CHEM-A1310 Biotieteen perusteet 2018 Laboratoriodemojen teoriaosuus Huomaa: Jokaisesta suorittamatta jääneestä demokerrasta vähennetään 0.75 pistettä tentin kokonaispisteistä. Rästikertojen jälkeen suoritukset eivät ole enää mahdollisia. Laboratoriodemoihin mukaan oma laboratoriotakki, suojalasit (tarvittaessa saa lainattuakin) ja kirjoitusvälineet harjoitustyön aikana tulet vastaamaan kirjallisiin kysymyksiin, jotka palautetaan opettajalle harjoituskerran lopussa; harjoituskerta arvostellaan käytännön työn lisäksi näiden vastausten perusteella (hyväksytty/hylätty) Laboratoriodemoissa mukana myös englanninkielisiä opettajia Mikroluokkademoihin EI laboratoriovarusteissa! 26.1.2018 2 1
Kromatografia Kromatografiaa voi käyttää proteiiniseosten puhdistukseen esim. koon ja/tai nettovarausten perusteella http://www.docstoc.com/docs/22067577/protein-separation-three-kinds-of-chromatography-column-chromatography 2
Kromatografiat proteiinien puhdistuksessa Ekskluusiokromatografia (size-exclusion chromatography) Nimiä: molekyyliseulakromatografia, geelikromatografia Ioninvaihtokromatografia Kiinteä faasi on joko positiivisesti tai negatiivisesti varautunut ja vastakkaisesti varautunut proteiini tarttuu siihen Hydrofobinen interaktio -kromatografia (HIC) Kolonnin kiinteässä faasissa hydrofobisia ligandeja, joihin proteiini tarttuu kiinni reversiibelisti http://www.bio-rad.com/en-fi/applications-technologies/chromatography Affiniteettikromatografia Proteiinilla spesifinen sitoutuminen kiinteän faaasin ligandiin Ekskluusiokromatografian periaate Pienikokoiset molekyylit kulkevat kolonnin partikkelien pienten huokosten kautta ja siksi liikkuvat kolonnissa hitaasti. Suuret proteiinit ja muut molekyylit kulkevat partikkelien ulkopuolelta ja siksi liikkuvat kolonnissa nopeasti. http://en.wikipedia.org/wiki/size-exclusion_chromatography 3
Ekskluusiokromatografiassa proteiinien ja muiden molekyylien erotus perustuu niiden erilaiseen etenemisnopeuteen kiinteällä materiaalilla täytetyssä kolonnissa. Erottuminen koon mukaan. Vertaa esim. DNA-elektroforeesi! Pienet vs. isot DNA-palat, kummat kulkevat nopeammin? http://upendrats.blogspot.fi/2013/05/gel-filtration.html Näyte ajetaan sisään kolonniin ja sen jälkeen kolonniin ajetaan puskuria, jossa proteiinit liikkuvat kolonnin sisällä. http://www.bioinfo.org.cn/book/biochemistry/chap t06/sim0.htm 4
Esimerkki HPLC-laitteistosta Tutkimustilanteessa kolonnista ulos tulevan proteiinin määrä mitataan esim. UV-detektorilla, jolloin nähdään missä fraktioissa erottuvat proteiinit ovat. Figure 2: HPLC chromatographic protein analysis of the fractions collected by the preparative size-exclusion chromatography (Sephadex G-100 column) of the clarified medium of the submerse culture. http://www.scielo.br/scielo.php?pid=s0104-66321999000200012&script=sci_arttext 5
Demotyön kuvaus Puhdistuskolonnin läpi ajetaan väriliuos, jossa erikokoiset (iso ja pieni) värimolekyylit kulkevat eri nopeuksilla kolonnin sisältämän geelin läpi ja siten erottuvat toisistaan. Värimolekyylit poistuvat kolonnista eri aikoina. Tässä työssä käytämme värimolekyylejä lähtömateriaalina, jotta voitte seurata erottumistapahtumaa. Econo-Pac 10DG Puskuri: 50 mm Tris-HCl, ph 7.5 Blue dextran 2000 + Fluorescein DNA:n geelielektroforeesi Proteiinien geelielektroforeesi 6
