi PYTPI 2011/Heikki Ojamo 22
Entsyymit katalyytteina (jatkoa) Hapetus/pelkistysentsyymit siirtävät elektroneja/vetyä/happea käyttäen hyväksi reaktioseoksessa olevaa elektroninsiirtäjää Entsyymi + NADH 2 ----------------> + NAD glukoosi Elektroninsiirtäjä (NADH 2 /NAD) on kallis komponentti => käytetään joko soluja (joissa tarvittavat entsyymit ja elektroninsiirtäjä syntetisoituvat ja NAD regeneroituu (pelkistyy) takaisin NADH 2 :ksi tai yhdistetään 2 reaktiota: toinen hapetus toinen pelkistys PYTPI 2011/Heikki Ojamo 23 D-sorbitoli
Entsyymit katalyytteina (jatkoa) Isomeraasit muuttavat substraattinsa sisäistä rakennetta, esim. glukoosi-isomeraasi Glukoosi-isomeraasi -----------------------> D-glukoosi D-fruktoosi PYTPI 2011/Heikki Ojamo 24
Entsyymit katalyytteina Lähteistään eristetyt entsyymit ovat bioprosessitekniikan tärkeitä tuotteita, joita hyödynnetään teollisuudessa hyvin laajasti (elintarvikeprosesseissa, sellu- ja paperiteollisuudessa, ympäristötekniikassa, erilaisten biopolymeerien käsittelyssä, biojalostamoissa, kemian teollisuudessa...) Entsyymejä voidaan käyttää liuosmuodossa, jolloin niitä yleensä ei voi kierrättää tai käyttää yhtä kertaa useammin; tällöin entsyymin hinnan tulee olla hyvin alhainen tai entsyymin avulla tuotetun tuotteen hinnan hyvin korkea Kuten soluja myös entsyymejä voidaan immobilisoida => kierrätys tai käyttö jatkuvassa prosessissa yleensä kolonnissa, jonka läpi substraattiliuos syötetään jatkuvana virtana PYTPI 2011/Heikki Ojamo 25
A540/% PROSESSITEKNIIKAN PERUSTA 2011 Entsyymit katalyytteina Kuten soluilla myös entsyymeillä on toiminnan (= aktiiivisuuden) kannalta optimaaliset olosuhteet (lähinnä T, ph, reaktanttien pitoisuudet, aktivaattorien ja inhibiittorien pitoisuudet) ja toisaalta ehdottomat rajat olosuhteille, joiden ulkopuolella ensyymit menettävät irreversiibelisti (= palautumattomasti) aktiivisuutensa 120 100 80 60 40 xynii, Y5 enzyme activity xynii Y5 Act. /% 120 100 80 60 40 ph act. xynii vs ST6 ST6/Tris ST6/sf xynii/sf xynii/tris 20 20 0 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 Temp/ºC 0 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 ph PYTPI 2011/Heikki Ojamo 26
Entsyymit katalyytteina 1-faasisysteemeissä (täysin liukoiset reaktantit ja entsyymit) reaktionopeus määräytyy yleensä reaktion alkuvaiheessa (s.o. substraatti ei rajoita) käytetyn entsyymiannostuksen mukaan, myöhemmin substraattipitoisuuden aletessa jossain vaiheessa (riippuu entsyymistä) alkaa substraattipitoisuus myös vaikuttaa reaktionopeuteen: Michaelis-Menten kinetiikka Immobilisoiduilla entsyymeillä myös aineensiirtonopeus voi rajoittaa reaktionopeutta Kiinteillä substraateilla joudutaan käyttämään liukoisia entsyymejä (esim. biomassojen sisältämien polymeerien hydrolyysissä) PYTPI 2011/Heikki Ojamo 27
TEHTÄVÄ Voidaanko bioprosessitekniikkaa hyödyntää tarkastelunne kohteena olevassa tuotantoprosessissa joko korvaamalla koko prosessi tai osia siitä bioteknisellä ratkaisulla? Perustelut? Miten? Mitä katalyyttejä käyttäen? Onko jo olemassa toteutettuja ratkaisuja? Miten prosessi /raaka-aineet tms. muuttuvat? Muuttuuko mittakaava (laitoskoko)? Bioprosessitekniikan edut/haitat ko. prosessissa? Tekniikan kypsyys (kehitysvaihe: ideataso/laboratoriotaso/demonstraatio/kypsä)? Miksi ei? Miten prosessia pitäisi muuttaa, jotta hyödyntäminen olisi mahdollista? Millaisia ympäristövaikutuksia prosessilla on? Miten prosessin tuottamia sivu- ja jätevirtoja pitäisi käsitellä? Voidaanko niiden käsittelyssä soveltaa bioprosessitekniikkaa (esim. biologinen jäteveden puhdistus, kiinteiden jätteiden kompostointi tai mädätys, raskasmetallien ym. myrkyllisten komponenttien poisto jne.)? PYTPI 2011/Heikki Ojamo 28