DNA eliöissä DNA-sekvenssi ja geenit muodostavat eliöiden genotyypin ja määräävät täten myös fenotyypin eli ilmiasun, jonka me voimme havaita. DNA on luonnon keskeinen rakennusosanen ja se toimii myös pohjana biotekniikan ja synteettisen biologian sovelluksissa. DNA sisältää solun geneettisen informaation (käydään läpi prof. Linderin luennolla) http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/basics/dna http://www-app.igb.illinois.edu/games2012/ 7
Geelielektroforeesi DNA-tutkimuksen perustyökaluna Kun DNA on eristetty esim. eläinsolusta tai bakteerista, sitä voidaan esim. Kopioida PCR:n (polymerase chain reaktion, polymeraasiketjureaktio) avulla Pilkkoa paloihin entsyymien avulla DNA:ta voidaan pilkkoa restriktio- eli katkaisuentsyymeillä, jotka tunnistavat esim. kuuden tai kahdeksan nukleotidin jakson sekvenssistä Perustyökalu esim. rekombinantti-dna-tekniikassa DNA-palojen pituus voidaan määrittää geelielektroforeesilla Restriktioentsyymi katkaisee DNA:n http://science.nayland.school.nz/graemeb/yr13%20work/biotech/biotech nology.htm 8
Restriktioentsyymejä on erilaisia http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/biologypages/r/restrictionenzymes.html Esimerkki DNA-digestion sovelluskohteesta: Geenin kloonaus plasmidiin, jonka avulla haluttua proteiinia voidaan tuottaa esim. E. coli soluissa -haluttu proteiini voi olla esim. lääkeaine tai vaikkapa entsyymi, jota bakteeri ei luonnostaan tuota 9
Harjoitustyö: DNA-geelielektroforeesi ja analyysi Plasmidissa olevan geeni-insertin olemassaolo voidaan tarkistaa restriktioentsyymi-digestion ja DNA-geelielektroforeesin avulla. Elektroforeesin tuloksena voidaan määrittää DNA-palojen määrä ja koko. 6200 bp 6200 bp http://www.addgene.org/plasmid_protocols/diagnostic_digest/ 10
Mikä on DNA:n varaus: negatiivinen, neutraali vai positiivinen? Mihin suuntaan DNA-palat liikkuvat sähkövirrassa? http://www.biochem.arizona.edu/miesfeld/teaching/bioc471-2/pages/lecture2/lecture2.html http://classroom.sdmesa.edu/eschmid/lab12%20-%20biol210.htm 11
SybrSafe: SYBR Safe is a safer alternative to the known mutagen ethidium bromide. - A cyanine dye used as a nucleic acid stain in molecular biology - Binds to DNA - The resulting DNA-dyecomplex absorbs blue light (λ max = 509 nm) and emits green light (λ max = 524 nm) http://classroom.sdmesa.edu/eschmid/lab12%20-%20biol210.htm Värjätty DNA näkyy UV-valossa - Suojamaskia ja suojakäsineitä käytettävä! http://science.nayland.school.nz/graemeb/yr13%20work/biotech/biotechnology.htm 12
Videot 1) Video agaroosigeelin valmistuksesta (BioRad) https://www.youtube.com/watch?v=kkmikkmddhy 2) Video DNA-agaroosigeeliajosta (BioRad) https://www.youtube.com/watch?v=vq759wkccuq Proteiinien elektroforeesi 13
Miten erottaa erilaiset proteiinit toisistaan? www.ironmanmagazine.com http://www.ucl.ac.uk/~sjjgsca/proteinstructure.html http://apbrwww5.apsu.edu/thompsonj/anatomy%20&%20physiology/2010/2010%20exam%20reviews/ Exam%201%20Review/Ch03%20Cell%20Organelles%20&%20Cytoskeleton.htm http://www.mcw.edu/pharmacology/people/faculty/leesang.htm Miten voidaan havaita onko haluamaamme proteiinia syntynyt esim. mikrobeissa tuotettaessa? http://en.wikipedia.org/wiki/bioreactor http://www.gene-vinate.com/#!bacterial-expression-systems/c1e2q 14
Proteiinien elektroforeesin periaate Proteiinit liikkuvat sähkökentässä Hyödynnetään proteiinien erottamiseksi toisistaan tunnistamista varten Proteiinit liikkuvat kokonsa perusteella eri nopeuksilla ja siten erottuvat toisistaan http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/bulletin_6040a.pdf SDS-PAGE SDS = sodium dodecyl sulphate (negatiivisesti varautunut detergentti) PAGE = polyakryyliamidi-geelielektroforeesi SDS-PAGE = natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesi SDS denaturoi ja linearisoi proteiinit niiden primaarirakenteiksi eli aminohapposekvenssimuotoon sekä päällystää linearisoidut proteiinit -> kompleksilla negatiivinen varaus 15
SDS-PAGE Miksi juuri polyakryyliamidi? Kemiallisesti inertti Sähköisesti neutraali Hydrofiilinen Läpinäkyvä koostumus hyvä havainnointitarkoituksiin Proteiinien erottuminen http://www.bio-rad.com/en-fi/applications-technologies/protein-electrophoresis-methods 16
Proteiinin koon määritys FDH: 10-formyltetrahydrofolate dehydrogenase 2,3-BDH: 2,3-butanediol dehydrogenase GDH: glutamate dehydrogenase www.nature.com Proteiini-elektroforeesin työjärjestys Ajopuskurien valmistus Geelin valmistus Näytteiden valmistelu ajoa varten Näytteiden ja standardien lataus ja ajo Geelin värjäys ja/tai immunoblottaus Kuvantaminen ja tulosten analysointi Esimerkki näyte-cocktailista: Tris-HCl-puskuri SDS glyseroli bromophenol blue DTT (dithiothreitol, rikkisillat poikki) näy eiden denaturoin kuumentamalla Geelin värjäys - Esim. Coomassie blue -värillä Huom! Muista työturvallisuus ja suojavarusteet, esim. akryyliamidi on neurotoksiini 17
Laitteisto 200 V Tärkeää, että johdot kytketään oikein päin! Ajolaitteen kansi päälle/pois vasta, kun virtalähde on sammutettu ja johdot on irrotettu virtalähteestä! http://bitesizebio.com/articles/sds-page-the-easy-way-to-find-the-wells/ 18
http://bitesizebio.com/articles/sds-page-the-easy-way-to-find-the-wells/ http://bitesizebio.com/articles/sds-page-the-easy-way-to-find-the-wells/ 19
Proteiinien identifiointi geeliajon jälkeen Yhtenä vaihtoehtona proteiinien immunoblottaus eli Western blot Geeliajossa koon mukaan erotellut proteiinit siirretään sähkövirran avulla membraanille, josta haluttu proteiini voidaan tunnistaa sille spesifisen vasta-aineen avulla http://technologyinscience.blogspot.fi/2011/12/ western-blot-protein-immunoblot.html#.vqqjewo6h8e http://www.genoprice.com/onestep.htm Western blot -menetelmän tuloksena vain tutkittava proteiini havaitaan membraanilla, jos alkuperäinen näyte sisältää ko. proteiinia Kemiluminesenssiin tai kolorimetriseen reaktioon perustuva detektio http://employees.csbsju.edu/hjakubowski/classes/ch331/techniques/techelectrophoresis.htm 20
Video Video vertikaalisesta SDS-PAGE-ajosta: https://www.youtube.com/watch?v=xnedmk1sqvg Huom! Käy tämä teoriaosuus läpi vielä juuri ennen omaa harjoituskertaasi (osa harjoituskerroista vasta maaliskuussa), jotta osaat toimia oikein demossa ja pystyt vastaamaan analyysiosuuden kysymyksiin 21
Töiden suoritus Pienryhmissä B-siiven oppilaslaboratorioissa Kromatografia-ajo tai pipetointiharjoitukset geeleihin Erillinen analyysiosio, tehtävien läpikäynti pienryhmissä -> opettajat tarkastavat tehtävät ja keräävät vastauspaperit ennen kuin lähdette Tule ajoissa paikalle, työ alkaa heti ilmoitettuna ajankohtana Mukaan laboratoriotakki ja suojalasit sekä kirjoitusvälineet REPPUJA ja TAKKEJA ym. EI LABORATORIOTILOIHIN! B-siiven aulassa lokerot päiväsäilytystä varten 22